DD285371A5

DD285371A5 - PROCESS FOR IMMOBILIZING MICROORGANISMS OR COIMMOBILIZATION OF MICROORGANISMS AND ENZYMES

Info

Publication number: DD285371A5
Application number: DD33008689A
Authority: DD
Inventors: Michael Foerster; Horst Dautzenberg; Torsten Hoffmann; Alfred Schellenberger; Klaus-Peter Doepfer; Johanna Mansfeld; Gabriele Holzapfel; Brigitte Tiersch; Wolfgang Wagenknecht; Brigitte Lukanoff; Helmut Kluge; Joachim Roembach
Original assignee: Ingenieurtechnik Im Stammbetrieb Veb Kombinat Suesswaren,Dd; Institut Fuer Polymerenchemie "Erich Correns" Der Adw Der Ddr,Dd
Priority date: 1989-06-29
Filing date: 1989-06-29
Publication date: 1990-12-12

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Immobilisierung von Mikroorganismen bzw. Coimmobilisierung von Mikroorganismen und Enzymen, das sehr stabile Biokatalysatoren liefert, die auch in Langzeitverfahren und stoffwandelnden Prozessen in der Biotechnologie, chemischen, pharmazeutischen und Lebensmittelindustrie sowie in der Medizin eingesetzt werden koennen. Die Mikroorganismen werden zunaechst durch Bindung an Traegermaterialien vorimmobilisiert. Im Falle der Coimmobilisierung von Mikroorganismen und Enzymen werden die Mikroorganismen und Enzyme separat an ein Traegermaterial gebunden. Nach Sedimentation und Separation der vorimmobilisierten Mikroorganismen bzw. vorimmobilisierten Mikroorganismen und Enzyme im Falle der Coimmobilisierung werden diese in Mikrokapseln eingeschlossen und nach UEberfuehrung in ein fuer die Zuechtung der immobilisierten bzw. coimmobilisierten Biokatalysatoren geeignetes Milieu der gewuenschten Verwendung zugefuehrt.{Immobilisierung von Mikroorganismen; Coimmobilisierung von Mikroorganismen und Enzymen; Vorimmobilisierung; Einkapselung; Polyelektrolytkomplexe; Stoffwandlung}The invention relates to a process for the immobilization of microorganisms or coimmobilization of microorganisms and enzymes, which provides very stable biocatalysts, which can also be used in long-term processes and material-converting processes in biotechnology, chemical, pharmaceutical and food industries and in medicine. The microorganisms are initially preimmobilized by binding to traeger materials. In the case of coimmobilization of microorganisms and enzymes, the microorganisms and enzymes are separately bound to a carrier material. After sedimentation and separation of the preimmobilized microorganisms or preimmobilized microorganisms and enzymes in the case of coimmobilization, these are enclosed in microcapsules and, after conversion to a suitable environment for the growth of the immobilized or coimmobilized biocatalysts, the desired use is brought {immobilization of microorganisms; Coimmobilization of microorganisms and enzymes; Vorimmobilisierung; encapsulation; polyelectrolyte complexes; Material conversion}

Description

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Titel der ICrfindungTitle of the invention

Verfahren zur Immobilisierung von Mikroorganismen bzw. Coimmobilisierung von Mikroorganismen und EnzymenProcess for the immobilization of microorganisms or coimmobilization of microorganisms and enzymes

Anwendungsgebiet der ErfindungField of application of the invention

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Immobilisierung von Mikroorganismen bzw. Coimmobilisierung von Mikroorganismen und Enzymen zur Herstellung von Biokatalysctoren, die zur Durchführung stoffwandelnder Prozesse in der Biotechnologie, in der pharmazeutischen, chemischen und Lebensmittelindustrie sowie für den Einsatz in der Medizin geeignet sind.The invention relates to a process for the immobilization of microorganisms or coimmobilization of microorganisms and enzymes for the production of biocatalysts, which are suitable for carrying out stoffwandelnder processes in biotechnology, in the pharmaceutical, chemical and food industries and for use in medicine.

Sie finden z. B. Verwendung für die Biosynthese von Medikamenten, hochwertigen Chemikalien, Enzymen usw.You will find z. B. Use for the biosynthesis of drugs, high quality chemicals, enzymes, etc.

Charakteristik des bekannten Standes der TechnikCharacteristic of the known state of the art

Zur Durchführung biochemischer Reaktionen in der Biotechnologie, pharmazeutischen, chemischen und Lebensmittelindustrie werden verstärkt Mikroorganismen eingesetzt. In zunehmendem Maße v/erden die Mikroorganismen in immobilisierter Form verwendet, um den Einsatz derselben ökonomisch und effektiv zu gestalten. Mit Hilfe der Immobilisierung wird eine Erhöhung der mikrobiellen Produktivität, im Verhältnis zum Reaktorvolumen, eine leichtere Abtrennbarkeit des Biokatalysators vom Produkt und damit eine wesentliche Senkung des Aufwands zur Isolierung der gewünschten Produkte ermöglicht.To carry out biochemical reactions in the biotechnology, pharmaceutical, chemical and food industries, microorganisms are increasingly used. Increasingly, microorganisms are used in immobilized form to make their use economical and effective. Immobilization allows an increase in microbial productivity, relative to the reactor volume, to facilitate the ability of the biocatalyst to separate from the product, thereby significantly reducing the cost of isolating the desired products.

