DD240999A3 - Verfahren zur saccharosehydrolyse mittels polystyrengebundener enzyme - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Saccharosehydrolyse mittels immobilisierter Enzyme zur Erzeugung eines Glucose-Fructose-Gemisches, das in einem so hohen Reinheitsgrad vorliegt, dass es ohne groesseren Reinigungsaufwand als Kohlenstoffquelle zur Kultivierung industriell bedeutsamer Mikroorganismen sowie in der Suess-, Backwaren- und Getraenkeindustrie eingesetzt werden kann. Bei diesem Verfahren werden mechanisch und chemisch stabile, zur kovalenten Bindung hoher Enzymaktivitaeten geeignete Copolymerisate aus Styren und Divinylbenzen in gepackten Saeulenreaktoren unter Beseitigung stoerender Einflussfaktoren auf die Standzeit der Reaktorsaeulen ueber so lange Zeitraeume kontinuierlich verwendet, dass die Saccharosehydrolyse in einer oekonomisch guenstigen Weise erfolgt. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass die zu spaltende Saccharoseloesung einer kurzzeitigen, kontinuierlichen Waermebehandlung unterworfen, auf die Prozesstemperatur abgekuehlt und anschliessend nach Durchlaufen eines adsorptiven Reinigungsschrittes den Hauptreaktor passiert, danach im Produktstrom zur Kontrolle hinsichtlich einer etwaigen mikrobiellen Kontamination der p H-Wert kontinuierlich ueberwacht wird und die Hydrolyseprodukte in einer an sich bekannten Weise aufgearbeitet werden.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erzeugung eines Glucose-Fructose-Gemisches aus Saccharose mit Hilfe trägergebundener Enzyme. Das Verfahren läßt sich in der Süß- und Backwarenindustrie, der Getränkeindustrie, der Imkereiwirtschaft und darüber hinaus überall dort anwenden, wo größere Mengen Glucose-Fructose-Sirup benötigt werden, so z. B. bei der zum Zwecke der Produktion von Antibiotika, Hormonen, Enzymen und ähnlichen Stoffen biogenen Ursprungs erfolgenden Kultivierung bestimmter Mikroorganismen.

Charakterisierung der bekannten technischen Lösungen

Hefeinvertase spielt in der Likör-, Süß- und Backwarenindustrie eine bedeutende Rolle, insbesondere zur Erzeugung nichtkristallisierende'r Cremes, zur Herstellung flüssiger Fondantkerne bei Pralinen, zur Weich- und Geschmeidigmachung von Marzipan- und Persipanmasse sowie bei der Kunsthonigproduktion. Zum Teil wird das Enzym selbst dem herzustellenden Produkt als glycerin-oder sorbitstabilisiertes Präparat zugesetzt.

Der größte Anteil des benötigten Invertzucker wurde bisher durch Hydrolyse von Saccharose mit Mineralsäuren hergestellt; aber die dabei entstehenden Verunreinigungen, die durch die saure Spaltung der bei der Inversion produzierten Fructose gebildet werden und hauptsächlich aus Hydroxymethylfurfural, Lävulinsäure, Ameisensäure und Undefinierten Bräunungsprodukten mit hoher Farbintensität bestehen, erschweren die Reinigung des Produkts, so daß sogar nach Entfernung des größten Teils der Verunreinigungen Spuren davon enthalten sind, die z. B. ein Verschneiden des Honigs mit diesem Invertzucker unmöglich machen. Von Nachteil sind dabei weiterhin der hohe Energieaufwand und die Diskontinuität des Verfahrens.

Ein Nachteil des obengenannten Verfahrens läßt sich durch saure Hydrolyse mit Hilfe von Polystyrensulfonat-Kationenaustauschern (GB-PS Nr. 1,085,696) überwinden, da hierbei der Prozeß kontinuierlich gestaltet werden kann. Die Bildung unerwünschter Nebenprodukte läßt sich bei diesem Verfahren jedoch nicht unterdrücken.

