DD245128A1

DD245128A1 - METHOD AND APPARATUS FOR ELECTROKINETIC ULTRAFILTRATION

Info

Publication number: DD245128A1
Application number: DD25218683A
Authority: DD
Inventors: Petko Danew; Jochen Schneider; Gerd-Joachim Krauss
Original assignee: Petko Danew; Jochen Schneider; Krauss Gerd Joachim
Priority date: 1983-06-21
Filing date: 1983-06-21
Publication date: 1987-04-29

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Apparatur zur Fraktionierung von Gemischen aus elektrisch geladenen Makromolekuelen verschiedener Groesse. Das Ziel der Erfindung ist es, eine Apparatur zu realisieren, mit deren Hilfe es moeglich ist, diese Fraktionierung beliebig oft wiederholbar und automatisierungsfaehig fuer analytische und biotechnologische Anwendung durchzufuehren. Das Wesen der Erfindung besteht darin, dass eine Kolonne thermostatisierter Kammern - durch Ultrafiltrationsmembranen gestaffelter Porengroesse voneinander getrennt - von einem elektrischen Gleichstrom durchflossen wird, wodurch sich die Membranen mit den Fraktionen belegen. Durch Umkehr der Polaritaet des elektrischen Feldes werden die Molekuele von den Membranen abgeloest und aus den Kammern ausgespuelt. Moegliche Einsatzgebiete sind die Vorfraktionierung von Enzymaktivitaeten, die Gewinnung grosser Proteinmengen fuer biotechnologische Zwecke, die Gewinnung von Enzymen als Therapeutika, die Vorreinigung von Proteinen fuer immunologische Untersuchungen, die Abtrennung von Proteinen aus biotechnologischen "Abwaessern" u. a.The invention relates to a method and apparatus for fractionating mixtures of electrically charged macromolecules of various sizes. The aim of the invention is to realize an apparatus with the help of which it is possible to carry out this fractionation as often as repeatedly and automatable for analytical and biotechnological application. The essence of the invention is that a column of thermostated chambers - separated by ultrafiltration membranes staggered pore size of each other - is traversed by a direct electrical current, whereby the membranes occupy with the fractions. By reversing the polarity of the electric field, the molecules are released from the membranes and purged from the chambers. Possible applications include the prefractionation of enzyme activities, the recovery of large quantities of protein for biotechnological purposes, the production of enzymes as therapeutics, the pre-purification of proteins for immunological investigations, the separation of proteins from biotechnological "effluents" u. a.

Description

Hierzu 2 Seiten ZeichnungenFor this 2 pages drawings

Field of application of the invention

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Apparatur zur elektrokinetischen Ultrafiltration von Makromolekülen und erlaubt die Fraktionierung von Makromolekülgemischen.The invention relates to a method and apparatus for the electrokinetic ultrafiltration of macromolecules and allows the fractionation of macromolecule mixtures.

Aus der Entwicklung der Biotechnologie und modernen Forschung ergibt sich in zunehmendem Maße der Bedarf an Apparaten zur leistungsfähigen Isolierung biologisch aktiver Proteine für folgende Einsatzgebiete:From the development of biotechnology and modern research there is an increasing demand for apparatuses for the efficient isolation of biologically active proteins for the following applications:

— Vorfraktionierung zur weiteren Hochreinigung und Charakterisierung von Enzymaktivitäten (biochem. Grundlagenforschung)- Prefractionation for further purification and characterization of enzyme activities (biochemical basic research)

— Gewinnung großer Proteinmengen für biotechnologische Zwecke: • Enzyme für die Trägerfixierung- Obtaining large amounts of protein for biotechnological purposes: • enzymes for carrier fixation

Ectoenzyme aus mikrowellen Kulturen zum Abbau von Zellstrukturen (Zellwandabbau — Protoplastierung, Proteinbereitstellung) Ectoenzymes from microwave cultures for the degradation of cell structures (cell wall degradation - protoplasting, protein supply)

Enzyme aus Zellhomogenaten (z. B. pflanzliche Zellkulturen) für die Biotransformation organischer Stoffe zu Arzneimitteln Enzymes from cell homogenates (eg plant cell cultures) for the biotransformation of organic substances to drugs

Enzyme für die Feinchemikalienbereitstellung (z. B. aus Racematen) Enzymes for the provision of fine chemicals (eg from racemates)

Ausgewählte biotechnologische Einsatzgebiete: Selected biotechnological applications:

Stärkeverarbeitung, Bauindustrie, Textilindustrie (Amylasen), Waschmittel, Käseproduktion, Lederindustrie (Proteasen), Frucht- und Gemüsesaftproduktion (Pektinasen, Amylasen), Backwarenherstellung (Amylasen, Proteasen) u.a.Starch processing, construction industry, textile industry (amylases), detergents, cheese production, leather industry (proteases), fruit and vegetable juice production (pectinases, amylases), bakery production (amylases, proteases) and others.