Zur Immobilisierung von Mikroorganismen ist eine Reihe von Methoden beschrieben worden, wie z. B. der Einschluß in Netzwerke und in Schaumstoffe, die Fixierung an porösen Trägermaterialien und die Vorkapselung. Daneben sind einige Methoden und Materialien in Kombination getestet worden.For the immobilization of microorganisms, a number of methods have been described, such as. As the inclusion in networks and in foams, the fixation on porous substrates and the pre-encapsulation. In addition, some methods and materials have been tested in combination.

Beim Einschluß in Netzwerke aus Gelen ist neben einer relativ geringen mechanischen Festigkeit häufig ein Auswaschen der Zellen aus den Gelen zu beobachten (Stöcklein, Eisgruber, Schmidt, Biotechnol. Lett. 5(10), 703 (1983)).When included in networks of gels, in addition to a relatively low mechanical strength, washing out of the cells from the gels is frequently observed (Stöcklein, Eisgruber, Schmidt, Biotechnol., Lett., 5 (10), 703 (1983)).

Um die Gefahr des Auswachsens von Zellen in das Medium herabzusetzen und daraus resultierende Störungen des Pr-ozesses zu vermeiden, wird in DE OS 34 32 932 ein Verfahren beschrieben, das das Auswachsen von Zellen auch bei Langzeitversuchen sicher verhindern soll. Diese Aufgabe wird dadurch gelöst, daß die Oberfläche des Biokatalysators durch eine zellenfreie Schutzschicht aus einem vernatzten, keine Durchlässigkeit für die Zellen aufweisenden den zellenhaltigen Kern umschließenden Gel gebildet wird. Dieses Verfahren liefert Gelkörper, die im allgemeinen eine begrenzte mechanische Haltbarkeit aufweisen. Finden beschriebenen Verwendungszweck, die Sektherstellung, ist jedoch die mechanische Festigkeit von untergeordneter Bedeutung, da der Biokatalysator nicht stark beansprucht wird, in anderen stoffwandelnden Prozessen spielt die mechanische Festigkeit eine bedeutende Rolle.In order to reduce the risk of the outgrowth of cells in the medium and to avoid resulting interference of the Pr-ozesses, a method is described in DE OS 34 32 932, which is intended to prevent the outgrowth of cells safely even in long-term trials. This object is achieved in that the surface of the biocatalyst is formed by a cell-free protective layer of a wetted, no permeability to the cells having the cell-containing core enclosing gel. This process provides gel bodies that generally have limited mechanical durability. However, the mechanical strength is of secondary importance since the biocatalyst is not heavily stressed, mechanical resistance plays a significant role in other material-converting processes.

In dieser Patentschrift wird zudem festgestellt, daß sich das Verfahren der Mikrokapselung für die Immobilisierung von Zellen nicht eignet aufgrund der Toxizität der zu verwendenden Lösungsmittel und der daraus resultierenden geringen Katalysatorakxivität, und daß auch bei dieser Methode das Auswachsen von Zellen nicht sicher verhindert werden kann.This patent also states that the method of microencapsulation is not suitable for the immobilization of cells due to the toxicity of the solvents to be used and the resulting low catalyst activity, and that also in this method the outgrowth of cells can not be reliably prevented.

Von Mosbach (Phil. Trans. R. Soc. Lond. B300, 355 (1983)) wird ebenfalls festgestellt, daß bei der Einkapselung von Mikroorganismen im Vergleich zum Einschluß in Netzv/erken die Anzahl Zellen, die ins Medium wachsen können, weiter reduziert ist, daß aber dennoch die in die Membran inkorporierten Zellen Eiomasse nach außen abgeben können.Mosbach (Phil Trans. R. Soc.Lond.B300, 355 (1983)) also notes that in the encapsulation of microorganisms as compared to inclusion in networks, the number of cells which can grow into the medium is further reduced is that, nevertheless, the cells incorporated in the membrane can deliver egg mass to the outside.

In DE-OS 30 12 233 wird ein Verfahren zur Immobilisierung von chemisch oder biologisch aktiven Stoffen, lebendem Gewebe und Einzelzellen beschrieben, bei dem zunächst die Materialien in einem Gel eingeschlossen und anschließend die sauren Gruppen an der Oberfläche der Gelmatrix mit einem aminogruppenhaltigen Polymer umgesetzt v/erden, so daß sich eine Membran ausbildet. Als nachteilig sind die geringe Widerstandsfähigkeit der so gebildeten Membran gegenüber proteolytischem Angriff anzusehen, die eine begrenzte Lebensdauer der Kapseln bedingt, und die Anwesenheit einer großen Anzahl freier Aminogruppen an der Oberfläche, die neben der Verklumpungsgefahr der Kapseln bei Einsatz anionischer Substrate zu einer Akkumulation derselben an derDE-OS 30 12 233 describes a process for the immobilization of chemically or biologically active substances, living tissue and single cells, in which first the materials are enclosed in a gel and subsequently the acidic groups on the surface of the gel matrix are reacted with an amino group-containing polymer / ground, so that forms a membrane. A disadvantage are the low resistance of the membrane thus formed to proteolytic attack, which requires a limited life of the capsules, and the presence of a large number of free amino groups on the surface, in addition to the risk of clumping of the capsules when using anionic substrates to an accumulation of the same the

Oberfläche führt.Surface leads.