Da die enzymatische Hydrolyse weitaus schonender abläuft und keine Nebenprodukte, die eine Färbung oder einen unerwünschten Beigeschmack des Erzeugnisses verursachen können, gebildet werden, wird dieses Verfahren, das wenig apparativen Aufwand erfordert und besser kontrollierbar ist, bevorzugt. Von Nachteil ist, daß dieses Verfahren chargenweisen Betrieb erfordert und das eingesetzte lösliche Enzym nicht aus der Reaktionsmischung zurückgewonnen werden kann, sondern durch Einwirkung hoher Temperaturen inaktiviert wird, was sich wiederum in hohen Energiekosten niederschlägt.

Um diesen Erhitzungsschrittzu umgehen und das Enzym für weitere Reaktionen verfügbarzu machen, kann das Enzym mit Hilfe physikalischer oder chemischer Methoden an ein in Wasser unlösliches, festes Trägermaterial gebunden werden. Die gebildeten Enzym-Träger-Komplexe können z. B. in Rührgefäßen oder Strömungsrohren stationär oder fluid zur kontinuierlichen Spaltung der Substrate eingesetzt werden, wodurch einige der oben beschriebenen Nachteile umgangen werden.

Viele Patente und Druckschriften beschreiben die Immobilisierung von Hefeinvertase.

Eine kleine Auswahl soll dies veranschaulichen: FILIPPUSSON und HORNBY, Biochem. J. 120,215 (1970); BOUDRANT und CHEFTEL, Biotechnol. Bioeng. 17,827 (1975); KOBAYASHI und MOO-YOUNG, Biotechnol. Bioeng. 15,47 (1973); U.S. Patente 4,113,567; 3,847,743; 3,915,795; Japan. Kokai 77,105,282; 77,105,281; 7,425,185; FR-PS 2,233,334; DE-OS 2930859; 2154672; 2360647; 2413694.

Das französische Patent Nr. 2,233,334 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung immobilisierter Invertase und zur Hydrolyse einer kommerziellen Saccharoselösung, bei dem das Enzym an einen makroporösen Ionenaustauscher auf Polystyrenbasis (Amberlite IRA 93) gebunden und bei 30⁰C in einem Festbettreaktor mit 50%iger kommerzieller Saccharoselösung in Acetatpuffer pH 4,0 in Kontakt gebracht wird.

Das japanische Patent Nr. 7,425,185 beinhaltet die adsorptive Bindung von Invertase am Amberlite XAD-12, einem Trägermaterial aus Polystyren.

Die Nachteile der beiden Verfahren bestehen in der geringen Stabilität des adsorptiv gebundenen Enzyms, die sich vor allem bei der Anwendung höherer Saccharosekonzentrationen bemerkbar macht und allgemein bekannt ist, sowie in der relativ niedrigen Umsatzrate (73% nach acht Tagen bei 30⁰C für das französische Patent).

Zusammenfassend kann eingeschätzt werden, daß die Vielzahl der in der Literatur beschriebenen Enzym-Träger-Komplexe zwar die generelle Eignung immobilisierter Invertase zur Saccharosehydrolyse belegt, aber bisher industriell nicht verwertet wird, weil die Herstellung entsprechender Glucose-Fructose-Gemische auf dem Wege der Isomerisierung von Glucose mit immobilisierter Glucoseisomerase im Anschluß an die Stärkehydrolyse industriell erfolgt oder weil die bisher synthetisierten Enzym-Träger-Komplexe den Anforderungen an einen großtechnischen Einsatz hinsichtlich Preis, Zugänglichkeit und mechanischer Belastbarkeit des Trägermaterials sowie in bezug auf die katalytische Wirksamkeit und/oder die Stabilität der Enzym-Träger-Komplexe nicht genügten.

Die bisher an Polystyren durchgeführten Untersuchungen haben ergeben, daß die Trägermatrix mit ihren spezifischen Eigenschaften neben der Art der Bindung des Enzyms die enzymatische Aktivität und Stabilität der Enzym-Träger-Komplexe sehr wesentlich bestimmt.