Fleischaufbereitung meat processing

— Gewinnung von Enzymen als Therapeutika, z. B. Applikation zur verbesserten Arzneimittelresorption; Kompensation der Insuffizienz bestimmter Organfunktionen; Behandlung von Erkrankungen- Obtaining enzymes as therapeutics, eg. B. Application for improved drug absorption; Compensation for the insufficiency of certain organ functions; Treatment of diseases

— Vorreinigung von Proteinen für immunologische Untersuchungen (z. B. in der Differentialdiagnostik)- Pre-purification of proteins for immunological investigations (eg in differential diagnostics)

— Abtrennung von Proteinen aus biotechnologischen „Abwässern", z. B. aus der Antibiotika-Produktion; Papierherstellung u.a...Separation of proteins from biotechnological "effluents", for example from antibiotics production, papermaking, etc.

— Der Apparat ist grundsätzlich auch zur Fraktionierung an derer Makromoleküle, wie Muco-Polysaccharide und Nukleinsäuren geeignet.- The apparatus is basically also suitable for fractionation of macromolecules, such as muco-polysaccharides and nucleic acids.

Characteristic of the known technical solutions

Es sind verschiedene Verfahren der elektrophoretischen Trennung von Polyelektrolyten bekannt. Dabei wird die elektrophoretische Beweglichkeit der Proteine genutzt, die von der Größe der Molekülladung sowie von der Größe und Form der einzelnen Teilchen abhängt. Darüber hinaus beeinflussen auch die Eigenschaften des Trägermediums die Wanderungsgeschwindigkeit. Bei der Freien Elektrophorese bewegen sich kolloidal gleöste Teilchen in der Untersuchungslösung unter elektrischer Feldwirkung. Dementsprechend sind die jeweils verwendeten Geräte sowie der Ablauf der elektrochemischen Vorgänge voneinander veschieden. Typische Beispiele sind Patente zur Ablenkungselektrophorese (US-PS 4.061.560, DE-PS 1.598.109, 1.698.181).Various methods of electrophoretic separation of polyelectrolytes are known. It uses the electrophoretic mobility of proteins, which depends on the size of the molecular charge as well as the size and shape of the individual particles. In addition, the properties of the carrier medium also influence the migration speed. In free electrophoresis, colloidally inert particles in the test solution move under an electric field effect. Accordingly, the devices used in each case as well as the course of the electrochemical processes are separated from each other. Typical examples are distraction electrophoresis patents (US Pat. No. 4,061,560, DE-PS 1,598,109, 1,698,181).

-2- 245 TZiS -2- 245 TZiS

Für die Ultrafiltration von Makromolekülen stehen verschiedene kommerziell angebotene Geräte, z. B. von der Firma Amicon, Niederlande, zur Verfugung, die die Abtrennung von Biopolymeren unter Druck über Filtermembranen erlauben. Effektive Möglichkeiten zur Entsalzung von Proteinen schafft die Elektrodialyse, wobei lonenaustauschermembranen, teilweise in Kombination mit elektroneutralen Ultrafiltrationsmembranen, verwendet werden, deren elektrische Widerstände die Wirtschaftlichkeit der Kammern bestimmen. Die bekannten technischen Lösungen erlauben lediglich eine Grobfraktionierung von großen (Proteinen) und kleinen (anorgan. Ionen) elektrischen Ladungsträgern.For the ultrafiltration of macromolecules are various commercially available devices, eg. From Amicon, Netherlands, which permit the separation of biopolymers under pressure via filter membranes. Effective ways of desalting proteins are achieved by electrodialysis, using ion exchange membranes, in part in combination with ultrafiltration electroneutral membranes, whose electrical resistances determine the economics of the chambers. The known technical solutions only allow coarse fractionation of large (proteins) and small (inorganic ions) electric charge carriers.

