DD285369A5

DD285369A5 - PROCESS FOR IMMOBILIZING MICROORGANISMS OR COIMMOBILIZATION OF MICROORGANISMS AND ENZYMES

Info

Publication number: DD285369A5
Application number: DD33008489A
Authority: DD
Inventors: Horst Dautzenberg; Michael Foerster; Torsten Hoffmann; Alfred Schellenberger; Klaus-Peter Doepfer; Johanna Mansfeld; Gabriele Holzapfel; Brigitte Tiersch; Wolfgang Wagenknecht; Brigitte Lukanoff; Helmut Kluge; Joachim Roembach
Original assignee: Univ Halle Wittenberg
Priority date: 1989-06-29
Filing date: 1989-06-29
Publication date: 1990-12-12

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Immobilisierung von Mikroorganismen bzw. Coimmobilisierung von Mikroorganismen und Enzymen, das sehr stabile Biokatalysatoren liefert, die auch in Langzeitverfahren und stoffwandelnden Prozessen in der Biotechnologie, chemischen, pharmazeutischen und Lebensmittelindustrie sowie in der Medizin eingesetzt werden koennen. Die Mikroorganismen werden zunaechst durch Einschlusz in Netzwerke aus Polyelektrolytkomplexen vorimmobilisiert. Im Falle der Coimmobilisierung von Mikroorganismen und Enzymen werden die Enzyme an ein Traegermaterial gebunden und die Mikroorganismen und traegergebundenen Enzyme zur Vorimmobilisierung in Netzwerke aus Polyelektrolytkomplexen eingeschlossen. Nach Separation und Sedimentation der vorimmobilisierten Mikroorganismen bzw. Mikroorganismen und traegergebundenen Enzyme im Falle der Coimmobilisierung von Mikroorganismen und Enzymen werden diese in Mikrokapseln eingeschlossen und nach UEberfuehrung in ein fuer die Zuechtung der immobilisierten bzw. coimmobilisierten Biokatalysatoren geeignetes Milieu der gewuenschten Verwendung zugefuehrt.{Immobilisierung von Mikroorganismen; Coimmobilisierung von Mikroorganismen und Enzymen; Vorimmobilisierung; Einkapselung; Polyelektrolytkomplexe; Stoffwandlung}The invention relates to a process for the immobilization of microorganisms or coimmobilization of microorganisms and enzymes, which provides very stable biocatalysts, which can also be used in long-term processes and material-converting processes in biotechnology, chemical, pharmaceutical and food industries and in medicine. The microorganisms are first preimmobilized by inclusion in networks of polyelectrolyte complexes. In the case of coimmobilization of microorganisms and enzymes, the enzymes are bound to a carrier material and the microorganisms and carrier-bound enzymes are incorporated into networks of polyelectrolyte complexes for preimmobilization. After separation and sedimentation of the pre-immobilized microorganisms or microorganisms and carrier-bound enzymes in the case of coimmobilization of microorganisms and enzymes, these are enclosed in microcapsules and, after conversion to a suitable environment for the growth of the immobilized or coimmobilized biocatalysts, the desired use is achieved {immobilization of microorganisms; Coimmobilization of microorganisms and enzymes; Vorimmobilisierung; encapsulation; polyelectrolyte complexes; Material conversion}

Description

Fields of application of the invention

Die Erfindung betrifft ein Verfahmn zur Immobilisierung von Mikroorganismen bzw. Coimmobilisierung von Mikroorganismen und Enzymen zur Herstellung von Biokatalysatoren, die zur Durchführung stoffwandelnder Prozesse in der Biotechnologie, in der pharmazeutischen, chemischen und Lebensmittelindustrie sowie für den Einsatz in der Medizin geeignet sind. Sie finden z. B. Verwendung für die Biosynthese von Medikamenten, hochwertigen Chemikalien, Enzymen usw.The invention relates to a Verfahmn for immobilization of microorganisms or coimmobilization of microorganisms and enzymes for the production of biocatalysts, which are suitable for carrying out stoffwandelnder processes in biotechnology, in the pharmaceutical, chemical and food industries and for use in medicine. You will find z. B. Use for the biosynthesis of drugs, high quality chemicals, enzymes, etc.

