DD250187A5

DD250187A5 - Verfahren zur photometrischen Bestimmung von Protein C

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Publication number: DD250187A5
Authority: DD
Publication date: 1987-09-30

Abstract

Zur photometrischen Bestimmung von Protein C, insbesondere im Plasma, wird die das zu bestimmende Protein C enthaltende Probe mit Thrombin unter Bildung von aktiviertem Protein C inkubiert, danach ueberschuessiger Thrombininhibitor, wie z. B. Antithrombin III, zugesetzt und anschliessend die Abnahme der durch Gerinnungsfaktoren vermittelten Bildung von Thrombin aus Prothrombin mittels eines chromogenen Thrombinsubstrates wie z. B. H-D-Phe-Pip-Arg-pNA oder Tos-Gly-Pro-Arg-pNA, bestimmt. Zur Verringerung der Thrombinbildung wird ein Aktivator fuer Faktor XII, beispielsweise Ellagsaeure unter Zusatz von Kephatin zugesetzt. Als Aktivator fuer Faktor VII wird z. B. Thromboplastin und Faktor V und als Aktivator fuer Faktor II Faktor Xa unter Zusatz von Kephatin zugesetzt. Fig. 1

Description

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Verfahren zur photometrischen Bestimmung von Protein G Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur photometrischen Bestimmung von Protein C, im besonderen im Plasma.

Protein C ist ein zweikettiges, Vitamin K abhängiges Glykoprotein im Plasma* Seine Synthese erfolgt in der Leber. Dabei wird zunächst eine gerinnungsphysiologisch indifferente Vorstufe (Decorboxy-Protein C) gebildet* Carboxylierung von If-Glutaminsäureresten im Protein durch eine Vitamin-K-abhängige Carboxylase führt zum Protein C. Protein C selbst ist ein Proenzym und wird durch Thrombin in aktiviertes Protein C überführt* Letzteres wirkt durch die Inhibierung der aktivierten Gerinnungsfaktoren V und VIII als ein Antikoagulans» Erniedrigte Protein-C-Spiegel wurden bei Patienten mit Lebererkrankungen» Verbrauchs-Coagulopathie (DIC) und Warfarintherapie beschrieben« Ein angeborener Mangel an Protein C führt zu venösen thromboembolischen Risiken« Protein C spielt daher eine wichtige Rolle sowohl bei der physiologischen Ha^-mostasis als auch in vielen Krankheiten, im besonderen bei der Thrombosis* Infolgedessen besteht auch ein Bedarf nach einer einfachen, insbesondere photometrischen Bestimmungsmethode für Protein C. Ein spezifisches chroraogenes Protein-C~ Substrat, das seine direkte photometrische Bestimmung erlauben würde, ist jedoch nicht bekannt.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Bei dem einzigen, bislang im Handel erhältlichen Testverfah-

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ren wird die Menge an Protein C im Serum durch enzymmarkierte Antikörper bestimmt« Dieses Verfahren hat jedoch den Nachteil, daß die zur Bestimmung eingesetzten Antikörper auch mit dem oben erwähnten Decarboxyprotein C reagieren«, Da die Serumkonzentration an Decarboxyprotein während einer Behandlung mit Antikoagulantien häufig stark ansteigt, birgt dieses Verfahren eine große Fehlerquelle, die unter Umständen zu einer falschen oder unzureichenden Therapie führen kann. R. B« Francis und M. D, Patch (Thrombosis Research 3_2, 605 613, 1983) lehren ein Verfahren zur Bestimmung von aktiviertem Protein C im Humanplasma durch Bestimmung der Partialthromboplastinzeit (PTT-Test). Dabei wird das Protein C durch Zusatz von Thrombin aktiviert und danach letzteres durch einen Unterschuß an Antithrombin III und Heparin inhibiert« Heparin wiederum wird durch eine jeweils neu zu bestimmende exakte Menge von Protaminsulfat neutralisiert. Danach kann Protein C über die partielle Thromboplastinzeit bestimmt werden.

