DD245128A1 - Verfahren und apparatur zur elektrokinetischen ultrafiltration - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Apparatur zur Fraktionierung von Gemischen aus elektrisch geladenen Makromolekuelen verschiedener Groesse. Das Ziel der Erfindung ist es, eine Apparatur zu realisieren, mit deren Hilfe es moeglich ist, diese Fraktionierung beliebig oft wiederholbar und automatisierungsfaehig fuer analytische und biotechnologische Anwendung durchzufuehren. Das Wesen der Erfindung besteht darin, dass eine Kolonne thermostatisierter Kammern - durch Ultrafiltrationsmembranen gestaffelter Porengroesse voneinander getrennt - von einem elektrischen Gleichstrom durchflossen wird, wodurch sich die Membranen mit den Fraktionen belegen. Durch Umkehr der Polaritaet des elektrischen Feldes werden die Molekuele von den Membranen abgeloest und aus den Kammern ausgespuelt. Moegliche Einsatzgebiete sind die Vorfraktionierung von Enzymaktivitaeten, die Gewinnung grosser Proteinmengen fuer biotechnologische Zwecke, die Gewinnung von Enzymen als Therapeutika, die Vorreinigung von Proteinen fuer immunologische Untersuchungen, die Abtrennung von Proteinen aus biotechnologischen "Abwaessern" u. a.

Description

Hierzu 2 Seiten Zeichnungen

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Apparatur zur elektrokinetischen Ultrafiltration von Makromolekülen und erlaubt die Fraktionierung von Makromolekülgemischen.

Aus der Entwicklung der Biotechnologie und modernen Forschung ergibt sich in zunehmendem Maße der Bedarf an Apparaten zur leistungsfähigen Isolierung biologisch aktiver Proteine für folgende Einsatzgebiete:

— Vorfraktionierung zur weiteren Hochreinigung und Charakterisierung von Enzymaktivitäten (biochem. Grundlagenforschung)

— Gewinnung großer Proteinmengen für biotechnologische Zwecke: • Enzyme für die Trägerfixierung

Ectoenzyme aus mikrowellen Kulturen zum Abbau von Zellstrukturen (Zellwandabbau — Protoplastierung, Proteinbereitstellung)

Enzyme aus Zellhomogenaten (z. B. pflanzliche Zellkulturen) für die Biotransformation organischer Stoffe zu Arzneimitteln

Enzyme für die Feinchemikalienbereitstellung (z. B. aus Racematen)

Ausgewählte biotechnologische Einsatzgebiete:

Stärkeverarbeitung, Bauindustrie, Textilindustrie (Amylasen), Waschmittel, Käseproduktion, Lederindustrie (Proteasen), Frucht- und Gemüsesaftproduktion (Pektinasen, Amylasen), Backwarenherstellung (Amylasen, Proteasen) u.a.

Fleischaufbereitung

— Gewinnung von Enzymen als Therapeutika, z. B. Applikation zur verbesserten Arzneimittelresorption; Kompensation der Insuffizienz bestimmter Organfunktionen; Behandlung von Erkrankungen

— Vorreinigung von Proteinen für immunologische Untersuchungen (z. B. in der Differentialdiagnostik)

— Abtrennung von Proteinen aus biotechnologischen „Abwässern", z. B. aus der Antibiotika-Produktion; Papierherstellung u.a...

— Der Apparat ist grundsätzlich auch zur Fraktionierung an derer Makromoleküle, wie Muco-Polysaccharide und Nukleinsäuren geeignet.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Es sind verschiedene Verfahren der elektrophoretischen Trennung von Polyelektrolyten bekannt. Dabei wird die elektrophoretische Beweglichkeit der Proteine genutzt, die von der Größe der Molekülladung sowie von der Größe und Form der einzelnen Teilchen abhängt. Darüber hinaus beeinflussen auch die Eigenschaften des Trägermediums die Wanderungsgeschwindigkeit. Bei der Freien Elektrophorese bewegen sich kolloidal gleöste Teilchen in der Untersuchungslösung unter elektrischer Feldwirkung. Dementsprechend sind die jeweils verwendeten Geräte sowie der Ablauf der elektrochemischen Vorgänge voneinander veschieden. Typische Beispiele sind Patente zur Ablenkungselektrophorese (US-PS 4.061.560, DE-PS 1.598.109, 1.698.181).

-2- 245 TZiS

Für die Ultrafiltration von Makromolekülen stehen verschiedene kommerziell angebotene Geräte, z. B. von der Firma Amicon, Niederlande, zur Verfugung, die die Abtrennung von Biopolymeren unter Druck über Filtermembranen erlauben. Effektive Möglichkeiten zur Entsalzung von Proteinen schafft die Elektrodialyse, wobei lonenaustauschermembranen, teilweise in Kombination mit elektroneutralen Ultrafiltrationsmembranen, verwendet werden, deren elektrische Widerstände die Wirtschaftlichkeit der Kammern bestimmen. Die bekannten technischen Lösungen erlauben lediglich eine Grobfraktionierung von großen (Proteinen) und kleinen (anorgan. Ionen) elektrischen Ladungsträgern.