Characteristic of the known state of the art

Zur Durchführung biochemischer Reaktionen in der Biotechnologie, pharmazeutischen, chemischen und Lebensmittelindustrie werden verstärkt Mikroorganismen eingesetzt. In zunehmendem Maße werden die Mikroorganismen in immobilisierter Form verwendet, um den Einsatz derselben ökonomisch und effektiv zu gestalten. Mit Hilfe der Immobilisierung wird eine Erhöhung der mikrobiellen Produktivität im Verhältnis zum Reaktorvolumen, eine leichtere Abtrennbarkeit des Biokatalysators vom Produkt und damit eine wesentliche Senkung des Aufwandes zur Isolierung der gewünschten Produkte ermöglicht. Zur Immobilisierung von Mikroorganismen ist eine Reihe von Methoden beschrieben worden, wie z.B. der Einschluß in Netzwerke und in Schaumstoffe, die Fixierung an porösen Trägermaterialien und die Verkapselung. Daneben sind einige Methoden und Materialien in Kombination getestet worden.To carry out biochemical reactions in the biotechnology, pharmaceutical, chemical and food industries, microorganisms are increasingly used. Increasingly, the microorganisms are used in immobilized form to make their use economical and effective. With the help of immobilization, an increase in the microbial productivity in relation to the reactor volume, an easier separability of the biocatalyst from the product and thus a significant reduction in the effort to isolate the desired products possible. For the immobilization of microorganisms a number of methods have been described, e.g. inclusion in networks and in foams, attachment to porous substrates and encapsulation. In addition, some methods and materials have been tested in combination.

Beim Einschluß in Netzwerke aus Gelen ist neben einer relativ geringen mechanischen Festigkeit häufig ein Auswaschen der Zellen aus den Gelen zu beobachten (Stöcklein, Eisgruber, Schmidt, Biotechnol. Lett. 5[1O], 703 [1983]). Um die Gefahr des Auswachsens von Zellen in das Medium herabzusetzen und daraus resultierende Störungen des Prozesses zu vermeiden, wird in DE OS 3432932 ein Verfahren beschrieben, das das Auswachsen von Zellen auch bei Langzeitversuchen sicher verhindern soll. Diese Aufgabe wird dadurch gelöst, daß die Oberfläche des Biokatalysators durch eine zellenfreie Schutzschicht aus einem vernetzten, keine Durchlässigkeit für die Zellen aufweisenden den zollenhaitigen Kern umschließenden Gel gebildet wird. Dieses Verfahren liefert Gelkörpor, die im allgemeinen eine begrenzte mechanische Haltbarkeit aufweisen. Für den beschriebenen Verwendungszweck, die Sektherstellung, ist jedoch die mechanische Festigkeit von untergeordneter Bedeutung, da der Biokatalysator nicht stark beansprucht wird, in anderen stoffwandelnden Prozessen spielt die mechanische Festigkeit eine bedeutende Rolle.When included in gels networks, in addition to a relatively low mechanical strength, washing out of the cells from the gels is frequently observed (Stöcklein, Eisgruber, Schmidt, Biotechnol. Lett. 5 [10], 703 [1983]). In order to reduce the risk of the outgrowth of cells in the medium and to avoid resulting disturbances of the process, a method is described in DE OS 3432932, which is intended to prevent the outgrowth of cells, even in long-term trials. This object is achieved in that the surface of the biocatalyst is formed by a cell-free protective layer of a crosslinked, no permeability to the cells having the zollenhaitigen core enclosing gel. This process provides gel bodies which generally have limited mechanical durability. However, for the described purpose, the sparkling, the mechanical strength is of minor importance, since the biocatalyst is not heavily stressed, in other material-converting processes, the mechanical strength plays an important role.