Der Nachteil bei der Verwendung immunologischer Bestimmungsverfahren im Plasma für Protein C liegt darin, daß sie keine Information über die biologische Aktivität der Protein-C-Moleküle liefern. Die Präsenz von abnormalem Protein C mit stark reduzierter biologischer Aktivität (genetische Variante) kann mit solchen Verfahren nicht gefunden werden,

R· M. Bertina et al (Thromb, Haemostas 5I₁ (1) 1-5, (1984)) lehren ein spektrophotometrisches Verfahren zur Bestimmung der Protein C-Aktivität* Dieses Verfahren umfaßt drei unabhängige Schritte:

1. Isolierung des Protein C mit Hilfe einer Al(OH)^Adsorp tion*

2. Aktivierung des vom Plasma abgetrennten Protein G mit Thrombin sowie nachfolgende Inhibierung des letzteren durch äquimolare Mengen Antithrombin III und Heparin,

3· Messen der proteolytischen Aktivität von isoliertem aktiviertem Protein C mit einem chromogenen Substrat =H pyro-Gly-Pro-Arg-pNA)♦

Dieses Verfahren ist unbefriedigend bezüglich der Spezifität für Protein C₁ da dieses Substrat auch von anderen Gerinnungsproteasen gespalten wird. Es kann somit zu falsch positiven Ergebnissen kommen»

Ziel der Erfindung ;

Das Ziel der Erfindung besteht darin» die Richtigkeit den Protein C-Bestimmung zu verbessern,

Darlegung des Lesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, einen einfachen und zuverlässigen optischen Test zur Bestimmung von aktivem Protein C zur Verfügung zu stellen.

Aktiviertes Protein C inaktiviert die Gerinnungsfaktoren Va und Villa, welche wiederum die Bildung von Thrombin aus dessen nichtaktiver Vorstufe, dem Prothrombin aktivieren.

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Man konnte daher daran denken, aktives Protein C über die Bildung bzw* die Hemmung der Thrombinbildung aus Prothrombin zu bestimmen» Da aber Protein C zuerst durch Thrombin aktiviert werden muß, anschließend aber die Aktivität von aus Prothrombin gebildeten Thrombin bestimmt werden soll, müßte das zuvor für die Aktivierung des Protein zugesetzte Thrombin vollständig entfernt oder inaktiviert werden. Bei dieser Inaktivierung müßte der Inhibitor, um das beim Bestimmungsverfahren gebildete Thrombin nicht ebenfalls zu inhibieren, so exakt dosiert werden, daß die Durchführung eines Bestimmungsverfahrens für Protein C nach dem oben erwähnten Muster für die Routinepraxis undurchführbar wäre«

Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß das zugesetzte Thrombin durch einen Überschuß an Antithrombin III inaktiviert werden kann, ohne daß Antithrombin III die Meßreaktionen verfälscht»

Das erfindungsgemäße Verfahren zur photometrischen Bestimmung von Protein C, insbesondere im Plasma, ist daher dadurch gekennzeichnet, daß die das zu bestimmende Protein C enthaltende Probe mit Thrombin unter Bildung von aktiviertem Protein C inkubiert wird, danach überschüssiger Thrombininhibitor zugesetzt wird und anschließend die Abnahme der durch Gerinnungsfaktoren vermittelten Bildung von Thrombin aus Prothrombin mittels eines chromogenen Thrombinsubstrates bestimmt wird.

