DD234441A1 - Verfahren zur herstellung von vektorplasmiden mit polylinker - Google Patents

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von neuen Vektorplasmiden, darunter vorzugsweise solchen mit Polylinker. Das unmittelbare Anwendungsgebiet der Erfindung liegt in der Gentechnologie sowie auf anderen Gebieten der Molekularbiologie. Die Erfindung verfolgt das Ziel, aus dem bekannten Streptokokken-Plasmid pGB301 durch aufeinanderfolgend ausgefuehrte Komplexe von an sich bekannten gentechnologischen Verfahrensschritten schrittweise die neuen, gleichfalls mehrfachfunktionellen Streptokokken-Vektorplasmide pGB360, pGB361, pGB362, pGB363 und pGB3634 sowie pGB364 und pGB3644 zu erzeugen. Diese Aufgabe wird in der Weise geloest, dass aus pGB301 durch Heraustrennen der das Chloramphenikolresistenzgen tragenden Region zunaechst Plasmid pGB360, aus diesem durch Fusion mit der ueber einen Polylinker verfuegenden RF-Form des E. coli-Phagen M13mp8 dann die chimaeren Plasmide pGB361 sowie pGB362, hieraus durch Elimination des M13mp8 RF-Rumpfes die Plasmide pGB363 sowie pGB364 und aus diesen durch Umkonstruktion eines singulaeren Restriktase-Spaltortes die modifizierten Plasmide pGB3634 und pGB3644 hergestellt wird bzw. werden.

Description

Ausreichende Mengen an pGB360-DNS, wie sie für die anschließenden Teile des vorliegenden Verfahrens zur Herstellung von neuen Vektorplasmiden mit Polylinker benötigt werden, werden bevorzugt auf an sich bekannte Weise (Kultivierung von Str. sanguis Challis 57 (pGB360)-Proben und anschließende Isolierung der Plasmid-DNS aus diesen Kulturen) bereitgestellt, m nächsten Komplex von Verfahrensschritten wird zunächst die doppelsträngige replikative Form (RF-Form) des E. coli-Phagen VI13mp8,

der bei einer Molekülgröße von 6,4kb einen 36bp langen Polylinker in sich trägt, welcher singuläre Spaltorte für die Restriktasen EcoRI, BamHI, Sail, Accl, Hindll, Smal, Xmal, Pstl sowie Hindlll aufweist und in dessen unmittelbarer Nachbarschaft sich einer der Haelll-Orte des Phagen befindet,

τι it der Restriktase Accl, also innerhalb des Polylinkers, linearisiert (Durch diese Linearisierung werden notwendigerweise auch die Spaltorte für die Restriktasen Sail und Hindll zerstört.). Parallel dazu wird Plasmid pGB360 mit Hpall, einer Restriktase, die :um Accl-Ortvon M13mp8 kompatible sticky ends liefert, linearisiert. Unter Einsatz von DNS-Ligase, vorzugsweise von DNS-Jgasedes Bakteriophagen T4, werden die so vorbereiteten Komponenten M13mp8 RF χ Accl und pGB360 χ Hpall zu neuen Chimären Plasmiden pGB361 und pGB362 (Größe jeweils ca. 14,7kb) ligiert.

3eide Plasmide unterscheiden sich hinsichtlich der Insertionsrichtung der M13mp8 RF-Komponente voneinander: Bei Plasmid dGB361 ist der M13mp8 RF-Anteil so in die pGB360-Komponente eingefügt, daß der Pstl-Spaltort des Polylinkers in nächster Mähe des BstEII-Spaltortes von pGB360 liegt; bei Plasmid pGB362 hingegen liegt diese Einfügung in der Weise vor, daß der 3amHI-Spaltort des Polylinkers dem BstEII-Spaltort von pGB360 am nächsten liegt.

Aus dem bei obiger Ligation anfallenden Reaktionsgemisch werden die Chimären Plasmide in der Weise abgetrennt, daß mit 'roben dieses Gemisches Kulturen eines Streptokokken-Rezipientenstammes, vorzugsweise Kulturen von Str. sanguis Challis 57, transformiert werden und auf der Basis der resultierenden Transformanten ein screening nach DNS-Molekülen im 3rößenbereich um 15,0 kb durchgeführt wird. Über eine anschließende Restriktionsanalyse werden unter den (den einzelnen Fransformanten-Stämmen eindeutig zugeordneten) DNS-Portionen mit Molekülgrößen aus dem 15,0kb-Suchbereich nun eweils diejenigen ermittelt, die dem Plasmid pGB361 oder dem Plasmid pGB362 zugeordnet sind. Auf diesem Wege können jnter den Transformanten-Klonen eindeutig solche, "die vom Typ Str. sanguis Challis 57 (pGB361 (sind, von jenen abgetrennt «erden, die vom Typ Str. sanguis Challis 57 (pGB362) sind.

