DD232988A1

DD232988A1 - Messkammer fuer mikroskopische einzelzellmessungen

Info

Publication number: DD232988A1
Application number: DD27158384A
Authority: DD
Inventors: Guenter Braun; Christa Wolfram; Lothar Lehmann
Original assignee: Akad Wissenschaften Ddr
Priority date: 1984-12-27
Filing date: 1984-12-27
Publication date: 1986-02-12

Abstract

Messkammer fuer mikroskopische Einzelzellmessungen mit hydrodynamisch fokussiertem Probenstrom, anwendbar an mit einem Photometer versehenen Fluoreszenzmikroskopen mit dem Ziel der Erhoehung der Anzahl der messbaren Parameter. Mit der Erfindung wird die Aufgabe geloest, in einer Messkuevette zusaetzlich zu Signalen, die mit Epibeleuchtung erzeugt werden, auch Signale mit 90 Grad Anregung messen zu koennen. Erfindungsgemaess wird die Aufgabe dadurch geloest, dass ein mit einer Huellstromkammer erzeugter hydrodynamisch fokussierter Probenstrom in den sich in der vertikalen Richtung verjuengenden Kanal der Messkuevette injiziert wird und als zweite Anregungslichtquelle neben der Quecksilberhoechstdrucklampe des Fluoreszenzmikroskops ein Laser verwendet wird, dessen Strahlung senkrecht zur Epibeleuchtung durch die Messkuevette tritt. Die erfindungsgemaesse Loesung ist sehr variabel einsetzbar und erlaubt die Erhoehung des Informationsgehaltes zytometrischer Messungen.

Description

Titel der Erfindung

Meßkammer für mikroskopische Einzelzellmessungen

Anwendungsgebiet

Die Erfindung ist anwendbar an mit einem Photometer versehenen Fluoreszenzmikroskopen zur schnellen Einzelzellmessungen an Zellen, die in Flüssigkeit suspendiert sind. Die Erfindung kann genutzt werden für die Lösung medizinischer und biologischer Aufgabenstellungen. Sie ist in die IPK G 01 IT einzuordnen.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

/ ' , Die Probenzuführung zum Meßort für schnelle Einzelpartikelmessungen an kleinen Partikeln,, die in Flüssigkeit suspendiert sind, basiert auf dem Prinzip der hydrodynamischen Fokussierung nach SPIELMiLN und GOREN (Improving Resolution in Coulter-Counting by Hydrodynamic Focusing, J. Colloid and Interface Sei. 26

. ' (1968), 175).

Vor. STEEN und LINDMO wurde ein elegantes Verfahren angegeben, den hydrodynamisch fokussierten Probenstrom i^m Tiefenschärfenbereich eines hochaperturigen Mikroskopobjektivs zu halten. Der von einer Eüllstromkammer mit hydrodynamischer Fokussierung erzeugte Wasserfreistrahl wird auf ein Mikroskopdeckglas gerichtet.

Damit werden die mikroskopischen Partikel in geringem Abstand vom Deckglas durch den Tiefenschärfenbereich des Objektivs geführt. Dies ist beschrieben ins PS-WO 80/02198 und in dieser Weise Grundlage für das Instrument MPV4 der Fa. ZEITZ. Die beschriebene Technik hat den Vorteil, daß sie in Verbindung mit umgekehrten Standard-Fluoreszenzmikroskopen angewendet werden kann und ein hohes Auflösungsvermögen gewährleistet. Dem steht aber der Nachteil gegenüber, daß nur vorwärts bzw. rückwärts gestreute Signale registriert werden und z. B₀ 90 Grad Streulichtsignale nicht erhalten werden können.

Ziel der Erfindung

Das Ziel der Erfindung ist, eine Meßkammer für mikroskopische Eihzelzellmessungen zu entwickeln, die an 1c Fluoreszenzmikroskopen, die mit einem Photometer ausgerüstet sind, angeordnet werden kann und die es gestattet, eine Vielzahl von Signalen, insbesondere auch 90 Grad Streusignale, zu messen.

Wesen der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, einen vorher hydrodynamisch fokussierten Probenstrom so durch den Tiefenschärfenbereich eines hochapertürigen Mikroskopobjektivs zu führen, daß zusätzlich zu vorwärts und rückwärts gestreuten Signalen auch Signale unter 90 Grad zur Ausbreitungsrichtung des Anregungslichts gewonnen werden können.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß eine Hüllstromkammer 13 in den Meßkanal 12 der Meßküvette 11 hineinragt und" der Meßkanal 12 sich in der Meßregion 10 zu einem flachen Streifen reduziert. Der flache Streifen in

der Meßregion 10 wird gebildet durch den aus polierten Glasplatten bestehenden Grundkörper der Meßküvette 11 und ein von oben her abschließendes Deckglas 21· Senkrecht zum Deckglas 21 ist ein Epibeleuchtungssystem eines Mikroskops mit Quecksilberhöchatdrucklampe 14 angeordnet (Pig. 1a). Zusätzlich ist ein Laser 18 mit Pokussierungsoptik 17 so angeordnet, daß seine Strahlung senkrecht zur Achse der Epibeleuchtung durch die Meßküvette 11 hindurchtritt (Pig 1b).

