DD282297A5 - Diagnosemittel und seine verwendung - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Diagnosemittel und seine Verwendung zum einfachen und schnellen immunchemischen Nachweis von Analyten mit antigenen Eigenschaften bestehend aus einem Rezeptor, der an einer flaechigen, festen Phase immobilisiert, trocken vorliegt und mindestens zwei weiteren Reaktanten, die in raeumlich getrennten Elementen trocken und nicht immobilisiert vorliegen. Das erfindungsgemaesze Diagnosemittel ist insbesondere zum Nachweis von Krankheitserregern anwendbar.{Diagnosemittel, trocken, immunchemisch; Immobilisierung; Antigene; Antikoerper; Flaechentraeger; Schnellnachweis; Krankheitserreger}

Description

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Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Diagnosemittel und seine Verwendung für die qualitative, immunchemische Diagnose von Analyten mit antigenen Eigenschaften, insbesondere Viren, Bakterien und Pilzen. Die Erfindung wird in der Landwirtschaft und der Medizin angewendet.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Immunologische Diagnosemethoden für Viren, Bakterien und Pilze unter der Verwendung enzymmarkierter Antikörper werden seit Jahren in der Praxis angewendet. Für die qualitative Diagnose von phytopathogenen Viren (J. gen. Virol. 34 [1977], 475-483), Bakterien (Proc. 5th Int. Conf. Plant Path. Bact., CaIi (1981), 122-128) und Pilzen (Phytopath. Z. 94 (1979), 89-91) ist ein naßchemisches Verfahren weit verbreitet, das als enzyme-linked immur.osorbent assay (ELISA) bezeichnet wird und häufig in einer Variante des heterogenen, direkten Doppelantikörper-Sandwich Assays angewendet wird. Dieses Massentestverfahren ist an gut ausgerüstete Labors gebunden, erfordert spezielle Testplatten, Dosier- und Auswertegeräte und alle Reaktanten werden in flüssiger Form verwendet. Auch bei dem mit Nitrocellulose-Membranen als Träger arbeitenden dot immuno-binding assay (DIBA), (Analyt. Biochemistry 119 (1982), 142-147) erfolgt die Zugabe der jeweils frisch anzusetzenden Reaktanten als Lösung. Das Testprinzip erfordert die räumliche Begrenzung des Analyten auf ein kleines Areal mittels einer Mikroliterspritze bzw. einer speziellen Apparatur. Beide genannte Diagnosemethoden sind daher für Tests außerhalb von Labors ungeeignet. Immunchemische Diagnosemittel auf der Basis trockeriuhemischer Elemente lassen sich in zwei Gruppen, die der einschichtigen und die der mehrschichtigen, unterteilen. In den EP 0113075,0246615 und 0203443 werden Testmittel und Verfahren, bei denen nur der Rezeptor des Analyten immobilisiert und trocken in einer Schicht kombiniert mit einem Tauchstab oder Streifen vorliegt, verwendet. Weitere Testreaktanten liegen in Gefäßen flüssig vor. In der WO 87/03965 wird ein trockener, einschichtiger Teststreifen mit mehreren Reaktionsfeldern für verschiedene Analyten beschrieben, der in einer alle Analyien erfassende Reaktantenlösung eingelegt und schließlich in eine Indikatorlösung überführt wird. Der Streifen ist mit der Verwendung von Antigenen als Rezeptoren und der eines Anti-Antikörperkonjugates ausschließlich für ein ' Antikörpernachweis geeignet. Auch bei dem in Clin. Chem. 31 (1985), S. 1427 beschriebenen Verfahren, bei dem unter N iung einer zylinderförmigen Konzentrationseinrichtung ?n einer Nylonmembran der Test aufgebaut wird oder dem in der US PS 4, 391, 904 beschriebenen Verfahren mit der Bindung eines Partners der immunologischen Reaktion an eine Festphase und dem Aufbau des Tests an dieser Festphase mit einem signalproduzierenden System erfolgt die Zugabe allerweiteren dafür erforderlichen Reaktanten in flüssiger Form. Des weiteren wird in der US PS 4,391,904 ein Glukoseoxidase-Peroxidase Enzympaar verwendet, das sich bei Cojekten pflanzlichen Ursprungs wegen häufig endogen vorhandener Peroxidase verbietet. In Clin. Chem. 9(1983), 1598-1603 wird schließlich ein trockenes einschichtiges Testelement beschrieben, bei dem der Analyt in einer Schicht mit einem Reakiint aufsteigt und die Länge der Aufstiegszone ermittelt wird, indem der Streifen in eine Indikatorlösung eingelegt wird. Bei trockenen, mehrschichtigen Diagnosemittel!, sind die einzelnen Reaktionszonen oder Schichten als fester Verbund vorgefertigt. Dabei liegen die Reaktionsfelder entweder hintereinander auf einer festen Unterlage oder auch übereinander. Die Herstellung derartiger Mittel ist kompliziert. Häufig müssen Trenn- und/oder Sperrschichten zwischen den verschiedenen Reaktionszonen eingearbeitet werden, um die unterschiedlichen Reaktanten vor einer vorzeitigen unerwünschten Reaktion zu schützen. Bei diesen Mitteln durchwandert der Analyt allein oder im Komplex mit weiteren Roaktanten mehrere Schichten des Mittels. Für sehr große Analyten, wie z. B. Viren und Bakterien, scheiden Testelemente, bei denen fest zusammengefügte Zonen oder Schichten des Elements vom Analyten oder dem Komplex aus Analyt und Antikörper durchwandert werde /ι müssen, auf Grund einer ungenügenden Diffusionsfähigkeit aus. Ein derartiges integriertes, trockenchemisches Testelement mit überlappenden, nebeneinanderliegenden, flächenförmigen Funktionsbereichen wird in der DE PS 3445816 beschrieben. In dieser Hinsicht sind für sehr große Analyten auch Testelemente mit mehreren Zonen, die übereinander liegen, wie z. B. beschrieben in der US PS 4,337,065 und US PS 4,615,983 nicht geeignet. Der Aufbau eines homogenen ELISA unter Verwendung eines mehrschichtigen Testmittels, wie in der US PS 4,472,498 oder der DE OS 3227474 bzw. in Anal. Chem. 55 (1983), S.878 und CNn. Chem. 27 (1981), S. 1499 beschrieben, ist nur bei sehr kleinen Analyten, wie etwa Serumbestandteilen, Enzymen oder Wirkstoffen von Pharmaka möglich. Er scheitert jedoch an der nicht sinnvollen, da materialintensiven Markierung