In den letzten Jahren wurden in zunehmendem Maße Mikroorganismen verschiedener Species und/oder Enzyme zusammen immobilisiert (Coimmobilisierung), nachdem anfangs jeweils nur ein bestimmter Mikroorganismus bzw. ein bestimmtes Enzym an oder in einer Matrix immobilisiert worden war, von denen einige in einer weiterentwickelten Form zusammen in einem Reaktor eingesetzt wurden, Die Coimmobilisierung von Mikroorganismen und Ei zymen ermöglicht es, den Einsatzbereich immobilisierter Mikroorganismen zu verbreitern, indem andere, normalerweise nicht durch den betrachteten Mikroorganismus verwertete Substrate mit Hilfe der coimmobilisicrten Enzyme in eine Form überführt werden, dip vom betreffenden Mikroorganismus umgesetzt werden kann. Bei Auswahl einer geeigneten Sequenz von Enzymen können auf diese Weise mehrstufige Reaktionen katalysiert werden.In recent years, microorganisms of various species and / or enzymes have been increasingly immobilized together (coimmobilization), after initially immobilizing only one particular microorganism or enzyme at or in a matrix, some of which are combined in a more advanced form The coimmobilization of microorganisms and eggs makes it possible to broaden the field of use of immobilized microorganisms by converting other substrates, which are not normally converted by the microorganism under consideration, into the form with the aid of the co-immobilized enzymes can be. By selecting an appropriate sequence of enzymes, multi-step reactions can be catalyzed in this way.

Nach einem Verfahren von B. llägerdal und K. Hosbach (US 4,524,137 zur Coimmobilisierung von Mikroorganismen und Enzymen wird das Enzym kovalent an das Trägermaterial gebunden, das zum Einschluß der Mikroorganismen dient. Als nachteilig sind bei dieser Methode die relativ geringe mechanische Festigkeit der Gelperlen und das Problem des Auswaschens von Zellen aus den Gelen beim Einsatz in Langzeitversuchen anzusehen.According to a method of B. llägerdal and K. Hosbach (US 4,524,137 for the co-immobilization of microorganisms and enzymes, the enzyme is covalently bound to the support material, which serves to enclose the microorganisms.The disadvantage of this method is the relatively low mechanical strength of the gel beads and to look at the problem of washing out cells from the gels when used in long-term experiments.

In EP 0 041 6.10 wird von C. H. Boehringer Sohn, Ingelheim die Bindung des Enzyms an Hefezellen vorgeschlagen. Diese Methode ist jedoch nicht bei allen Mikroorganismen-Species anwendbar, da die meisten Mikroorganismen durch die Irnmobilisierungsprozedur des Enzyms inaktiviert werden. Darüber hinaus wird die Größe der Zellen nicht wesentlich verändert, so daß die Rückhaltung des Coimmobilisats in kontinuierlichen Fermentatxonsprozessen sehr schwierig ist.EP 0 041 6.10 proposes binding of the enzyme to yeast cells by C.H. Boehringer Sohn, Ingelheim. However, this method is not applicable to all microorganism species, since most microorganisms are inactivated by the enzyme immobilization procedure of the enzyme. In addition, the size of the cells is not significantly altered so that the retention of coimmobilisate in continuous fermentation processes is very difficult.

Von W. Hartmeier und A. Heinrichs wird in DE 35 34 983 ein Verfahren zur Coimmobilisierung von Mikroorganismen und Enzymen beschrieben, bei dem die Mikroorganismen und Enzyme zugleich in einer polymeren Matrix eingeschlossen werden, die in situ mit einer entgegengesetzt geladenen, somipermeablen Membran überzogen wird. Bei diesem Verfahren wird die Anzahl Zellen, die bei Langzeitfermentationen ins Medium auswachsen können, gegenüber dem alleinigen Einschluß in ein Gelnetzwerk reduziert. Es kann aber dennoch nicht verhindert v/erden, daß beim Eintropfen derIn DE 35 34 983, W. Hartmeier and A. Heinrichs describe a process for the coimmobilization of microorganisms and enzymes in which the microorganisms and enzymes are simultaneously enclosed in a polymeric matrix which is coated in situ with an oppositely charged, somipermeable membrane , In this method, the number of cells that can grow into the medium during long-term fermentations is reduced compared to the sole inclusion in a gel network. However, it can not prevent v / earth that when dripping the