Λ/ar Plasmid pG360 noch als ein Vorstufenplasmid zu charakterisieren, so liegen mit pGB361 und pGB362 im hier beschriebenen /erfahren die ersten neuen Vektorplasmide vor, die einen Polylinker in sich tragen. Bei pGB361 und pGB362 handelt es sich um :rifunktionelle Vektoren; sie sind sowohl in Bakterien verschiedener Streptokokken-Spezies als auch in Bakterien der Arten E. coli jnd B. subtilis replikationsfähig.

Nach in an sich bekannter Weise erfolgter Bereitstellung einer ausreichenden Menge von pGB361-bzw. pGB362-DNS wird das /erfahren mit einem Komplex von Verfahrensschritten fortgesetzt, mit denen aus jeder dieser beiden Chimären unter Erhalt des ^Dolylinkers der M13mp8 RF-Rumpf entfernt wird. Dazu werden pGB361 und pGB362 mit der Restriktase Haelll = BspRI gespalten. Vlitdem Einsatz gerade dieses Enzyms wird der M13mp8 RF-Rumpf in mehrere Fragmente zerlegt; daneben fällt jeweils ein ca. 3,6kb großes Hauptfragment an, von welchem durch anschließende Nachverdauung mit der Restriktase EcoRI ein letztes ^estf rag ment des M13mp8 RF-Rumpfes abgetrennt wird. Nach Auffüllen der sticky ends des EcoRI-Spaltortes mittels Klenow- ^:ragment der DNS-Polymerase I werden diese aus pGB360 und den jeweils verbleibenden Polylinkeranteilen bestehenden Hauptfragmente durch blunt end-Selbstligation zu den neuen Plasmiden pGB363 und pGB364 geschlossen, wobei durch die gewählte experimentelle Anordnung der EcoRI-Spaltorte im Polylinker-Abschnitt jeweils wieder hergestellt wird. Ms bevorzugter Rezipientenstamm zur Aufbewahrung und Vermehrung der Plasmide pGB363 und pGB364 wird wiederum Str. sanguis Challis 57 herangezogen.

/Vie das Vorstufenplasmid pGB360 haben die jetzt erhaltenen Polylinker-Plasmide pGB363 und pGB364eine Molekülgröße von eweils ca. 8,3 kb. Neben den 7singulären Restriktase-Spaltorten, die von pGB360 in diese Plasmide eingebracht werden — es iandelt sich bekanntlich um Spaltorte für die Restriktasen BstEII, Bell, Sphl, Pvull, Hpal, Kpnl und Aval —, stammen die übrigen 3 singuiären Restriktase-Spaltorte, über die diese Plasmide verfügen (Pstl, Hpall, EcoRI, Smal, Xmal, BamHI), aus dem vom ³hagen M13mp8 übernommenen Polylinker (vgl. Abb.2). Anzumerken ist noch, daß in den Plasmiden pGB363 und pGB364als Ergebnis der verfahrensgemäßen Operationen der Polylinker nicht in ursprünglicher, sondern in in sich umgeklappter Reihung /orliegt.

Anzumerken ist weiterhin, daß in der Polylinker-Region dieser Plasmide die Spaltorte für die beiden Restriktasen Smal und Xmal äbstandslos nebeneinander angeordnet sind. Diese Positionierung hat zur Folge (s. a. Abb.2), daß in den erhaltenen Plasmiden dGB363 und pGB364 wiederum ein unikaler Spaltort für die Restriktase Hpall besteht.

Das Verfahren wird schließlich mit einem Komplex von Verfahrensschritten abgeschlossen, mit dem jeweils eine Hpall-Ort-freie Vlodifikation der Plasmide pGB363 und pGB364 hergestellt wird. Hierzu wird Plasmid pGB363 bzw. pGB364 zunächst jeweils mit der Restriktase Hpall linearisiert, danach werden die entstandenen sticky ends mittels Klenow-Fragment der DNS-Polymerase I so aufgefüllt, daß bei nachfolgender blunt end-Selbstligation an der Verbindungsstelle der nunmehr entstehenden neuen ^Dlasmide pGB3634 bzw. pGB3644 ein Spaltort für die Restriktase Sacll konstituiert wird. Dieser Spaltort ist für Plasmid pGB3634 /vie tür Plasmid pGB3644 jeweils eine singuläre Spaltsieile (vgl. Abb..?).

Als Rezipient wird für diese neuen Plasmide gleichfalls bevorzugt der Stamm Str. sanguis Challis 57 herangezogen. Biologisch reine Kulturen von Str. sanguis-Stämmen, die einige der verfahrensgemäß hergestellten neuen Plasmide in sich Tagen, sind unter den Registriemummem ΣΙΜΕΤfür Stamm Str. sanguis Challis 57 (pGB363) ZIMETfür Stamm Str. sanguis Challis 57 (pGB3634)

η der ZIMET-Hinterlegungsstelle für Mikroorganismen, Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie der AdW der DDR, 6900 Jena, Beutenbergstr. 11, hinterlegt worden.