In den US-PS 2.801.962 und 3079.318 wird eine Proteinanreicherung durch dialytisch parallel geschaltete Kammern erreicht, wobei das angelegte Geleichspannungsfeld lediglich dieTrennung beschleunigt. Der Grad der Konzentration ist kontinuierlich schwer verfolgbar. Es ist sehr zweifelhaft, ob die Apparatur einen kontinuierlichen Langzeitbetrieb erlaubt. Die verwendeten Papierfilter bzw. Dialysemembranen verstopfen sehr schnell. In den Patenten werden keine Reinigungsmöglichkeiten beschrieben. Die Apparaturen erlauben keine Auftrennung von Molekülen unterschiedlicher Größe.In US Pat. Nos. 2,801,962 and 3,079,318, protein accumulation is achieved by dialytically parallel chambers, with the applied bias voltage field only accelerating separation. The degree of concentration is continuously difficult to track. It is very doubtful whether the apparatus allows continuous long-term operation. The paper filters or dialysis membranes used clog very quickly. The patents do not describe cleaning options. The apparatuses do not allow separation of molecules of different sizes.

In der US-PS 3.844.926 wird ein Elektrodialysator mit rotierender Außenkammer und zahlreichen Kammern um die Mittelachse des zylindrischen Gerätes beschrieben, der Enzymmixturen entsalzt. Neuere technische Lösungen ordnen mehrere Trennkammern mit Dialysemembranen an, wobei das elektrische Feld senkrecht zum Flüssigkeitsstrom angelegt wird (US-PS 4.043.859; 4.123.342; 4.276.140; EP 0.029.540).US Pat. No. 3,844,926 describes an electrodialyzer with a rotating outer chamber and numerous chambers around the central axis of the cylindrical apparatus which desalt enzyme mixtures. More recent technical solutions arrange several separation chambers with dialysis membranes, wherein the electric field is applied perpendicular to the liquid flow (US-PS 4,043,859, 4,123,342, 4,276,140, EP 0,029,540).

Ziel der ErfindungObject of the invention

Ziel der Erfindung ist es, eine Apparatur zu realisieren, die die Fraktionierung elektrisch geladener Makromoleküle ausflüssigen Gemischen, z. B. die Proteinfraktionierung und -anreicherung aus biologischen Flüssigkeiten, gestattet. Der Ablauf der Fraktionierung soll diskontinuierlich beliebig oft wiederholbar und automatisierungsfähig sein, so daß sowohl analytische wie biotechnologische Aufgaben erfüllt werden können. 'The aim of the invention is to realize an apparatus which the fractionation of electrically charged macromolecules of liquid mixtures, for. As the protein fractionation and enrichment from biological fluids allowed. The process of fractionation should be discontinuous as often repeatable and automated, so that both analytical and biotechnological tasks can be met. '

Darlegung des Wesens der ErfindungExplanation of the essence of the invention

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die Fraktionierung elektrisch geladener Makromoleküle mit Hilfe einer Kombination von Freier Elektrophorese und Ultrafiltration zu erreichen, wobei die Anzahl der Fraktionen und die Größe der Moleküle zu einer jeweils angepaßten Konfiguration der Apparatur führen sollen. Weiterhin sollen durch geeigneten Aufbau der Apparatur und die Wahl des Regimes der äußeren Parameter eine oftmalige Wiederholung des Fraktionierungsprozesses möglich und darüber hinaus nur ein minimaler Anteil von Verschleißteilen Bestandteil der Apparatur sein.The invention has for its object to achieve the fractionation of electrically charged macromolecules using a combination of free electrophoresis and ultrafiltration, the number of fractions and the size of the molecules should lead to a respectively adapted configuration of the apparatus. Furthermore, by suitable design of the apparatus and the choice of the regime of the external parameters, a repeated repetition of the fractionation process should be possible and, moreover, only a minimal proportion of wearing parts should be part of the apparatus.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß eine Kolonne von thermostatisierten Kammern verwendet wird, deren jede durch eine auswechselbare Ultrafiltrationsmembran einseitig abgeschlosse ist. Die Ausrüstung der aneinanderzureihenden Kammern erfolgt in Anpassung an die jeweils zu fraktionierenden Moleküle mit Membranen entsprechend gestaffelter Porengröße. Am Anfang und am Ende der Kolonne befinden sich je eine Kammer mit einer Elektrode zur Erzeugung eines elektrischen Feldes über die gesamte Länge der Kolonne.According to the invention the object is achieved in that a column of thermostatically controlled chambers is used, each of which is terminated on one side by an exchangeable ultrafiltration membrane. The equipment of the chambers to be joined is made in adaptation to the respective molecules to be fractionated with membranes corresponding staggered pore size. At the beginning and at the end of the column are each a chamber with an electrode for generating an electric field over the entire length of the column.