eines großen Analyten, wie einem Virus, mit einem entsprechenden Enzym. Derartige homogene ELISA sind des weiteren zu wenig empfindlich. In der WO 86/02165 wird ein Diagnosemittel mit einem Klappmechanismus beschrieben und ein Testprinzip aus der US PS 4,446,232 angewendet. Bei seiner Herstellung und Anwendung ergeben sich mehrere Nachteile: Das Verfahren der Immobilisierung für die in ihrer Größe und Zusammensetzung differierenden Antigene muß objektivbezogen optimiert werden. Das Diagnosemittel erfordert den Einsatz monovalenter Antikörper sowie die zusätzliche Reinigung der enzymmarkierten Antikörper mittels Immunaffinitätschromatographie. Dies verteuert das Diagnosemittel. Die Empfindlichkeit des Testelements ist durch die Konkurrenzreaktion des Antigens der Analytprobe und des immobilisierten Antigens um die Bindungsstellen des enzymmarkierten Antikörpers herabgesetzt. Der Komplex aus enzymmarkiertem Antikörper und Antigen erreicht das signalproduzierende System nur, wenn er auf Grund seiner Größe die Zone des immobilisierten Antigens noch durch Diffusion überwinden kann. In der DD 221843 wird ein Test beschrieben, bei dem eine wäßrige Substratlösung auf einen den Antigen-Antikörperkomplex tragenden Formkörper aus Kunststoff oder Glas aufgetragen wird, die anschließend mit einem Nachweiselement in Kontakt gebracht wird. In der DD 262043 wird schließlich ein Verfahren zur variablen Anwendung spezieller biokatalytischer Teststreifen beschrieben. Verschiedene biokatalytische Teststreifen werden durch ein nicht weiter erläutertes Übereinanderlegen in Kontakt gebracht.

Es besteht daher ein Bedarf nach einem empfindlichen, immunchemischen Diagnosemittel, welches einfach herzustellen ist, sowohl für sehr große als auch kleine Analyten geeignet ist, bei dem alle Reagenzien trocken, testfertig für den Anwender vorliegen und daher Nachwaisverfahren mit diesem Mittel außerhalb von Labors für Analyten, wie Viren, Bakterien und Pilze durchführbar sind, so daß der Diagnose weitere Einsatzstellen erschlossen werden können.

Ziel der Erfindung

Das Ziel der Erfindung besteht darin, ein Diagnosemittel und ein Verfahren zum Nachweis von Viren, Bakterien und Pilzen zu entwickeln, mit dem eine Diagnose außerhalb von Labors und rationelle Analysen von Einzelproben möglich sind.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Diagnosemittel mit einem solchen Aufbau zu entwickeln, daß damit ein sicheres und schnelles immunchemisches Nachweisverfahren für Viren, Bakterien und Pilze auch außerhalb von Labors ausgeführt werden kann und das Mittel einfach herzustellen ist. Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß ein Diagnosemittel zur Verfügung gestellt wird, bei dem ein Rezeptor an einer flächigen, festen Phase immobilisiert, trocken vorliegt und mindestens zwei weitere Reaktanten in räumlich getrennten Elementen trocken und nicht immobilisiert vorliegen. Das erfindungsgemäße Diagnosemittel stellt ein einfach herstellbares System von Rezeptor und Reaktanten für immunchemische Nachweise in der Landwirtschaft und Medizin dar, das an jedem Arbeitsplatz und für sehr große sowie kleine Analyten einsetzbar ist. In einer ersten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Diagnosemittels liegen Rezeptor und die Reaktanten auf flächigen Trägermaterialien vor. Insbesondere ist es vorteilhaft, daß die flächigen Trägermaterialien, die den Rezeptor und die Reaktanten ent lalten, über einen gemeinsamen Drehpunkt fächerartig miteinander verbunden sind und daß Rezeptor und Reaktanten in Reaktionsfeldern angeordnet sind. Durch diesen bevorzugten Aufbau dfis Diagnosemittels wird sichergestellt, daß Rezeptor und Reaktanten in ihren Reaktionsfeldern reagenzspezifisch sowie reagenzsparend und räumlich getrennt hergestellt werden und testspezifisch kombiniert werden können. Es hat sich als günstig erwiesen, daß die Fächerblätter und die Reaktionsfelder aus unterschiedlichen Materialien bestehen. Vorteilhaft ist es auch, daß die Fächerblätter aus unterschiedlichen Materialien und die Reaktionsfelder aus unterschiedlichen Materialien bestehen. So z. B. kann ein Fächerblatt aus Gründen einer höheren Stabilität aus Polystyrol und die weiteren aus Polyvinylchlorid bestehen. Es können jedoch auch alle Fächerblätter aus dem gleichen Material hergestellt werden. Günstig ist es, das Material der Fächerblätter vorzugsweise nach physikalischen Gesichtspunkten und das der Reaktionsfelder vorzugsweise nach ihren chemischen Bindungseigenschaften für Rezeptor und Reaktanten auszuwählen. In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Diagnosemittels besitzt das den Rezeptor tragende Fächerblatt eine hakenartige Einhängevorrichtung, so daß der Rezeptor z. B. in Waschlösungen eingehangen werden kann. Besonders vorteilhaft ist es auch, daß die Reaktionsfelder für Rezeptor und Reaktanten in Größe und Form identisch sind und gegenüber dem Drehpunkt nur auf einer begrenzten Fläche auf den Fächerblättern aufliegen. Durch diesen bevorzugten Aufbau wird gewährleistet, daß verschiedene Reaktionsfelder für Rezeptoren und Reaktanten entsprechend testspezifischer Reaktionsabläufe mit Hilfe eines Lösungsmittels, wie z.B. phosphatgepufferter Kochsalzlösung oder Wasser und unter Ausnutzung von Kohäsionskräften in Kontakt und zur Reaktion gebracht werden, indem man sie mit den sie tragenden verschiedenen Fächerblättern deckungsgleich übereinander schwenkt bzw. wenn ihre weitere Wirkung für einen Rezeptor oder Reaktant unerwünscht ist, von diesem wegschwenkt. Die Wirkung der Kohäsionskräfte zwischen den Reaktionsfeldern wird insofern unterstützt, als sie vorteilhaft nur auf einer begrenzten Fläche auf den sie tragenden Fächerblättern auflaminiert sind. So z. B. entstehen durch einfaches Aufsaugen oder Eintauchen von zwei deckungsgleich übereinander geschwenkten Reaktionsfeldern in ein Lösungsmittel, wie z.B. phosphatgepufferte Kochsalzlösung oder Wasser genügend große Kohäsionskräfte für einen innigen Kontakt der Reaktionsfelder. Für den Fall, daß mehrere gleichartige Analyten mit einem Diagnosemittel geprüft werden, enthält dieses meh^rere gleichartige Reaktionsfelder für den Rezeptor und dem Fächerprinzip folgend die gleiche Anzahl von gleichen Feldern für einen ersten und ebenso die gleiche Anzahl von gleichen Reaktionsfeldern f Jr einen zweiten Reaktanten. Die Reaktionsfelder der weiteren Reaktanten sind dabei insofern fächerolattspezifisch, als die auf linem Blatt einen ersten Reaktanten tragen und die auf dem folgenden Fächerblatt einen für den ersten Reaktanten k")mplementären zweiten Reaktanten. Dies eröffnet z. B. die Möglichkeit zur Prüfung einer unbekannten Analytprobe im Vergleich m.« einer Positiv- und Negativkontrolle mit einem Diagnosemittel. In einer besonders anwenderfreundlichen Ausführungsform des Diagnosemittels können die Kontrollproben, ebenfalls getrocknet, bereits in den für sie vorgesehenen Reaktionsfeldern des Rezeptors vorliegen. Durch eine relative räumliche Nähe der Reaktionsfelder ergibt sich das Prinzip eines testaktuellen Komparator zur Einschätzung des unbekannten Analyten im Vergleich mit den Kontrollproben, mit dem auch e:·. ame Versuchsbedingungen, die außerhalb von Labors auftreten können, berücksichtigt werden. Es resultiert somit eine hohe