Mikroorganismen/Enzym/Alginatlösung in die Calciumchlorid/ Methacrylat/Acrylat-Copolymer-Lösung Mikroorganismen in die Membran inkorporiert werden, die Ursache für das Auswachsen von Mikroorganismen ins Außenmediu.n sein können. Bei den an dieser Stolle dargestellten Methoden zur Immobilisierung von Mikroorganismen bzw. Mikroorganismen und Enzymen ist festzustellen, daß sie im Falle des Geleinschlusses von vornherein eine geringe mechanische Festigkeit besitzen und daß bei den bekannten Verfahren zur Einkapselung von Mikroorganismen bzw. Mikroorganismen und Enzymen dieselben in die Kapselmembran inkorporiert werden und durch Wachstums- und Zellteilungsvorgänge der vitalen Objekte eine beträchtliche Verminderung der Kapselfestigkeit verursacht wird.Microorganisms / enzyme / alginate solution in the calcium chloride / methacrylate / acrylate copolymer solution microorganisms are incorporated into the membrane, which may be the cause of the outgrowth of microorganisms in the Außenmediu.n. In the case of the methods for immobilizing microorganisms or microorganisms and enzymes shown in this Stolle is to be noted that in the case of Geleinschlusses from the outset have a low mechanical strength and that in the known methods for encapsulation of microorganisms or microorganisms and enzymes in the same Capsule membrane are incorporated and caused by growth and cell division processes of vital objects, a significant reduction in capsule strength.

Ziel der ErfindungObject of the invention

Ziel· der Erfindung sind stabile enkapsulierte Biokatalysatoren, deren Stabilität auch im Falle der Einkapselung proliferierender Systeme nicht durch Wachstums- und Zellteilungsvorgänge derselben herabgesetzt wird und die in biotechnologischen Verfahren eingesetzt werden können.The aim of the invention is stable encapsulated biocatalysts whose stability, even in the case of the encapsulation of proliferating systems, is not diminished by growth and cell division processes of the same and which can be used in biotechnological processes.

Darlegung des Wesens der ErfindungExplanation of the essence of the invention

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung immobilisierter oder coimmobilisierter Biokatalysatoren mit hoher Operationsstabilität auf dem Wege der Enkapsulierung von Mikroorganismen oder Mikroorganismen und Enzymen zu finden, das den Einbau der zu immobilisierenden. Biokatalysatoren in die Kapselwand verhindert und Kapseln mit hoher Membranfestigkeit erzeugt.The invention has for its object to provide a method for producing immobilized or co-immobilized biocatalysts with high operational stability by way of encapsulation of microorganisms or microorganisms and enzymes to find that the incorporation of immobilized. Prevents biocatalysts in the capsule wall and produces capsules with high membrane strength.

Erfindungsgemäß wird das dadurch erreicht, daß die zu immobilisierenden Mikroorganismen, beispielsweise Hefen und Bakterien, schonend an ein Trägermaterial gebunden werden zürn Zwecke der Vorimmobilisierung, daß das Enzym/die Enzyme im Falle der Coimmobilisierung von Mikroorganismen und Enzymen separat an ein Trägermaterial gebunden werden, die sedimentierten und separierten Vorimmobilisate in einer wäßrigen Lösung aus C Hulosesulfat suspendiert werden, die Suspension in eine wäßrige Polydimethyldiallylammoniumchlorid-Lösung eingetropft wird, und die immobilisierten Biokatalysatoren nach Abschluß des Einkapselungsprözesses in bekannter Weise abgetrennt und in ein für die Züchtung der Mikroorganismen geeignetes Milieu eingebracht werden. Zur Vorimmobilisierung werden die Mikroorganismen entweder adsorptiv unter Verwendung eines physiologisch kompatiblen Mediums oder kovalent an ein Trägermaterial gebunden, das vorzugsweise ein unlösliches Material darstelltAccording to the invention this is achieved in that the microorganisms to be immobilized, for example yeasts and bacteria, are gently bound to a support material for the purpose of pre-immobilization that the enzyme / enzymes are bound separately in the case of coimmobilization of microorganisms and enzymes to a support material, the sedimented and separated Vorimmobilisate be suspended in an aqueous solution of C Hulosesulfat, the suspension is added dropwise into an aqueous polydimethyldiallylammonium chloride solution, and the immobilized biocatalysts are separated after completion of the encapsulation in a known manner and introduced into a suitable for the cultivation of microorganisms environment. For preimmobilization, the microorganisms are either adsorbed using a physiologically compatible medium or covalently bound to a support material, which is preferably an insoluble material

Im Falle der kovalenten Bindung der Mikroorganismen an das Trä- In the case of covalent bonding of the microorganisms to the carrier

germaterial wird vorzugsweise Glutardialdehyd in einem physiologisch kompatiblen Medium verwendet, der in Konzentrationen zwischen 0,1 bis 5 % eingesetzt wird.Germaterial is preferably used Glutardialdehyd in a physiologically compatible medium, which is used in concentrations between 0.1 to 5%.

Als unlösliches Trägermaterial wird insbesondere Aminomethylpolystyrsn mit einem Partikeldurchmosser von 5 bis 200 /um zum Einsatz gebracht.In particular, aminomethyl polystyrene having a particle diameter of from 5 to 200 μm is used as the insoluble support material.

Die Temperatur während des Vorimmobilisierungsprozesses wird zwischen 277 K und der·Stabilitätsgrenze der zu immobilisier,enden Mikroorganismen gewählt.The temperature during the pre-immobilization process is chosen between 277 K and the stability limit of the microorganisms to be immobilized.