In dieser Patentschrift wird zudem festgestellt, daß sich das Verfahren der Mikrokapselung für die Immobilisierung von Zellen nicht eignet aufgrund der Toxizität der zu verwendenden Lösungsmittel und der daraus resultierenden geringen Katalysatoraktivität, und daß auch bei dieser Methode das Auswachsen von Zellen nicht sicher verhindert werden kann. Von Mosbach (Phil. Trans. R. Soc. Lond. B300,355 [1983]) wird ebenfalls festgestellt, daß bei der Einkapselung von Mikroorganismen im Vergleich zum Einschluß in Netzwerken die Anzahl Zellen, die ins Medium wachsen können, weiter reduziert ist, dsß aber dennoch die in die Membran inkorporierten Zellen Biomasse nach außen abgeben können. In DE-OS 3012233 wird ein Verfahren zur Immobilisierung von chemisch oder biologisch aktiven Stoffen, lebendem Gewebe und Einzelzellen beschrieben, bei dem zunächst die Materialien in einem Gel eingeschlossen und anschließend die sauren Gruppen an der Oberfläche der Gelmatrix mit einem aminogruppenhaltigtin Polymer umgesetzt werden, so daß sich eine Membran ausbildet. Als nachteilig sind die geringe Widerstandsfähigkeit der so gebildeten Membran gegenüber proteolytischem Angriff anzusehen, die eine begrenzte Lebensdauer der Kapseln bedingt, und die Anwesenheit einer großen Anzahl freier Aminogruppen an der Oberfläche, die neben der Verklumpungsgefahr der Kapseln bei Einsatz anionischer Substrate zu einer Akkumulation derselben an der Oberfläche führt.This patent also states that the method of microencapsulation is not suitable for the immobilization of cells due to the toxicity of the solvents to be used and the resulting low catalyst activity, and that also in this method the outgrowth of cells can not be reliably prevented. Mosbach (Phil. Trans. R. Soc. Lond., B300, 355 [1983]) also notes that in the encapsulation of microorganisms, as compared to inclusion in networks, the number of cells that can grow into the medium is further reduced, However, the cells incorporated in the membrane can still deliver biomass to the outside. DE-OS 3012233 describes a process for the immobilization of chemically or biologically active substances, living tissue and single cells, in which first the materials are enclosed in a gel and then the acidic groups on the surface of the gel matrix are reacted with an amino group-containing polymer, thus that forms a membrane. A disadvantage are the low resistance of the membrane thus formed to proteolytic attack, which requires a limited life of the capsules, and the presence of a large number of free amino groups on the surface, in addition to the risk of clumping of the capsules when using anionic substrates to an accumulation of the same the surface leads.

In den letzten Jahren wurden in zunehmendem Maße Mikroorganismen verschiedener Species und/oder Enzyme zusammen immobilisiert (Coimmobilisierung), nachdem anfangs jeweils nur ein bestimmter Mikroorganismus bzw. ein bestimmtes Enzym an oder in einer Matrix immobilisiert worden war, von denen einige in einer weiterentwickelten Form zusammen in einem Reaktor eingesetzt wurden. Die Coimmobilisierung von Mikroorganismen und Enzymen ermöglicht es, den Einsatzbereich immobilisierter Mikroorganismen zu verbreitern, indem andere, normalerweise nicht durch den betrachteten Mikroorganismus verwertete Substrate mit Hilfe der coimmobilisierten Enzyme in eine Form überführt werden, die vom betreffenden Mikroorganismus umgesetzt werden kann. Bei Auswahl einer geeigneten Sequenz von Enzymen können auf diese Weise mehrstufige Reaktionen katalysiert werden.In recent years, microorganisms of various species and / or enzymes have been increasingly immobilized together (coimmobilization), after initially immobilizing only one particular microorganism or enzyme at or in a matrix, some of which are combined in a more advanced form were used in a reactor. The coimmobilization of microorganisms and enzymes makes it possible to broaden the field of use of immobilized microorganisms by converting other substrates, which are not normally utilized by the microorganism under consideration, into a form which can be reacted by the microorganism concerned with the aid of the coimmobilized enzymes. By selecting an appropriate sequence of enzymes, multi-step reactions can be catalyzed in this way.

Nach einem Wfahren von B. Hägerdal und K. Mosbach (US 4,524,137) zur Coimmobilisierung von Mikroorganismen und Enzymen wird das Enzym kovalent an das Trägermaterial gebunden, das zum Einschluß der Mikroorganismen dient. Als nachteilig sind bei dieser Methode die relativ geringe mechanische Festigkeit der Gelperlen und das Problem 'ies Auswachsens von Zellen aus den Gelen beim Einsatz in Langzeitversuchen anzusehen.After a trial of B. Hägerdal and K. Mosbach (US 4,524,137) for coimmobilization of microorganisms and enzymes, the enzyme is covalently bound to the support material, which serves to enclose the microorganisms. Disadvantages of this method are the relatively low mechanical strength of the gel beads and the problem of the outgrowth of cells from the gels when used in long-term experiments.