Die aufgeführten Patente, bei denen Invertase an Polystyren (Amberlite XAD-12 und IRA 93) gebunden wurde, zeigen, daß die kommerziell verfügbaren Polystyrene (Amberlite, Dowex) keine für die Enzymbindung optimale Struktur besitzen oder daß die verwendete Bindungsmethode den Anforderungen nicht entsprach.

Ein mit Aminomethyl- oder Ethylendiaminomethylgruppen funktionalisiertes, poröses Styren-Divinylbenzen-Copolymerisat erwies sich bei der Immobilisierung glykosidspaltender Enzyme als optimal. Die Struktur dieses Polymeren wurde bereits in einem früheren Schutzrecht des Anmelders (vgl. DD-PS Nr. 149679) dargelegt.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Hydrolyse von Saccharose mittels polystyrengebundener Enzyme zu entwickeln, bei dem die Spaltprodukte in einer ökonomisch günstigen Variante erzeugt werden können, wobei auch das Problem des Langzeitbetriebes des Enzymreaktors zur Erzeugung des Glucose-Fructose-Gemisches gelöst ist und außerdem die gebildeten Produkte in einem so hohen Reinheitsgrad vorliegen, daß sie ohne größeren Reinigungsaufwand als Kohlenstoffquelle zur Kultivierung industriell bedeutsamer Mikroorganismen sowie in der Süß- und Backwarenindustrie, der Imkereiwirtschaft und in der Getränkeindustrie eingesetzt werden können.

Wesen der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, unter Verwendung eines immobilisierten saccharosespaltenden Enzyms eine ökonomisch günstige Verfahrensweise für die Hydrolyse von Saccharose zu entwickeln, die es zugleich gestattet, die Reaktionsprodukte — Glucose und Fructose — in einer kürzeren Zeit und in einer höheren Reinheit herzustellen, als dies bei konventionellen Verfahren der Fall ist.

Dabei sollen die in einem früheren Schutzrecht des Anmelders beschriebenen, mechanisch und chemisch stabilen, zur Bindung hoher Enzymaktivitäten geeigneten Copolymerisate aus Styren und Divinylbenzen in gepackten Säulenreaktoren unter Beseitigung solcher Einflußfaktoren auf die Standzeit der Reaktorsäulen, wie z. B. einer möglichen mikrobiellen Kontamination oder einer Verstopfung der Oberflächenporen des Trägermaterials, über so lange Zeiträume kontinuierlich betrieben werden, daß die Standzeit der Reaktoren im wesentlichen nur durch die thermische Denaturierung des Enzymproteins limitiert wird. Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß man zunächst soviel kristalline Saccharose in Wasser oder in einem geeigneten Puffer auflöst, bis der Trockensubstanzgehalt zwischen 20 und70°Brix liegt. Bei Verwendung von nichtraffinierter Saccharoselösung muß derTrockensubstanzgehalt durch Hinzufügen von Wasser oder durch Eindampfen so korrigiert werden, bis er im obengenannten Bereich liegt. Falls erforderlich, kann in diesem Fall auch eine Reinigung des Substrates nach bekannten Methoden (Filtration, Ionenaustausch o.a.) erfolgen, bevor es dem erfindungsgemäßen Verfahren unterworfen wird. Entsprechend des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die wäßrige oder schwach abgepufferte Saccharoselösung zur Abtötung unerwünschter Mikroorganismen einer kurzzeitigen, kontinuierlichen Wärmebehandlung (10 bis 30 Minuten bei 90⁰C) unterworfen und anschließend auf die optimale oder eine andere gewünschte Prozeßtemperatur abgekühlt, worauf das Substrat in ein im folgenden als Vorsäule bezeichnetes Adsorptionsrohr geleitet wird. Dieses muß eine Größe von 10 bis 50% des Volumens des Hauptreaktors aufweisen und sich gegebenenfalls temperieren lassen. Als Adsorptionsmittel können granulierte Aktivkohle, Adsorberharze (z. B. Wofatit EA60), Enzym-Träger-Materialien auf Polystyrenbasis (z. B. Wofatit Y58, Versuchsprodukt des VEB Chemiekombinat Bitterfeld), partiell inaktivierte oder inaktivierte Enzym-Träger-Komplexe, wobei das Enzym die Fähigkeit zur Saccharosehydrolyse besitzt oder besaß, sowie andere granuläre Adsorptionsmittel verwendet werden.