Im Falle der Coimmobilisierung von Mikroorganismen und Εηζ'Λ ion erfolgt die Bindung des Enzyms/der Enzyme entweder adsorptiv oder kovalent an einem Trägermaterial, das vorzugsweise ein unlösliches Material darstellt, in einer wäßrigen Lösung bei ρί!~ Werten zwischen 3,5 und S, bei Temperaturen von 277 K bis zur Stabilitätsgrenze der Enzyme und bei einer Reaktionsdauer von min bis 24 Stunden. Als Kupplungsreagens wird vorzugsweise Glutardialdehyd mit einer Konzentration zwischen 0,1 bis 10 %, vorzugsweise jedoch 2,5 %. Als unlösliches Trägermaterial werden vorzugsweise aminogruppenhaltige Polystyrenderivate mit einem Partikeldurchmesser vqn 5 bis 200 /am verwendet.In the case of the coimmobilization of microorganisms and Εηζ'Λ ion, the binding of the enzyme / enzymes takes place either adsorptively or covalently on a support material, which is preferably an insoluble material, in an aqueous solution at ρί! ~ Values between 3.5 and S, at temperatures of 277 K until the stability limit of the enzymes and at a reaction time of min to 24 hours. The coupling reagent is preferably glutaric dialdehyde at a concentration between 0.1 to 10%, but preferably 2.5%. As insoluble carrier material, preferably polystyrene derivatives containing amino groups are having a particle diameter of 5 to 200 VQN / am used.

Die Temperatur bei der sich anschließenden Einkapselung der sedirnentierten und separierten Vorimrnobilisate wird ebenfalls zwischen 273 K und der Stabilitätsgrenze der zu immobilisierenden Biokatalysatoran gewählt.The temperature in the subsequent encapsulation of the sedimented and separated Vorimrnobilisate is also chosen between 273 K and the stability limit of the biocatalyst to be immobilized.

Die Cellulosesulfatkonzentration für die Einkapselung der Vorimmobilisate liegt zwischen 5 und 100 g/l, die Konzentration der Polydimethyldiallylammoniumchlorid-Lösung gleichfalls zwischen 5 und 100 g/l.The cellulose sulphate concentration for the encapsulation of the preimmobilisates is between 5 and 100 g / l, the concentration of the polydimethyldiallylammonium chloride solution likewise between 5 and 100 g / l.

Die Verweilzeit der immobilisierten Mikroorganismen oder Mikroorganismen und Enzyme liegt zwischen 30 Sekunden und 12 Stunden. Mach Abtrennung der erfindungsgemäß hergestellten immobilisierten Biokatalysatoren von der Polydimethyldiallylamrnoniumchlorid-Lösung werden diese in ein für die Züchtung der immobilisierten Biokatalysatoren geeignetes Üilieu überführt und anschließend der gewünschten Verwendung zugeführt.The residence time of the immobilized microorganisms or microorganisms and enzymes is between 30 seconds and 12 hours. If separation of the immobilized biocatalysts prepared according to the invention from the polydimethyldiallylamonium chloride solution is carried out, they are converted into a mixture suitable for the growth of the immobilized biocatalysts and then supplied to the desired use.

Somit liefert das erfindungsgemäße Verfahren immobilisierte Biokatalysatoren, die sich durch eine hohe Vitalität, Aktivität und Operationsstabilität auszeichnen, die auch im Falle der Einkapselung vitaler, proliferieronder Systeme bei Langzeitversuchen nicht durch V/achstums- und Zellteilungssvorgänge derselben oderThus, the inventive method provides immobilized biocatalysts, which are characterized by a high vitality, activity and operational stability, even in the case of encapsulation of vital, proliferieronder systems in long-term experiments not by V / ststums- and cell division processes of the same or

Auswaschen vermindert wird. Die Bindung des ICnzyms/der Enzyme schützt dieses vor Abbauprozessen und Inaktivierung. Die Vorimmobilisierung gewährleistet, daß keine Mikroorganismen in die Kapselwand inkorporiert v/erden und die Oberfläche des immobilisierten bzw. coimmobilisierton üiokatalysators frei von Mikroorganismen ist. Somit ist das Risiko des Auswachsens von Mikroorganismen in das Kulturmedium, das beim Einschluß von Mikroorganismen in Gelnetzwerke nicht verhindert v/erden kann und zu Störungen des Prozesses führt, ausgeschlossen. Von Vorteil ist weiterhin eine erhöhte mechanische Stabilität der Biokatalysatoren gegenüber der von Gelnetzwt;rken.Washing is reduced. The binding of the ICnzyme / enzymes protects it from degradation and inactivation. The preimmobilization ensures that no microorganisms are incorporated into the capsule wall and the surface of the immobilized or coimmobilized clay cocatalyst is free of microorganisms. Thus, the risk of outgrowth of microorganisms into the culture medium, which can not be prevented by the inclusion of microorganisms in gel networks and leads to disturbances of the process, is excluded. An additional advantage is an increased mechanical stability of the biocatalysts over that of gel networks.

Im Falle der Coimmobilisierung von Invertase und Yarrowia lipolytica-Zellen wird es möglich, Saccharose als Substrat einzusetzen, die normalerweise nicht von diesen Zellen verwertet werden kann, jedoch ein wesentlich preiswerteres Substrat als das eigentliche Substrat Glucose darstellt.In the case of coimmobilization of invertase and Yarrowia lipolytica cells, it becomes possible to use sucrose as a substrate, which normally can not be utilized by these cells, but is a much cheaper substrate than the actual substrate glucose.