Vlit den Polylinker-tragenden Plasmiden pGB363 und pGB3634 einer- sowie pGB364 und pGB3644 andererseits stehen im 3ereich der grampositiven Bakterien, vorzugsweise für solche aus den Gattungen Streptococcus und Bacillus, primäre, ätrukturoptimierte Klonierungsvektoren als Trägerreplika für anschließende gentechnologische Projekte, so zum Beispiel für die Instruktion von Expressionsvektoren, zur Verfügung. In alle diese Plasmide sind aus dem Basisplasmid pGB301 die <opiekontrollregion (Cop), die Replikationsregion (Rep) und das Makrolidresistenzgen (MLS^R-Gen) unverändert übernommen /vorden; außerdem weisen sie jeweils ein Reststück des Chloramphenikolresistenzgens von pGB301 auf. Vor allem im Ergebnis

des Polylinker-Einbaus besitzen alle diese Plasmide an günstiger Position eine Anhäufung von singulären Spaltorten für eine Reihe von Restriktasen, darunter für so gebräuchliche wie EcoRI, Pstl, BamHI, BstEII, Bell sowie Smal bzw. Sacll. Es liegen damit Trägerreplika vor, aus denen möglichst vielfältig einsetzbare Expressionsvektoren aufgebaut werden können.

Ausführungsbeispiele ' " ~""^:

1. Gewinnung des Zwischenplasmides pGB360

DNS des Plasmids pGB301 wird aus Zellen des Stammes Streptococcus sanguis Challis 57 (pGB301) — Stamm ZIMET 10721 — in der folgenden Weise gewonnen:

500ml einer Übernacht-Kultur von Challis 57 (pGB301), die in BHI-Medium mit 2,5% Pferdeserum, lOmmol D,L-Threonin und 5(ag/ml Erythromycin gezüchtet wurde, werden für 15 IVlinuten bei 5000 bis 6000 U/min zentrifugiert. Diesedimentierten Zellen werden einmal mit lOmmol Tris-HCI (pH 8,0) gewaschen und anschließend in 50ml desselben Puffers resuspendiert. Nach Zugabe einer Lysozymlösung (5ml lOmmol Tris-HCI, pH 8,0, mit 150mg Lysozym) wird für 90 Minuten bei 37⁰C inkubiert und dann 1 mg Protease K hinzugesetzt. Nach weiteren 30 Minuten Inkubation bei 37⁰C wird die Lyse der Zellen durch Zugabe von 10ml einer 10%SDS-Lösung bewerkstelligt. DasZellysatwirddann30 Minuten bei 4°C und 22QOOU/min zentrifugiert, um den größten Teil derchromosomalen DNS zu entfernen. Der plasmidhaitige Überstand wird gewonnen und mit 12 ml einer 5mol NaCIC^-Lösung versetzt. Es folgen schließlich zur Deproteinisierung je eine Extraktion der DNS-Lösung mit je einem Volumen puffergesättigtem Phenol-Chloroform-Gemisch (2:1) und Chloroform-Isoamylalkohl-Gemisch (24:1). Anschließend wird die DNS mit 2,5 Volumenteilen 96%igem Ethanol in der Kälte (-2O⁰C) gefällt, sedimentiert und getrocknet. Dei DNS wird zuletzt in 10ml TES-Puffer(50mmol Tris-HCI, pH 8,0; 5mmol EDTA, 50mmol NaCI) aufgenommen. Zur Abtrennung und Reinigung der Plasmid-DNSvon kontaminierender chromosomaler DNS wird in an sich bekannter Weise eine Ethidiumbromid-Cäsiumchlorid-Dichtegradienten-Zentrifugation ausgeführt. Am Ende liegt die gereinigte zirkuläre Plasmid-DNS in einer Lösung in lOmmol Tris-HCI, pH 7,5, vor und wird bei 4⁰C aufbewahrt.

Fünf /ig der so gewonnen Plasmid-DNS werden in an sich bekannter Weise in einem Endvolumen von 80μΙ zunächst mit ca. 5 Einheiten des Restriktionsenzyms BspRI (=Haell) linearisiert. Nachdem die Vollständigkeit der Spaltung durch die gelelektrophoretische Analyse einer Probe bestätigt wurde, werden 3 Einheiten eines zweiten Restriktionsenzyms, BstEII, zugesetzt und für 2 Stunden bei 60°C inkubiert. Die Spaltung von pGB301 in ein ca. 8,3 und ein ca. 1,5 großes Fragment wird wieder gelelektrophoretisch kontrolliert. Die mit beiden Enzymen komplett gespaltene pGB301-DNS wird dann einmal mit puffergesättigtem Phenol, einmal mit Chloroform-Isoamylaikohol (24:1) und zweimal mit Ether extrahiert. Die DNS wird schließlich mit2,5-Volumenteilen96%igem Ethanol für 15 Minuten bei -70°C gefällt, in der Eppendorfzentrifuge sedimentiert, getrocknet und in 50μΙ desfolgenden Puffers gelöst: lOmmol Tris-HCI, pH 7,6; 7 mmol MgCI₂; 60mmol NaCI; 1 mmol DTE. Nach Zugabe von je 2μΙ 2mmol dATP, 2mmol dGTP und 2mmol dTTP sowie einer Einheit Klenow-Fragment der DNS-Polymerase I wird 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Durch die Reaktion werden die einzelsträngigen 5'-Enden des BstEII-Spaltortes aufgefüllt. In der nachfolgenden blunt end-Selbstligation des 8,3kb großen BspRI-BstEII-Fragmentesvon pGB301 wird so der BstEII-Ort rekonstruiert. Nach der Klenow-Reaktion wird die DNS abermals mit 2,5VT 96%igem Ethanol bei -70°C gefällt, sedimentiert, getrocknet und schließlich in 50μΙ Ligationspuffer resuspendiert (66mmol Tris-HCI, pH 7,5; 6,6mmol MgCI₂). Dreißig μΙ dieser DNS-Präparation werden dann Γηί^^μΙ lOmmol ATPund 100 mmol DTE versetzt und nach Zugabe von einer Einheit T4-DNS-Ligase über Nacht bei Raumtemperatur belassen.