Testsicherheit. Wenn unterschiedliche Analyten mit einem Diagnosemittel geprüft werden, enthält dieses unterschiedliche, analytspezifische Reaktionsfelder für den Rezeptor und dem Fächerprinzip folgend unterschiedliche, analytspezifische Reaktionsfelder eines ersten Reaktanten auf dem folgenden Fächerblatt und zum ersten Reaktanten komplementäre Reaktionsfelder eines zweiten Reaktanten, die gegebenenfalls wiederum unterschiedlich oder auch gleich sein können, auf einem nächsten Fächerblatt. Zwischen den Fächerblättern mit verschiedenen Reaktionsfoldern sind in einer bevorzugten Variante des Diagnosemittels Fächerblätter mit Filterpapier angeordnet, die sowohl einen unerwünschten Abrieb und Übertragung der Reagenzien verhindern als auch, ebenfalls um den gemeinsamen Drehpunkt schwenkbar, zum Abtupfen des den Rezeptor tragenden Fächerbjattes nach Waschschritten verwendet werden. Weiterhin ist es denkbar, daß das Diagnosemittel zusätzlich Saugelemente in Form von porösen Materialien besitzt, die eine verstärkte Hinbewegung der weiteren Reaktanten zum Rezeptor in Gegenwart von Lösungsmitteln, wie phosphatgepufferte Kochsalzlösung oder Wasser, sichern. Von Bedeutung für die Funktionssicherheit des erfindungsgemäßen Diagnosemittels ist sowohl die stoffliche Zusammensetzung der flächigen, festen Phase als auch insbesondere die chemische Grundlage für die Bindung des Rezeptors an diese flächige, feste Phase. In einer bevorzugten Ausführungsform des Diagnosemittels wird daher Biomoleküle kovalent bindendes Material, wie z. B. Cellulose oder Cellulosederivate, die nach der DD 245785 mit Cyanurchlorid aktiviert wurden, verwendet. Möglich sind jedoch auch Celluloseträger, die mit Carbonyldiimidazol oder Natriumperjodat aktiviert wurden. In bestimmten Fällen genügt auch die natürliche Adsorptionsfähigkeit und Bindungsfähigkeit von Materialien, die über zwischenmolekulare Wechselwirkungen Biomoleküle zu fixieren vermögen. Beispielsweise können flächige, feste Phasen aus Nitrocellulose-Membranen oder aus synthetischen Polymeren, wie z. B. Polyvinylchlorid, Polystyren oder Polyvinylidenfluorid für die Immobilisierung des Rezeptors verwendet werden. Für die Funktionsweise des erfindungsgemäßen Diagnosemittels bestimmend ist, daß die weiteren Reaktanten nicht immobilisiert in Reaktionsfeldern vorliegen. Vorteilhafterweise werden für diese Reaktionsfelder poröse Celluloseträger so ausgewählt, daß sich ein trockener, erster Reaktant und ein trockener zweiter Reaktant in Gegenwart eines Lösungsmittels, wie z. B. phosphatgepufferte Kochsalzlösung oder Wasser optimal aus ihnen auslösen lassen. In einer weiteren Ausführimgsform des erfindungsgemäßen Diagnosemittels liegt nur der Rezeptor auf flächigem Trägermaterial vor und die weiteren Reaktanten in einer trockenen Form in Depots, die den Charakter von Reaktionsgefäßen haben. Vorzugsweise haben die Reaktanten in den Depots eine lockere, leicht aufzulösende Struktur. Erfindungsgemäß wird weiterhin ein Verfahren zur Verwendung des Diagnosemittels zum Nachweis von Analyten zur Verfügung gestellt, das dadurch gekennzeichnet ist, daß ein Diagnosemittel, bestehend aus einer flächigen, festen Phase, an der ein Rezeptor immobilisiert, trocken vorliegt und mindestens zwei weitere Reaktanten in räumlich getrennten Elementen trocken und nicht immobilisiert vorliegen, verwendet wird und der Nachweis folgendermaßen durchgeführt wird: a) In Kontaktbringen der trockenen, den immobilisierten Rezeptor tragenden flächigen, festen Phase (A) mit clnr flüssigen

Analytprobe

b> Auswaschen des überschüssigen Analyten.