Jede der Kammern besitzt einen separaten Zu- und Abfluß und eine separate Thermostatisierung, so daß die Kolonne aus einer variablen Anzahl von Kammern nach dem Baukastenprinzip zusammengesetzt werden kann.Each of the chambers has a separate inlet and outlet and a separate thermostating, so that the column can be composed of a variable number of chambers according to the modular principle.

In Funktion werden die einzelnen Kammern im Parallelbetrieb an einen Thermostaten angeschlossen, alle Kammern außer der ersten werden mit Pufferlösung gefüllt und die erste Kammer wird mit dem zu fraktionierenden Gemisch beschickt. Nachdem die Kolonne auf diese Weise betriebsbereit ist, wird an die Elektroden der ersten und letzten Kammer eine elektrische Gleichspannung so angelegt, daß die Makromoleküle des Gemischs in Richtung Kolonne zu wandern beginnen. Beim Durchlaufen der Kolonne treffen die Moleküle auf das nach abnehmender Porengröße gestaffelte System der Ultrafiltrationsmembranen und belegen diese als Fraktion in der Reihenfolge abnehmender Molekülgrößen.In operation, the individual chambers are connected in parallel to a thermostat, all chambers except the first are filled with buffer solution and the first chamber is charged with the mixture to be fractionated. After the column is ready in this way, a DC electrical voltage is applied to the electrodes of the first and last chamber so that the macromolecules of the mixture begin to migrate in the direction of the column. As they pass through the column, the molecules impact the ultrafiltration membrane system, which is staggered by decreasing pore size, and occupy it as a fraction in the order of decreasing molecular sizes.

Um zu verhindern, daß durch Verstopfung einer Membran durch die dominierende Molekülgröße die Fraktionierung in einem unvollständigen Stadium teilweise zum Stillstand kommt, sollte durch eine vorangegangene Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese über die maximale Füllm'enge des Gemischs entschieden werden. Zusätzlich können an dieser Analyse optimale Anzahl und Porengröße der notwendigen Ultrafiltrationsmembranen bestimmt werden.To prevent clogging of a membrane by the dominating molecular size from partially arresting fractionation at an incomplete stage, prior polyacrylamide gel electrophoresis should be used to determine the maximum fill level of the mixture. In addition, the optimum number and pore size of the necessary ultrafiltration membranes can be determined from this analysis.

Wenn die Fraktionierung vollständig stattgefunden hat, was am Erreichen eines Sättigungswertes der Elektrodenspannung bei Konstantstrombetrieb bzw. des Elektrodenstromes bei Kostantspannungsbetrieb erkennbar ist, werden alle Kammern entleert, nachdem durch Umpolung des elektrischen Feldes die fraktionierten Moleküle von den Membranen abgelöst wurden.If the fractionation has taken place completely, as can be seen by reaching a saturation value of the electrode voltage in constant current operation or the electrode current in the case of constant voltage operation, all chambers are emptied after the fractionated molecules have been detached from the membranes by reversing the polarity of the electric field.

Danach kann der geschilderte Vorgang von vorn beginnen. Gegebenenfalls läßt sich der gesamte periodische Ablauf automatisieren.Then the described process can start over. Optionally, the entire periodic process can be automated.

Für die kontrollierende Messung der elektrischen Potentiale der Kolonne ist jede einzelne Kammer mit einer Meßelektrode ausgerüstet.For the controlling measurement of the electrical potentials of the column, each individual chamber is equipped with a measuring electrode.

Ausführungsbeispielembodiment

Die Erfindung soll nachstehend an einem Ausführungsbeispiel näher erläutert werden.The invention will be explained in more detail below using an exemplary embodiment.

Figur 1 zeigt die Kolonne für die fraktionierende elektrokinetische Ultrafiltration schematisch. Die einzelnen Kammern sind durch Ultrafiltrationsmembranen 1 gestaffelter Porengröße voneinander getrennt. Jede der Kammern stellt ein zylindrisches Doppelmantelgefäß dar. Zwischen äußerer Wandung 2 und innerer Wandung 3 befindet sich das Volumen mit Zu- und Abflußstutzen für den Durchlauf der Thermostatflüssigkeit, wobei alle Kammern parallel geschaltet sind.Figure 1 shows the column for fractional electrokinetic ultrafiltration schematically. The individual chambers are separated by ultrafiltration membranes 1 staggered pore size. Each of the chambers is a cylindrical jacketed vessel. Between outer wall 2 and inner wall 3 is the volume with inlet and outlet nozzles for the passage of the thermostat fluid, all chambers are connected in parallel.

