DD239045A1 - METHOD AND BIOSENSOR FOR DETERMINING MEDIUM AND LOW-CHAINED ALCOHOLS - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren und einen Biosensor zur Bestimmung von mittel- und langkettigen Alkoholen. Die Aufgabe besteht darin, eine einfache Methode und einen Biosensor bereitzustellen. Erfindungsgemaess wird in einem gepufferten Medium eine, eine Alkoholoxidase enthaltende, Membranfraktion alkanverwertender Hefen mit der alkoholhaltigen Materialprobe unter Anwesenheit von molekularem Sauerstoff in Kontakt gebracht und der Alkoholgehalt anhand des verbrauchten Sauerstoffs oder des gebildeten H2O2 quantitativ bestimmt. Der Biosensor ist dadurch gekennzeichnet, dass eine Schicht der Alkoholoxidase enthaltenden immobilisierten Membranfraktion von alkanverwertenden Hefen vor eine sauerstoff- oder vor eine H2O2-anzeigende Elektrode aufgebracht wird.The invention relates to a method and a biosensor for the determination of medium and long-chain alcohols. The task is to provide a simple method and a biosensor. According to the invention, in a buffered medium, an alcohol oxidase-containing membrane fraction of alkane-utilizing yeasts is brought into contact with the alcohol-containing material sample in the presence of molecular oxygen and the alcohol content is quantitatively determined on the basis of the consumed oxygen or the H2O2 formed. The biosensor is characterized in that a layer of the alcohol oxidase-containing immobilized membrane fraction of alkane-utilizing yeasts is applied in front of an oxygen or an H2O2-indicating electrode.
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren und einen Biosensor zut Bestimmung der Konzentration von mittel- und langkettigen Alkoholen. Anwendung findet das Verfahren in der Biotechnologie und der kosmetischen, petrolchemischen und pharmazeutischen Industrie.The invention relates to a method and a biosensor for determining the concentration of medium and long-chain alcohols. The process is used in biotechnology and the cosmetic, petrochemical and pharmaceutical industries.
Üblicherweise werden mittel- und langkettige Alkohole (Kettenlänge > Ce) mittels Gaschromatographie und Massenspektrometrie bestimmt. Diese Verfahren erfordern einen hohen apparativen Aufwand und lange Meßzeiten.Usually, medium and long-chain alcohols (chain length> Ce) are determined by means of gas chromatography and mass spectrometry. These methods require a high expenditure on equipment and long measuring times.
Die analytische Bestimmung von längerkettigen Alkoholen ist auch enzymatisch mit Hilfe von Alkoholdehydrogenasen möglich.The analytical determination of longer-chain alcohols is also possible enzymatically with the aid of alcohol dehydrogenases.
Bisher wurden entsprechende Alkoholdehydrogenasen aus verschiedenen Hefen und Bakterien beschrieben, die aber jewejls mit NAD+ oder NADP+ als natürlichen Elektronenakzeptoren wirken (J.M.Lebeaut, F.Meyer, B.Roche, E.Azoulay, Biochim.So far, corresponding alcohol dehydrogenases have been described from various yeasts and bacteria, but which each jewejls with NAD + or NADP + act as natural electron acceptors (JMLebeaut, F.Meyer, B. Roche, E.Azoulay, Biochim.
Biophys. Acta 220,386 [1970]; G. P.Sapozhnikova, V. I. Krauzova, Mikrobiologija 48,793 [1979]).Biophys. Acta 220, 386 [1970]; G. P. Sapozhnikova, V. I. Krauzova, Mikrobiologija 48,793 [1979]).
Weiterhin sind pyridinnucleotid-unabhängige Alkoholdehydrogenasen (Alkohol: Akzeptor Oxidoreduktase) aus Bakterien bekannt, die aber artifizielle Elektronenakzeptoren (Dichlorphenolindophenol, Ferricyanid) benötigen (H.Tauchen, W. Schöpp,Furthermore, pyridine nucleotide-independent alcohol dehydrogenases (alcohol: acceptor oxidoreductase) are known from bacteria, but they require artificial electron acceptors (dichlorophenolindophenol, ferricyanide) (H.Tauchen, W. Schöpp,
H. Aurich, Wiss. Z. KMU-Leipzig, Math. Nat. R. 27,25 [1978]; H. Muraoka, Y.Watanabe, N.Ogasawara, H.Takahashi, J. Ferm.H. Aurich, Wiss. Z. SME Leipzig, Math. Nat. R. 27,25 [1978]; H. Muraoka, Y. Watanabe, N. Ogasawara, H. Takahashi, J. Ferm.
