DD280043A1

DD280043A1 - Verfahren zur affinen anreicherung von anorganischen oder organischen substanzen an anorganische oder organische affinitaetstraeger in reaktoren mit kleinen trennbodenzahlen

Info

Publication number: DD280043A1
Application number: DD32575589A
Authority: DD
Inventors: Eberhard Steinborn; Horst Buechting
Original assignee: Akad Wissenschaften Ddr
Priority date: 1989-02-14
Filing date: 1989-02-14
Publication date: 1990-06-27

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur affinen Anreicherung von anorganischen oder organischen Substanzen an anorganische oder organische Affinitaetstraeger in Reaktoren mit kleinen Trennbodenzahlen. Anwendungsgebiete sind die chemische Analytik, Biotechnologie und Umweltschutz. Erfindungsgemaess werden anorganische oder organische Affinitaetstraeger, die sich in einer oder mehreren Affinitaetssaeulen befinden, mit Loesungen, die anorganische oder organische affine Substanzen enthalten, kontinuierlich in einem Kreislaufsystem durchstroemt. Dabei weist die Stroemungsgeschwindigkeit der Zufuehrung zur Geschwindigkeit des Kreislaufs ein Verhaeltnis von mindestens 1:25 auf.

Description

Hierzu 1 Seite Zeichnung

Anwendungsgebiet der Erfindurg

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur affinen Anreicherung von anorganischen und organischen Substanzen an organischen und anorganischen Trägern in Reaktoren mit kleinen Trennbodenzahlen. Anwendungsgebiete sind chemische Analytik, Biotechnologie und Umweltschutz.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Die Möglichkeit der affinen Anreicherung an Träger niedriger Trennbodenzahlen ist als diskontinuierliches Verfahren weitreichend beschrieben, z. B. affine Markierung an Proteinen bzw. DNS auf einem Blot mit dem entsprechenden Gegenpart (ELISA, RIA). Kontinuierliche Verfahen sind unbekannt.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist es, ein kontinuierliches Verfahren zur Anreicherung affiner organischer odor anorganischer Substanzen aus stark verdünnten Lösungen an einen Affinitätsträger mit kleinen Trennbeden zu entwickeln, durch das eine kontinuierliche Produktion von Biomolekülen, ihre anschließende Analytik in Reaktoren sowie Metallanreicherungsverfahren, aber auch die enzymatische Reaktion an fixierten Substanzen, z. B. an Trägern, Zellen und Geweben, durchführbar ist.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Anreicherungsverfahren für anorganische und organische Substanzen aus Lösungen an Affinitätsträger unter Anwendung der Abhängigkeit der Strömungsgeschwindigkeit und Bindungskapazität zu schaffen.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß man in einem Kreislauf anorganische und organische affine Substanzen enthaltende Lösungen auf einen anorganischen oder organischen Affinitätsträger pumpt. Der Affinitätsträger befindet sich in einer Affinitätssäule oder in mehreren Affinitätssäulen, die in Reihe oder in Kaskadenform angeordnet sind.

Das Durchströmen der Affinitätssäulen erfolgt kontinuierlich, mindestens zweimal, wobei die Strömungsgeschwindigkeit der Zuführung zur Strömungsgeschwindigkeit des Kreislaufs ein Verhältnis von mindestens 1:25 aufweist.

Dabei wird ein optimales Verhältnis der Strömungsgeschwindigkeit der Dosierung zur Strömungsgeschwindigkeit im Kreislauf eingestellt. Die Strömungsgeschwindigkeit im Kreislauf wird entsprechend der affinen Bindungsstäike der anzureichernden Substanz eingestellt.

Als Affinitätsträger dienen alle üblichen Träger, wie z. B. Zellulose, Nitrozellulose, Quarz, Perlzellulose u. a.

Eine bevorzugte Variante besteht in dem Einsatz von Trägern mit extrem kleinen Oberflächen, wie Nitrozellulosepapier, aktivierte PVC-Folien und modifizierte Flächenträger. Anorganische oder organische Substanzen enthaltende Lösungen sind Lösungen mit Biomakromolekülen, wie Proteine, DNS und andere sowie metallhaltige Lösungen.

Die für das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzte Apparatur besteht aus dem Reaktor, der mit 2 Verbindungsleitungen und einer Umlaufpumpe einen Kreislauf bildet. In diesen Kreislauf wird aus einem Vorratsgefäß eine Flüssigkeit eingespeist. Durch eine Dosierpumpe wird aus dem Kreislauf eine einstellbare Flüssigkeitsmenge entnommen. Diese gelangt in die Vorlage. Im stationären Zustand ist die dem Kreislauf entnommene Flüssigkeitsmenge gleich der dem Kreislauf zugeführten Flüdsigkeitsmenge.