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Das erfindungsgemäße Verfahren soll anhand nachfolgender Bei spiele erläutert werden.The inventive method will be explained with reference to the following games.

Ausführungsbeispiele Beispiel 1Exemplary embodiments Example 1

0,2 g Polystyren Wofatit UF 93 (Partikeldurchmesser 100 bis 200-yum) v/erden mit 0,5 ml Zollsuspension der Hefe Yarrowia lipolytica (1 mg HTH/ml) und 15 ^r,l Vollmedium nach Behrends 12 h mäßig gerührt.0.2 g of polystyrene Wofatit UF 93 (particle diameter 100 to 200 yum) v / ground with 0.5 ml inch suspension of the yeast Yarrowia lipolytica (1 mg HTH / ml) and 15 ^r, l complete medium after 12 h Behrends moderately stirred.

Dann läßt man das Polystyron sedimentieren und trennt den Überstand ab. Mach mehrmaligem Waschen mit VJasser wird das Pclystyren erneut sedimentiert und, wie in Beispiel 3 beschrieben, verwendet.Then the polystyrene is allowed to sediment and the supernatant is separated off. After washing with VJasser several times, the plylystyrene is sedimented again and used as described in Example 3.

Example 2

0,2 g Polystyren Wofatit UF 93 (Partikeldurchmesser 100 bis 200 um) werden 2 h mit wäßrigem Glutardialdehyd (2,5%ig in £?GKEKSEN-Phosphatpuf for pH 7,0) gerührt. Das aktivierte Trägermaterial wird anschließend mit Wasser bis zur völligen Entfernung des überschüssigen Glutardialdehyds gewaschen. Dann rührt man das aktivierte Polystyren 3 h mit 0,5 ml einer Zellsuspension der Hefe Yarrowia lipolytica (1 mg HTM/ ml) und 3 ml SÖRENSEK-Phosphatpuffer pH 7,0.0.2 g of polystyrene Wofatit UF 93 (particle diameter 100 to 200 μm) is stirred for 2 hours with aqueous glutaric dialdehyde (2.5% in oil GKEKSEN phosphate buffer pH 7.0). The activated carrier material is then washed with water until complete removal of the excess glutaric dialdehyde. The activated polystyrene is then stirred for 3 hours with 0.5 ml of a cell suspension of the yeast Yarrowia lipolytica (1 mg HTM / ml) and 3 ml of SÖRENSEK phosphate buffer pH 7.0.

Das Polystyren wird erneut mit Wasser gewaschen und sedimentiert.The polystyrene is washed again with water and sedimented.

Der Zell-Träger-Komp.lex wird, wie in Beispiel 3 beschrieben, verwendet.The cell-carrier complex is used as described in Example 3.

Example 3

0, 5 g des Sediments der voriinmobilisierten Hefe Yarrowia lipolytica gemäß Beispiel 1 und 2 werden in 5 ml 2,2%iger CeI-lulosesulfatlösung (Cellulosesulfat mit einem DS von 0,43) suspendiert und möglichst homogen verteilt.0.5 g of the sediment of the pre-immobilized yeast Yarrowia lipolytica according to Examples 1 and 2 are suspended in 5 ml of 2.2% strength CelI sulfate sulfate solution (cellulose sulfate with a DS of 0.43) and distributed as homogeneously as possible.

Dann wird diese Suspension in 50 ml einer Lösung von l,2%igem Polydimeth}Idiallylammoniumchlorid mit einer Molmasse vonThen, this suspension in 50 ml of a solution of l, 2% polydimeth) idiallylammonium chloride having a molecular weight of

40000 unter leichtem Rühren getropft und mindestens 5 min langsam gerührt.40000 added dropwise with gentle stirring and stirred slowly for at least 5 min.

Nach Abtrennung des Fällbads von den gebildeton Mikrokapseln werden diese zweimal mit 50 ml sterilem destillierten Wasser gewascnen.After separating the precipitation bath from the formed microcapsules, they are washed twice with 50 ml of sterile distilled water.

Zur Kultivierung werden 20 g der so erhaltenen Kapseln in einem 500-ml-Fermenter eingesetzt. Hach einer Kultivierungsdauer von 2Λ h ist das Kulturmedium aufgezehrt und das ZeIlwachstum abgeschlossen. Die Zellmasse im Kapselinneren ist. auf eine Konzentration von 15 mg HTii/ml Immobilisat angewachsen. Das Außenmedium ist nichb getrübt, d, h. frei von Hefezellen. Diese Kapseln v/erden in einem kontinuierlichen Fermentationsprozeß zur Produktion von Citronensäure einge-For cultivation, 20 g of the capsules thus obtained are used in a 500 ml fermenter. After culturing for 2 h, the culture medium is eaten and the cell growth is completed. The cell mass in the capsule interior is. grown to a concentration of 15 mg HTii / ml immobilizate. The external medium is not clouded, d, h. free of yeast cells. These capsules are used in a continuous fermentation process for the production of citric acid.