In den US-PS 2.801.962 und 3079.318 wird eine Proteinanreicherung durch dialytisch parallel geschaltete Kammern erreicht, wobei das angelegte Geleichspannungsfeld lediglich dieTrennung beschleunigt. Der Grad der Konzentration ist kontinuierlich schwer verfolgbar. Es ist sehr zweifelhaft, ob die Apparatur einen kontinuierlichen Langzeitbetrieb erlaubt. Die verwendeten Papierfilter bzw. Dialysemembranen verstopfen sehr schnell. In den Patenten werden keine Reinigungsmöglichkeiten beschrieben. Die Apparaturen erlauben keine Auftrennung von Molekülen unterschiedlicher Größe.

In der US-PS 3.844.926 wird ein Elektrodialysator mit rotierender Außenkammer und zahlreichen Kammern um die Mittelachse des zylindrischen Gerätes beschrieben, der Enzymmixturen entsalzt. Neuere technische Lösungen ordnen mehrere Trennkammern mit Dialysemembranen an, wobei das elektrische Feld senkrecht zum Flüssigkeitsstrom angelegt wird (US-PS 4.043.859; 4.123.342; 4.276.140; EP 0.029.540).

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist es, eine Apparatur zu realisieren, die die Fraktionierung elektrisch geladener Makromoleküle ausflüssigen Gemischen, z. B. die Proteinfraktionierung und -anreicherung aus biologischen Flüssigkeiten, gestattet. Der Ablauf der Fraktionierung soll diskontinuierlich beliebig oft wiederholbar und automatisierungsfähig sein, so daß sowohl analytische wie biotechnologische Aufgaben erfüllt werden können. '

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die Fraktionierung elektrisch geladener Makromoleküle mit Hilfe einer Kombination von Freier Elektrophorese und Ultrafiltration zu erreichen, wobei die Anzahl der Fraktionen und die Größe der Moleküle zu einer jeweils angepaßten Konfiguration der Apparatur führen sollen. Weiterhin sollen durch geeigneten Aufbau der Apparatur und die Wahl des Regimes der äußeren Parameter eine oftmalige Wiederholung des Fraktionierungsprozesses möglich und darüber hinaus nur ein minimaler Anteil von Verschleißteilen Bestandteil der Apparatur sein.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß eine Kolonne von thermostatisierten Kammern verwendet wird, deren jede durch eine auswechselbare Ultrafiltrationsmembran einseitig abgeschlosse ist. Die Ausrüstung der aneinanderzureihenden Kammern erfolgt in Anpassung an die jeweils zu fraktionierenden Moleküle mit Membranen entsprechend gestaffelter Porengröße. Am Anfang und am Ende der Kolonne befinden sich je eine Kammer mit einer Elektrode zur Erzeugung eines elektrischen Feldes über die gesamte Länge der Kolonne.

Jede der Kammern besitzt einen separaten Zu- und Abfluß und eine separate Thermostatisierung, so daß die Kolonne aus einer variablen Anzahl von Kammern nach dem Baukastenprinzip zusammengesetzt werden kann.

In Funktion werden die einzelnen Kammern im Parallelbetrieb an einen Thermostaten angeschlossen, alle Kammern außer der ersten werden mit Pufferlösung gefüllt und die erste Kammer wird mit dem zu fraktionierenden Gemisch beschickt. Nachdem die Kolonne auf diese Weise betriebsbereit ist, wird an die Elektroden der ersten und letzten Kammer eine elektrische Gleichspannung so angelegt, daß die Makromoleküle des Gemischs in Richtung Kolonne zu wandern beginnen. Beim Durchlaufen der Kolonne treffen die Moleküle auf das nach abnehmender Porengröße gestaffelte System der Ultrafiltrationsmembranen und belegen diese als Fraktion in der Reihenfolge abnehmender Molekülgrößen.

Um zu verhindern, daß durch Verstopfung einer Membran durch die dominierende Molekülgröße die Fraktionierung in einem unvollständigen Stadium teilweise zum Stillstand kommt, sollte durch eine vorangegangene Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese über die maximale Füllm'enge des Gemischs entschieden werden. Zusätzlich können an dieser Analyse optimale Anzahl und Porengröße der notwendigen Ultrafiltrationsmembranen bestimmt werden.

Wenn die Fraktionierung vollständig stattgefunden hat, was am Erreichen eines Sättigungswertes der Elektrodenspannung bei Konstantstrombetrieb bzw. des Elektrodenstromes bei Kostantspannungsbetrieb erkennbar ist, werden alle Kammern entleert, nachdem durch Umpolung des elektrischen Feldes die fraktionierten Moleküle von den Membranen abgelöst wurden.

Danach kann der geschilderte Vorgang von vorn beginnen. Gegebenenfalls läßt sich der gesamte periodische Ablauf automatisieren.

Für die kontrollierende Messung der elektrischen Potentiale der Kolonne ist jede einzelne Kammer mit einer Meßelektrode ausgerüstet.

Ausführungsbeispiel

Die Erfindung soll nachstehend an einem Ausführungsbeispiel näher erläutert werden.

