DD245445A1 - Verfahren zur herstellung von humaninsulin und seinen derivaten - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur biotechnologischen Herstellung von Humaninsulin und seinen Derivaten aus Schweineinsulin und/oder anderen sequenzentsprechenden Insulinpraekursoren, bei dem das verwendete Enzym ohne signifikante Aktivitaetseinbusse zurueckgewonnen werden kann. Die Reaktion wird in Gegenwart von Trypsin oder eines anderen trypsinaehnliche Aktivitaet aufweisenden Enzyms mit einem Threoninderivat in einem Gemisch organischer Loesungsmittel und in Gegenwart einer Puffersubstanz durchgefuehrt und ergibt Ausbeuten ueber 85%. Das Loesungsmittelgemisch besteht aus 30 bis 55% DMSO, wovon 1 bis 20% durch Essigester und/oder halogenierte Kohlenwasserstoffe ersetzt werden koennen und 45 bis 70% eines mehrwertigen Alkohols. Der p H-Wert der liegt im Bereich von 6,6 bis 7,1 und die Temperatur bei 20 bis 28C. Nach beendeter Reaktion wird der Biokatalysator abgetrennt und kann mehrfach verwendet werden.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur biotechnologischen Herstellung von Humaninsulin und seinen Derivaten, wobei als Ausgangsmaterial Schweineinsulin und/oder andere sequenzentsprechende Insulinpräkursoren eingesetzt werden. Humaninsulin wird zur Therapie des Diabetes mellitus in zunehmendem Maße in der Medizin verwendet und leistet aus immunologischen Gründen Vorteile gegenüber anderen Insulinspezies.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Die Herstellung von Humaninsulin, das sich vom Schweineinsulin nur durch Threonin anstelle von Alanin am C-Terminus der B-Kette unterscheidet, ist prinzipiell auf drei Wegen möglich: Chemosynthese, Semisynthese und gentechnische Darstellung. Während die chemosynthetische Darstellung gegenwärtig nicht ökonomisch vertretbar ist (vgl. H.-D. Jakubke/H.Jeschheit: Aminosäuren, Peptide, Proteine; Akademieverlag, Berlin, 1982, S.296-304), gelingt die gentechnologische Herstellung des Humaninsulins entweder über die Vorstufe des Proinsulins mit der sich anschließenden Umwandlung in Humaninsulin oder durch getrennte bakterielle Synthese der A- und B-Kette mit der essentiellen Kettenkombination (vgl. Übersicht F. Wengenmayer, Angew. Chem. 95,1983, S.874).

Bei hinreichender Verfügbarkeit von Schweine-Pankreata sind die semisynthetischen Herstellungsverfahren durch direkten enzymkatalysierten Austausch der differenten Aminosäure am einfachsten zu realisieren. (Vgl. H.-D. Jakubke et al., Angew. Chem.37,1985, S.79).

Für die direkte Umwandlung von Schweineinsulin in Humaninsulin mittels Trypsin oder Proteasen ähnlicher Substratspezifität existieren mehrere Verfahren, die sich inhaltlich nur in den angewandten Reaktionsbedingungen unterscheiden. Es wurde ein Verfahren vorgeschlagen (EP 0056951), DE 31 01382), das ohne Zusatz organischer Lösungsmittel bei einem pH-Wert von 4,5 durchgeführt wird und Ausbeuten von 90% an Humaninsulinester liefern soll. Weiterhin werden Verfahren vorgeschlagen (DE 31 04949, DE 31 29404, WO 8302772), die mit hohen Anteilen organischer Cosolventien bei pH_app.-Werten zwischen 5 und 7 arbeiten und Umwandlungsausbeuten an Humaninsulinester bis zu 99% erreichen sollen.

Der Nachteil dieser bekannten Verfahren zur enzymkatalysierten semisynthetischen Humaninsulindarstellung besteht darin, daß der in ungewöhnlich hohen Konzentrationen eingesetzte Biokatalysator nach nur einmaliger Verwendung verworfen oder sogar nach beendeter Reaktion inaktiviert wird (WO 8302772).

