DD242284A1

DD242284A1 - METHOD FOR IMPROVING THE SELECTIVITY OF AMPEROMETRIC ENZYME ELECTRODES

Info

Publication number: DD242284A1
Application number: DD23896682A
Authority: DD
Inventors: Frieder Scheller; Michael Jaenchen; Hartmut Weise; Dieter Kirstein
Original assignee: Adw Ddr
Priority date: 1982-04-14
Filing date: 1982-04-14
Publication date: 1987-01-21

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Verbesserung der Selektivitaet von amperometrischen Enzymelektroden. Es hat zum Ziel, Stoerungen der elektrochemischen Anzeigereaktion durch Bestandteile der Messprobe auszuschalten, die bei den bisher bekannten Enzymelektroden auftreten. Die Erfindung loest die Aufgabe auf der Basis der elektrolytischen Umsetzung dieser Stoersubstanzen vor Erreichen der Enzymschicht. Dazu wird eine Hilfselektrode in einer Anordnung mit Bezugs- und Gegenelektrode durch einen Potentiostaten auf das gleiche Potential wie die Indikatorelektrode polarisiert, so dass die Stoersubstanzen kein Signal an der Indikatorelektrode hervorrufen. Gegenueber den bekannten Verfahren, die auf der Differenzmessung zwischen einer enzymfreien und einer mit Enzym beladenen Indikatorelektrode basieren, tritt eine erhebliche Reduzierung des apparativen Aufwandes ein. Im Vergleich zum Einsatz von permselektiven Membranen kann eine "Filtration" entsprechend dem fuer die Indikatorelektrode entscheidenden Abscheidungspotential gegenueber der Molekuelgroesse bzw. Ionisationsgrad erfolgen. Das Verfahren ist in der klinischen Diagnostik, der mikrobiologischen Industrie sowie im Umweltschutz einsetzbar.The invention relates to a method for improving the selectivity of amperometric enzyme electrodes. It aims to eliminate disturbances of the electrochemical indicator reaction by constituents of the measurement sample that occur in the previously known enzyme electrodes. The invention solves the problem on the basis of the electrolytic conversion of these interfering substances before reaching the enzyme layer. For this purpose, an auxiliary electrode in an arrangement with reference and counter electrode is polarized by a potentiostat to the same potential as the indicator electrode, so that the interference substances do not cause a signal at the indicator electrode. Compared with the known methods, which are based on the difference measurement between an enzyme-free and an enzyme-loaded indicator electrode, a considerable reduction in the expenditure on equipment occurs. In comparison to the use of permselective membranes, a "filtration" can take place in accordance with the deposition potential, which is decisive for the indicator electrode, in relation to the molecular size or degree of ionization. The method can be used in clinical diagnostics, the microbiological industry and in environmental protection.

Description

Field of application of the invention

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Verbesserung der Selektivität von amperometrischen Enzymelektroden, z. B. für die Glukose- oder Cholesterolbestimmung in physiologischen Lösungen. Das Verfahren ist in der klinischen Diagnostik, ,der mikrobiologischen Industrie sowie im Umweltschutz einsetzbar.The invention relates to a method for improving the selectivity of amperometric enzyme electrodes, for. B. for the determination of glucose or cholesterol in physiological solutions. The method can be used in clinical diagnostics, the microbiological industry and in environmental protection.