Als Thrombin-Inhibitor kann einer der bekannten Thrombin-Inhibitoren wie Antithrombin III (AT III) , gegebenenfalls

ο

unter Zusatz von Heparin oder heparinartigen Substanzen verwendet werden« Bevorzugt wird im Rahmen der Erfindung als Thrombininhibitor AT III verwendete Geeignete Mengen hängen zwar grundsätzlich ab von der vorhandenen Thrombinmenge, da ja ein Oberschuß an Inhibitor verwendet werden muß. Im allgemeinen werden jedoch AT III-Mengen zwischen 0,5 und 100 U/ml, vorzugsweise 1 bis 20 U/ml Testvolumen angewendet. Der Inhibitorüberschuß sollte im allgemeinen wenigstens 10 %, vorzugsweise mehr als 20 %„ bezogen auf die Throrabinaktivität, betragen» Werden beispielsweise zur Protein-C-Aktivierung 0,5 U Thrombin eingesetzt, so verwendet man zweckmäßig nach der Aktivierung 0,7 U oder mehr an Thrombininhibitor, wie insbesondere AT III.

Da aktiviertes Protein C (APC) die Gerinnungsfaktoren V und VIII proteolytisch inaktiviert, wird beim erfindungsgemäßen Verfahren vorzugsweise das Gerinnungssystem durch Zusatz von Aktivatoren für Gerinnungsfaktoren oder/und von Gerinnungsfaktoren selbst derart modifiziert, daß sich die Inaktivierung der Faktoren V bzw. VIII in einer möglichst ausgeprägten Verringerung der Thrombinbildung auswirkt. Gemäß einer ersten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird dies zweckmäßig dadurch erreicht, daß man einen Aktivator für Faktor XII, beispielsweise Ellagsäure unter Zusatz von Kephalin, zusetzt. Gemäß einer zweiten Ausführungsform dieser bevorzugten Variante gibt man einen Aktivator für Faktor VII, z, B, Thromboplastin, und Faktor V zu, Gemäß einer dritten Ausführungsform setzt man als Aktivator für Faktor II Faktor Xa unter Zusatz von Kephalin zu.

Diese bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung berück-

sichtigen die Tatsache, daß die Konzentrationen der Gerinnungsparameter Faktoren XII, XI, IX, VIII, X, V und II die Zeit der Thrombinbildung beeinflussen derart, daß ein bestimmter Thrombinschwellwert umso eher erreicht wird, je höher die Konzentration dieser Faktoren ist.

Die Thrombinbildung wird im Rahmen der Erfindung nach an sich bekannten Methoden bestimmt. Geeignet hierfür ist die partielle Thromboplastinzeit (PTT)-Methode. 3ei ihrer Durchführung wird zweckmäßig ein Aktivator für Faktor XII zugesetzt» Die Thrombinbildung kann auch nach der Prothrombinzeit-Methode bestimmt werden. In diesem Falle setzt man zweckmäßig einen Aktivator für Faktor VII und F Va zu.

Als chromogenes Thrombinsubstrat kann im Rahmen der Erfindung jedes für die Thrombinbestimmung geeignete chromogene Substrat verwendet werden. Bevorzugt wird jedoch im Rahmen der Erfindung H-D-Phe-Pip-Arg-pNA oder Tos-Gly-Pro-Arg-pNA verwendet, wobei pNA = para-Nitroanilin bedeutet. Das pNA stellt den chromogenen Bestandteil der Substrate dar und wird durch das gebildete Thrombin abgespalten, so daß es photometrisch in bekannter Weise bestimmt werden kann.

Als Gerinnungssystem kann beispielsweise eine Mischung der Faktoren II bis-XII oder Substratplasma (z. B. Normalcitratplasma) eingesetzt werden.