Figur 1 zeigt die Kolonne für die fraktionierende elektrokinetische Ultrafiltration schematisch. Die einzelnen Kammern sind durch Ultrafiltrationsmembranen 1 gestaffelter Porengröße voneinander getrennt. Jede der Kammern stellt ein zylindrisches Doppelmantelgefäß dar. Zwischen äußerer Wandung 2 und innerer Wandung 3 befindet sich das Volumen mit Zu- und Abflußstutzen für den Durchlauf der Thermostatflüssigkeit, wobei alle Kammern parallel geschaltet sind.

Alle Kammern besitzen weiterhin einen Zu- und Abflußstutzen zum Innenraum, wobei die Kammer A mit dem zu fraktionierenden Primärgemisch, die Kammern B und C mit Pufferlösung gefüllt werden. Nach Beendigung der Fraktionierung verlassen die Kammer A ein sekundäres, d. h. das um die Fraktionen reduzierte Primärgemisch, die Kammern B die Fraktionen 1,2,...,n und die Kammer C ein Restgemisch von Pufferund Molekülen, die alle Membranen durchlaufen haben. Die Kammern A und C sind mit Platinelektroden 4 für das Anlegen des elektrischen Feldes an die Kolonne ausgerüstet. Die Kammern B besitzen je eine Elektrode 5 für die Messung des elektrischen Kammerpotentials.

Figur 2 zeigt die Kammern A, B und C im Schnitt. Die Verbindung der Kammern untereinander geschieht durch Schraubgewinde und zwischengelegte Dichtringe 6. Die Ultrafiltrationsmembranen 1 werden durch Schraubringe 7 auf die Dichtfläche des Kammeroberteils 8 gepreßt und sind somit leicht auswechselbar.

Claims (12)

1. Erfindungsanspruch:

   1. Verfahren zur elektrokinetischen Ultrafiltration von Makromolekülen, gekennzeichnet dadurch, daß Freie Elektrophorese und Ultrafiltration kombiniert werden, wobei nach Anlegen eines elektrischen Gleichfeldes ein Molekülgemisch durch ein Kammersystem mit Ultrafiltrationsmembranen gestaffelter Porengröße in Fraktionen getrennt wird und sich die Porengröße der Ultrafiltrationsmembranen nach der Größe der jeweils zu fraktionierenden Moleküle richtet.
2. 2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß für die Durchführung der Fraktionierung die Kammer A mit dem Gemisch und die Kammern B und C mit Pufferlösung gefüllt werden.
3. 3. Verfahren nach den Punkten 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß alle Kammern im Parallelbetrieb an einen Thermostaten angeschlossen werden.
4. 4. Verfahren nach den Punkten 2 und 3, gekennzeichnet dadurch, daß nach Füllung der Kammern an die Elektroden 4 eine elektrische Gleichspannung angelegt wird.
5. 5. Verfahren nach den Punkten 2,3 und 4, gekennzeichnet dadurch, daß nach Eintreten der Strom- bzw. Spannungssättigung, also abgeschlossener Belegung der Membranen mit den Fraktionen, die an den Elektroden 4 anliegende Gleichspannung kurzzeitig umgepolt wird, um die Makromoleküle von den Membranen ablösen und die Kammern entleeren zu können.
6. 6. Apparatur zur Durchführung des Verfahrens nach den Punkten 1 bis 5, gekennzeichnet dadurch, daß eine variable Anzahl von thermostatisierten Kammern durch Ultrafiltrationsmembranen voneinander getrennt hintereinander angeordnet sind und an eine elektrische Gleichspannung angelegt werden.
7. 7. Apparatur nach Punkt 6, gekennzeichnet dadurch, daß jede Kammer doppelwandig ausgeführt ist und je einen Zu- und Abfluß für Kühlflüssigkeiten und für den eigentlichen Kammerinhalt besitzt.
8. 8. Apparatur nach den Punkten 6 und 7, gekennzeichnet dadurch, daß die Kammern B und C mit Membranen 1 geeigneter Porengröße mit Hilfe geeigneter Kupplungsmechanismen ausgerüstet werden.
9. 9. Apparatur nach den Punkten 6 bis 8, gekennzeichnet dadurch, daß die Kammern A und C mit je einer Elektrode 4 zum Anlegen einer elektrischen Gleichspannung an die Kolonne ausgerüstet sind.
10. 10. Apparatur nach den Punkten 6 bis 9, gekennzeichnet dadurch, daß die Kammern B je eine in radialer Richtung durch die Kammerwände geführte Meßelektrode 5 besitzen.
11. 11. Apparatur nach den Punkten 6 bis 10, gekennzeichnet dadurch, daß der Aufbau der Kolonne durch geeignete Verbindung derfür die Fraktionierung jeweils benötigten Anzahl von Einzelkammern geschieht. ,
12. 12. Apparatur nach den Punkten 6 bis 11, gekennzeichnet dadurch, daß die Kammern B und C mit Membranen ausgerüstet werden, die in der Porengröße den zu fraktionierenden Makromolekülen angepaßt sind und in der Kolonne nach abnehmender Porengröße angeordnet werden.