Characteristic of the known technical solutions

Enzymelektroden basieren auf der Kopplung der Umsetzung des zu bestimmenden Substrates unter der Wirkung von immobilisierten Enzymen mit der elektrochemischen Anzeige eines elektrodenaktiven Partners der Enzymreaktion. Während die Enzymreaktionen im allgemeinen eine hohe Selektivität besitzen, ist die darin gekoppelte elektrochemische Anzeigereaktion relativ unspezifisch. Die Ursache dafür liegt in der elektrochemischen Umsetzung aller Bestandteile der Meßprobe mit einem Abscheidungspotential unterhalb des Potentials der Indikatorelektrode. Diese Störungen werden durch permselektive Membranen ausgeschaltet, die entweder unmittelbar vor die Indikatorelektrode (US Pat. 3,979,274) oder zwischen Meßlösung und Enzymschicht (Toshiba Rev. 132) angebracht werden. Diese Membranen besitzen eine selektive Permeabilität aufgrund des Porenausschlußvolumens oder der Ladung des Permeanten. Aufgrund dieses „Filtrationsprinzips" ruft die Gegenwart des in der Enzymreaktion gebildeten und an der Indikatorelektrode angezeigten Reaktionsproduktes in der Meßprobe eine nicht zu eliminierende Störung hervor. Weiterhin können ebenfalls Moleküle mit einem ähnlichen Molekulargewicht wie die an der Elektrode angezeigte Substanz zu Störungen führen. Außerdem ist die Herstellung solcher permselektiver Membranen aufwendig, und die Verwendung in Enzym£lektrqden ist wegen der mechanischen Instabilität unzweckmäßig. Ein anderes Prinzip zur Ausschaltung dieser Störungen beruht auf der Differenzmessung zwischen einer enzymfreien und einer mit Enzym beladenen Indikatorelektrode (BRD Pat. 1598 285). Dieses Verfahren erlaubt zwar die Ausschaltung des Einflusses von Störsubstanzen der Meßprobe, sie ist aber apparativ sehr aufwendig und erfordert ein häufiges Nacheichen. Außerdem ist diese Methode für die „kinetische Meßmethode" nicht geeignet, da das kinetische Verhalten dieser beiden unterschiedlichen Elektroden verschieden ist.Enzyme electrodes are based on the coupling of the reaction of the substrate to be determined under the action of immobilized enzymes with the electrochemical display of an electrode-active partner of the enzyme reaction. While the enzyme reactions generally have high selectivity, the electrochemical indicator reaction coupled therein is relatively nonspecific. The reason for this lies in the electrochemical conversion of all constituents of the test sample with a deposition potential below the potential of the indicator electrode. These disturbances are eliminated by permselective membranes placed either directly in front of the indicator electrode (US Pat. No. 3,979,274) or between measurement solution and enzyme layer (Toshiba Rev. 132). These membranes have a selective permeability due to the pore exclusion volume or charge of the permeant. Due to this "filtration principle", the presence of the reaction product formed in the enzyme reaction and displayed on the indicator electrode in the sample causes incalculable disturbance Furthermore, molecules having a similar molecular weight to the substance indicated on the electrode can also cause interference The production of such permselective membranes is complicated and the use in enzyme vectors is impractical because of the mechanical instability Another principle for the elimination of these disorders is based on the difference measurement between an enzyme-free and an enzyme-loaded indicator electrode (Federal Republic of Germany Patent No. 1598 285) Although this method makes it possible to eliminate the influence of interfering substances in the test sample, it is very expensive in terms of apparatus and requires frequent recalcitration, and this method is not suitable for the "kinetic method of measurement" since the kinetic behavior d this two different electrodes is different.

Es wurde weiterhin vorgeschlagen, Störsubstanzen der Meßprobe mittels enzymatischer Reaktion in einer vor der eigentlichen Enzymschicht befindlichen weiteren Schicht zu entfernen (WPG01 N/235684). Dieses Verfahren erfordert für jede Störsubstanz ein spezifisches Enzym und ist deshalb nur für den Einsatz bei Meßproben, die jeweils die gleichen Störsubstanzen enthalten, geeignet.It has also been proposed to remove interfering substances of the test sample by enzymatic reaction in a further layer located in front of the actual enzyme layer (WPG01 N / 235684). This method requires a specific enzyme for each interfering substance and is therefore suitable only for use in test samples, each containing the same interfering substances.