c) In Kontaktbringen der flächigen, festen Phase (A) mit dem gebundenen Analyten mit einem ersten Reaktanten, der in einer zweiten festen Phase »rocken und nicht immobilisiert vorliegt, in Gegenwart eines Lösungsmittels.

d) Auswaschen des überschüssigen Reaktanten.

e) Gegebenenfalls ein- oder mehrmalige Wiederholung der Schritte c) und d) mit einem oder mehreren weiteren Reaktanten vom Typ des ersten Reaktanten.

f) In Kontaktbringen der flächigen, festen Phase (A) mit dem gebundenen Analyten und erstem sowie gegebenenfalls weiteren Reaktanten mit einem zweiten Reaktanten, der in einer dritten festen Phase trocken und nicht immobilisiert vorliegt, in Gegenwart eines Lösungsmittels.

g) Durchführung der Reaktion h) Auswertung

Das mit dem fächerartigen Aufbau des Diagnosemittels ermöglichte erfindungsgemäße Testverfahren ist universell anwendbar. Es gestattet sowohl den Nachweis von sehr kleinen Analyten, wie z. B. pilzlichen Antigenen als auch den von sehr großen Analyten, wie Viren oder Bakterien mit ungünstigen Diffusionseigenschal en, indem der Analyt an den Rezeptor gebunden wird, dort verbleibt und alle weiteren rteaktanten zum Analyten hinbewegt werden. In Gegenwart von Lösungsmitteln, wie z. B. phosphatgepufferter Kochsalzlösung oder Wasser bzw. der flüssigen Analytprobe selbst, werden die sämtlichst trocken vorliegenden testessentiellen Reagenzien, wie Rezeptor und weitere Reaktanten mit dem Analyten zur Reaktion gebracht und dieser damit mit einem sensitiven immunchemischen Test nachgewiesen. Vorzugsweise erfolgt mit dem Verfahren der Nachweis von Antigenen. Dies können sein: intakte Viruspartikeln, Virushüllproteine, Strukturproteine, Bakterien, Bakterienzellwandproteine, lösliche Proteine aus Pilzorganen und Geweben usw. In all diesen Fällen ist der Rezeptor ein antigenspezifischer Antikörper, der erste Reaktant ein antigenspezifischer Antikörper, der mit einem Enzym gekoppelt ist und der zweite Reaktant ein zu diesem Enzym komplementäres Enzymsubstrat. Gegebenenfalls kann das Verfahren nach Anspruch 22 e dahingehend modifiziert sein, daß nach dem an; Rezeptor gebundenen Analyten nicht gleich ein enzymmarkierter Antikörper folgt, sondern ein weiterer nicht markierter Antikörper, der zunächst mit einem komplementären enzymmarkierten Antikörper zur Reaktion gebracht wird und dieser wiederum mit dem zweiten Roaktanten reagiert. Durch den universellen Aufbau des Diagnosemittels sind weitere Testverfahren denkbar. Möglich ist es auch, daß das Diagnosemittel zum Nachweis von Antikörpern eingesetzt wird, wenn als Rezeptor ein Antigen verwendet wird. Ob poly- oder monoklonale Antikörper im Diagnoseverfahren eingesetzt werden, richtet sich in erster Linie nach der erforderlichen Spezifität des Tests. Vorzugsweise wird bei Analyten pflanzlichen Ursprungs alkalische Phosphatase als Markerenzym für den Antikörper verwendet, da dieses Enzym endogen im Pflanzenreich nicht vorkommt. Die Enzymsubstrate 4-Methylumbellipherylphosphat und 5-Brom-4-Chlor-3-Indoxylphosphat in Verbindung mit Nitroblautetrazoliumchlorid sind dadurch ausgezeichnet, daß die Auswertung ihrer Reaktionsprodukte durch die Eigenfärbung der ungeklärten pflanzlichen Analytproben nicht behindert wird. Es können mehrere Analyten gleichzeitig mit einem Verfahren und auf einem Diagnosemittel nachgewiesen werden. Es kann sich dabei sowohl um gleichartige Analyten als auch unterschiedliche Analyten handeln. Gemeint sind hier Viren des gleichen oder unterschiedlicher Virusstämme, der gleichen oder unterschiedlicher Virusarten usw.. Bakterien des gleichen Bakterienstammes oder unterschiedlicher Stämme, Pilze gleicher oder unterschiedlicher Rassen usw. Prinzipiell ist auch der Nachweis von Viren,

Bakterien und Pilzen mit einem Diagnosemittel möglich. Die Testmöglichkeiten richten sich allein nach der Aufeinanderfolge analytspezifischer Rezeptoren und analytspezifischer erster Reaktanten sowie einem zum ersten Reaktanten komplementären zweiten Roaktanten. Mit dem Aufbau des Diagnosemittels ist gleichzeitig die korrekte Reaktionsfolge des Nachweisverfahrens beim Anwender festgelegt. Überschüssiger Analyt und überschüssiger erster sowie gegebenenfalls weitere Reaktanten vom Typ des ers'.en Reaktanten werden durch Waschschritte entfernt, indem das den Rezeptor tragende Reaktionsfeld unter Verwendung einer Einhängevorrichtung in Waschlösung eingehangen wird.

In einer bevorzugten Ausi"hrungsvariante des erfindungsgemäßen Diagnosemittels zum Nachweis von drei Analyten sind die einzelnen Elemente der Figuren 1 a, 1 b, und 1 c wie folgt definiert:

1 - Reaktionsfeld mit dem immobilisierten Rezeptor (Antikörper)

2 - Reaktionsfeld mit dem nicht immobilisierten ersten Reaktant (enzymmarkierter Antikörper)

3 - Reaktionsfeld mit dem nicht immobilisierten zweiten Reaktant (Enzymsubstrat)

4 - Fächerblatt mit Reaktionsfeld 1

5 - Fächerblatt mit Reaktionsfeld 2

6 - Fächerblatt mit Reaktionsfeld 3

7 - erstes Fächerblatt ohne Reaktionsfeld (Filterpapier)

8 - zweites Fächerblatt ohne Reaktionsfeld (Filterpapier)

9 - Verbindungselement für alle Fächerblätter

10 - hakenartige Einhängevorrichtung für das Oiagnosemittel

Das erfindungsgemäße Diagnosemittel besitzt folgende Vorteile:

- es ist ein neuer Lösungsweg für den Aufbau eines an sich kompliziert herzustellenden mehrschichtigen Diagnosemittels aufgezeigt

- eine einfache Herstellung ist mit einer sicheren, da räumlich getrennten und reaktantspezifischen Herstellung von Elementen mit verschiedenen Reaktanten und ihrer testgemäßen Kombination vereint und variabel gestaltet

- alle an den immunchemischen Reaktionen beteiligten Reagenzien liegen in einer trockenen, stabilen Form vor. Das im Zusammenhang mit dem erfindungsgemäßen Diagnosemitte! zur Verfügung gestellte erfindungsgemäße Nachweisverfahren besitzt folgende Vorteile:

- das Nachweisverfahren ist einfach und außerhalb von Labors an jedem Arbeitsplatz durchführbar

- das Nachweisverfahren ist empfindlich und universell einsetzbar für kleine bis zu sehr großen Analyten.