In EP 0041610 wird von C. H. Boehringer Sohn, Ingelheim die Bindung des Enzyms an Hefezellen vorgeschlagen. Diese Methode ist jedoch nicht bei allen Mikroorganismen-Species anwendbar, da die meisten Mikroorganismen durch die Immobilisierungsprozedur des Enzyms inaktiviert werden. Darübor hinaus wird die Größe der Zellen nicht wesentlich verändert, so daß dio Rückhaltung des Coimmobilisats in kontinuierlichen Farmentationsprozessen sehr schwierig ist. Von W. Hartmeier und A. Heinrichs wird in DE 3534983 ein Verfahren zur Coimmobilisierung von Mikroorganismen und Enzymen beschrieben, bei dem die Mikroorganismen und Enzyme zugleich in einer polymeren Matrix eingeschlossen werden, die in situ mit einer entgegengesetzt geladenen, semipermeable η Membran überzogen wird. Bei diesem Verfahren wird die Anzahl Zellen, die bei Langzeitfermentationen ins Medium auswichsen können, gegenüber dem alleinigen Einschluß in ein Gelnetzwerk reduziert. Es kann aber dennoch nicht verhindert warden, daß beim Eintropfen der Mikroorganismen/Enzym/ Alginatlösung in die Calciumchlorid/Methacrylat/Acrylat-Copolymer-Lösung Mikroorganismen in die Membran inkorporijrt werden, die Ursache für das Auswachsen von Mikroorganismen ins Außenmedium sein können. Bei den an dieser Stelle dargestellten Methoden zur Immobilisierung von Mikroorganismen bzw. Mikroorganismen und Enzymen ist festzustellen, daß sie im FaSIe des Geleinschlusses von vornherein eine geringe mechanische Festigkeit besitzen und daß bei den bekannten Verfahren zur Einkapselung von Mikroorganismen bzw. Mikroorganismen und Enzymen dieselben in die Kapselmembran inkorporiert werden und durch Wachstums- und Zellteilungsvorgänge der vitalen Objekte eine beträchtliche Verminderung der Kapselfestigkeit verursacht wird.In EP 0041610 the binding of the enzyme to yeast cells is proposed by C.H. Boehringer Sohn, Ingelheim. However, this method is not applicable to all microorganism species, since most microorganisms are inactivated by the immobilization procedure of the enzyme. Darübor addition, the size of the cells is not changed significantly, so that the retention of the Coimmobilisats in continuous Farmentationsprozessen is very difficult. In DE 3534983, W. Hartmeier and A. Heinrichs describe a process for the coimmobilization of microorganisms and enzymes, in which the microorganisms and enzymes are simultaneously enclosed in a polymeric matrix which is coated in situ with an oppositely charged, semipermeable η membrane. In this method, the number of cells that can dodge into the medium during long-term fermentations is reduced compared to the sole inclusion in a gel network. However, it can not be prevented that microorganisms are incorporated in the membrane when dropping the microorganisms / enzyme / alginate solution into the calcium chloride / methacrylate / acrylate copolymer solution, which may be the cause of the outgrowth of microorganisms in the outer medium. In the methods described here for the immobilization of microorganisms or microorganisms and enzymes is to be noted that they have in the Fasein gel inclusion from the outset a low mechanical strength and that in the known methods for the encapsulation of microorganisms or microorganisms and enzymes the same in the Capsule membrane are incorporated and caused by growth and cell division processes of vital objects, a significant reduction in capsule strength.

Object of the invention

Ziel der Erfindung sind stabile enkapsulierte Biokatalysatoren, deren Stabilität auch im Falle der Einkapselung proliferierender Systeme nicht durch Wachstums- und Zellteüungsvorgänge derselben herabgesetzt wird und die in biotechnologischen Verfahren eingesetzt werden können.The aim of the invention are stable encapsulated biocatalysts whose stability, even in the case of the encapsulation of proliferating systems, is not diminished by growth and cell partitioning processes of the same and which can be used in biotechnological processes.

Explanation of the essence of the invention The invention is based on the object, a method for producing immobilized or co-immobilized biocatalysts

mit hoher Operationsstabilität auf dem Wege der Enkapsulierung von Mikroorganismen oder Mikroorganismen und Enzymen zufinden, das den Einbau der zu immobilisierenden Biokatalysatoren -n die Kapselwand verhindert und Kapseln mit hoherwith high operational stability through the encapsulation of microorganisms or microorganisms and enzymes, which prevents the incorporation of the immobilized biocatalysts -n the capsule wall and capsules with high

Membrane fatigue generated. According to the invention this is achieved in that the enzyme / enzymes in the case of coimmobilization of microorganisms

und Enzymen an ein Trägermaterial gebunden werden, die zu immobilisierenden Mikroorganismen, beispielsweise Hefen undand enzymes are bound to a carrier material to be immobilized microorganisms, such as yeasts and