Von wesentlicher Bedeutung für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Reihenfolge, in der die letztgenannten Verfahrensschritte realisiert werden. Während im Normalfall der keimzahlreduzierende Schritt erst unmittelbar vor dem Hauptreaktor liegt, erfolgt bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die Wärmebehandlung vor der adsorptiven Reinigung. Damit wird eine hohe Reaktorstandzeit gesichert, denn durch die Wärmebehandlung werden unerwünschte Proteine denaturiert und flocken bei der Abkühlung auf die optimale Prozeßtemperatur aus und lassen sich durch die natürliche

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Filterwirkung der Vorsäule leicht entfernen. Zugleich bewirkt eine mit Polystyrenadsorberharzen oder mit Enzym-Träger-Materialien auf Polystyrenbasis gefüllte Vorsäule eine befriedigende Adsorption von eventuell vorhandenen Kondensationsprodukten der MAILLARD-Reaktion. Die Einschaltung der Vorsäule in den Substratstrom verringert außerdem wesentlich die Gefahr einer Verstopfung des Hauptreaktors. Damit erhöht sich die Standzeit des Enzymreaktors beträchtlich. Um den kontinuierlichen Betrieb des Hauptreaktors zu sichern, wird die prinzipiell bekannte Methode der Parallelschaltung zweier oder mehrerer Vorsäulen angewandt, von denen jeweils eine mittels geeigneter Rohrverbindungen und Absperrvorrichtungen mit dem Hauptreaktor und dem Wärmetauscher zur Temperierung des Substrates verbunden ist, die anderen jedoch mit einer geeigneten Methode regeneriert werden bzw. in Reserve verbleiben.

Die Regenerierung von Polystyrenadsorberharzen oder Enzym-Trägermaterialien auf Polystyrenbasis erfolgt entsprechend dei in der DD-PS Nr. 2221090 dargelegten Methode mittels Ultraschallbehandlung oder durch Behandeln mit Natronlauge. Nach Passieren der Vorsäule wird die Saccharoselösung mittels einer Dosierpumpe durch den Hauptreaktor gepumpt. Dieser enthält Invertase, wobei das Enzym durch Bindung an einen Träger auf Polystyrenbasis, der aus einem mit Stickstoff enthaltenden Gruppen, am aromatischen Kern substituierten, porösen Copolymerisat aus Styren und/oder einem substituierter Styren und einer oder mehreren Verbindungen mit mehreren nicht konjugierten Vinylgruppen sowie gegebenenfalls anderen Monomeren, das in Gegenwart von porenbildenden Hilfsstoffen hergestellt wurde, wasserunlöslich gemacht wurde. Die Struktur des verwendeten Polymeren ist dadurch bestimmt, daß das Verhältnis der Monomeren mit einer und den Monomerer mit mehreren Vinylgruppen zwischen 8:2 und 9,5:0,5 Gewichtsteilen liegt und der porenbildende Hilfsstoff in einer Menge von 0,75 bis 0,90 Gewichtsteilen pro Gewichtsteil der Monomeren eingesetzt wird.

Die Bindung des Enzyms erfolgte nach Aktivierung der sich am aromatischen Kern des Trägers befindlichen stickstoffhaltigen funktionellen Gruppen mit 1,4-Benzochinon (J.FISCHER, R.ULBRICH und A.SCHELLENBERGER [1978], Acta Biol. Med. Germ. 37, (1413-1424) oder mit Glutaraldehyd (M. D. LILLY [1976], „Methods in Enzymology" 44,46). Zur rechtzeitigen Erkennung einer eventuellen mikrobiologischen Kontamination wird der pH-Wert des den Hauptreaktor verlassenden Produktstroms kontrolliert, da es sich gezeigt hat, daß eine Kontamination zum Absinken des pH-Wertes im Produktstrom führt. Dadurch ist es möglich, sofort Maßnahmen zur Desinfektion der Gesamtanlage oder auch nur des Hauptreaktors einzuleiten, d. h. schneller, als wenn die Keimzahl des Produktes z. B. nach der KOCHschen Plattenverdünnungsmethode bestimmt wird.