Insgesamt werden damit der wirtschaftlich wichtigen Diagnose von Viren, Bakterien und Pilzen bedeutende neue Einsatzstellen eröffnet, die bekannten trockenchemischen Diagnosemitteln verschlossen bleiben bzw. für die naßchemischen Verfahren nicht relevant sind.

Das Wesen der Erfindung soll nachstehend anhand von Ausführungsbeispielen und im Zusammenhang mit den Figuren 1 a, 1 b und 1 c näher erläutert werden.

Ausführungsbeispiele

Beispiel 1

Zur Herstellung des Reaktionsfeldes 1 mit dem immobilisierten Rezeptor werden mit Cyanurchlorid aktivierte Papiere der Sorte Nr. 540 der Fa. Whatman 3 bis 7 Std. in eine phosphatgepufferte (0,05 mol PBS; pH 7,4) IgG-Lösung eines spezifischen Antiserums mit 0,15 bis 0,5mg IgG/ml eingelegt, anschließend dreimal 5min in PBS gewaschen und zur Blockierung freier Bindungsstellen 2 Std. in PBS mit 1,0% Gelatine inkubiert. Die IgG-Lösung hat dabei für eine Papierfläche von 10cm χ 20cm ein Volumen, welches nicht kleiner als 20ml ist. Nach einem erneuten Waschen der Papiere werden sie zwischen Filterpapier getrocknet, bei 4⁰C aufbewahrt bzw. in einer Größe von 0,5cm x 0,7cm auf einen als Fächerblatt 4 fungierenden Polyvinylchlorid (PVC)-Streifen von 1,1cm Breite unter Verwendung ßines Papier und PVC verklebenden Klebstoffes, wie z. B. PVC-Kleber PCM 13, so aufgeleimt, daß eine quadratische Fläche von J,5cm Kantenlänge über den PVC-Streifen hinausragt und drei Reaktionsfelder 1, wie in Figur 1 b dargestellt, kreuzförmig auf dem Fächerblatt 4 befestigt sind. Die Herstellung des Reaktionsfeldes 2 mit dem ersten Reaktanten erfolgt durch Betropfen von FN1-Filterpapieren der Größe 0,5cm x 0,7 cm mit 10μΙ eines mit alkalischer Phosphatase markierten spezifischen Antikörpers in PBS mit 2% Polyvinylpyrrolidon 25 und 1 % Rinderserumalbumin, wobei die Filterpapiere in gleicher Weise wie die Papierplättchen der Reaktionsfelder 1 auf einen als Fächerblatt 5 fungierenden PVC-Streifen aufgeleimt sind. Nach dem Betropfen mit dem markierten Antikörper werden die Reaktionsfelder 2, bereits am Fächerblatt 5 befindlich, bei 37^CC in einem Brutschrank für 45min getrocknet. Für den zweiten Reaktant wird FN 5-Filterpapier der Größe 0,5cm χ 0,7cm in 1 mol Diethanolaminpuffer, pH 9,8 mit 0,005 mmol 4-Methylumbellipherylphosphat und 10% Invertzucker eingetaucht und durch anschließendes flaches Auflegen auf ein Filterpapier vorgetrockent. Die endgültige Trocknung geschieht mit dem kalten Luftstrom eines Föns. Diese Papieiplättchen ergeben die Reaktionsfelder 3, die wie die Felder 1 und 2 kreuzförmig auf einem als Fächerblatt 6 fungierenden PVC-Streifen aufgeleimt sind. Die Fächerblätter 4,5 und 6 aus PVC werden mit dazwischen liegenden Fächerblättern 7 und 8 aus Filterpapier so kombiniert, daß die Reaktionsfelder 2 und 3 zu den Reaktionsfeldern 1 weisen und deckungsgleich über diesen angeordnet sind. Mit einem Verbindungselement 9 werden alle Fächerblätter durch ein Loch gegenüber den Reaktionsfeldern dicht aneinander gefügt. Damit ist ein Diagnosemittel für den gleichzeitigen Nachweis von drei Analyten hergestellt.

Beispiel 2

Dor Einsatz des Diagnosemittels zum Nachweis von Pflanzenviren im Pflanzensaft erfolgt in Verbindung mit einem Kit. In diesem Kit sind enthalten: eine gefriergetrocknete Negativ-und Positivkontrolle, eine Tablette zur Herstellung von 10 ml PBS-Lösung für die Extraktion der Untersuchungsproben aus dem Pflanzenmaterial und als Lösungsmittel für die Reaktionsfelder 2 und eine Tablette zur Herstellung von 100ml PBS-Lösung zum Waschen der den immobilisierten Rezeptor tragenden Reaktionsfelder'!.