Im Rahmen der Erfindung kann jedes Plasma eingesetzt werden, bevorzugt wird Citratplasma. Vor der Protein-C-Bestimmung aus Plasma sollte eine Probenvorbereitung durchgeführt

werden. Hierzu kann Jedes Adsorbens verwendet werden, welches Vitamin-K-abhängige (carboxylierte) Proteine binden kann (z, B. Bariumeitrat, Aluminiumhydroxid)«

Das Verfahren kann bei neutralen oder schwach alkalischen PH-Werten durchgeführt werden, vorzugsweise zwischen pH 6 und 9» Als Puffer können die in diesem Bereich wirksamen physiologisch unbedenklichen Puffer verwendet werden wie z. B» Tris/HCl. Ferner können die für Gerinnungstests üblichen Stabilisatoren und Konservierungsmittel wie Rinder serumalbumin, Merthiolat und dergleichen, ebenfalls zugesetzt werden«

AusfÖhrungsbeispiele

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter in Verbindung mit der beigefügten Zeichnung. In dieser stellen dar:

Fig, 1: eine Eichkurve für die Verlängerung der partiellen Thromboplastinzeit durch aktives Protein C aus Plasma (150 bis O %) und mit Tos-Gly-Pro-Arg-pNA (ChromozymO TH) als chromogenes Substrat.

Fig» 2: die Verlängerung der partiellen Thromboplastinzeit durch reines aktives Protein C mit Chromo- ^ als Substrat.

Fig, 3: die Verlängerung der Prothro'mbinzeit durch reines aktives Protein C mit Substrat Chromozym© TH.

Fig, 4: die Verringerung der Anfangssteigung durch reines aktives Protein C in einem chroraogenen Prothrombintest, Substrat ebenfalls Chromozym w TH.

Beispiel 1

Protein C-Bestimraung aus Plasma über Verlängerung der partiellen Thromboplastinzeit (Faktor VHI-Inaktivierung)

Reagentien:

Lösung 1: 50 mmol/1 Natriumeitrat_# 0,00025 % Polypren und 0,01 % Merthiolat,

Lösung 2: 250 mmol/1 Bariumchlorid, 150 mmol/1 Natriumchlorid und 0,01 % Merthiolat,

Lösung 3: 200 mmol/1 MES, 150 mmol/1 Natriumeitrat und 0,01 % Merthiolat, pH 6,0,

Lösung 4.: 6 U/ml Thrombin in 100 mmol/1 Tris/HCl, pH 8,0, 0,1 % RSA und 0,01 % Merthiolat,

Lösung 5: 9 U/ml Antitrombin III und 0,25 USP/ml Heparin in 100 mmol/1 Tris/HCl, pH 8, 100 mmol/1 NaCl, 2 % BSA, 1,5 % Saccharose und 0,01 % Merthiolat,

Reagenzlösung: Kephalin und Ellagsäure als Faktor XII-

Aktivator in 10 mmol/1 Tris/HCl, pH 7,6,

Startreagenz: 1,1 mmol/1 Chromozym^ TH = Tos-Gly-Pro-

Arg-pNA und 100 mraol/1 Calciumacetat,

a) Proben

Normalcitratplasmapool: Als Spender kommen Personen in Betracht, deren Quick-Wert zwischen 80 bis 120 % liegt«

Die Eichkurve wird mit dem Normalpool erstellt. Der PC-Gehalt des Normalcitratplasmapools wird 100 % gesetzt. Unterschiedliche Protein OKonzentrationen werden durch .Verdünnen des Pools mit Natriumditrat (20 mmol/1) erhalten. Abstufungen: 150 %, 100 %, 75.%, 50 %, 25 %, 10 %, 0 %* Für den 150 %-Wert wird statt 200 ,ul 300 ,ul Pool als Probe eingesetzt.

Drei Citratplasmen mit unterschiedlichem Protein C-Antigengehalt werden als Kontrolle mitgeführt.

b) Probenvorbereitung

200 yUl Probe werden mit 100 ,ul Lösung 1 10 Minuten bei 25 ⁰C inkubiert. Nach Zugabe von 200 ,ul der eiskalten (O ⁰C) Lösung 2 wird 10 Minuten bei O ⁰C inkubiert. Das Sediment wird 5 Minuten bei 4000 Umdrehungen pro Minute (Rotordurchmesser 17 cm) und O C abzentrifugiert, mit 100 ,ul der 1:2 mit Wasser verdünnten Lösung 2 bei O ⁰C gewaschen und erneut zentrifugiert. Das Sediment wird in 100 ,ul Lösung 3 aufgenommen und 5 Minuten bei 25 C inkubiert, abschließend nochmals zentrifugiert. Der Überstand = Eluat enthält neben anderen Vitamin K-abhängigen Proteinen auch Protein C.