Technol. 60,41 [1982]).Technol. 60,41 [1982]).
Bekannt ist außerdem eine ^Orbildende Alkoholoxidase (Alkohol: 02-Oxidoreduktase) aus auf Methanol kultivierten Hefen, die jedoch nur eine Substratspezifitätfürkurzkettige Alkohole (bis C6) aufweist (H. Sahm, Adv. Biochem. Eng. 6,77 [1977]).Also known is an organogenic alcohol oxidase (alcohol: O 2 -oxidoreductase) from yeasts cultured on methanol, but which has only one substrate specificity for short-chain alcohols (up to C 6 ) (H. Sahm, Adv. Biochem., Eng., 6.77 [1977] ).
Darüber hinaus wurden zwei Biosensoren zur Bestimmung mittel- und langkettiger Alkohole beschrieben. In einem dieser Sensoren werden intakte, an eine Sauerstoffelektrode fixierte Mikroorganismen eingesetzt, deren Substratveratmung als Meßsignal verwertet wird (R. Renneberg, P.Riege, K.Schwandt, W.-H.Schunck, K.Riedel, F. Scheller und H.-G. Müller, DD-WP G 01 N/2646488). Ein Nachteil dieses Verfahrens ist die geringe Selektivität der Zellen. Neben Alkoholen verursachen auch langkettige Alkane und Fettsäuren sowie weitere Wachstumssubstrate der Mikroorganismen ein Meßsignal.In addition, two biosensors for the determination of medium and long-chain alcohols have been described. In one of these sensors, intact, fixed to an oxygen electrode microorganisms are used, the Substratveratmung is utilized as a measurement signal (R. Renneberg, P. Riege, K. Schwandt, W.-H. Schunk, K. Riedel, F. Scheller and H. G. Müller, DD-WP G 01 N / 2646488). A disadvantage of this method is the low selectivity of the cells. In addition to alcohols, long-chain alkanes and fatty acids as well as further growth substrates of the microorganisms also cause a measurement signal.
Höhere Selektivität wird mit einer Enzymelektrode zur Messung mittel kettiger Alkohole unter Nutzung einer ebenfalls vor einer O2-Elektrode befindlichen cofaktorabhängigenAlkoholdehydrogenase erreicht (S.Vorlop, W. Schöpp, Fresenius Z. Anal. Chemie 320,48 [1985]). Die Funktion dieses Sensors erfordert jedoch den Zusatz eines Mediators, der in der Enzymreaktion reduziert und durch Sauerstoff reoxidiert wird. Da beide Biosensoren auf O2-Elektroden basieren, sind sie gegenüber Änderungen des Sauerstoffgehalts der Meßlösung störanfällig.Higher selectivity is achieved with an enzyme electrode for measuring medium chain alcohols using cofactor-dependent alcohol dehydrogenase, also in front of an O 2 electrode (S. Vorlop, W. Schöpp, Fresenius Z. Anal. Chemie 320,48 [1985]). However, the function of this sensor requires the addition of a mediator, which is reduced in the enzyme reaction and reoxidized by oxygen. Since both biosensors are based on O 2 electrodes, they are susceptible to changes in the oxygen content of the measurement solution.
Ziel der Erfindung ist es, eine einfache Methode und einen Biosensor zur Bestimmung von mittel- und langkettigen Alkoholen mit hoher Selektivität und ohne Zusatz von Hilfssubstanzen zu entwickeln, die erforderlichenfalls von Änderungen der O2-Konzentration in der Meßlösung weitgehend unabhängig sind.The aim of the invention is to develop a simple method and a biosensor for the determination of medium and long-chain alcohols with high selectivity and without the addition of auxiliary substances, which are largely independent of changes in the O 2 concentration in the measurement solution, if necessary.
Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, eine einfache Methode und einen Biosensor zur Bestimmung der Konzentration von mittel- und langkettigen organischen Verbindungen mit primären oder sekundären Alkoholgruppen bereitzustellen. Es wurde gefunden, daß alkanverwertende Hefen der Gattungen Candida, Torulopsis, Yarrowia, Lodderomyces bei Wachstum auf n-Alkanen oder Alkanolen ein membrangebundenes Enzym (eine Alkoholoxidase) ausbilden, das substratspezifisch mittel-und langkettige primäre und sekundäre Alkohole oxidiert: Alkohol + O2-»Aldehyd + H2O2 The object of the invention is to provide a simple method and a biosensor for determining the concentration of medium and long-chain organic compounds having primary or secondary alcohol groups. It has been found that alkane-utilizing yeasts of the genera Candida, Torulopsis, Yarrowia, Lodderomyces, when grown on n-alkanes or alkanols, form a membrane-bound enzyme (an alcohol oxidase) which oxidizes substrate-specific medium and long-chain primary and secondary alcohols: alcohol + O 2 - »Aldehyde + H 2 O 2
Erfindungsgemäß wird eine diese Alkoholoxidase enthaltende Membranfraktion alkanverwertender Hefen, vorzugsweise von C. maltosa, mit der alkoholhaltigen Probe in gepuffertem wäßrigem Medium unter Anwesenheit von molekularem Sauerstoff in Kontakt gebracht und der Alkoholgehalt anhand des verbrauchten Sauerstoffs und/oder des dabei gebildeten Wasserstoffperoxids quantitativ bestimmt. Als mittel-und langkettige Alkohole werden primäre Alkanole (>Ce), Diole, ω-Hydroxycarbonsäuren oder Terpenalkohole bestimmt. Die Bestimmung erfolgt entweder elektrochemisch mittels entsprechender Elektroden oder über einen geeigneten Indikator (z. B. ein chromogenes Peroxidasesubstrat), der bei der Reaktion mit H2O2 eine meßbare Veränderung anzeigt.According to the invention, a membrane fraction of alkane-utilizing yeasts containing this alcohol oxidase, preferably C. maltosa, is brought into contact with the alcohol-containing sample in buffered aqueous medium in the presence of molecular oxygen and the alcohol content is quantitatively determined on the basis of the consumed oxygen and / or the hydrogen peroxide formed thereby. As medium and long-chain alcohols primary alkanols (> Ce), diols, ω-hydroxycarboxylic acids or terpene alcohols are determined. The determination is carried out either electrochemically by means of appropriate electrodes or via a suitable indicator (eg a chromogenic peroxidase substrate) which indicates a measurable change in the reaction with H 2 O 2 .
Der erfindungsgemäße Biosensor besteht aus einer Schicht mit einer immobilisierten Membranfraktion alkanverwertender Hefen, die vor einer üblichen Sauerstoffelektrode oder vor einer H2O2-anzeigenden Elektrode fixiert ist. Die Elektrode taucht in eine Meßlösung, der der zu bestimmende Alkohol zugesetzt wird. Der Sauerstoffverbrauch oder die H2O2-Bildung wird als Meßsignal elektrochemisch angezeigt. Das Signal ist von der Alkoholkonzentration abhängig. Das erfindungsgemäße Verfahren und der erfindungsgemäße Biosensor haben den Vorteil, daß sie eine einfache Reaktionsführung bei Normalbedingungen ermöglichen und außer molekularem Sauerstoff keinen Zusatz von Cofaktoren (NAD+, NADP+) oder artifiziellen Elektronenakzeptoren benötigen. Aufgrund der Selektivität der Alkoholoxidase werden nur Alkohole mit einer Kettenlänge > C6 angezeigt. Die Verwendung einer H2O2-anzeigenden Elektrode macht das Verfahren und den Biosensor weitgehend unempfindlich gegenüber Schwankungen des O2-Gehalts der Meßlösung.The biosensor according to the invention consists of a layer with an immobilized membrane fraction of alkane-utilizing yeasts, which is fixed in front of a conventional oxygen electrode or in front of a H 2 O 2 -looking electrode. The electrode is immersed in a measuring solution to which the alcohol to be determined is added. The oxygen consumption or the H 2 O 2 formation is displayed electrochemically as a measurement signal. The signal depends on the alcohol concentration. The inventive method and the biosensor according to the invention have the advantage that they allow a simple reaction under normal conditions and require no addition of cofactors (NAD + , NADP + ) or artificial electron acceptors except molecular oxygen. Due to the selectivity of the alcohol oxidase, only alcohols with a chain length> C 6 are indicated. The use of an H 2 O 2 -looking electrode makes the method and the biosensor largely insensitive to variations in the O 2 content of the measurement solution.