Beispiel 3

Zur Untersuchung einer Analytprobe mit einem in den Figuren 1 a, 1 b und 1 c dargestellten Diagnosemittel werden dessen drei Reaktionsfelder 1 in der Reihenfolge durch Aufsaugen der aufgelösten Negativkontrolle mit einem seitlichen Reaktionsfeld, der Analytprobe mit dem vorderen Reaktionsfeld und der Positivkontrolle mit dem verbliebenen seitlichen Reaktionsfeld völlig durchfeuchtet. Die Fächerblätter 5 bis 8 des Mittels sind dabei in die zum Fächerblatt 4 entgegengesetzte Richtung geschwankt. Die Inkubation der Analytprobe und der Kontrollen auf den Reaktionsfeldern 1 des Fächerblattes 4 erfolgt für 1 Std. bei Raumtemperatur in einem luftfeuchten Milieu. Nach einem kurzen Abspülen der Reaktionsfelder 1 in der Waschlösung und einem Abtupfen der Reaktionsfelder 1 mit Hilfe des Fächerblattes 7 wird das Fächerblatt 5 deckungsgleich über das Fächerblatt 4 geschwenkt, leicht mit diesem zusammengedrückt und die Reaktionsfelder 1 und 2 beider Fächerblätter durch Eintauchen in die Extraktionslösung aneinander geheftet. Nach einer erneuten Inkubation von 1 Std. in eintm luftfeuchten Milieu wird das Fächerblatt 5 von den Reaktionsfeldern 1 weggeschwenkt und diese für zweimal 10 min unter Nutzung der Einhängevorrichtung 10 in Waschflüssigkeit eingehangen. Mit dem Fächerblatt 8 werden die Reaktionsfelder 1 abgetupft und nunmehr das Fächerblatt 6 mit seinen Reaktionsfeldern 3 deckungsgleich über die Reaktionsfelder 1 gebracht. Unter leichtem Zusammendrücken der Fächerblätter 4 und 6 werden die Reaktionsfelder 3 mit dem zweiten Reaktanten durch Eintauchen in Aqua dest. an die Reaktionsfelder 1 angeheftet und zur Reaktion gebracht. Im Verlauf von etwa 15 min erfolgt der Machweis einer Virusinfektion in der Analytprobe, indem in dieser Zeitspanne die aneinandergeheftc en Reaktionsfelder 1 und 3 der Fächerblätter 4 und 6 im Licht einer UV-Lampe visuell ausgewertet werden. Das Fächerblatt 4 mit seinen Reaktionsfeldern 1 liegt dabei über dem Blatt 6 und weist zur UV-Lampe hin. Die räumliche Nähe der Reaktionsfelder für die Kontrollproben und das der zu untersuchenden Analytprobe garantieren eine sichere Einordnung der Analytprobe.

Beispiel 4

Unter Verwendung eines diagnostischen, polyklonalon Antikörpers als Rezeptor und der eines monoklonalen Antikörpers als erster Reaktant und nach dem Beispiel 3 wird das Gurkenmosaikvirus (cucumber mosaic virus, CMV) bis zu einer Verdünnung der pflanzlichen Analytprobe von 1:2000 nachgewiesen.

Beispiele

Unter Verwendung eines diagnostischen, polyklonalen Antikörpers als Rezeptor und der eines polyklonalen Antikörpers aus einer zweiten Versuchstierart als erster Reaktant und nach dem Beispiel 3 wird das Kartoffelvirus-X (potato virus X, PVX) bis zu einer Verdünnung der pflanzlichen Analytprobe von 1:2000 nachgewiesen.

Die Beispiele können durch Austausch der immunchemischen Reagenzien zum Nachweis weiterer Pflanzenviren zz:·::? ?"-^h Bakterien und Pilze fortgesetzt werden.

Claims (52)

1. Diagnosemittel zum Nachweis von Analyten in flüssigen Proben, gekennzeichnet dadurch, daß ein Rezeptor an einer flächigen festen Phase immobilisiert, trocken vorliegt und mindestens zwei weitere Reaktanten in räumlich getrennten Elementen trocken und nicht immobilisiert vorliegen.

2. Diagnosemittel nach Anspruch 1. gekennzeichnet dadurch, daß die Reaktanten auf flächigen Trägermaterialien voi.iegen.

3. Diagnosemittel nach Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß die flächigen Trägermaterialien mit R r. optor u¹ id Reaktanten über einen gemeinsamen Drehpunkt fächerartig miteinander verbunden sind und daß Rezeptor und Reaktanten in Reaktionsfeldern angeordnet sind.

4. Diagnosemittel nach Anspruch 3, gekennzeichnet dadurch, daß die Fächerblätter und die Reaktionsfelder aus unterschiedlichen 'Vlaterialien bestehen.

5. Diagnosemittel nach Anspruch 3, gekennzeichnet dadurch, daß die Reaktionsfelder aus unterschiedlichen Materialien bestehen.

6. Diagnosemittel nach Anspruch 3, gekennzeichnet dadurch, daß die Fächerblätter aus unterschiedlichen Materialien bestehen.

7. Diagnosemittel nach Anspruch 3, gekennzeichnet dadurch, daß Rezeptor nd Reaktanten auf der dem Drehpunkt gegenüberliegenden Seite auf einer begrenzten Fläche vorliegen.

8. Diagnosemittel nach Anspruch 3, gekennzeichnet dadurch, daß das Fächerblatt mit dem an dem Reaktionsfeld des Rezeptors gegenüberliegendem Ende eine hakenartige Einhängevorrichtung aufweist.

9. Diagnosemittel nach Anspruch 3, gekennzeichnet dadurch, daß die Reaktionsfelder der Fächerblätter in Größe und Form identisch und durch Drehung der Fächerblätter deckungsgleich übereinander geschwenkt werden.

10. Diagnosemittel nach Anspruch 3, gekennzeichnet dadurch, daß das Fächerblatt mit dem Rezeptor mehrere gleichartige Reaktionsfelder und die Fächerblätter mit den weiteren Reaktanten mehrere gleichartige., fächerblattspezifische Reaktionsfelder aufweisen.

11. Diagnosemittel nach Anspruch 3, gekennzeichnet dadurch, daß das Fächerblatt mit dem Rezeptor mehrere unterschiedliche Reaktionsfelder und die Fächerblätter mit den weiteren Reaktanten mehrere unterschiedliche, fächerblattspezifische Reaktionsfelder aufweisen.

12. Diagnosemittel nach Anspruch 3, gekennzeichnet dadurch, daß zusammen mit den Fächerblättern Saugelemente vergesehen sind.

13. Diagnosemittel nach Anspruch 12, gekennzeichnet daderch, daß ein oder mehrere Saugelemente auf das Fächerblatt mit dem immobilisierten Rezeptor folgen.

14. Diagnosemittel nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß die flächige, feste Phase ein kovalent bindendes Material darstellt.