Ziel der Erfindung

Es ist das Ziel der Erfindung, Schweineinsulin und/oder andere entsprechende Insulinpräkursoren im Gegensatz zu bekannten Verfahren unter Mehrfachverwendung des Biokatalysators auf semisynthetischem Wege ökonomisch vorteilhafter in Humaninsulin oder seine Derivate umzuwandeln.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zu entwickeln, mit dessen Hilfe die enzymkatalysierte semisynthetische Umwandlung von Schweineinsulin oder anderer sequenzentsprechender Insulinpräkursoren in Humaninsulin oder seine Derivate unter Bedingungen abläuft, die eine Mehrfachverwendung des eingesetzten Biokatalysators ermöglichen.

Erfindungsgemäß erfolgt die enzymkatalysierte Umwandlung von Schweineinsulin oder anderer entsprechender sequenzentsprechender Insulinpräkursoren in Humaninsulin oder seine Derivate in einem Gemisch aus einem spezifischen Puffer und organischen Lösungsmitteln, in welcher die Aktivität den für die Umwandlung eingesetzten Enzyme nut unwesentlich beeinträchtigt wird, wodurch hohe Umwandlungsraten von Schweineinsulin bzw. sequenzentsprechender Insulinpräkursoren in Humaninsulinester garantiert werden und der Biokatalysator nach geeigneter Abtrennung für weitere Reaktionsansätze verwendet werden kann.

Erfindungsgemäß wird die Umwandlung in Gegenwart eines Enzyms aus der Gruppe Trypsin bzw. trypsinähnliche Aktivität aufweisende Enzyme mit einem Threoninderivat in einem Gemisch organischer Lösungsmittel und in Gegenwart einer Puffersubstanz vorgenommen, wobei die Reaktion in einem Lösungsmittelgemisch aus 30 bis 55% DMSO, wovon 1 bis 20% durch Essigester und/oder halogenierte Kohlenwasserstoffe ersetzt werden können und 45 bis 70% eines mehrwertigen Alkohols bei einer Temperatur von 2O⁰C bis28°C in Gegenwart einer Puffersubstanz bei einem pH-Wert von 6,6 bis 7,1 durchgeführt.

Ais zweiwertige Alkohole, die als Lösungsmittel benutzt werden, kommen vor allem Butandiol-1,3, Diethylenglykol oder Triethylenglykol zur Anwendung. Als halogenierfe Kohlenwasserstoffe werden Tetrachlormethan, Dichlormethan oder 1,2-Dichlorethan eingesetzt. Als Enzyme eignen sich zur Durchführung der Reaktion vor allem Trypsin, Lysyl-Endopeptidase und Carboxypeptidase. Die Reaktion wird vorzugsweise in einem Temperaturbereich von 24°C bis 26°C durchgeführt, wobei die Reaktionszeit bis zu 4 Stunden, vorzugsweise 1 bis 2,5 Stunden beträgt. Als Puffersubstanz wird TRIS, HEPES, Imidazol oder ein Boratpuffer eingesetzt, der Ca²⁺-lonen zugefügt wurden.

Das Volumenverhältnis zwischen Puffer und Lösungsmittelgemisch liegt zwischen 40:60 und 5:95. Das eingesetzte Th reaninderivat weist eine freie oder protoniertea-Aminofunktion auf. Die Ausbeuten für die Umwandlung liegen bei über 85%.

Werden für die Reaktion lösliche Biokatalysatoren verwendet, eignen sich zur Abtrennung der Biokatalysatoren übliche präparative Trenntechniken, wie AC, GPC und Ultrafiltration sowie selektive Extraktion oder Fällung. Immobilisierte Biokatalysatoren können durch einfache Filtration abgetrennt werden.

Im Gegensatz zu bekannten Umwandlungsverfahren wird durch die erfindungsgemäße Lösung eine ökonomisch vorteilhafte Mehrfachverwendung des Biokatalysators möglich. Durch die Abtrennung des Biokatalysators vereinfacht sich die weitere Aufarbeitung des Umwandlungsansatzes, und gleichzeitig wird das Umwandlungsprodukt weitgehend von schädigenden proteolytischen Aktivitäten befreit.

Die Erfindung soll nachstehend anhand einiger Beispiele näher erläutert werden.