Es wurde weiterhin bekannt, daß durch die Elektrodenreaktion der Indikatorelektrode das Kosubstrat Nikotinsäureadenindinukleotid (NAD) durch anodische Oxidation zurückgebildet werden kann, so daß der lineare Meßbereich der Elektrode vergrößert werden kann. Bei Ausnutzung dieses Prinzips in Kombination mit immobilisiertem Nikotinsäureadenin-dinukleotid (NAD) wurden „reagenzlose Enzymelektroden" entwickelt (DD-Pat. 125560; BRD-Pat. 2659071). Weiterhin wurde die elektrolytische Erzeugung von Sauerstoff mit einer Hilfsanode, die sich in der Enzymschicht befindet, beschrieben. Damit wurde erreicht, daß die Sauerstoffkonzentration der Meßprobe nicht den Meßwert der Enzymelektrode beeinflußt (EP 0035480). In beiden Fällen wird die durch Begleitsubstanzen bei der Verwendung der Enzymelektrode nicht ausgeschaltet.It has also been known that the cosubstrate nicotine acid adenine dinucleotide (NAD) can be reformed by anodic oxidation by the electrode reaction of the indicator electrode, so that the linear measuring range of the electrode can be increased. Utilizing this principle in combination with immobilized nicotinic acid adenine dinucleotide (NAD), "reagentless enzyme electrodes" were developed (DD Pat 125560, BRD Pat 2659071) Furthermore, the electrolytic production of oxygen with an auxiliary anode residing in the enzyme layer It was thus achieved that the oxygen concentration of the test sample does not influence the reading of the enzyme electrode (EP 0035480) .In both cases, the accompanying substances do not eliminate it when using the enzyme electrode.

Object of the invention

Das Ziel der Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Verbesserung der Selektivität von amperometrischen Enzymelektroden zu entwickeln, bei dem der Gehalt an verschiedenen elektrodenaktiven Störsubstanzen in der jeweiligen Meßprobe die Richtigkeit des Meßergebnisses nicht beeinflußt.The object of the invention is to develop a method for improving the selectivity of amperometric enzyme electrodes, in which the content of different electrode-active interfering substances in the respective test sample does not affect the accuracy of the measurement result.

Explanation of the essence of the invention

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Verbesserung der Selektivität von amperometrischen Enzymelektroden zu entwickeln, bei dem die Störsubstanzen der Meßprobe vor Erreichen der Enzymschicht an einer Hilfselektrode elektrolytisch umgesetzt werden.The object of the invention is to develop a method for improving the selectivity of amperometric enzyme electrodes, in which the interfering substances of the test sample are electrolytically reacted before reaching the enzyme layer on an auxiliary electrode.

Die Erfindung löst die Aufgabe auf der Basis der elektrolytischen Umsetzung dieser Störsubstanzen vor Erreichen der ' Enzymschicht. Dazu wird eine Hilfselektrode in einer Anordnung mit Bezugs- und Gegenelektrode durch einen Potentiostaten auf das gleiche Potential wie die Indikatorelektrode polarisiert, so daß die Störsubstanzen kein Signal an der Indikatorelektrode hervorrufen, bevor sie durch Diffusion oder Strömung die Enzymschicht und die Indikatorelektrode erreichen. Die Hilfselektrode ist vorteilhafterweise so anzubringen, daß die Störsubstanzen bereits vor Erreichen der Enzymschicht quantitativ durch den Elektrodenprozeß an der Hilfselektrode zu elektrodeninaktiven Substanzen umgesetzt werden. Bei der Anwendung dieses Verfahrens in der gerührten Meßzelle ist die Hilfselektrode zweckmäßigerweise vor dem die Enzymschicht einschließenden Dialyseschlauch anzubringen. Dabei muß die Hilfselektrode ein sehr feinmaschiges Metalinetz {„minigrid") sein, da die Verbesserung der Selektivität in diesem Fall auf der nichtlinearen Diffusion des Substrates in die Enzymschicht beruht.The invention solves the problem on the basis of the electrolytic conversion of these interfering substances before reaching the 'enzyme layer. For this purpose, an auxiliary electrode is polarized in a configuration with reference and counter electrode by a potentiostat to the same potential as the indicator electrode, so that the interfering substances cause no signal on the indicator electrode before they reach by diffusion or flow of the enzyme layer and the indicator electrode. The auxiliary electrode is advantageously to be mounted in such a way that the interfering substances are quantitatively converted by the electrode process on the auxiliary electrode into electrode-inactive substances even before reaching the enzyme layer. When using this method in the stirred measuring cell, the auxiliary electrode is expediently mounted in front of the dialysis tube enclosing the enzyme layer. In this case, the auxiliary electrode must be a very fine-meshed metal mesh {"minigrid"), since the improvement of the selectivity in this case is based on the non-linear diffusion of the substrate into the enzyme layer.

Bei Einsatz der amperometrischen Enzymelektrode im Flußsystem ist die Hilfselektrode in dem Strom vor der Indikatorelektrode einzubringen, wobei die Hilfselektrode als Metallnetz ausgeführt ist.When using the amperometric enzyme electrode in the flow system, the auxiliary electrode is to introduce in the stream in front of the indicator electrode, wherein the auxiliary electrode is designed as a metal mesh.