Bacteria, or microorganisms and carrier-bound enzymes for preimmobilization into a network formed from Embedded polyelectrolyte complexes, then the sedimented and separated gel particles (Vorimmobilisate)

in einer wäßrigen Lösung aus Cellulosesulfat suspendiert werden, die Suspension in eine wäßrigeare suspended in an aqueous solution of cellulose sulfate, the suspension in an aqueous

Polydimethyldiallylammonium chloride solution is added dropwise, and the immobilized or coimmobilisiert Biocatalysts after completion of the encapsulation process in a known manner and separated into a for the cultivation of the Microorganisms suitable environment are introduced. In the case of coimmobilization of microorganisms and enzymes, the binding of the enzyme (s) either occurs

adsorptiv oder kovalent an einem Trägermaterial, das vorzugsweise ein unlösliches Material darstellt, in einer wäßrigen Lösungbei pH-Werten zwischen 3,5 und 8, bei Temperaturen von 277 K bis zur Stabilitätgrenze der Enzyme und bei einer Reaktionsdauorvon 30min bis 24 Stunden. Als Kupplungsreagens wird vorzugsweise Glutardialdehyd mit einer Konzentration zwischen 0,1 bis10%, vorzugsweise jedoch 2,5%. Als unlöslichesTrägermaterial werden vorzugsweise aminogruppenhaltigePolystyrenderivatemit einem Partikeldurchmesser von 5 bis 200pm veiwendet.adsorptive or covalent on a support material, which is preferably an insoluble material, in an aqueous solution at pH's between 3.5 and 8, at temperatures of 277K to the stability limit of the enzymes and at a reaction time of 30min to 24 hours. The coupling reagent is preferably glutaraldehyde having a concentration between 0.1 to 10%, but preferably 2.5%. As the insoluble carrier material, amino group-containing polystyrene derivatives having a particle diameter of 5 to 200 μm are preferably used.

For preimmobilization, the microorganisms or microorganisms and carrier-bound enzymes become part of a network

aus Polyelektrolytkomplexen, das vorzugsweise durch Eintropfen einer Polydimethyldiallylammoniumchlorid-Lösung in eineof polyelectrolyte complexes, preferably by dropping a polydimethyldiallylammonium chloride solution into a

Suspension consisting of microorganisms or microorganisms and carrier-bound enzymes and cellulose sulphate Solution is made up to the isoionic point, included. The concentration of cellulose sulfate solution is between 0.5 and 10g / l, the concentration of Polydimethyldiallylammonium chloride solution also between 0.5 and 10 g / l for the preparation of Vorimmo'iilisate. The temperature during the pre-immobilization process is between 273 K and the stability limit of

immobilisierenden Biokatalysatoren gewählt.immobilizing biocatalysts selected.

The cellulose sulphate concentration for the encapsulation of the preimmobilisates is between 5 and 100 g / l, the concentration Polydimethyldiallylammonium chloride solution also between 5 and 100g / l. The temperature in the subsequent encapsulation of the sedimented and separated Vorimmobilisate is also

zwischen 273 K und der Stabilitätsgrenze der zu immobilisierenden Biokatalysatoren gewählt.between 273 K and the stability limit of the biocatalysts to be immobilized.

The residence time of the immobilized microorganisms or microorganisms and enzymes is between 30 seconds and

12 Stunden. Nach Abtrennung der erfindungsgemäß hergestellen immobilisierten bzw. coimmobilisierten Biokatalysatoren vonder Polydimethyldiallylammoniumchlorid-Lösung werden diese in ein für die Züchtung der immobilisierton Biokatalysatorengeeignetes Milieu überführt und anschließend der gewünschten Verwendung zugeführt. Somit liefert das erfindungsgemäße12 hours. After separation of the immobilized or coimmobilized biocatalysts according to the invention from the polydimethyldiallylammonium chloride solution, these are converted into an environment suitable for cultivating the immobilized biocatalysts and then fed to the desired use. Thus, the invention provides

Process immobilized biocatalysts, which are characterized by a high vitality, activity and operational stability, the

auch im Falle der Einkapselung vitaler, proliferiondor Systeme bei Langzeitversuchen nicht durch Wachstums- undeven in the case of encapsulation vital, proliferiondor systems in long-term trials not by growth and

Zellteüungsvorgänge same or washing is reduced. The binding of the enzyme (s) protects it Degradation processes and inactivation. The pre-immobilization ensures that no microorganisms or carrier-bound Enzymes are incorporated into the capsule wall and froi the surface of the immobilized biocatalyst Microorganisms and carrier-bound enzymes. Thus, the risk of outgrowth of microorganisms in the Culture medium that can not be prevented by the inclusion of microorganisms in gel networks and disorders of the Process leads, excluded. Another advantage is the increased mechanical stability of the biocatalysts

der von Gelnetzwerken.that of gel networks.

