Claims (2)
1. Biosensor zur Bestimmung von Glyoxylat, bestehend aus einer Enzymelektrode, die in eine gepufferte Meßlösung mit Zusätzen getaucht ist, dadurch gekennzeichnet, daß auf der Oberfläche einer O2-, H2Or oder CO2-anzeigenden Elektrode Lactatdehydrogenase und Oxalatoxidase oder Oxalatdecarboxylase immobilisiert sind, die gegebenenfalls sterisch gekoppelt sind, und gegebenenfalls eine oder mehrere Dialysemembranen fixiert sind.1. biosensor for the determination of glyoxylate, consisting of an enzyme electrode, which is immersed in a buffered measurement solution with additives, characterized in that immobilized on the surface of an O 2 -, H 2 Or or CO 2 -labelling electrode lactate dehydrogenase and oxalate or oxalate are optionally sterically coupled, and optionally one or more dialysis membranes are fixed.
2. Verfahren zur Bestimmung von Glyoxylat mittels Biosensor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man der gepufferten Meßlösung NAD+ in Konzentrationen von 0,2 mM bis 5 mM zusetzt.2. A method for the determination of glyoxylate by means of biosensor according to claim 1, characterized in that one adds the buffered measurement solution NAD + in concentrations of 0.2 mM to 5 mM.
Anwendungsgebiet der ErfindungField of application of the invention
Die Erfindung betrifft einen Bio sensor und ein Verfahren zur schnellen Bestimmung der Konzentration von Glyoxylat (Glyoxylat, Ethanalsäure). Der Biosensor kann in der Pflanzenproduktion, Lebensmittelindustrie, Biotechnologie und biochemischen Forschung angewendet werden.The invention relates to a bio sensor and a method for rapid determination of the concentration of glyoxylate (glyoxylate, ethanalic acid). The biosensor can be used in crop production, food industry, biotechnology and biochemical research.
Charakteristik des bekannten Standet der TechnikCharacteristic of the known state of the art
Glyoxylat wird üblicherweise durch Reaktion mit NADH in Anwesenheit des Enzyms Glyoxylatreduktase durch spektralphotometrische Messung der Abnahme der NADH-Konzentration bestimmt (G.G.Guilbault, Handbook of Enzymatic Methods of Analysis, New York 1976). Dieses Verfahren ist zeitaufwendig, für getrübte Lösungen erst nach Probenvorbehandlung anwendbar und, wegen des hohen Verbrauchs an Enzym, reagenzienintensiv und deshalb kostenaufwendig. Der Einsatz von Biosensoren für die Bestimmung von Glyoxylat wurde bisher nicht beschrieben.Glyoxylate is usually determined by reaction with NADH in the presence of the enzyme glyoxylate reductase by spectrophotometric measurement of the decrease in NADH concentration (G.G.Guilbault, Handbook of Enzymatic Methods of Analysis, New York 1976). This process is time consuming, for turbid solutions only after sample pretreatment applicable and, because of the high consumption of enzyme, reagent-intensive and therefore expensive. The use of biosensors for the determination of glyoxylate has not previously been described.
Ziel der ErfindungObject of the invention
Ziel der Erfindung ist es, mit geringem Reagenzien· und Zeitaufwand und ohne die Notwendigkeit einer Probenvorbehandlung die Konzentration von Glyoxylat in Lösungen zu bestimmen.The aim of the invention is to determine the concentration of glyoxylate in solutions with low reagents and time and without the need for sample pretreatment.
Darlegung des Wesens der ErfindungExplanation of the essence of the invention
Die Aufgabe der Erfindung ist es, einen Biosensor und ein Verfahren zu schaffen, mit denen die enzymelektronische, schnelle Messung von Glyoxylat möglich ist.The object of the invention is to provide a biosensor and a method with which the enzyme-electronic, rapid measurement of glyoxylate is possible.