In eine gerührte, geschlossene Meßzelle (Volumen 3ml, Temperatur 30°C) wird luftgesättigter 5OmM Tris-HCI-Puffer, pH 8,8, gegeben und die (^-Konzentration mit einer Sauerstoffelektrode vom Clark-Typ (Pt-Ag/AgCI, 0,1 M KCI, mit Polyethylenfolie, polarisiert bei -60OmV) mittels eines pO2-Meters, gekoppelt mit einem X-Y-Schreiber, kontinuierlich registriert (Luftsättigung bei 300C entspricht 240 μΜ02 bei Normalbedingungen). Danach erfolgt die Zugabe von 100-200μΙ einer mikrosomalen Membranfraktion präpariert nach SCHUNCK et al. (1978) bzw. einer mitochondrialen/peroxisomalen Membranfraktion präpariert nach MAUERSBERGER et al. (1984) (1,5-3 mg Protein entsprechend), was zu keiner wesentlichen Veränderung der O2-Konzentration führt.In a stirred, closed measuring cell (volume 3 ml, temperature 30 ° C) is added air-saturated 5OmM Tris-HCl buffer, pH 8.8, and the (^ concentration with a Clark-type oxygen electrode (Pt-Ag / AgCl, 0.1 M KCl, with polyethylene film, polarized at -60 OmV) by means of a pO 2 -meter, coupled with an XY-recorder, continuously registered (air saturation at 30 0 C corresponds to 240 μΜ0 2 under normal conditions) -200μΙ of a microsomal membrane fraction prepared according to SCHUNCK et al. (1978) or a mitochondrial / peroxisomal membrane fraction prepared according to MAUERSBERGER et al. (1984) (corresponding to 1.5-3 mg of protein), resulting in no significant change in the O 2 Concentration leads.
Erst die nachfolgende Zugabe von (primären) Alkanolen (z. B. Decan-1 -öl oder Hexadecan-1 -öl) gelöst in bis zu 80 μΙ Aceton oder als Ultraschallemulsion führt durch die Wirkung der Alkoholoxidase zu einem deutlichen Abfall der O2-Konzentration in der geschlossenen Meßzelle.Only the subsequent addition of (primary) alkanols (eg decane 1 oil or hexadecane 1 oil) dissolved in up to 80 μΙ acetone or as an ultrasound emulsion leads to a significant drop in the O 2 due to the action of the alcohol oxidase. Concentration in the closed measuring cell.
Dieser Abfall der O2-Konzentration ist der zugesetzten Alkoholmenge proportional. Im Versuchsbeispiel sind Alkohole bestimmbar in einem Bereich von 0 bis 440 μΜ Alkanol im Meßansatz in Abwesenheit von Natrium-Azid (Stöchiometrie der Reaktion: 1 Mol Substratverbrauch entspricht 0,5 Mol O2-Verbrauch aufgrund der Wirkung der in der Membranfraktion enthaltenen Katalaseaktivität auf das gebildete H2O2) bzw. von 0 bis 220 μΜ Alkanol im Ansatz in Anwesenheit von 6mM NaN3 (Stöchiometrie der Reaktion: 1 Mol Substratverbrauch entspricht 1 Mol O2-Verbrauch).This drop in O 2 concentration is proportional to the amount of alcohol added. In the experimental example, alcohols are determinable in a range of 0 to 440 μΜ alkanol in the measurement batch in the absence of sodium azide (stoichiometry of the reaction: 1 mol of substrate consumption corresponds to 0.5 mol O 2 consumption due to the effect of contained in the membrane fraction catalase activity on the formed H 2 O 2 ) or from 0 to 220 μΜ alkanol in the reaction in the presence of 6 mM NaN 3 (stoichiometry of the reaction: 1 mol of substrate consumption corresponds to 1 mol of O 2 consumption).