Gegenüber den bekannten Verfahren, die auf der Differenzmessung zwischen einer enzymfreien und einer mit Enzym beladenen Indikatorelektrode basieren, tritt eine erhebliche Reduzierung des apparativen Aufwandes ein. Im Vergleich zum Einsatz von permselektiven Membranen kann eine „Filtration" entsprechend dem für die Indikatorelektrode entscheidenden Abscheidungspotential gegenüber der Molekülgröße bzw. lonisationsgrad erfolgen. Die Erfindung soll nachfolgend anhand von Beispielen dargelegt werden:Compared with the known methods, which are based on the difference measurement between an enzyme-free and an enzyme-loaded indicator electrode, a considerable reduction in the expenditure on equipment occurs. In comparison to the use of permselective membranes, "filtration" can take place in accordance with the deposition potential decisive for the indicator electrode in relation to the molecular size or ionization degree.

embodiments example 1

Eine Sauerstoffelektrode wird in an sich bekannter Weise in einer Sandwich-Anordnung als amperometrische Enzymelektrode präpariert. Dabei ist eine Enzymschicht aus immobilisierter Alkoholdehydrogenase zwischen zwei Dialysemembranen eingeschlossen, wie in der DD-PS 125560 beschrieben wurde. Zusätzlich wird eine Gold-minigrid-Elektrodeauf den zur Meßlösung orientierten Dialyseschlauch aufgebracht. Der elektrische Kontakt erfolgt über eine Zuleitung, die durch eine Bohrung im Kanal der Meßzelle für die Enzymelektrode eingebracht wird. Neben dem üblichen Meßgerät für amperometrische Messungen, z. B. ein Polarograph, wird ein Potentiostat benutzt. An dieses Gerät wird eine zusätzliche Referenzelektrode, eine großflächige Gegenelektrode, die sich in der Meßlösung befinden, sowie die Gold-minigrid-Hilfselektrode angeschlossen. Die Polarisation der Hilfselektrode wird auf +80OmV gegenüber der.Bezugselektrode und die der Indikatorelektrode ebenfalls auf +80OmV eingestellt.An oxygen electrode is prepared in a manner known per se in a sandwich arrangement as an amperometric enzyme electrode. In this case, an enzyme layer of immobilized alcohol dehydrogenase is enclosed between two dialysis membranes, as described in DD-PS 125560. In addition, a gold minigrid electrode is applied to the dialysis tube oriented to the measurement solution. The electrical contact is made via a feed line, which is introduced through a bore in the channel of the measuring cell for the enzyme electrode. In addition to the usual measuring device for amperometric measurements, z. As a polarograph, a potentiostat is used. To this device, an additional reference electrode, a large-scale counter electrode, which are located in the measuring solution, and the gold minigrid auxiliary electrode connected. The polarization of the auxiliary electrode is also set to + 80OmV with respect to the reference electrode and that of the indicator electrode to + 80OmV.

In die Meßzelle werden 2ml 10mmol/l NAD in 0,1 M Phosphatpuffer pH8 gegeben, so daß alle Elektroden in die mit einem Magnetrührer bewegte Lösung eintauchen. Nachdem der Grundstrom der Enzymelektrode auf einen konstanten Wert abgefallen ist, werden 0,1 ml mit der Probelösung, die neben Alkohol auch NADH enthält, in die Meßzelle gegeben. Dabei wird das NADH vor Erreichen der Enzymschicht auf der Hilfselektrode zu NAD oxidiert, so daß die Alkoholmessung nicht dadurch verfälscht wird. Der in der Enzymschicht diffundierende Alkohol wird quantitativ zu Azetaldehyd oxidiert, wobei eine äquimolare Menge NAD zu NADH reduziert wird. Dieses NADH erreicht die Indikatorelektrode, und der Oxidationsstrom ist der NADH- und damit der Alkoholmenge in der Meßprobe proportional. Bei Ausschalten des Potentiostaten kann aus dem Anstieg des Stroms der Indikatorelektrode zusätzlich die NADH-Konzentration in der Meßprobe ermittelt werden. Die Messung der Alkoholkonzentration in Meßproben basiert auf dem Vergleich mit der Kalibrierungskurve.In the measuring cell 2ml 10mmol / l NAD in 0.1 M phosphate buffer pH8 are added, so that all electrodes immersed in the moving with a magnetic stirrer solution. After the base flow of the enzyme electrode has dropped to a constant value, 0.1 ml of the sample solution containing NADH in addition to alcohol is added to the measuring cell. In this case, the NADH is oxidized to NAD before reaching the enzyme layer on the auxiliary electrode, so that the alcohol measurement is not falsified thereby. The alcohol diffusing in the enzyme layer is quantitatively oxidized to acetaldehyde, reducing an equimolar amount of NAD to NADH. This NADH reaches the indicator electrode and the oxidation current is proportional to the NADH and thus the amount of alcohol in the sample. When the potentiostat is switched off, the increase in the current of the indicator electrode can additionally be used to determine the NADH concentration in the test sample. The measurement of the alcohol concentration in test samples is based on the comparison with the calibration curve.