Das Ligationsgemisch wird am nächsten Morgen 5 Minuten auf 65°C erhitzt und die DNS anschließend mit 2,5VT 96%igem Ethanol bei -70⁰C für 15 Minuten gefällt. Die sedimentierte und getrocknete DNS wird in 25μΙ lOmmol Tris-HCI, pH 7,5, aufgenommen und anschließend in an sich bekannter Weise mit dem Restriktionsenzym BspRI gespalten. Dadurch wird ein Teil der möglicherweise rekonstruierten pGB301-Plasmide vor der Transformation zerstört. In dem Ligationsgemisch befinden sich daher vorwiegend dieSelbstligationsprodukte des 8,3 kb großen BspRI-BstEII-Fragments von pGB301.

Diese DNS-Moleküle werden durch Transformation in den plasmidfreien Streptococcus sanguis-Stamm Challis 57 eingeführt. Die Herstellung kompetenter Challis 57-Zellen und die Transformation wird in an sich bekannter Weise ausgeführt. Plasmidtragende Transformantenklone werden auf BHI-Agarplatten, die 5μg/ml Erythromycin enthalten, selektiert. Im Ergebnis dieserTransformation lagen ca. 400 Erythromycinresistente Transformantenklone vor. Einige davon wurden einem Plasmid-Screening unterworfen, das wie folgt abläuft:

20 ml Kulturen der jeweiligen Transformanten, die über Nacht in BHI-Medium mit 2,5% Pferdeserum, 10 mmol D,L-Threonin und 5μg/ml Erythromycin gewachsen sind, werden zentrifugiert und die Zellen einmal mit lOmmol Tris-HCI pH 8,0 gewaschen. Die Zellen werden danach in 0,5ml des gleichen Puffers resuspendiert, dem zuvor jedoch 4mg/ml Lysozym zugesetzt worden sind. Nach einer Inkubation von 90 Minuten bei 37 °C wird 0,1 ml einer Protease K-Lösung (0,5mg/ml) zugesetzt und für weitere 30 Minuten bei 37⁰C inkubiert. Die Lyse der Zellen wird dann durch Zugabe von 0,6 ml puffergesättigtem Phenol und vorsichtiges Mischen bewirkt. Bei der sich anschließenden Zentrifugation (5 Minuten in der Eppendorfzentrifuge) wird zusammen mit dem Protein ein Großteil der chromosomalen DNS entfernt. Die plasmidhaitige wäßrige Phase wird noch einmal mit Phenol und schließlich mit 1 ml Chloroform-Isoamylalkohol-Gemisch (24:1) extrahiert/bevor mit 2,5VT Ethanol für 10 Minuten bei -7O⁰C gefällt wird. Die präzipierte und getrocknete DNS wird zum Schluß in 50 μΙ lOmmol Tris-HCI, pH 7,5, gelöst und bei 4°C aufbewahrt.

Von diesen Plasmid-Schnellisolaten werden je 15μΙ mit dem Restriktionsenzym BstEII gespalten und im Vergleich mit linearisierter pGB301 Plasmid-DNS gelelektrophoretisch in an sich bekannter Weise analysiert. Im Ergebnis wird ein Transformantenklon identifiziert, der das ca. 8,3 kb große neueZwischenplasmid pGB360 enthält. Diesem Plasmid fehlt im Vergleich zu pGB301 der größte Teil des Chloramphenikolresistenzgens. Der auf pGB360 verbleibende kurze Rest dieses Gens ist inaktiv. Das Plasmid pGB360 zeichnet sich gegenüber pGB 301 durch eine Klusterung der unikalen Restriktionsorte für die Enzyme Hpall, BstEII und Bell in einem ca. 200 bp bis 300 bp großen Bereich aus. Im Gegensatz zu pGB301 hat pGB360 keinen Schnittpunkt für das Enzym BspRi (= Haelll) mehr und bietet mit diesen Eigenschaften die Voraussetzung für die weiteren experimentellen Schritte zum Einfügen eines Polylinkers.