In the case of coimmobilization of invertase and Yarrowia lipolytica cells it becomes possible. Sucrose as substrate

einzusetzen, die normalerweise nicht von diesen Zellen verwertet werden kann, jedoch ein w sentlich preiswerteres Substrat alsdas eigentliche Substrat Glucose darstellt.which can not normally be utilized by these cells, but is a considerably cheaper substrate than the actual substrate glucose.

The process according to the invention will be explained by means of the following examples. embodiments example 1

1,2ml einer 2,4%igen Cellulosesulfat-Lösung (Cellulosesulfat mit einem DS von 0,43) werden in 10ml einer Zellsuspension der1.2 ml of a 2.4% strength cellulose sulfate solution (cellulose sulfate with a DS of 0.43) are dissolved in 10 ml of a cell suspension of

Yarrowia lipolytica yeast evenly distributed with a content of 1 mg HTM / ml. 3 ml of a 0.25% solution of Polydimethyldiallyiammonium chloride with a molecular weight of 40000 dripped. The suspension is stirred vigorously for 1.5 minutes and

anschließend mit 13ml ste/ilem Wasser verdünnt. Dann läßt man die entstehenden Polysalze, in deren Geflecht diethen diluted with 13 ml of sterile water. Then you leave the resulting polysalts, in their braid the

Microorganisms are fixed, sediment and used the sediment as described in Example 2. Example 2

0,5ml des Sediments der vorimmobilisierten Hefe Yarrowia lipolytica gemäß Beispiel 1 werden in 5ml, 2,2%iger0.5 ml of the sediment of preimmobilized yeast Yarrowia lipolytica according to Example 1 are in 5ml, 2.2%

Cellulosesulfallösung (cellulose sulfate with a DS of 0.43) and suspended as homogeneously distributed. Then diene suspension in 50ml of a solution of 1.2% polydimethyldiallylammonium chloride having a molecular weight of

40000 unter Ie ichtem Rühren getropft und mindestens 5 min langsam gerührt.40000 added dropwise with gentle stirring and stirred slowly for at least 5 min.

After separating the precipitation bath from the formed microcapsules, they are washed twice with 50 ml of sterile distilled water

gewaschen.washed.

For cultivation, 20 g of the capsules thus obtained are used in a 500 ml fermenter. After a cultivation period

von 24h ist das Kulturmedium aufgezehrt und das Zellwachstum abgeschlossen. Die Zellmasse im Kapselinneren ist auf einefrom 24 h the culture medium is consumed and cell growth is complete. The cell mass in the capsule interior is on one

Concentration of 15mg HTM / ml of immobilisate increased. The external medium is not clouded, d. H. free of yeast cells. These Capsules were used in a continuous fermentation process to produce citric acid. The erfindunijsgemäße method was carried out analogously with bacteria of the species Pseudomonas aeruginosa. Example 3

0,2g Polystyren Wofatit UF93 (Partikeldurchmeaserö bis 100pm) werden mit 3ml 2,5%igerGlutardialdehyd-Lösung in0.2 g of polystyrene Wofatit UF93 (particle diameter until 100 pm) are mixed with 3 ml of 2.5% glutaraldehyde solution in

SÖRENSEN phosphate buffer pH 7.0 stirred for 2 h at room temperature. The activated carrier material is subsequently mixed with Water until complete removal de =; washed excess Qlutardialdehyds. Subsequently, the activated Polystyrene with 800 U invertase in 3 ml SÖRENSEN phosphate buffer pH 7.0 for 4 h at room temperature and then stirred with

25mM Natriumacetatpuffer pH 5,0/1 M NaCI und 25mM Natriumacetatpuffer pH 5,0 gewaschen, bis kein Protein mehr im25mM sodium acetate buffer pH 5.0 / 1M NaCl and 25mM sodium acetate buffer pH 5.0 until no more protein in the