Example 2

Die unter Beispiel 1 beschriebene Meßanordnung wird zur Glukosemessung in vitaminhaltige Lösungen wie folgt modifiziert:The measuring arrangement described under Example 1 is modified for glucose measurement in vitamin-containing solutions as follows:

Als immobilisiertes Enzym wird Glukoseoxidase benutzt. Die Hilfselektrode wird auf +60OmV und die Indikatorelektrode auf +60OmV polarisiert.The immobilized enzyme used is glucose oxidase. The auxiliary electrode is polarized to +60 ohms and the indicator electrode to +60 ohms.

Als Grundlösung wird luftgesättigter 0,1 M Phosphatpuffer pH7,4 verwendet.The basic solution used is air-saturated 0.1 M phosphate buffer pH 7.4.

Nach Aufnahme der Kalibrierungskurve mit Lösungen bekannter Glukosekonzentration kann die Messung von Prüfmaterial erfolgen.After taking the calibration curve with solutions of known glucose concentration, the measurement of test material can take place.

Example 3

Zur Messyng der Glukosekonzentration in einem Flußsystem wird zur Entfernung von Störsubstanz eine Durchfluß-Elektrolysezelle, bestehend aus Hilfselektrode, Referenz- und Gegenelektrode, in den Flüssigkeitsstrom vor die Enzymelektrodenmeßzelle eingebracht. Zur Beseitigung der Störung der Indikatorelektrodenreaktion durch NADPH wird die Hilfselektrode auf +900 mV polarisiert, während die Indikatorelektrode zur H₂O₂-Anzeige auf ein Potential von +800 mV gebracht wird. Die Glukosemessung erfolgt in der für Enzymelektroden sonst üblichen Weise mittels Aufnahme einer Kalibrierungskurve.To measure the glucose concentration in a flow system, a flow-through electrolysis cell, consisting of auxiliary electrode, reference electrode and counterelectrode, is introduced into the liquid stream in front of the enzyme electrode measuring cell to remove interfering substance. To eliminate the disturbance of the indicator electrode reaction by NADPH, the auxiliary electrode is polarized to +900 mV, while the indicator electrode is brought to a potential of +800 mV for H ₂ O ₂ indication. The glucose measurement is carried out in the usual way for enzyme electrodes by recording a calibration curve.

Claims

Invention claim:

A method for improving the selectivity of amperometric enzyme electrodes, characterized in that a per se known amperometric enzyme electrode is combined with an auxiliary electrode so that different interfering substances of the respective test sample at the auxiliary electrode are converted into electrode-inactive substances before they by diffusion or flow the enzyme layer and reach the indicator electrode, wherein the reference and counter electrodes are polarized by a potentiostat to a defined potential.

2. The method according to item 1, characterized in that the auxiliary electrode has the same potential as the indicator electrode.

3. The method according to item 1 and 2, characterized in that the auxiliary electrode has a different potential than the indicator electrode. '^

4. The method according to item 1, characterized in that the auxiliary electrode is attached directly from the semipermeable membrane of the enzyme electrode.

5. The method according to item 1, characterized in that the auxiliary electrode is a close-meshed network of gold, platinum, nickel or amalgamated gold.

6. The method according to item 1, characterized in that the auxiliary electrode is mounted in a flow-through front enzyme electrode.