2. Konstruktion der Chimären neuen Plasmide pGB361 und pGB362

Eine ausreichende Menge gereinigter pGB360-Plasmid-DNS, wie sie für die nachfolgenden Verfahrensschritte nötig ist, wird in der bereits für pGB301 beschriebenen Art und Weise aus dem Stamm Challis 57 (pGB360) gewonnen. Die für den nachfolgenden Verfahrensschritt ebenfalls notwendige doppelsträngige replikative Form (RF-Form) des einzelsträngigen E. coli-Bakteriophagen M13mp8 wird wie folgt bereitgestellt:

ton einem Indikatorrasen des E. coli-Stammes JM103 wird mit einem sterilen Zahnstocher ein blauer „Plaque" des Phagen <113mp8 in 1 ml 2 χ TY-Medium eingeimpft und über Nacht bei 37⁰C geschüttelt. Am nächsten Tag werden 100ml steriles 2 χ Ύ-Medium mit 0,2ml der über Nacht gewachsenen phageninfizierten JM103-Zellen und mit 2 ml einer nicht infizierten jbernachtkulturvon JM103 beimpft. Anschließend wird für 5 Stunden unter Schütteln bei 37⁰C inkubiert. Die phageninfizierten lellen mitderplasmidförmigen RF-Form von M 13mp8 werden gewaschen und in an sich bekannter Weise wie für eine Plasmid-)NS-lsolation aufgearbeitet. Die RF-Form von M13mp8wird dann noch durch Zentrifugation im Ethidiumbromid- !läsiumchlorid-Dichtegradienten von kontaminierender chromosomaler E. coli-DNS gereinigt. Am Schluß liegt die M13mp8 iF-DNS gelöst in lOmmol Tris-HCI, pH 7,5, vor und wird bei 4°C oder -20°C aufbewahrt.

^g des Plasmids pGB360 werden sodann in einem Gesamtvolumen von 25μΙ mit dem Restriktionsenzym Hpall in an sich )ekannter Weise gespalten. Die linearisierte pGB360-DNS wird zur Inaktivierung der Restriktase zunächst mit puffergesättigtem 'henol, dann einmal mit Chloroform-Isoamylalkohol (24:1) und schließlich zweimal mit Ether extrahiert. Vor diesen Extraktionen vardas Probenvolumen auf insgesamt 100μΙ mit lOmmol Tris-HCI, pH 7,5, aufgefüllt worden. Die mit 2,5VT96%igem Ethanol >ei -70⁰C gefällte Plasmid-DNS wird am Ende in 20μΙ ügationspuffer aufgelöst:

'arallelzu pGB360 werden 5^g der RF-DNS von M13mp8in einem Gesamtvolumen von 75μΙ mit dem Restriktionsenzym Accl inearisiert. Diese gespaltene M13mp8 RF-DNS wird zur Inaktivierung des Enzyms in derfür pGB360 ausgeführten Weise iehandelt. Der unikale Accl-Ort von Μ 13mp8 RF hat die Sequenz 5'GTCGAC3' und ist somit auch ein Erkennungsort für die testriktasen Sail und Hindll. Mit Accl geschnitten, entsteht ein überlappendes 5'-sticky end (5' ca gc tg 3'), das mit dem durch

-Ipall generierten kompatibel ist. ___ —— ~ ~~~ ~~

η der nachfolgenden Ligationsreaktion werden daher die mit Hpall bzw. Accl linearisierten DNSen von pGB360 und M13mp8 RF :u Chimären Molekülen miteinander verknüpft. Dazu werden 1μΙ pGB360-DNS x Hpall mit 19μΙ M13mp8 RF-DNS x Accl gemischt, mit 2μΙ lOmmol ATP, 2μΙ lOOmmol DTE und 0,5 Einheiten T4-DNS-Ligase versetzt und über Nacht bei Raumtemperatur belassen. Mit diesem Ligationsgemisch werden am nächsten Tag kompetente Zellen des plasmidfreien Streptococcus sanguis-StammesChallis 57 in an sich bekannter Weise transformiert. PlasmidtragendeTransformanten werden auf BHI-Agarplatten mit 5/xg/ml Erythromycin selektiert.