Washing water was detectable. The Invertas'3-polystyrene complex is used as described in Examples 5 and 6. Example 4

0,2g Polystyren Wofatit UF93 (Partikeldurchmesser 5 bis 100pm) werden mit 800 U Invertase in 3 ml SÖRENSEN-PhosphatpufferpH 7,0 4hbai Raumtemperatur gerührt und anschließend mit 25mM Natriumacetatpuffer pH5,0/1 M NaCI und25mM0.2 g of polystyrene Wofatit UF93 (particle diameter 5 to 100 pm) are stirred with 800 U invertase in 3 ml of SÖRENSEN phosphate buffer pH 7. 4 h at room temperature and then with 25 mM sodium acetate buffer pH 5.0 / 1 M NaCl and 25 mM

Sodium acetate buffer pH 5.0 until no more protein was detectable in the wash water. The invertase polystyrene complex is used as described in Examples 5 and 6. Example 5

15ml einer (i,25%igen Cellulosesulfat-Lösung (Cellulosesulfat mit einem DS von 0,43) werden mit 7ml einer Zellsuspension der Hefe Yarrowia lipolytica mit einem Gehalt von 1 mg HTM/ml und 3 ml Invertase-Polystyren-Komplex vermischt. Zu dieser Suspension wird langsam unter leichtem Rühren eine 0,25%ige Lösung von Polydimethyldiallylammoniumchlorid mit einer Molmasse von 40000 eingetropft, bis der isoionische Punkt erreicht ist, der durch Ausflockung der Cofällung sichtbar wird. Die entstandeni) Suspension wird 1,5min stark gerührt und anschließend mit 13ml sterilem Wasser verdünnt. Dann läßt man die entstehenden Polysalze, in deren Geflecht die Mikroorganismen und der Invertase-Polystyren-Komplex fixiert sind, sedimentiei en und verwendet das Sediment, wie in Beispiel 6 beschrieben.15 ml of a 1.25% cellulose sulfate solution (cellulose sulfate with a DS of 0.43) are mixed with 7 ml of a cell suspension of the Yarrowia lipolytica yeast containing 1 mg HTM / ml and 3 ml of invertase-polystyrene complex With gentle stirring, a solution of polydimethyldiallylammonium chloride with a molecular weight of 40,000 is slowly added dropwise to this suspension until the isoionic point is reached, which is visible by flocculation of the coprecipitate.The suspension formed is stirred vigorously for 1.5 minutes and then diluted with 13ml of sterile water. Then the resulting polysalts, in whose network the microorganisms and the invertase-polystyrene complex are fixed, sedimentiei en and uses the sediment, as described in Example 6.

Example 6

0,5ml des Sediments der zusammen mit Invertase-Polystyren-Komplex vorimmobilisierten Hefe Yarrowia lipolytica gemäß0.5 ml of the sediment of yeast Yarrowia lipolytica pre-immobilized with invertase-polystyrene complex according to

Example 5 are suspended in 5 ml of 2.2% strength cellulose sulfate solution (cellulose sulfate with a DS of 0.43) and if possible

homogen verteilt.distributed homogeneously.

Then this suspension is dissolved in 50 ml of a solution of 1.2% polydimethyldiellylammonium chloride with a molecular weight of

40000 untc r leichtem Rühren getropft und mindestens 5min langsam gerührt.40000 dropwise with gentle stirring and stirred slowly for at least 5 min.

After removal of the precipitation bath from the microcapsules formed, they are washed twice with 50 ml of sterile distilled water

gewaschen.washed.

von 24h ist das Kulturmedium aufgezehrt und das Zellwachstum abgeschlossen. Dio Zellmasse im Kapselinneren ist auf einefrom 24 h the culture medium is consumed and cell growth is complete. Dio cell mass in the capsule interior is on one

Concentration of 15mg HTM / ml of immobilisate increased. The external medium is not clouded, d. H. free of yeast cells. These capsules are in a continuous Fermentation process used for the production of citric acid Example 7