Das erfindungsgemäße Verfahren wurde analog mib Bakterien der Species Pseudomonas aeruginosa ausgeführt.The method according to the invention was carried out analogously to bacteria of the species Pseudomonas aeruginosa.

Example 4

0,2 g Polystyren Wofatit UF 93 (Partikeldurchmesser 5 bis 100 /um) v/erden mit 3 ml 2,5%iger Glutardialdehyd-Lösung in SÖRENSEN-Phosphatpuffer pH 7,0 2 Ii bei Löumtemperatur gerührt. Das aktivierte Trägermaterial wird anschließend mit Wasser bis zur völligen Entfernung des überschüssigen GIutardialoehyds gewaschen. Anschließend wird das aktivierte Polystyren mit 300 U Invertase in 3 ml SÖRENSEN-Phosphatpuffer pH 7,0 4 h bei Raumtemperatur gerührt und danach mit 25 mi! Matriumacetatpuffer pH 5,0/1 M NaCl und 25 mi' N^- triumacetatpuffer pH 5,0 gewaschen, bis kein Protein mehr im Waschwasser nachweisbar ist.0.2 g of polystyrene Wofatit UF 93 (particle diameter 5 to 100 / um) are stirred with 3 ml of 2.5% glutaraldehyde solution in SÖRENSEN phosphate buffer pH 7.0 2 Ii at room temperature. The activated carrier material is then washed with water until complete removal of the excess glutaraldehyde. Subsequently, the activated polystyrene is stirred with 300 U invertase in 3 ml SÖRENSEN phosphate buffer pH 7.0 for 4 h at room temperature and then with 25 ml! Matriumacetatpuffer pH 5.0 / 1 M NaCl and 25 mi 'N - - Triumacetatpuffer pH 5.0 washed until no protein is detectable in the wash water.

Der Invcrtase-Polystyren-Komplex wird, wie in Beispiel 6 beschrieben, verwendet.The Invcrtase-polystyrene complex is used as described in Example 6.

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Example 5

0,2 g Polystyren Wofatit Ul' 93 (Partikeldurchmesser 5 bis 100 ^m) werden mit 800 U Inverhase in 3 ml SÖRENSEN-Phosphatpuffer pH 7,0 4 h bei Raumtemperatur gerührt und anschließend mit 25 mM Natriumacetatpuffer pH 5,0/1 M NaCl und 25 mM Natriumacetatpuffer pH 5,0 gewaschen, bis kein Protein mehr ir.i Waschwasser nachweisbar ist. Der Invertase-Polystyren-Kornplex wird, wie in Beispiel G beschrieben, verwendet.0.2 g of polystyrene Wofatit Ul '93 (particle diameter 5 to 100 ^ m) are stirred with 800 U Inverhase in 3 ml SÖRENSEN phosphate buffer pH 7.0 for 4 h at room temperature and then with 25 mM sodium acetate pH 5.0 / 1 M NaCl and 25 mM sodium acetate buffer pH 5.0 until no more protein is detectable in wash water. The invertase polystyrene complex is used as described in Example G.

Example 6

0,5 g des Sediments der vorimmobilisierten Hefe Yarrowia lipolytica gemäß Beispiel 1 und 2 sowie 0,2 g des Sediments der polystyrengebundenen Invertase gemäß Beispiel 4 und 5 v/erden in 5 ml 2,2^?öiger Celluloscsulfatlösung (Cellulosesulfat mit einem DS von 0,43) suspendiert und möglichst hoino.jen verteilt.0.5 g of the sediment of the pre-immobilized yeast Yarrowia lipolytica according to Example 1 and 2 and 0.2 g of the sediment of the polystyrene-bound invertase according to Example 4 and 5 v / earth in 5 ml of 2.2 ^? oiger Celluloscsulfatlösung (cellulose sulfate with a DS of 0.43) and suspended hoino.jen as possible.

Dann wird diese Suspension in 50 ml einer Lösung von l,2£igem Polydimethyldiallylarnmoniumchlorid mit einer Molmasse von 40000 unter leichtem Rühren getropft und mindestens 5 min langsam gerührt.Then, this suspension is added dropwise in 50 ml of a solution of l, 2 oly Polydimethyldiallylarnmoniumchlorid with a molecular weight of 40,000 with gentle stirring and stirred slowly for at least 5 min.

Nach Abtrennung des Fällbads von den gebildeten Mikrokapseln werden diese zweimal mit 50 ml sterilem destillierten Wasser gewaschen.After separation of the precipitation bath from the microcapsules formed, they are washed twice with 50 ml of sterile distilled water.

Zur Kultivierung werden 20 g der so erhaltenen Kapseln in einem 500-ml-Fermenter eingesetzt, fach einer Kultivierungsdauer von 24 h ist das Kulturmedium aufgezehrt und das Zellwachstum abgeschlossen. Die Zellmasse im Kapselinneren ist auf eine Konzentration von 15 mg HTM/ml Immobilisat angewachsen. Das Außenmedium ist nicht getrübt, d. h. frei von Hefozellcn. Diese Kapseln werden in einem kontinuierlichen Fermentation.sprozeß zur Produktion von Citronensäure mit Saccharose als Substrat eingesetzt.For cultivation, 20 g of the capsules thus obtained are used in a 500 ml fermenter, times a culturing time of 24 h, the culture medium is eaten and cell growth is complete. The cell mass in the capsule interior has grown to a concentration of 15 mg HTM / ml immobilizate. The external medium is not clouded, d. H. free of yeast cells. These capsules are used in a continuous fermentation process for the production of citric acid with sucrose as substrate.