Eine geeignete Zahl von Transformantenklonen wird isoliert und in der bereits beschriebenen Art und Weise einem Screening auf Plasmid-DNS unterzogen. Zur Identifikation der gewünschten rekombinanten pGB360:M13mp8 RF-Chimären werden je 15μΙ der Plasmid-Schnellisolate mit dem Restriktionsenzym EcoRI gespalten und im Vergleich mit geeigneten Standard-DNSen [pGB360 mit Hpall gespalten und DNS des E. coii-Bakteriophagen λ mit Hindill gespalten) in an sich bekannter Weise analysiert. Solche Transformantenklone, die Plasmide mit einer Größe von ca. 15kb enthalten, werden für die Isolation von gereinigter ³lasmid-DNS ausgewählt. Die Spaltung dieser gereinigten Plasmid-DNSen mit den Restriktionsenzymen EcoRI, BamHI, BspRI (= Haelll), BstEII und BamHI + BstEII sowie die nachfolgende gelelektrophoretische Größenanalyse der entstandenen Fragmente gestatten eine eindeutige Identifikation der neuen Chimären Plasmide pGB361 und pGB362. Diese Plasmide sind beide jeweils ;a. 14,7kbgroß. Sie unterscheiden sich nur durch die Insertionsorientierung der M13mp8RF-Komponente: η pGB362 liegt der unikale BamHI-Spaltort des M13mp8RF-Polylinkers in unmittelbarer Nachbarschaft des unikalen BstEII-Ortes /on pGB360; in pGB361 hingegen sind beide Orte durch den M13mp8RF-Anteil,d.h. um ca. 7,2 kb, voneinander getrennt. Durch die Fusion der beiden Moleküle sind der Accl/Sall/Hindll-Spaltort des Polylinkers von M13mp8 RF und der unikale Hpall-3paltortvon pGB360 zerstört worden. Infolge der Chimärenbildung ist ferner der M13mp8 RF-Polylinkerin der Mitte gespalten; die beiden Hälften flankieren jetzt den M13mp8 RF-Anteil der Chimären Plasmide. Es befinden sich daher in unmittelbarer Nachbarschaft der Fusionsorte der beiden Plasmide die unikalen Spaltorte für EcoRI, Smal, Xmal und BamHI auf der einen Seite jnd für Pstl auf der anderen Seite. In unmittelbarer Nachbarschaft der Pstl-Ortes befindet sich noch ein BspRI (= Haelll)-Schnittortausder M13mp8 RF-Sequenz.

3. Konstruktion der Polylinker-tragenden neuen Plasmide pGB363 und pGB3634 Eine ausreichende Menge gereinigter pGB361-Plasmid-DNS, wie sie für die nachfolgenden Verfahrensschritte nötig ist, wird in der bereits für pGB301 beschriebenen Art und Weise aus dem Stamm Streptococcus sanguis Challis 57 (pGB361) gewonnen. Etwa 5μg der pGB361-DNS werden in einem Gesamtvolumen von 125μΙ mit dem Restriktionsenzym EcoRI in an sich bekannter i/Veise linearisiert. Die Vollständigkeit der Spaltung wird durch gelelektrophoretische Analyse einer Probe kontrolliert, bevor die Restriktase durch lOminütiges Erhitzen des Reaktionsgemisches auf 70⁰C inaktiviert wird. Anschließend wird die lineare Plasmid-DNS in 2,5 VT 96%igem Ethanol in der Kälte (-70⁰C; 10 Minuten) gefällt. Die sedimentierte und getrocknete DNS wird in 30μΙ des für das Klenow-Fragmentder DNS-Polymerase I geeigneten Puffers obiger Zusammensetzung gelöst und mit je 2μΙ 2mmol dATPund 2mmol dTTP versetzt. Nach Zugabe von einer Einheit Klenow-Fragmentder DNS-Polymerase I wird 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wird die DNS-Probe erneut erhitzt (10 Minuten, 7O⁰C) und mit 2,5VT 36%igem Ethanol in der Kälte (-70⁰C; 10 Minuten) gefällt. Die präzipitierte und getrocknete Plasmid-DNS wird schließlich in 50μΙ lOmmol Tris-HCI, pH 7,5, aufgenommen. Durch die Behandlung mit dem Klenow-Fragment sind die einzelsträngigen 5'-Enden des EcoRI-Spaltortes aufgefüllt worden, so daß jetzt lineare pGB361 -DNS mit glatten doppelsträngigen Enden vorliegt. Diese DNS wird dann mit der Restriktase BspRI (= Haelll) in an sich bekannter Weise weiter gespalten. Hiervo ι ist nur der M13mp8 RF-Anteil von pGB361 betrogen, der in 16 kleinere Fragmente zerlegt wird. Der pGB360-Anteil ist frei von BspRI-Spaltorten.

Das Enzym BspRI generiert glatte doppelsträngige Enden an seinen Spaltstellen, so daß in der nachfolgenden Reaktion eine Selbstligation des mit Polylinkeranteilen beladenen pGB360-Restes möglich wird, wobei der EcoRI-Ort rekonstruiert wird. Für die nachfolgende Ligationsreaktion wird die (EcoRI-t-BspRI)-gespaltene pGB361-DNS erneut mit 2,5VT 96% Ethanol in der Kälte gefällt und in 20μΙ Ligationspuffer aufgenommen. Nach Zusatz von 2μΙ lOOmmol DTE, 2μΙ lOmmol ATP und einer Einheit T4-DNS-Ligase wird das Reaktionsgemisch über Nacht bei Raumtemperatur belassen. Am nächsten Tag wird dieses Ligationsgemisch zur Transformation kompetenter Zellen des plasmidfreien Streptococcus sanguis-Stammes Challis 57 in an sich bekannter Weise eingesetzt. Piasmidtragende Transformantenklone werden wiederum auf BHI-Agarplatten mit 5μg/ml Erythromycin selektiert. Einige Transformantenklone werden einem Plasmid-Screening in der bereits beschriebenen Weise unterworfen.