50ml einer 2,2%iqen Cellulosesulfatlösung (Cellulosesulfat mit einem DS von 0,43) werden 10min bei 121"C autoklaviert. Dann werden 0,5ml des Sediments gemäß Beispiel 1 bzw. 6 in 5ml des autoklavieren Cellulosesulfats suspendiert und homogen verteilt. Diese Suspension wird in 50ml einer Lösung von 0,25% Polydimethyldiallylammoniumchlorid mit einer Molmasse von 40000 unter leichtem Rühren getropft und mindestens 40 min gerührt. Danach wird das Fällbad 1:1 mit Wasser verdünnt. Die Kapseln werden weitere 80min unter leichtem Rühren im Fällbad bewegt. Nach Abtrennung des Fällbades werden die Kapseln ohne weitere Behandlung sofort dem Kultivierungsprozeß zugeführt, wie es in Beispiel 2 und 6 beschrieben wurde.50 ml of a 2.2% strength cellulose sulfate solution (cellulose sulfate with a DS of 0.43) are autoclaved for 10 minutes at 121 ° C. Then 0.5 ml of the sediment according to Example 1 or 6 are suspended in 5 ml of the autoclave cellulose sulfate and homogeneously distributed The suspension is added dropwise in 50 ml of a solution of 0.25% polydimethyldiallylammonium chloride having a molecular weight of 40,000 with gentle stirring and stirred for at least 40 minutes, after which the precipitating bath is diluted 1: 1 with water. After separation of the precipitation bath, the capsules without further treatment are immediately fed to the cultivation process, as described in Example 2 and 6.

Claims

1. A method for the immobilization of microorganisms or coimmobilization of microorganisms and enzymes by preimmobilization and encapsulation, characterized in that the microorganisms or the microorganisms and the enzyme / enzymes which have been bound to a support material for preimmobilization in a network at s Embedded polyelectrolyte complexes, then the sedimented and separated gel particles (Vorimmobilisate) are suspended in an aqueous solution of cellulose sulfate, the suspension is dripped into an aqueous polydimethyldiallylammonium chloride solution, and the immobilized microorganisms or the obtained complex (co-immobilized) biocatalysts separated in a known manner be introduced into a suitable environment for breeding the immobilized or coimmobilized biocatalyst environment.

2. The method according to claim 1, characterized in that the enzyme / enzymes adsorptively or covalently on a support material in an aqueous solution at pH values between 3.5 and 8, at temperatures of 227 K to the stability limit of the enzymes and in a Reaction time of 30min to 24 hours are bound.

3. The method according to claim 1 and 2, characterized in that for covalent bonding of the enzymes to the support material preferably glutaric dialdehyde is used as a coupling reagent.

4. The method according to claim 1 to 3, characterized in that the concentration of glutaric dialdehyde 0.1 to 10%, preferably 2.5%.

5. The method according to claim 1 to 4, characterized in that preferably an insoluble carrier material is used for binding of the enzymes.

6. The method according to claim 1 to 5, characterized in that is preferably used as the insoluble support material Aminomethylpolystyren.

7. The method according to claim 1 to 6, characterized in that the particle diameter of the polystyrene beads of 5 to 200 microns is selected.

8. The method according to claim 1, characterized in that the microorganisms or the microorganisms and carrier-bound enzymes for preimmobilization in a network of polyelectrolyte complexes, preferably by dropping a Poiydimethyldiallylammoniumchlorid solution into a suspension of microorganisms or microorganisms and carrier-bound enzymes and microorganisms in a cellulose sulfate solution is prepared.

9. The method according to claim 1 and 8, characterized in that the concentration of Cellulosesulfats for the preparation of Vorimmobilisate 0.5 to lOg / l.

10. The method according to claim 1,8 and 9, characterized in that the concentration of Polydimethyldiallylammoniumchlorid solution for the preparation of Vorimmobilisate 0.5 to 10 g / l.

11. The method according to claim 1 and 8 to 10, characterized in that the temperature during the Vorimmobilisierungsprozesses of 273 K to the stability limit of the immobilized microorganisms or microorganisms and carrier-bound enzymes ranges.

12. The method according to claim 1, characterized in that for the encapsulation of Vorimmobilisate a concentration of the cellulose sulfate of 5 to 100g / l is used.

13. The method according to claim 1 and 12, characterized in that a concentration of Polydimethylallylammoniumchlorids between 5 and 100g / l is used for encapsulation of Vorimmobilisate.

14. The method of claim 1,12 and 13, characterized in that the temperature in the encapsulation of Vorimmobilisate of 273K to the stability limit encapsulates the microorganisms or microorganisms and carrier-bound enzymes.

15. The method according to claim 1 and 12 to 14, characterized in that the Verweiizeit the immobilized or coimmobilisierten biocatalysts in the polydimethyldiallylammoniumchiorid solution is selected from 30 seconds to 12 hours.