Die im Kreislauf geförderte Flüssigkeit kann variabel oder konstant sein.

Die aus dem Kreislauf abgeführte Flüssigkeit kann in bestimmten Grenzen variiert werden (etwa von 0,5 bis 100ml/h).

Das Verhältnis der Volumenströme der Kreislaufflüssigkeit zu der dem Kreislauf entnommenen Flüssigkeit kann = 25 sein.

Der Reaktor und ein Teil der Verbindungsleitungen befinden sich in einem Temperierbad.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren wird ein kontinuierliches Verfahren zur affinen Anreicherung von affinen Substanzen aus stark verdünnten Lösungen an Träger mit kleinen Trennböden bereitgestellt.

Durch die Optimierbarkeit der Strömungsgeschwindigkeit im Kreislauf ergibt sich die Anwendung von Kaskaden mit Affinitätsträgern, die mit abgestuften Strömungsgeschwindigkeiten durchflossen werden und entsprechend unterschiedlich zu ein und demselben Affinitätsträger bindende Substanzen binden können.

Das Verfahren ist anwendbar zur

- Affinitätsanreicherung von Bicrnakromolekülen in niedriger Konzentration in Reaktoren mit niedriger Trennbodenzahl

- Anreicherung von Biomakromolekülen aus einer Lösung an einen Blot

- spezifischen Anreicherung von Biomakromolekülen an Affinitätschromatographiesäulen

- kontinuierlichen spezifischen Anreicherung von Biomakromolekülen aus Zellkulturreaktoren

- spezifischen Anreicherung anorganischer und organischer Materialien mit Biomakromolekülen

- spezifischen Dotierung proteinbeladener anorganischer und organischer Materialien mit Metallionen

- Umsetzung mit Enzymen

- Analyse von Wasser

- Anreicherung von seltenen Metallen.

Anschließend wird die Erfindung an Beispielen näher erläutert:

Ausführungsbeispiele

Abb. 1: Apparatur, bestehend aus Vorratsgefäß 1

Reaktor 2 Umlaufpumpe 3 Dosierpumpe 4 Vorlage 5

Beispiel 1 Adsorption von J^12sHuman IgG an Protein A-Affinitätsträger

1,5pg J¹²⁵Human IgG werden gelöst in 2,51 0,025M Boratpuffer pH 8, d.h. 0,6pg/l, d.h. bei einem Molekulargewicht von ~ 150000g/mol ist die Lösung 4-p-molar. Als Blocker der unspezifischen Adsorption z. B. an Schläuchen usw. werden 250mg Caseinhydrolysat pro Liter zugesetzt. Das Medium wird durch eine 65-Fritte gereinigt und mit Merthiolat versetzt. Die spezifische Aktivität betrug 0,021 MBq/pg, d.h. bei 1,5pg - 0,0315MBq.

0,05MBq S lOOOOOOcpm

0,0315MBq & 630000cpm

Auf dem Filter wurden 3000cpm wiedergefunden, d.h. 0,5% 630000 A 100% A 1,5pg 3000 α x% ~ 0,5% = 7,2 ng fixiert auf = 19,6HIm* & 0,36ng/mm²

Maximale Beladung ist 0,15Mg/mm², d.h. die Flächenbeladung ist ~ Vs».

Beispiel 2

a-feto-Protein P³² markiert vorliegend in einer gefärbten Bande der Laemmli-Elektrophorese wird ausgeschnitten und der Protease Trypsin ausgesetzt. Nach der zweidimensionalen Auftrennung der Peptide auf zeüulosebeschichteten Glasplatten erfolgt ein Blotting nach DD 225228 A1 auf Nitrozellulose. Die Peptide werden in der. ÜKR gegeben und mit spezifischer Strömungsgeschwindigkeit mit einem Gemisch polyklonaler humaner Antikörper eines Patienten mit systemic lupus innerhalb von zwei Tagen zur affinen Anreicherung gebracht. Es wurden zwei Peptide mit systemic lupus erymathosis spezifischen Determinanten identifiziert, indem die Blots mit Peroxidase Protein A auf die Anwesenheit von IgG getestet wurden.

Beispiel 3

10g 5-60Mm Quarz werden mit einer Lösung 1mg Ovalbumin in 10ml Mes-4-morpholinoethansulfonsäure bei pH8(0,1 M Na-Borat) getaucht. Das Quarz wird danach mit TBS pH7,4 gewaschen und danach in einen Reaktor gegeben. Aufgrund der Strömungsgeschwindigkeit werden aus einer Undefinierten Salzlösung (pH 5,7 0,05 M Mes/NaOH) entweder spezifisch Lutetium, Scandium oder Thorium an Ovalbumin fixiert. Nach Waschen mit 0,05 M Mes/NaOH pH 5,7 wird das Quarz aus dem Reaktor entfernt und zu Kieselglas, dotiert mit o.g. Metallen, geschmolzen.