20 yul Eluat (Protein C) werden mit 100 _/ul Lösung 4 60 Minuten bei 37 ⁰C inkubiert_e Protein C (PC) wird dabei zu aktivem PC (APC) aktiviert. Zur Inaktivierung von Thrombin werden anschließend 100 ,ul Lösung 5 zugemischt und die Mischung 60 Minuten bei 37 C inkubiert. Die Mischung, die neben aktiviertem Protein C (APC) einen gegen-

über Thrombin 50%igen Oberschuß an Antithrombin III enthält, wird in den chromogenen Gerinnungstest als Probe eingesetzt»

c) Messung der APC-Konzentration mittels Verlängerung der partiellen Thromboplastinzeit

50 ,Ul aktiviertes Protein C (Mischung aus b, siehe oben), 100 ,ul Normalcitratplasma und 1000 ,ul Reagenzlösung

' O

werden in einer Mikroplastikküvette 5 Minuten bei 37 C inkubiert« Nach Zugabe von 100 ,ul Startreagenz wird in einem Photometer bei 405 nm und 37 C die Zeit bestimmt, bis eine definierte Menge Substrat von neu entstandenem Thrombin zu Tos-Gly-Pro-Arg-Peptid und para-Nitroanilin (=pNA) umgesetzt ist. Die Menge umgesetzten Substrats, die gemessen wird, wird durch einen Schwellenextinktionsvvert (z* B* Λ E = 0,2) definiert» Die Konzentration der Gerinnungsparameter F XII, F XI, F IX, F VIII, F X, F V und F II beeinflussen die Zeit, je höher konzentriert sie sind, desto schneller wird der Schwellenwert erreicht» Da APC die Faktoren VIII und V proteolytisch inaktiviert, wird das endogene Gerinnungssystem (F XII - F II) empfindlich gestört und somit die partielle Thromboplastinzeit (PTT) verlängert. Unter den angegebenen Bedingungen nimmt die Verlängerung der partiellen Thromboplastinzeit proportional mit der Konzentration von APC (bzw, PC im Plasma) zu.

Zur Auswertung wird eine Eichkurve (Fig. 1) mit den Meßwertpaaren Plasma/Plasmaverdünnungen (150 bis O %) und PTT-Zeiten erstellt. Für Plasmen unbekannter PC-Konzen-

trationen wird ebenfalls die PTT-Zeit ermittelt und aus der Eichkurve die entsprechende PC-Konzentration abgelesen.

d) Ergebnisse

In Tabelle 1 sind die mit Plasmapool, Plasmapoolverdünnungen und Kontrollplasmen ermittelten PTT-Zeiten zusammengefaßt. Die PTT-Zeiten nehmen proportional zur PC-Konzentration in der Probe (0 % bis 150 %) zu. Die Protein C-Aktivitäten in den Kontrollplasmen entsprechen den Protein C-Antigenkonzentrationen, d. h. die Wiederfindung ist im Normalbereich (80 bis 120 %) wie im Abnormalbereich 20 bis 40 %) gut.

Tabelle 1.