Der erfindungsgemäße Biosensor besteht aus einer Elektrode, auf deren Oberfläche Lactatdehydrogenase und Oxalatoxidase oder Oxalatdecarboxylase immobilisiert sind, die gegebenenfalls sterisch gekoppelt sind, und gegebenenfalls einer oder mehreren Dialysemembranen. Die Elektrode ist eine Oj-anzeigende, eine H2O2-anzeigende oder eine CO2-anzeigende Elektrode. Die Bestimmung von Glyoxylat mit dem erfindungsgemäßen Biosensor erfolgt in einer gepufferten Meßlösung, in die die Enzymelektrode getaucht ist. Der gepufferten Meßlösung wird erfindungsgemäß NAD+ in Konzentrationen von 0,2 mM bis 5 mM zugesetzt. Das Verfahren zur Bestimmung von Glyoxylat soll im weiteren in seiner Funktion erläutert werden. Taucht die erfindungsgemäße Enzymelektrode in die gepufferte Meßvorlage, der NAD+ zugesetzt ist, und wird eine glyoxylathaltige Probe zugegeben, so wird Glyoxylat überraschenderweise durch vor der Elektrode immobilisierte Lactatdehydrogenase zu Oxalat umgesetzt. Das Oxalat wird entweder durch die coimmobilisierte Oxaiatoxidase unter O2-Verbrauch und H2O2- und CO2-Bildung oxidiert oder durch die coimmobilisierte Oxalatdecarboxylase unter CO2-Bildung umgesetzt. Die elektrochemische Anzeige erfolgt dementsprechend an einer O2-, H2O2- oder CO2-anzeigenden Elektrode. Die Auswertung der Elektrodensignale erfolgt durch Bestimmung der absoluten Strom- bzw. Potentialänderungen oder der ersten Ableitung dieser Änderungen nach der Zeit.The biosensor according to the invention consists of an electrode on the surface of which lactate dehydrogenase and oxalate oxidase or oxalate decarboxylase are immobilized, which are optionally sterically coupled, and optionally one or more dialysis membranes. The electrode is an Oj-indicating, an H 2 O 2 -indicating or a CO 2 -indicating electrode. The determination of glyoxylate with the biosensor according to the invention is carried out in a buffered measurement solution in which the enzyme electrode is immersed. The buffered measurement solution is added according to the invention NAD + in concentrations of 0.2 mM to 5 mM. The method for the determination of glyoxylate will be further explained in its function. If the enzyme electrode according to the invention is immersed in the buffered measurement template to which NAD + has been added and a glyoxylate-containing sample is added, then glyoxylate is surprisingly converted into oxalate by lactate dehydrogenase immobilized in front of the electrode. The oxalate is either oxidized by the co-immobilized oxaiate oxidase under O 2 consumption and H 2 O 2 and CO 2 formation or converted by the coimmobilized oxalate decarboxylase with CO 2 formation. The electrochemical display is accordingly carried out on an O 2 , H 2 O 2 or CO 2 indicating electrode. The evaluation of the electrode signals is carried out by determining the absolute current or potential changes or the first derivative of these changes over time.
Der Vorteil des erfindungsgemäßen Biosensors und Verfahrens besteht in der Möglichkeit der schnellen und, aufgrund der Wiederverwendbarkeit der eingesetzten Enzyme, kostengünstigen Bestimmung des Glyoxylats in Lösungen ohne die Notwendigkeit einer Probenvorbehandlung.The advantage of the biosensor and method according to the invention is the possibility of rapid and, due to the reusability of the enzymes used, cost-effective determination of the glyoxylate in solutions without the need for sample pretreatment.
Ausführungsbeispieleembodiments
I.BeispielI.Beispiel
In einer Gelatinemembran werden Lactatdehydrogenase (50 U/cm2) und Oxalatoxidase (5 U/cm2) immobilisiert. Ein 6 χ 6 mm großes Stück der Membran wird auf der Polyethylenfolie einer an einen Polarographen mit Schreiber angeschlossenen, auf -0,6V polarisierten Ag/AgCI-Elektrode mittels einer Dialysemembran und eines O-Ringes fixiert. Die so präparierte Enzymelektrode taucht in 2ml auf 25eC thermostatierten, gerührten 0,1 M Na-Citrat/Citronensäurepuffer, pH 6,0. Dem Puffer wird 2,5mM NAD+ zugesetzt. Wenn sich ein stationärer Grundstrom eingestellt hat, werden 50 ul einer wäßrigen Glyoxylatlösung zugegeben. Der Strom fällt bis zu einem neuen stationären Wert. Die Meßzelle wird entleert, gespült und für die nächste Messung gefüllt. Auf diese Weise werden Glyoxylat-Standardlösungenvon1mM,2mM,5mM, 1OmM und 5OmM gemessen und ausden jeweiligen Differenzen der stationären Stromendwerte und des Grundstroms wird eine Eichkurve für Glyoxylat erstellt.In a gelatin membrane, lactate dehydrogenase (50 U / cm 2 ) and oxalate oxidase (5 U / cm 2 ) are immobilized. A 6χ6 mm piece of the membrane is fixed on the polyethylene film of an Ag-AgCI electrode polarized to -0.6V polarizer connected to a recorder using a dialysis membrane and an O-ring. The enzyme electrode thus prepared is dipped in 2 ml of 25 e C thermostated, stirred 0.1 M Na citrate / citric acid buffer, pH 6.0. To the buffer is added 2.5 mM NAD + . When a steady state baseline has been established, 50 μl of an aqueous glyoxylate solution is added. The electricity drops to a new steady state value. The measuring cell is emptied, rinsed and filled for the next measurement. In this way, glyoxylate standard solutions of 1 mM, 2 mM, 5 mM, 10 mM and 50 mM are measured, and a calibration curve for glyoxylate is prepared from the respective differences of the stationary current end values and the base current.