Beispiel 4 Enzymreaktion am Träger im Kreislaufreaktor

Epichlorhydrinmodifiziertes Fraktogel mit etwa 40MmolEpoxygruppen pro g wird mit0,1%Zulkowskistärkein0,1 M NaOH bei 4O⁰C 24 h unter Schütteln umgesetzt. Danach wird der Träger mit Wasssr und mit 0,1 M HCI 30 min bei Raumtemperatur und abermals mit Wasser gewaschen. Der Träger wird in einen Reaktor gegeben. Im Kreislaufreaktor wird eine Glucoamylaselösung mit 43U/ml in PBS unter spezifischen Strömungsbedingungen mit der fixierten Stärke zur Reaktion gebracht. Die freigesetzte Glucose wird mit einer Enzymelektrode gemessen.

Beispiel 5 Spezifische Proteinanreicherung an anorganischen Trägern im Kreislaufreaktor einer Strömungskaskade

Ein Zellhydrolysat (Aspergillusniger) in 0,01 M Boratpufier pH8 wird im Kreislaufreaktor mit 10g AI₂Os (10μΓη-35μΐϊΐ) unter spezifischen Strömungsbedingungen zur Adsorption gebracht. Nach der Adsorption wird der Träger mit PBS gewaschen. Die Elution der gebundenen Proteine erfolgt mit 0,1 M Glycin/HCI pH3.40% des gebundenen Proteins wurde als Glucoamylase identifiziert.

Beispiel 6 Spezifische Anreicherung von Metallen an Affinitätskaskaden

Über einen mit 1 mg Ovalbumin pro ml Perlzellulose modifizierten Träger werden in 0,1 M CH₃COOH/NaOH pH 5 gelöste Salze (0,1 g/100 ml) im Kreislaufreaktor zur Adsorption gebracht. Nach Durchlauf der spezifischen Strörnungskaskaae wurde La³ \ Fe^{3 f} und Th⁴⁺ an der modifizierten Perlzellulose gefunden.

Beispiel 7 Anreicherung von Biomakromolekülen an Affinitätskaskaden

50mg Human-lgG in 0,01 M Brratpuffer pH8 wird über 2ml Protein A beladene Zellulose, die im Kreislaufreaktor ist, mit spezifischen Strömungsgpcchwindigkeiten geleitet. Nach Elution der drei mit unterschiedlicher Strömungsgeschwindigkeit durchströmten Zellulosen wurden IgG4, IgG 2, IgG 1 und IgG 3 getrennt.

Beispiel 8 Leakageuntersuchungen in einer DKR-Kaskade

Ein mit 1,9 mg/ml Protein-beladener Zelluloseträger (1 ml) wird mit 816,3 ml/h im Kreislauf mit aq.biol. durchströmt. Der Zu-und Abfluß erfolgt mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 12,9 ml/h. Danach erfolgt ein Kreislauf mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 333ml/h, in dem sich ein Reaktor mit einem Nitrozellulosenflächenträger (1 cm²) befindet. Das Differentialkreislaufverhältnis für den Säulenkreislauf ist 63,2. Das Differentialkreislaufverhältnis für den Reaktorkreislauf ist 25,8.

Claims

1. Verfahren zur affinen Anreicherung von anorganischen oder organischen Substanzen an anorganische oder organische Affinitätsträger in Reaktoren mit kleinen Trennbodenzahlen, dadurch gekennzeichnet, daß man einen in einer Affinitätssäule oder in mehreren Affinitätssäulen, die in Reihe oder in Kaskadenform angeordnet sind, befindlichen anorganischen oder organischen Affinitätsträger mit anorganischen und organischen affinen Substanzen enthaltenden Lösungen kontinuierlich, mindestens zweimal, in einem Kreislaufsystem durchströmt, wobei die Strömungsgeschwindigkeit der Zuführung zur Strömungsgeschwindigkeit des Kreislaufs ein Verhältnis von mindestens 1:25 aufweist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Affinitätsträger Träger mit kleinen Oberflächen einsetzt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als anorganische oder organische Substanzen enthaltende Lösungen Lösungen mit Biomakromolekülen, wie Proteine, DNS u.a. und metallhaltige Lösungen einsetzt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Strömungsgeschwindigkeit des Kreislaufs spezifisch entsprechend der affinen Bindungsstärke wählt.