Verlängerung der PTT-Zeit durch APC aus Plasmaverdünnungen und Kontrollplasmen

Probe	% Antigen	PTT (see)	% Aktivität
	150	173 „5	150
Plasma	ioo	116	100
verdün	75	108	75
nungen	50	93	50
	25	76,5	25
	10	68	10
	O	60	O
Kontroli-	114	121	102
plasrnen	81	115	84,5
	23 _f 5	71	16

Beispiel 2

Reines Protein C - Bestimmung mittels Verlängerung der partiellen Thromboplastinzeit (Faktor Vlll-Inaktivierung) Die Zusammensetzung der Lösungen ist im Beispiel 1 angegeben«

a) Vorbereitung

Protein C wird aus Plasma nach der Methode von Comp et al·, Blood 63 (1984) 15-21, gereinigt* 20 ,ul reines Protein C in Puffer, bestehend aus 100 mmol/1 Tris/ HCl, pH 8,0, 0,1 % BSA und 0,01 % Merthiolat, wird mit 100 Ml Lösung 4 60 Minuten bei 37 ⁰C inkubiert_o Thrombin wird dann durch Zugabe von 100 ,ul Lösung 5 und 60 Minuten Inkubation bei 37 C inaktiviert« Die Aktivität von aktiviertem Protein C in dieser Mischung wird mit einem Substrat, Acetyl Pro-Pro-Arg-pNA (Hersteller: Pentapharm, Basel), dessen para-Nitroanilin von APC abgespalten wird, bestimmt (vgl* Lit* Bertina et al», Thromb, Haemostas. 51 (1) 1984, 1-5) und in U/ml angegeben. 1 U/ml ist definiert als die Menge an aktiviertem Protein C, die nach oben beschriebener Probenvorbereitung eines iMormalcitratplasmapools (100 %) in der Mischung enthalten ist,

b) Testdurchführung

20 ,ul aktiviertes Protein C (Mischung aus 2a, siehe oben, unterschiedliche Konzentrationen werden durch Verdünnen mit Puffer, bestehend aus 100 mmol/1 Tris/ HCl, pH 8,0, 0,1 % BSA und 0,01 % Merthiolat erhalten), 100 ,ul Plasma (Zusammensetzung: 5 Teile Faktor VIII-

&,

Mangelplasma und 1 Teil Normalcitratplasma) und 100 ,ul Reagenzlösung werden in einer Mikroplastikküvette 5 Minuten bei 37 C inkubiert« Nach Zugabe von 100 ,ul Startreagenz, bestehend aus 1*1 ,umol/1 Chrornozym TH = Tos-Gly-Pro-Arg-pNA und 120 ,umol/1 Calciumlactat, wird

in einem Photometer bei 405 nm und 37 C die Zeit bestimmt, bis eine definierte Menge Substrat von neu entstandenem Thrombin zu Tos-Gly-Pro-Arg-Peptid und para-Nitroanilin umgesetzt ist. Die Menge umgesetzten Substrats, die gemessen wird, wird durch einen Schwellenextinktionswert (z, B₄ Δ. £ = 0,2) definiert»

c) Ergebnisse

Wird die Konzentration von aktiviertem Protein C in der Mischung von 0 auf 10,6 U/ml variiert, so verlängert sich die Zeit bis zum Erreichen des Schwellenwertes (PTT-Zeit) von 96,6 auf 744 Sekunden (Fig, 2). Die Zunahme der PTT-Zeit ist bis zu 6,4 U/ml der APC-Konzentration direkt proportional.

Beispiel 3

Protein C-3estimmung mittels Verlängerung der Prothrornbinzeit (Faktor V-Inaktivierung)

Reagentien:

Püfferlösung: 100 mraol/1 Tris/HCl, pH 8,0 und 0,1 % BSA

und 0,01 % Merthiolat

Reagenzlösung: Thromboplastin aus Kaninchenhirn als Faktor VII-Aktivator, 1,7 -umol/1 Chromozym

TH = los-Gly-Pro-Arg-pNA, 6 mmol/1 CaCl₂ in 100 mmol/1 Tris/HCl-, pH 8,1.

a) Vorbereitung

Es wird ebenfalls reines Protein C mit Thrombin aktiviert, anschließend das Thrombin rait Antithrombin III/ Heparin inaktiviert und als Probe eingesetzt (Beschreibung siehe 2a).