15. Diagnosemittel nach Anspruch 14, gekennzeichnet dadurch, daß das kovalent bindende Material makromolekulare Massen mit chemisch aktiven Füllstoffen bestehend aus

a) einer makromolekularen Verbindung mit4,6-Dihalogen-1,3,5-triazin-Gruppierungen, gegebenenfalls noch nucleophile Gruppen aufweisend, in einer Konzentration von 1-80Vol.-% (I)

b) 2,4,6-Trihalogen-1,3,5-triazin in einer Konzentration von 0,5-50Vol.-% (II)

c) Metallhalogeniden in einer Konzentration bis zu 20 Vol.-% (III)

d) einer makromolekularen Verbindung, gegebenenfalls nucleophile Gruppen aufweisend, in einer Konzentration von 5-80 Vol.-% (IV)

e) gegebenenfalls Puffersubstanzen bis zu 5 Vol.-% (V)

f) gegebenenfalls einem flüssigen Dispersionsmittel (IV) sind.

16. Diagnosemittel nach Anspruch 14, gekennzeichnet dadurch, daß das kovalent bindende Material mit Carbonyldiimidazol aktiviertes Papier ist.

17. Diagnosemittel nach Anspruch 14, gekennzeichnet dadurch, daß das kovalent bindende Material mit Natriumperjodat aktiviertes Papier ist.

18. Diagnosemittel nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß die flächige, feste Phase ein Material darstellt, das über zwischenmolekulare Wechselwirkungen Biomoleküle zu fixieren vermag.

19. Diagnosemittel nach Anspruch 18, gekennzeichnet dadurch, daß das über zwischenmoiekulare Wechselwirkungen bindende Material Nitrocellulose ist.

20. Diagnosemittel nach Anspruch 18, gekennzeichnet dadurch, daß das über zwischenmolekulare Wechselwirkungen bindende Material ein synthetisches Polymer ist.

21. Diagnosemittel nach Anspruch 20, gekennzeichnet dadurch, daß das synthetische Polymer Polyvinylchlorid, Polystyren oder Polyvinylidenfluorid ist.

22. Verfahren zum Nachweis von Analyten, gekennz iichnat dadurch, daß ein Diagnosemittel, bestehend aus einer flächigen, festen Phase, an der ein Rezeptor immobilisiert, trocken vorliegt und mindestens zwei weitere Reaktanten in räumlich getrennten Elementen trocken und nicht immobilisiert vorliegen, verwendet wird und der Nachweis folgendermaßen durchgeführt wird:

a) In Kontaktbringen der trockenen, den immobilisierten Rezeptor tragenden flächigen, festen Phase (A) mit der flüssigen Analytprobe.

b) Auswaschen des überschüssigen Analyten.

c) In Kontaktbringen der flächigen, festen Phase (A) mit dem gebundenen Analyten mit einem erster Reaktanten, der in einer zweiten festen Phase trocken und nicht immobilisiert vorliegt, in Gegenwart eines Lösungsmittels.

d) Auswaschen des überschüssigen Reaktanten.

e) Gegebenenfalls ein- oder mehrmalige Wiederholung :«r Schritte c) und d) mit einem oder mehreren weiteren Reaktanten vom Typ des ersten Reaktanten.

f) In Kontaktbringen der flächigen, festen Phase (A) mit dem gebundenen Analyten und erstem sowie gegebenenfalls weiteren Reaktanten mit einem zweiten Reaktanten, der in einer dritten festen Phase trocken und nicht immobilisiert vorliegt, in Gegenwart eines Lösungsmittels.

g) Durchführung der Reaktion,
h) Auswertung.

23. Verfahren zum Nachweis von Analyten nach Anspruch 22, gekennzeichnet dadurch, daß der Analyt ein Antigen ist.

24. Verfahren zum Nachweis von Analyten nach Anspruch 22, gekennzeichnet dadurch, daß der Analyt ein Antikörper ist.

25. Verfahren nach Anspruch 23, gekennzeichnet dadurch, daß der Rezeptor ein poly- oder monoklonaler Antikörper ist.

26. Verfahren nach Anspruch 23, gekennzeichnet dadurch, daß der erste Reaktant ein mit einem Enzym gekoppelter poly- oder monoklonaler Antikörper ist.

27. Verfahren nach Anspruch 26, gekennzeichnet dadurch, daß das Enzym alkalische Phosphatase ist.

28. Verfahren nach Anspruch 27, gekennzeichnet dadurch, daß der zweite Reaktant 4-Methylumbellipherylphosphat ist.

29. Verfahren nach Anspruch 27, gekennzeichnet dadurch, daß der zweite Reaktant ö-Brom^-Chlor-S-Indoxylphosphat in Verbindung mit Nitroblautetrazoliumchlorid ist.

30. Verfahren nach Anspruch 22, gekennzeichnet dadurch, daß mehrere Analyten gleichzeitig nachgewiesen werden.

31. Verfahren nach Anspruch 22, gekennzeichnet dadurch, daß der Auswerteschritt h) mittels eines Auflichtphotometers durchgeführt wird.

32. Diagnosemittel nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Reaktanten in Depots vorliegen.

33. Verfahren zum Nachweis von Viren, gekennzeichnet dadurch, daß ein Diagnosemittel bestehend aus einer flächigen, festen Phase, an der ein Rezeptor immobilisiert, trocken vorliegt und mindestens zwei weitere Reaktanten in rä'.imlich getrennten Elementen trocken und nicht immobilisiert vorliegen, verwendet wird und der Nachweis folgendermaßen durchgeführt wird:

a) In Kontaktbringen der trockenen, den immobilisierten Rezeptor tragenden flächigen, festen Phase (A) mit der flüssigen Analytprobe.

b) Auswaschen des überschüssigen Analyten.

c) In Kontaktbringen der flächigen, festen Phase (A) mit dem gebundenen Analyten mit einem ersten Reaktanten, der in einer zweiten festen Phase trocken und nicht immobilisiert vorliegt, in Gegenwart eines Lösungsmittels.

d) Auswaschen des überschüssigen Reaktanten.

e) Gegebenenfalls ein- oder mehrmalige Wiederholung der Schritte c) und d) mit einem oder mehreren weiteren Reaktanten vom Typ des ersten Reaktanten.

f) In Kontaktbringen der flächigen, festen Phase (A) mit dem gebundenen Analyten und erstem sowie gegebenenfalls weiteren Reaktanten mit einem zweiten Reaktanten, der in einer dritten festen Phase trocken und nicht immobilisiert vorliegt, in Gegenwart eines Lösungsmittels.

g) Durchführung der Reaktion,
h) Auswertung.