Die Plasmidschnellisolate dieser Transformanten werden mit dem Restriktionsenzym EcoRI gespalten und gelelektrophoretisch in an sich bekannter Weise analysiert. Dabei wird ein solcher Transformantenklon identifiziert, der ein neues Plasmid von pGB360-Größe trägt, das aber mit dem Enzym EcoRI an einer Stelle spaltbar ist. Dieses Plasmid wird als pGB363 bezeichnet. Eine

größere Menge von Plasmid pGB363 wird für die weiteren Arbeiten in der in Beispiel 1 fürpGB301 beschriebenen Art und Weise isoliert und gereinigt. Zur Bestätigung der Struktur von pGB363 wird das Plasmid einer Analyse mit den Restriktionsenzymen BstEll, EcoRI, Hpall und BamHI unterworfen.

Diese Analyse bestätigt, daß der Polylinker von M13mp8 RF in der erwarteten Weise in pGB363 vorliegt (siehe Abb. 2). Dabei ist der Polylinker auf pGB363 ein in sich umgeklappter M13mp8 RF-Polylinker, in dem durch die Fusionsreaktion die gemeinsame unikale Spaltsequenz für dei Enzyme Accl, Hindll, Sail zerstört ist. Dafür ist der in der Saml-, Xmal-Erkennungssequenz des Polyiinkers enthaltene Hpall-Spaltort jetzt als zusätzlicher unikaler Restriktionsspaltort auf pGB363 vorhanden (siehe Abb.2).

In einem letzten Verfahrensschritt wird ein Hpall-Ort-freies Plasmidderivat von pGB363 konstruiert. Dazu wird gereinigte pGB363-DNS mit dem Restriktionsenzym Hpail in an sich bekannter Weise linearisiert. Die dabei entstehenden einzelsträngigen 5'-Enden werden in der bereits beschriebenen Weise durch das Klenow-Fragment der DNS-Polymerase I in Anwesenheit von dCTP und dGTP in doppeisträngige glatte Enden umgewandelt, so daß bei der nachfolgenden Selbstligation der Hpall-Ort von pGB363 zerstört wird und im Polylinker stattdessen ein Sacll-Schnittort entsteht, der ebenfalls unikal für dieses Plasmid ist.

Ligationsreaktion und Transformation dieses als pGB3634 bezeichneten neuen Plasmides sowie seine Charakterisierung erfolgen in analoger Weise wie für pGB363 beschrieben (s. a. Abb. 3).

4. Konstruktion der Polylinker-tragenden neuen Plasmide pGB364 und pGB3644 Die Konstruktion des Polylinker-tragenden neuen Plasmides pGB364 erfolgt nach den gleichen Verfahrensschritten wie für pGB363. Es wird lediglich das chimäre Plasmid pGB362 als Ausgangsplasmid benutzt.

Im Ergebnis liegt das neue Plasmid pGB364 vor, das den gleichen Polylinker wie pGB363 trägt, nur liegt dieser in umgekehrter Orientierung vor.

Aus Plasmid pGB364 wird abschließend das Hpall-Ort-freie neue Plasmid pGB3644 erzeugt, indem pGB364 den gleichen Operationen unterworfen wird, wie sie im voranstehenden Beispiel auf Plasmid pGB363 zum Zwecke der Herstellung von pGB3634 angewendet worden waren.

Claims (3)

1. Erfindungsanspruch:

   1. Verfahren zur Herstellung von Vektorplasmiden mit Polylinker unter Nutzung von an sich bekannten gentechnologischen Standardverfahrensschritten, gekennzeichnet dadurch, daß

   — aus Plasmid pGB301 durch Heraustrennen seiner das Chloramphenikolresistenzgen tragenden Region unter Selbstligation zunächst ein verkleinertes, neues Streptokokken-Plasmid pGB360 (Molekülgröße 8,3kb) konstruiert wird,

   — Plasmid pGB360 dann mit der RF-Form des E. coli-Phagen M13mp8, weicher einen 6 pGB360-fremde singuläre Restriktase-Spaltorte aufweisenden Polylinker in sich trägt, entweder zum neuen Chimären Plasmid pGB361 oder zum neuen Chimären Plasmid pGB362 (Molekülgröße jeweils 14,7 kb) fusioniert wird,

   — anschließend die Plasmide pGB361 bzw. pGB362 durch Heraustrennung des M13mp8 RF-Rumpfes unter Selbstligation in die neuen Polylinker-tragenden Vektorplasmide pGB363 bzw. pGB364 (Molekülgröße jeweils 8,3kb) umgewandelt werden und

   — aus den Plasmiden pGB363 bzw. pGB364 durch Umkonstruktion des jeweils singuläreri Hpall-Spaltortes in einen Sacll-Spaltort die neuen, Polylinker-tragenden Vektorplasmide pGB3634 bzw. pGB3644 gleicher Molekülgröße erhalten werden.
2. 2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß für die Fusionierung Plasmid pGB360 mit der RestriktaseHpall und die RF-Form des Phagen M13mp8 innerhalb des Polylinkers mit Restriktase Accl linearisiert werden.
3. 3. Verfahren nach Punkt 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß aus den Plasmiden pGB361 bzw. pGB362derM13mp8RF-Rumpf durch aufeinanderfolgende Verdauung mit den Restriktasen Haelll = BspRI und EcoRI herausgetrennt wird.