b) Testdurchführung

20 ,ul aktiviertes Protein C (Mischung aus 2a) , 50 ,ul Plasma (Zusammensetzung 1 Teil Normalcitratplasma und 4 Teile 0,9%ige NaCl-Lösung) und 50 ,ul Faktor Va (IU/ ml in Puffer) werden in einer Mikroplastikküvette für 10 Minuten bei 37 ⁰C inkubiert* Nach Zugabe von 1000 ,ul Reagenzlösung wird in einem Photometer bei 405 nm und 37 ⁰C die Zeit bestimmt, bis eine definierte Menge Substrat von neu entstandenem Thrombin zu Tos-Gly-Prö-Arg-Peptid und para-Nitroanilin umgesetzt ist. Die Menge umgesetzten Substrats, die gemessen wird» wird durch einen Schwellenextinktionswert (z# B» AE= 0,1) definiert* Die Konzentration der Gerinnungsparameter F VII, F X, F V und F II beeinflussen die Zeit - je höher konzentriert sie sind, desto schneller wird der Schwellenwert erreicht. Da APC den Faktor V proteolytisch inaktiviert, wird das exogene Gerinnungssystem (F VII - F II) empfindlich gestört und somit die Prothrombinzeit (PT) verlängert«

c) Ergebnisse

Wird die Konzentration von aktiviertem Protein C in der

Mischung von O auf 10,6 U/ml variiert, so verlängert sich die Zeit bis zum Erreichen des Schwellenwertes (PT-Zeit) von 52,8 auf 156 Sekunden (Fig* 3). Die Zunahme der PT_-Zeit ist bis zu 6,4 U/ml der APC-Konzentration direkt proportional·

Seispiel 4

Protein C-Bestimmung mittels eines chromogenen Prothrombintests "(Faktor V-lnaktivierung)

Reagenzien:

Prothrombinreagenzlosung:

mmol/1 Tris/Imidazol/HCl, pH 8,4, 75 mmol/1 NaCl, mmol/1 CaCl„ und 0,005 mmol/1 Kephalin,

a) Vorbereitung

Es wird ebenfalls reines Protein C mit Thrombin aktiviert, anschließend das Thrombin mit Antithrombin III/Heparin inaktiviert und als Probe eingesetzt (Beschreibung siehe 2a),

b) Testdurchführung

20 ,ul aktiviertes Protein C (Mischung aus 2a), 50 ,ul Plasma (Zusammensetzung 1 Teil Normalcitratplasma und 60 Teile 0,9%ige NaCl-Lösung) als Prothrombin und Faktor V-Quelle und 1000 /Ul Prothrombinreagenz werden in einer Mikroplastikküvette 5 Minuten bei 37 ⁰C inkubiert, nach

3» -W

Zugabe von 20 ,ul Faktor Xa (2 U/ml in einer 0,9%igen

NaCl-Lösung) wird vieitere 5 Minuten bei 37 G inkubiert. Die Farbreaktion wird mit Zugabe von 50 ,ul Substrat Chromozym TH (3*75 mmol/1) gestartet und bei 405 nm und 37 ⁰C photometrisch verfolgt«

Das neu gebildete" Thrombin setzt das Substrat zu Tos-Gly-Pro-Arg-Peptid und para-Nitroanilin um. Es wird die Extinktionsänderung pro Minute im Reaktionsanfang gemessen* Unter den Beschriebenen Bedingungen beeinflussen die Konzentrationen der Gerinnungsfaktoren Xa₁ V und II die Extinktionsänderung pro Minute im Reaktionsanfange Da APC den Faktor V proteolytisch inaktiviert, wird dieses System empfindlich gestört, d, h. die Umwandlung von Prothrombin zu Thrombin ist bis zum Meßzeitpunkt noch nicht vollständig abgelaufen und die Anfangssteigung der Thrombin-Substratreaktion wird umso kleiner, je mehr APC im Meßansatz vorhanden ist,

c) Ergebnisse

Wird die Konzentration von aktiviertem Protein C in der Mischung von 0 auf 10_a6 U/ml erhöht, verringert sich die Extinktionsänderung pro Minute im Meßanfang von 159 mE/min auf 42 mE/Min (Fig, 4), Die Anfangssteigung nimmt mit der APC-Konzentration exponentiell ab.