Versuchsdurchführung wie in Beispiel 1, jedoch in einer offenen gerührten Meßzelle (Meßvolumen 3 ml), die mit einer auf +60OmV polarisierten Elektrode vom gleichen Typ, zur H2O2-Bestimmung abgedeckt mit einer Dialysemembran, ausgerüstetExperimental procedure as in Example 1, but in an open stirred measuring cell (measuring volume 3 ml) equipped with a + 60OmV polarized electrode of the same type, for H 2 O 2 determination covered with a dialysis membrane equipped
Die Meßlösung ist wie im Beispiel 1 unter Zusatz von 6mM NaN3. Diese Elektrode wird mit definierter H2O2-Lösung geeicht. Die Eichkurve ist linear von 0 bis 1,5mM H2O2Jm Ansatz.The measurement solution is as in Example 1 with the addition of 6 mM NaN 3 . This electrode is calibrated with defined H 2 O 2 solution. The calibration curve is linear from 0 to 1.5mM H 2 O 2 μm.
Nach Zugabe der entsprechenden Membranfraktion wie im Beispiel 1 kann die Alkoholkonzentration einer Meßprobe (z. B.After addition of the appropriate membrane fraction as in Example 1, the alcohol concentration of a test sample (eg.
Decan-1-ol in einem Bereich von 0 bis 1,5mM im Ansatz) anhand der gemessenen Konzentration des durch die Alkoholoxidase gebildeten H2O2 bestimmt werden. Die H2O2-Bildung ist der eingesetzten Alkoholmenge mit einer Stöchiometrie von 1 Mol H2O2 pro 1 Mol Alkohol proportional.Decan-1-ol in a range of 0 to 1.5mM in the approach) are determined on the basis of the measured concentration of formed by the alcohol oxidase H 2 O 2 . The formation of H 2 O 2 is proportional to the amount of alcohol used with a stoichiometry of 1 mol of H 2 O 2 per 1 mol of alcohol.
Nach Eichung der Meßanordnung mit bekannten Alkoholkonzentrationen kann die Bestimmung der Konzentration von Alkoholen in unbekannten Materialproben erfolgen (z.B. aus Fermentationslösungen).After calibration of the measuring device with known alcohol concentrations, determination of the concentration of alcohols in unknown material samples may be made (e.g., from fermentation solutions).
100μΙ einer 5%igen Gelatinelösung werden bei37cCmit200μl der nach W.-H.Schunck, P.Riege, R. Blasig, H.Honeck und H.-100 μΙ of a 5% gelatin solution are incubated at 37 C C with 200 μL of the according to W.-H.Schunck, P.Riege, R. Blasig, H. Hecke and H.
G. Müller, Acta Biol. Med. Germ. 37 K3 (1978) präparierten mikrosomalen Membranfraktion der Hefe Candida maltosa vermischt.G. Müller, Acta Biol. Med. Germ. 37 K3 (1978) prepared microsomal membrane fraction of the yeast Candida maltosa mixed.
Die Mischung wird auf einer Fläche von 3cm2 einer PVC-Unterlage ausgestrichen und 20 h bei 4°C getrocknet. Ein Stück von 5 x 5 mm der so erhaltenen Membran wird auf der Polyethylenfolie einer Sauerstoffelektrode (Pt-Ag/AgCI, 0,1 M KCI) mittels einer Dialysemembran (Dicke 20 μιτι) und eines O-Ringes befestigt. Die Elektrode wird an einen Polarographen angeschlossen und auf -0,6V polarisiert. Sie taucht in 2 ml einer Meßlösung, besteht aus 5OmM Tris-HCI-Puffer, pH 8,8, mit 1OmM NaN3. Hat sich ein stationärer Grundstrom eingestellt, so werden 20 μΙ einer 10 mM Hexadecanollösung in Aceton zugegeben. Die daraufhin einsetzende Änderung des Stromes wird als Meßsignal verwendet.The mixture is spread on an area of 3 cm 2 of a PVC backing and dried at 4 ° C for 20 h. A piece of 5 × 5 mm of the membrane thus obtained is attached to the polyethylene film of an oxygen electrode (Pt-Ag / AgCl, 0.1 M KCl) by means of a dialysis membrane (thickness 20 μιτι) and an O-ring. The electrode is connected to a polarograph and polarized to -0.6V. It is immersed in 2 ml of a measuring solution and consists of 50 mM Tris-HCl buffer, pH 8.8, with 10 mM NaN 3 . If a stationary background current has stopped, 20 μΙ of a 10 mM hexadecane solution in acetone are added. The subsequent change in the current is used as a measuring signal.