Das im Hauptreaktor erzeugte Glucose-Fructose-Gemisch kann nach bekannten Methoden getrennt oder aber sofort oder nach Korrektur des Trockensubstanzgehaltes zu den obengenannten Zwecken verwendet werden.

Ausführungsbeispiele

Die aufgeführten Ausführungsbeispiele sollen die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Hydrolyse von Saccharose zwecks Erzeugung eines Glucose-Fructose-Gemisches und die Leistungsfähigkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens zeigen.

Beispiel 1

Beispiel 1 soll die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens im Labormaßstab demonstrieren. Zunächst werden 2g Invertase-Polystyren-Komplex durch Aktivierung eines synthetischen, Ethylendiaminomethyl- oder Aminomethylgruppenhaltigen Trägermaterials (Wofatit Y58, VEB Chemiekombinat Bitterfeld) mit Glutaraldehyd und durch anschließende kovalente Bindung von Invertase (Saccharomycescerevisiae) hergestellt.

Die Aktivität des hergestellten Invertase-Polystyren-Komplexes beträgt 1320 U/g, wobei 1 U die Freisetzung von 1 μηηοΙ Glucose/ min und 1 μιηοΙ Fructose/min bei 25°Cund einem pH-Wert von 4,5 (0,025 M Natriumacetatpuffer) katalysiert. Eine durch Auflösen von Saccharose in Wasser hergestellte Substratlösung wird durch Filtration gereinigt. Entsprechend des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Substrat mit Hilfe einer geeigneten Pumpe in einen auf 90°C erhitzten Wärmetauscher gepumpt, der solche Abmessungen besitzt, daß die Verweilzeit des Substrates bei einer Flußgeschwindigkeit von 50 ml/h 10 bis 30 min beträgt. Zur Realisierung der oben angegebenen Verweilzeit verwendet man eine Glaswendel mit einem Durchmesser von 5 mm. In einem sich anschließenden Kühler gleicher Dimensionierung wird das Substrat auf die im Reaktor vorherrschende Temperatur von 40⁰C abgekühlt und durch eine ebenfalls temperierte Vorsäule (40⁰C) geleitet, deren Volumen 10 bis 50% des Hauptreaktors beträgt und mit 2 ml Wofatit Y58 gefüllt ist. Eine für die Adsorption unbrauchbar gewordene Vorsäule wird durch eine zweite, parallel geschaltete Vorsäule ersetzt, wenn der vorher auf einen bestimmten Wert festgesetzte Druckabfall erreicht wird.

Durch Umpumpen von Natronlauge wird die außer Betrieb genommene Vorsäule von adsorptiven Verunreinigungen befreit und kann nach Auswaschen der überschüssigen Natronlauge mit Wasser erneut zur Substratfeinreinigung eingesetzt werden. Nach Passieren des Wärmetauschers und der Vorsäule wird die Saccharoselösung in den Hauptreaktor (1 x 5,6cm) geleitet, der im Abwärtsstrom betrieben wird und mit 1,7 g Ivertase-Polystyren-Komplex gefüllt ist. Der erreichte Umsatzgrad wird durch Bestimmung der freigesetzten Glucosemenge mit Hilfe der Glucoseoxidase/Peroxidase-Methode ermittelt.

Beispiel 2

Charakterisierung der Leistungsfähigkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens Um die Leistungsfähigkeit der Invertase-Polystyren-Komplexe zu demonstrieren, wird die Flußgeschwindigkeit des Substrates durch den Reaktor im unter Beispiel 1 aufgeführten System in weiten Grenzen variiert. Tabelle 1 macht deutlich, daß der oben beschriebene Reaktor bis zu acht Bettvolumina/h bei gleichbleibend hohem Hydrolysegrad umsetzen kann.