Alle Kammern besitzen weiterhin einen Zu- und Abflußstutzen zum Innenraum, wobei die Kammer A mit dem zu fraktionierenden Primärgemisch, die Kammern B und C mit Pufferlösung gefüllt werden. Nach Beendigung der Fraktionierung verlassen die Kammer A ein sekundäres, d. h. das um die Fraktionen reduzierte Primärgemisch, die Kammern B die Fraktionen 1,2,...,n und die Kammer C ein Restgemisch von Pufferund Molekülen, die alle Membranen durchlaufen haben. Die Kammern A und C sind mit Platinelektroden 4 für das Anlegen des elektrischen Feldes an die Kolonne ausgerüstet. Die Kammern B besitzen je eine Elektrode 5 für die Messung des elektrischen Kammerpotentials.All chambers continue to have an inlet and outlet connection to the interior, wherein the chamber A with the primary mixture to be fractionated, the chambers B and C are filled with buffer solution. After completion of the fractionation leave the chamber A a secondary, d. H. the primary mixture reduced around the fractions, chambers B, fractions 1,2, ..., n, and chamber C a residual mixture of buffers and molecules that have passed through all the membranes. The chambers A and C are equipped with platinum electrodes 4 for the application of the electric field to the column. The chambers B each have an electrode 5 for the measurement of the electrical chamber potential.

Figur 2 zeigt die Kammern A, B und C im Schnitt. Die Verbindung der Kammern untereinander geschieht durch Schraubgewinde und zwischengelegte Dichtringe 6. Die Ultrafiltrationsmembranen 1 werden durch Schraubringe 7 auf die Dichtfläche des Kammeroberteils 8 gepreßt und sind somit leicht auswechselbar.Figure 2 shows the chambers A, B and C in section. The connection of the chambers with each other is done by screw thread and interposed sealing rings 6. The ultrafiltration membranes 1 are pressed by screw rings 7 on the sealing surface of the upper chamber part 8 and are thus easily interchangeable.

Claims

Invention claim:

1. A method for electrokinetic ultrafiltration of macromolecules, characterized in that free electrophoresis and ultrafiltration are combined, wherein after applying a DC electric field, a molecule mixture is separated by a chamber system with ultrafiltration membranes staggered pore size in fractions and the pore size of the ultrafiltration membranes according to the size of each directed to fractionating molecules.

2. The method according to item 1, characterized in that for carrying out the fractionation, the chamber A with the mixture and the chambers B and C are filled with buffer solution.

3. The method according to points 1 and 2, characterized in that all chambers are connected in parallel to a thermostat.

4. The method according to points 2 and 3, characterized in that after filling the chambers to the electrodes 4, a DC electrical voltage is applied.

5. The method according to the points 2,3 and 4, characterized in that after the occurrence of the current or voltage saturation, so completed occupancy of the membranes with the fractions, the current applied to the electrodes 4 DC voltage is temporarily reversed to the macromolecules of the Detach membranes and empty the chambers.

6. Apparatus for carrying out the method according to points 1 to 5, characterized in that a variable number of thermostatically controlled chambers are separated by ultrafiltration membranes arranged one behind the other and applied to a DC electrical voltage.

7. Apparatus according to item 6, characterized in that each chamber is double-walled and each has an inlet and outlet for cooling liquids and for the actual chamber contents.

8. Apparatus according to the items 6 and 7, characterized in that the chambers B and C are equipped with membranes 1 suitable pore size by means of suitable coupling mechanisms.

9. Apparatus according to the points 6 to 8, characterized in that the chambers A and C are each equipped with an electrode 4 for applying a DC electrical voltage to the column.

10. Apparatus according to the points 6 to 9, characterized in that the chambers B each have a guided in the radial direction through the chamber walls measuring electrode 5.

11. Apparatus according to items 6 to 10, characterized in that the construction of the column is effected by suitable combination of the number of individual chambers required for the fractionation. .

12. Apparatus according to items 6 to 11, characterized in that the chambers B and C are equipped with membranes which are adapted to the fraction to be fractionated macromolecules in the pore size and are arranged in the column after decreasing pore size.