Die Meßzelle wird entleert, 2mal mit Puffer gespült und für eine neue Messung mit 2 ml Puffer gefüllt. Auf diese Weise werden weitere Hexadecanollösungen der Konzentrationen 20,40,60,80 und 100 mM vermessen. Aus den absoluten Stromänderungen und den konzentrationen wird eine Eichkurve erstellt. Zur Bestimmung der Hexadecanolkonzentration in einer Fermentationslösung werden 20 μΙ dieser Lösung in die Meßzelle gegeben. Aus dem angezeigten Stromabfall und der Eichkurve kann die gesuchte Konzentration ermittelt werden.The measuring cell is emptied, rinsed twice with buffer and filled with 2 ml of buffer for a new measurement. In this way, further Hexadecanollösungen the concentrations 20,40,60,80 and 100 mM are measured. From the absolute current changes and the concentrations, a calibration curve is created. To determine the Hexadecanolkonzentration in a fermentation solution 20 μΙ of this solution are added to the measuring cell. From the indicated current drop and the calibration curve, the sought concentration can be determined.
10μΙ mitochondriale/peroxisomale Membranfraktion von Candida maltosa, hergestellt nach S. Mauersberger, W.-H.Schunck und H.-G. Müller, Appl. Microbiol. Biotechnol. 19,29 (1984) werden auf ein Stück Zellstoff (d = 5 mm) gegeben und zwischen 2 Dialysemembranen auf der Pt-Oberfläche einer modifizierten Sauerstoffelektrode, die auf +0,6 V polarisiert wird, fixiert. Die Meßlösung ist wie in Beispiel 3. Die Eichung erfolgt mit Decanolproben von 20 μΙ der Konzentrationen 10,20,40,80 und 10OmM, wobei der Anstieg des Stromes als Meßsignal dient. 20 μΙ einer Fermentationsprobe, deren Decanolgehalt bestimmt werden soll, werden zugegeben und aus dem Stromanstieg und der Eich kurve wird die gesuchte Konzentration ermittelt.10μΙ mitochondrial / peroxisomal membrane fraction of Candida maltosa, prepared according to S. Mauersberger, W.-H. Schunk and H.-G. Müller, Appl. Microbiol. Biotechnol. 19, 29 (1984) are placed on a piece of pulp (d = 5 mm) and fixed between 2 dialysis membranes on the Pt surface of a modified oxygen electrode which is polarized to +0.6 V. The measurement solution is as in Example 3. The calibration is carried out with Decanolproben of 20 μΙ the concentrations 10,20,40,80 and 10OmM, the increase of the current serves as a measurement signal. 20 μΙ a fermentation sample whose decanol content is to be determined, are added and from the current increase and the calibration curve, the sought concentration is determined.
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| DD27822885A DD239045A1 (en) | 1985-07-03 | 1985-07-03 | METHOD AND BIOSENSOR FOR DETERMINING MEDIUM AND LOW-CHAINED ALCOHOLS |
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| DD (1) | DD239045A1 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0357027A2 (en) * | 1988-08-30 | 1990-03-07 | New Oji Paper Co., Ltd. | Alcohol oxidase enzyme electrode and its use for quantitative alcohol determination. |
| EP0470312A1 (en) * | 1989-07-24 | 1992-02-12 | Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha | Novel omega-carboxyalcohol oxidase |
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1985
- 1985-07-03 DD DD27822885A patent/DD239045A1/en not_active IP Right Cessation
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0357027A2 (en) * | 1988-08-30 | 1990-03-07 | New Oji Paper Co., Ltd. | Alcohol oxidase enzyme electrode and its use for quantitative alcohol determination. |
| EP0357027A3 (en) * | 1988-08-30 | 1991-03-20 | New Oji Paper Co., Ltd. | Alcohol oxidase enzyme electrode and its use for quantitative alcohol determination. |
| EP0470312A1 (en) * | 1989-07-24 | 1992-02-12 | Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha | Novel omega-carboxyalcohol oxidase |
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