34. Verfahren nach Anspruch 33, gekennzeichnet dadurch, daß das Virus ein pflanzenpathogenes, insektenpathogenes oder pilzpathogenes Virus ist.

35. Verfahren nach Anspruch 34, gekennzeichnet dadurch, daß das pflanzenpathogene Virus ein Gurkenmosaikvirus (cucumber mosaic virus, CMV), ein Kartoffelvirus-X (potato virus X, PVX) oder ein Mildes Gerstenmosaikvirus (barley mild mosaic virus, BamMV) ist.

36. Verfahren nach Anspruch 34, gekennzeichnet dadurch, daß das insektenpathogene Virus ein Kernpolyedervirus (nuclear polyhedrosis virus) der Kohleule Mamestra brassicae L, (MbKPV) ist.

37. Verfahren nach Anspruch 34, gekennzeichnet dadurch, daß das pilzpathogene Virus ein Champignonvirus 1 (mushroom virus 1) ist.

38. Verfahren zum Nachweis von Bakterien, gekennzeichnet dadurch, daß ein Diagnosemittel bestehend aus einer flächigen, festen Phase, an der ein Rezeptor immobilisiert, trocken vorliegt und mindestens zwei weitere Reaktanten in räumlich getrennten Elementen trocken und nicht immobilisiert vorliegen, verwendet wird und der Nachweis folgendermaßen durchgeführt wird:

a) In Kontaktbringen der trockenen, den immobilisierten Rezeptor tragenden flächigen, festen Phase (A) mit der flüssigen Analytprobe.

b) Auswaschen des überschüssigen Analyten.

c) !n Kontaktbringen der flächigen, festen Phase (A) mit dem gebundenen Analyten mit einem ersten Reaktanten, der in einer zweiten festen Phase trocken und nicht immobilisiert vorliegt, in Gegenwart eines Lösungsmittels.

d) Auswaschen des überschüssigen Reaktanten.

e) Gegebenenfalls ein- oder mehrmalige Wiederholung der Schritte c) und d) mit einem oder mehreren weiteren Reaktanten vom Typ des ersten Reaktanten.

f) In Kontaktbringen der flächigen, festen Phase (A) mit dem gebundenen Analyten und erstem sOiVie gegebenenfalls weiteren Reaktanten mit einem zweiten Reaktanten, der in einer dritten festen Phase trocken und nicht immobilisiert vorliegt, in Gegenwart eines Lösungsmittels.

g) Durchführung der Reaktion,
h) Auswertung.

39. Verfahren nach Anspruch 38, gekennzeichnet dadurch, daß das Bakterium ein Vertreter der Gattungen Agrobacterium, Clavibacter, Erwinia, Pseudomonas, Rhizobium oder Xanthomonas ist.

40. Verfahren nach Anspruch 39, gekennzeichnet dadurch, daß das Bakterium aus der Gattung Agrobacterium, Agrobacterium tumefaciens ist.

41. Verfahren nach Anspruch 39, gekennzeichnet dadurch, daß das Bakterium aus der Gattung Clavibacter, Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis ist.

42. Verfahren nach Anspruch 39, gekennzeichnet dadurch, daß das Bakterium aus der Gattung Erwinia, Erwinia amylovora oder Erwinia carotovora ist.

43. Verfahren nach Anspruch 39, gekennzeichnet dadurch, daß das Bakterium aus der Gattung Pseudomonas, Pseudomonas syringae pv. phaseolicola ist.

44. Verfahren nach Anspruch 39, gekennzeichnet dadurch, daß das Bakterium aus der Gattung Rhizobium, Rhizobium trifolii ist.

45. Verfahren nach Anspruch 39, gekennzeichnet dadurch, daß das Bakterium aus der Gattung Xanthomonas, Xanthomonas campestris pv. phaseoli ist.

46. Verfahren zum Nachweis von Pilzen, gekennzeichnet dadurch, daß ein Diagnosemittel bestehend aus einer flächigen, festen Phase, an der ein Rezeptor immobilisiert, trocken vorliegt und mindestens zwei weitere Reaktanten in räumlich getrennten Elementen trocken und nicht immobilisiert vorliegen, verwendet wird und der Nachweis folgendermaßen durchgeführt wird:

a) In Kontaktbringen der trockenen, den immobilisierten Rezeptor tragenden flächigen, festen Phase (A) mit der flüssigen Analytprobe.

b) Auswaschen des überschüssigen Analyten.

c) In Kontaktbringen der flächigen, festen Phase (A) mit dem gebundenen Analyten mit einem ersten Reaktanten, der in einer zweiten festen Phase trocken und nicht immobilisiert vorliegt, in Gegenwart eines Lösungsmittels.

d) Auswaschen des überschüssigen Reaklanten.

e) Gegebenenfalls ein- oder mehrmalige Wiederholung der Schritte c) und d) mit einem oder mehreren weiteren Reaktanten vom Typ des ersten Reaktanten.

f) In Kontaktbringen der flächigen, festen Phase (A) mit dem gebundenen Analyten und erstem sowie gegebenenfalls weiteren Reaktanten mit einem zweiten Reaktanten, der in einer dritten festen Phase trocken und nicht immobilisiert vorliegt, in Gegenwart eines Lösungsmittels.

g) Durchführung der Reaktion,
h) Auswertung.

47. Verfahren nach Anspruch 46, gekennzeichnet dadurch, daß der Pilz ein Vertreter der Gattungen Fusarium, Phytophthora, Pseudocercosporella, Pythium oder Ustilago ist.

48. Verfahren nach Anspruch 47, gekennzeichnet dadurch, daß der Pilz aus der Gattung Fusarium, Fusarium oxysporum ist.

49. Verfahren nach Anspruch 47, gekennzeichnet dadurch, daß der Pilz aus der Gattung Phytophthora, Phytophthora nicotianae oder Phytophthora fragariae ist.

50. Verfahren nach Anspruch 47, gekennzeichnet dadurch, daß Pilz aus der Gattung Pseudocercosporella, Pseudocercosporella herpotrichoides ist.

51. Verfahren nach Anspruch 47, gekennzeichnet dadurch, daß der Pilz aus der Gattung Pythium, Pythium debaryanum ist.

52. Verfahren nach Anspruch 47, gekennzeichnet dadurch, daß der Pilz aus der Gattung Ustilago, Ustilago maydis ist.