Beispiel 5

Einfluß von AT HI-Überschuß in Gegenwart von Heparin auf die partielle Thromboplastinzeit - Einsatz zweier Throm-

- 20 binsubstrate

a) Testdurchführung - . .

50 ,ul einer Mischung von AT III (Konzentration 0, 2,4, 3,6/ 4,9, 6,1 U/ml) und Heparin als Cofaktor (Konzentration 0,12 USP/ml) , 100 ,ul Normalcitratplasma und 1000 ,ul Reagenz gemäß Beispiel 1 werden

ο in einer Mikroplastikküvette 5 Minuten bei 37 C inkubiert. Nach Zugabe von 100 ,ul Startreagenz, bestehend aus 1,1 ,umol/1 Substrat (Chromozym ^ iH = Tos-Gly-Pro-Arg-pNA oder S 2238 = H-D-Phe-Pip-ArgpNA) und 120 ,ul Calciumacetat, wird in einem Photo-

meter bei 405 nm und 37 C die Zeit bestimmt, bis eine definierte Menge Substrat von entstandenem Thrombin zum Peptid und para-Nitroanilin umgesetzt ist» Die Menge umgesetzten Substrats, die gemessen wird., wird durch einen Schwellenextinktionswert (z. S. Δ Ε = 0,2) definiert,

b) Ergebnisse

In Tabelle 2 sind die in Abwesenheit und in Gegenwart von AT III ermittelten PTT-Zeiten für beide Substrate zusammengefaßt. Mit beiden Thrombinsubstraten werden die PTT-Zeiten durch AT III-Zusatz nicht verlängert, d. h. neu entstandenes Thrombin reagiert auch bei AT Ill-Oberschuß unter den gegebenen Reaktionsbedingungen zunächst mit dem Substrat»

Tabelle 2

AT III-Einfluß auf die PTT-Substrate: Chromozym * TH und S 2238

Heparin	AT III	PTT (sec) „	^ TH	PTT (see)
USP/ml	U/ml	Chromozym ^		S 2238
0,12	0	75 -		72,5
	2,4	72,5		72,5
	3,6	72		72
	4,9	72		71
	6,1	72	73

Claims

Patentansprüche

1« Verfahren zur photometrischen Bestimmung von Protein C_# insbesondere im Plasma, dadurch gekennzeichnet, daß die das zu bestimmende Protein C enthaltende Probe mit Thrombin unter Bildung von aktiviertem Protein C inkubiert wird, danach überschüssiger Thrombininhibitor zugesetzt wird und anschließend die Abnahme der durch Gerinnungsfaktoren vermittelten Bildung von Thrombin aus· Prothrombin mittels eines chromogenen Thrombinsubstrates bestimmt wird.

Ζ» Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Thrombininhibitor Antithrombin III gegebenenfalls unter Zusatz von Heparin verwendet wird,

3» Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als chromogenes Thrombinsubstrat H-D-Phe-Pip-Arg-pNA oder Tos-Gly-Pro-Arg-pNA verwendet wird.

4« Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß ein Aktivator für Faktor XII zugesetzt wi ra ·

5_# Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß Kephalin und Ellagsäure zugesetzt werden_e

6, Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß ein Aktivator für Faktor VII zugesetzt wird»

-Z-

7, Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß Faktor V sowie als Faktor VII-Aktivator Thromboplastin zugesetzt v/erden.

8* Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß ein Aktivator für Faktor II zugesetzt wird,

9* Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß Kephalin und Faktor Xa zugesetzt werden«

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