   Hierzu 3 Seiten Zeichnungen

   Anwendungsgebiet der Erfindung

   Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von neuen Vektorplasmiden, die einen Polylinker tragen und vorteilhaft zur Klonierung von Fremdgenen sowie für die Konstruktion spezialisierter Vektoren herangezogen werden können. Die Erfindung bietet Anwendungsmöglichkeiten in der Gentechnologie sowie auf anderen Gebieten der Molekularbiologie und nachgelagert damit in der Human- und Veterinärmedizin, in der Pflanzen- und Tierproduktion, in der Nahrungsmittelerzeugung und in der pharmazeutisch-chemischen Industrie.

   Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

   Bekannt ist aus der Patentschrift DD 206562, die ein Verfahren zur Herstellung von pGB-Vektorplasmiden zum Gegenstand hat, unter anderem das Streptokokken-Plasmid pGB 301. Dieses Plasmid ist (vgl. Abb. 1)

   — durch eine Molekülgröße von 9,8kb

   — durch singuläre Spaltorte für die Restriktasen Hpall, BspRI, BstEII, Bell, Sphl, Pvull, Hpal, Kpnl und Aval sowie

   — durch das Vorhandensein von 2 Resistenzmarkern, nämlich denen für die Chloramphenikol- und die Makrolidresistenz (Cam^R,MLS^R),

   charakterisiert.

   Daneben verfügt Plasmid pGB301 jedoch auch über Eigenschaften bzw. Parameter, die bei seinem Einsatz in gentechnologischen Konstruktionen eher nachteilig zu Buche schlagen. So weist dieses Plasmid zum einen noch ein relativ großes Molekulargewicht auf, und zum anderen besitzt es keine Spaltorte für so gebräuchliche Restriktionsenzyme wie Pstl, EsoRI und BamHI.

   Ziel der Erfindung

   Die Erfindung verfolgt das Ziel, neue Vektorplasmide, darunter vorzugsweise solche mit Polylinker, für die Gentechnologie und für andere Bereiche der DNS-Forschung bereitzustellen.

   Darlegung des Wesens der Erfindung

   Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zu beschreiben, mit dessen Hilfe aus dem Streptokokken-Plasmid pGB301 durch aufeinanderfolgend ausgeführte Komplexe von gentechnologischen Verfahrensschritten schrittweise neue Vektorplasmide, darunter vorzugsweise solche mit Polylinker, erzeugt werden können. Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe wie folgt gelöst:

   Benötigte Mengen an Plasmid pGB301-DNS werden vorzugsweise zunächst in der Weise gewonnen, daß aus einer Kultur von Streptococcus sanguis Challis 57 (pGB301) das Plasmid in an sich bekannter Weise isoliert, gereinigt und in TrisHCI-Puffer gelöst wird. Der plasmidtragende Stamm ist im Zusammenhang mit früheren Arbeiten in der ZIMET-Hinterlegungssteile für Mikroorganismen, Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie der AdW der DDR, 6900 Jena, Beutenbergstr. 11, unter der Registriernummer ZIMET 10721 hinterlegt worden.

   Aus so bereitgestellten Proben von DNS des sowohl in Streptokokken als auch in Baciilus-Stämmen funktions- und replikationsfähigen sowie ausrerh~nd stabilen Plasmids pGB301 wird durch Öffnen mit den Restriktionsenzymen BspRI und BstEII der Großteil des Chloramphenikolresistenzgens entfernt. Beim zurückbleibenden pGB301 -Hauptfragment werden die sticky ends des BstEII-Ortes mittels Klenow-Fragment der DNS-Polymerase I aufgefüllt. Das so präparierte linearisierte pGB301-Hauptfragment wird mittels blunt end-Selbstligation unter Wiederherstellung des BstEII-Spaltortes zum neuen Plasmid pGB360 geschlossen; dieses Plasmid wird zur Transformation von Str. sanguis Challis 57 herangezogen. DasZwischenplasmid pGB360 weist eine Molekülgröße von ca. 8,3kb auf und ist durch eine für die nachfolgenden Verfahrensschritte günstige Anordnung bestimmter Restriktase-Spaltorte gekennzeichnet. Plasmid pGB360 besitzt singuläre Spaltorte für die Restriktasen Hpall, BstEII, Bell, Sphl, Pvull, Hpal, Kpnl und Aval. In der Region zwischen seinem Bcll-und seinem BstEII-Spaltort verfügt dieses Plasmid noch über einen ca. 100 bis 150bp langen Rest (ACam^R) des Chloramphenikolresistenzgens. -