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Example 7

50 rnl einer 2,2%igen Cellulosesulfatlösung (Cellulosesulfat mit einem DS von 0,43) werden 10 min bei 121 C autoklaviert. Dann Dann v/erden 0,5 ml des Sediments gemäß Beispiel 3 bzv/. 6 in 5 ml des autoklavieren Cellulosesulfat^ suspendiert und homogen verteilt. Diese Suspension wird in 50 ml einer Lösung von 0,25 % Polydimethyldiallylammoniumchlorid mit einer Molmasse von 40000 unter leichtem Rühren getropft und mindestens 40 min gerührt. Danach wird das Fällbad 1 : 1 mit Wasser verdünnt. Die Kapseln werden weitere 80 min unter leichtem Rühren im Fällbad bewegt. Nach Abtrennung des Fällbades werden die Kapseln ohne weitere Behandlung sofort dem Kultivierungsprozeß zugeführt, wie es in Beispiel 3 und 6 beschrieben wurde.50 ml of a 2.2% strength cellulose sulfate solution (cellulose sulfate with a DS of 0.43) are autoclaved at 121 ° C. for 10 minutes. Then 0.5 ml of the sediment according to Example 3 is used. 6 suspended in 5 ml of autoclaving cellulose sulfate ^ and distributed homogeneously. This suspension is added dropwise in 50 ml of a solution of 0.25% polydimethyldiallylammonium chloride with a molecular weight of 40,000 with gentle stirring and stirred for at least 40 min. Thereafter, the precipitating bath is diluted 1: 1 with water. The capsules are stirred for a further 80 minutes with gentle stirring in the precipitation bath. After separation of the precipitation bath, the capsules without further treatment are immediately fed to the cultivation process, as described in Example 3 and 6.

Claims

Pa csntan sayings

1. Verfalircn for the immobilization of microorganisms or coimmobilization of microorganisms and enzymes by Vorirnmobilisierung and encapsulation, characterized in that the microorganisms for Vorimrnobilisierung or, the enzyme / enzymes and immobilized microorganisms are bound separately to a support material, then the sedimcntierten and separated preimmobilizates are suspended in an aqueous solution of cellulose sulfate, the suspension is dripped into an aqueous Polydimethyldiallylammoniumchlorid-Lösunq, and the resulting immobilized or complex immobilized (co-immobilized) biocatalysts in a known Vseise separated and in a for the cultivation of immobilized or coimmobilisierten biocatalysts suitable environment are introduced.

2. The method according to claim 1, characterized in that the enzyme / enzymes adsorptively or covalently on a carrier material in an aqueous solution at pH values between 3.5 and 8, at temperatures of 277 K to the stability limit of the enzymes and at a reaction time bound from 30 minutes to 24 hours.

3. The method according to claim 1 and 2, characterized in that for covalent bonding of the enzymes to the support material preferably glutaric dialdehyde is used as a coupling reagent.

4. The method according to claim 1 to 3, characterized in that the concentration of glutaric dialdehyde is 0.1 to 10%, preferably 2.5 % .

5. The method according to claim 1, characterized in that the immobilized microorganisms for pre-immobilization adsorbed to a support material using a physiologically compatible medium bound v / earth.

6. The method according to claim 1, characterized in that the Vorirnmobilisierung the microorganisms by kovalento binding to a carrier material.

7. The method according to claim 1 and 6, characterized in that for the covalent bonding of the microorganisms to a support material preferably glutaric dialdehyde is used in a physiologically compatible medium.

8. The method of claim 1, 6 and 7, characterized in that the concentration of glutaric dialdehyde for Vorimmobilisierung of microorganisms is 0.1 to 5%.

9. The method of claim 1 and 5 to 8, characterized in that the temperature during the Vorimmobilisierungsprozesses the microorganisms of 277 K to the stability limit of the immobilized microorganisms.

10. The method according to claim 1 to 9, characterized in that preferably an insoluble carrier material is used.

11. The method according to claim 1 to 10, characterized in that is preferably used as insoluble support material Aminornethylethylpolystyrene.

12. The method according to claim 1 to 11, characterized in that the particle diameter of the polystyrene beads of 5 to 200 pm. enough.

13. The method according to claim 1, characterized in that a concentration of Cellulosesulfats in the encapsulation of Vorimmobilisate of 5 to 100 g / 1 is used.

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14. The method according to claim 1 and 13, characterized in that a concentration of Polydimethyldiallylainmoniurnchlorids between 5 and 100 g / l is used for the encapsulation of Vorimmobilisate.

15. The method of claim 1, 13 and 14, characterized in that the temperature in the encapsulation of Vorimmobilisate of -273 K to the stability limit of encapsulated Vorimmobilisate ranges.

16. The method according to claim 1 and 13 to 15, characterized in that the Verwllzeit the immobilized microorganisms in the polydimethyldiallylammonium chloride solution is selected from 30 seconds to 12 hours.