Beispiel 1

250mg krist. Schweineinsulin und 320 mg Threoninethylester werden in einer Mischung aus 1,4ml Triethylenglykol, 0,1 ml Ethylacetat und 0,5 ml Dimethylsulfoxid gelöst und 0,25ml 0,5 M Boratpuffer pH 7,0 (1OmM CaCI₂) zugefügt. Der pH-Wert der Mischung wird mit ca. 0,25 ml HCI korrigiert, 25mg Trypsin zugegeben und der Ansatz wird bei 24°C inkubiert. Nach 2 h haben sich It. HPLC 94% Humaninsulinethylester (bezogen auf 90% Reinheit des Schweineinsulins) gebildet und die Insulinderivate und Trypsin werden mit Aceton gefällt und abzentrifugiert. Zum Niederschlag fügt man ca. 16 ml Isopropanol und 0,3 N HCI (4ml) zu und trennt das unlösliche Trypsin ab, das in 0,001 N NCI gelöst und lyophilisiertwird. Man erhält 17 mg (85% bezogen auf 80% Proteingehalt des eingesetzten Trypsins) vollaktives Trypsin zurück. Aus der Isopropanollösung wird das Insulinderivat in bekannter Weise chromatographisch isoliert, das nach Abspaltung des Esters und Reinigung Humaninsulin liefert.

Beispiel 2

Wie Beispiel 1, jedoch mit 1,3 ml 1,3-Butandiol, 0,1 ml Isoamylacetat, 0,6 ml Dimethylsulfoxid und 0,25 M Tris-Puffer pH 6,9 (1 OmM CaCI₂) bei 25⁰C mit den zurückgewonnen Trypsin. Nach 1,7 h 89% Humaninsulinethylester, 14mg Trypsin werden zurückgewonnen.

Beispiel 3

Wie Beispiel 1, jedoch mit Diethylenglykol, Dichlormethan und Tris-Puffer bei 24°C. Nach 1 h 87% Humaninsulinethylester und 17,5mg Trypsin zurückgewonnen.

Claims (10)

1. Patentansprüche:

   1. Verfahren zur Herstellung von Humaninsulin und seinen Derivaten, bei dem das verwendete Enzym ohne signifikante Aktiyjtäfseinbuße zurückgewonnen werden kann, bei dem Schweineinsulin und/oder andere sequenzentsprechende Insulinpräkursoren in Gegenwart eines Enzyms aus der Gruppe Trypsin bzw. trypsinähnliche Aktivität aufweisende Enzyme mit einem Threoninderivat in einem Gemisch organischer Lösungsmittel und in Gegenwart einer Puffersubstanz umgesetzt werden, und das mit Ausbeuten von über 85% arbeitet, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktion in einem Lösungsmittelgemisch aus 30 bis 55% DMSO, wovon 1 bis 20% durch Essigester und/oder halogeniert^ Kohlenwasserstoffe ersetzt werden können, und 45 bis 70% eines mehrwertigen Alkohols bei einer Temperatur von 20⁰C bis28°Cin Gegenwart einer Puffersubstanz bei einem pH-Wert von 6,6 bis 7,1 durchgeführt wird.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktion bei einer Temperatur zwischen 24°C und26°C durchgeführt wird.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß als zweiwertiger Alkohol Butandiol-1 -3, Diethylenglykol oder Trietylenglykol verwendet wird.
4. 4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als halogenierter Kohlenwasserstoff Tetrachlormethan, Dichlormethan oder 1,2-Dichlormethan eingesetzt wird.
5. 5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, daß als Enzyme Trypsin, Lysyl-Endopeptidase und gekennzeichnet dadurch, daß Carboxypeptidase eingesetzt werden.
6. 6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß eine Reaktionszeit von 4 Stunden nicht überschritten wird.
7. 7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktionszeit 1 bis 2,5 Stunden beträgt.
8. 8. Verfahren nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß als Puffersubstanz TRIS, HEPES, Imidazol oder ein Boratpuffer eingesetzt wird, der Ca²⁺-lonen zugefügt werden.
9. 9. Verfahren nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Volumenverhältnis zwischen Puffer und Lösungsmittelgemisch zwischen 40:60 und 5:95 beträgt.
10. 10. Verfahren nach Anspruch 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß ein Threoninderivat eingesetzt wird, dessen Aminofunktion entweder frei oder protoniert vorliegt.