Tabelle 1

Flußgeschwindigkeit

(ml/h) 87 47 21 16

Umsatzgrad (%) 69,5 95,0 97,0 97,3

Beispiel 3

Dieses Beispiel soll den Einfluß der Temperatur auf die Saccharosehydrolyse mit an Polystyren immobilisierter Invertase darstellen.

Dazu wird die Versuchsanordnung gemäß Beispiel 1 verwendet, mit dem Unterschied, daß die Aktivierung des funktionalisierten Polystyrens (130mg) mit 1,4-Benzochinon anstelle von Glutaraldehyd erfolgt und die Substratlösung einen Trockensubstanzgehalt von 171g Saccharose/l 0,025 M Natriumacetatpuffer, pH 4,5, aufwies. Die so ermittelten kinetischen Halbwertszeiten polystyrengebundener Invertase sind in Tabelle 2 zusammengestellt.

Tabelle 2

Temperatur (⁰C) 70 65 60

Halbwertszeit (Tage) 0,22 2,2 7,1 20,3

Claims (10)

1. Erfindungsansprüche:

   1. Verfahren zur Saccharosehydrolyse mittels polystyrengebundener Enzyme, gekennzeichnet dadurch, daß die zu spaltende Saccharoselösung vor dem Inkontaktbringen mit dem polystyrengebundenen Enzym einem adsorptiven Reinigungsschritt unterzogen wird.
2. 2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß als saccharosespaltendes Enzym Hefeinvertase verwendet wird.
3. 3. Verfahren nach Punkt !,gekennzeichnet dadurch, daß die adsorptive Reinigung des Substrates in einem kontinuierlichen temperierbaren System aus mehreren, jedoch mindestens zwei parallel zueinander geschalteten, wechselseitig betriebenen Vorsäulen erfolgt.
4. 4. Verfahren nach den Punkten 1 und 3, gekennzeichnet dadurch, daß die Größe der Vorsäulen zur adsorptiven Reinigung so bemessen ist, daß sie 10 bis 50% des Volumens des Hauptreaktors beträgt.
5. 5. Verfahren nach den Punkten 1,3 und 4, gekennzeichnet dadurch, daß als Füllstoff für die Vorsäulen granulierte Aktivkohle, Adsorberharze oder Enzym-Trägermaterialien auf Polystyrenbasis, vorzugsweise jedoch das zur Immobilisierung des saccharosehydrolysierenden Enzyms verwendete optimale Polymere auf Polystyrenbasis eingesetzt wird.
6. 6. Verfahren nach den Punkten 1,3,4 und 5, gekennzeichnet dadurch, daß auch mehrfach regenerierte, mindestens jedoch dreimal regenerierte Enzym-Trägermaterialien auf Polystyrenbasis, deren Einsatz im Hauptreaktor aufgrund der geringen Aktivität nicht mehr gerechtfertigt ist, eingesetzt werden.
7. 7. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die zu spaltende Saccharoselösung vor dem adsorptiven Reinigungsschritt einer kurzzeitigen, kontinuierlichen Wärmebehandlung unterworfen und dadurch auf die optimale Prozeßtemperatur abgekühlt wird.
8. 8. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Wärmebehandlung des Substrates in einem kontinuierlichen System bei einer Temperatur von 70 bis 100°C, vorzugsweise jedoch bei 90°C durchgeführt wird.
9. 9. Verfahren nach den Punkten 1 und 8, gekennzeichnet dadurch, daß die Dauer der Wärmebehandlung des Substrates 5 bis 30, vorzugsweise jedoch zwischen 10 und 15 Minuten beträgt.
10. 10. Verfahren nach den Punkten 1,5 und 6, gekennzeichnet dadurch, daß die Regenerierung verbrauchter Füllmaterialien der Vorsäulen durch Behandlung mit einer wäßrigen Alkalihydroxidlösung, vorzugsweise jedoch mit Natronlauge erfolgt.