Durch den Abschluß der Meßküvette 11 mit einem Deckglas 21 sind, wie in der gewöhnlichen Mikroskopie, verschiedene Mikroskopobjektive 15» etwa angebracht in einem Objektivrevolver als Lichtsammeieinrichtung einsetzbar. Eine weitere Lichtsammeieinrichtung 16 ist in Laserstrahlrichtung angebracht. Die Hüllstromkammer 13 wird mittels einer Spannvorrichtung 24 auf der Halterung 23 befestigt. Eine Dichtung 25 schließt den Meßkanal 12 gegen die Hüllstromkammer 13 ab. . .

Im Glaskörper der Meßküvette 11 sind ein Auslaßstutzen 22 und eine Schleppstromzuführung 28 angebracht. Die Stutzen für die Probenstromzuführung 26 und die Hüllstromzuführung befinden sich an der Hüllstromkammer 13·

Mittels der Hüllstromkammer 13 wird ein hydrodynamisch fokussierter Probenstrom in den Meßkanal 12 injiziert und mittels des Meßkanals in der Meßregion 10 in den Tiefenschärfenbereich 'des Mikroskopobjektivs 15 geführt. In der Meßregion 10 erfolgt die Anregung von Signalen entweder mittels der Epibeleuchtung mit Quecksilberhöchstdrucklampe 14 oder senkrecht dazu mittels des Laser 18 mit Poküssierungsoptik 17 oder mit beiden Lichtquellen gleichzeitig. Die Signaldetektion erfolgt mittels Mikroskopobjektiv 15 oder der zusätzlichen Lichtsammeieinrichtung ^6.

Mit dem Mikroskopobjektiv I5 können sowohl von beiden. Lichtquellen angeregte Fluoreszenzsignale als auch laserangeregte 90 Grad Streulichtsignale detektiert werden. Die zusätzliche Lichtsammeleinrichtung 16 gestattet die Detektion laserangeregter Yorwärtsstreuung.

Beispiel 1:

Die erfindungsgemäße Meßkammer, bestehend aus drei .

miteinander verklebten Glasplatten als Meßküvette 11, abgeschlossen durch ein Deckglas 21 der Dicke 0,17 sowie einer eingeklebten Hüllstromkammer 13» bestehend aus einem ausgezogenen Glasschliff und einer Dentalkanüle als Probenstromzuführung 26 wurde an einem bezüglich der Signalauswertung modifizierten PLUOVAL photometrie (VEB Carl Zeiß JEKl) angewendet. Die Probenförderung erfolgte durch den am Auslaßstutzen 22 erzeugten Unterdruck von 45kPa. Es wurden mit Ethidiumbromid gefärbte EAT-Zellen vermessen, Die Anregung der Fluoreszenz erfolgte Mittels der Quecksilberhöchstdrucklampe 14 HBO 200 des FLUOVAL. Es wurde ein Objektiv 15 der numerischen Apertur 1,30- und Ölimmersion verwendet. Das erhaltene DNA-Histogramm hatte einen .Variationskoeffizienten (CV) von 5,7 %·

Beispiel 2;

Mit der erfindungsgemäßen Meßkammer in der im ersten Beispiel beschriebenen Ausführung wurde die 90 Grad Streuung von Latexpartikeln des Durchmessers 0,8 /um gemessen, indem die Anregungsbedingungen gegenüber Beispiel 1 geändert wurden. Die Anregung der Streulichtsignale erfolgte mit einem Laser 18 ILA 120 (VEB Carl Zeiß JENA) bei der Wellenlänge 456,7 mn. Das Laserlicht wurde durch die polierten Glasplatten der Meßküvette 11 senkrecht zum Objektiv 15 eingestrahlt und das Streulicht wurde mit einem Objektiv 15 der numerischen Apertur 0,25 gesammelt. Das resultierende Histogramm hatte einen CV von 3,2 %.

Beispiel 3:

Mit der erfindungsgemäßen Meßkammer in der im ersten Beispiel "beschriebenen Ausführung wurde die Vorwärtsstreuung von EAT-Zellen zusätzlich zum DNA-Gehalt gemessen, indem folgende Bedingungen geändert wurden: Der Nachweis der Fluoreszenz erfolgte mit einem Trockensystem der numerischen Apertur 0,95 als Objektiv 15, die Anregung der Vorwärtsstreuung erfolgte mit einem He-Ne Laser der Ausgangsleistung 0,5 mW (VEB Carl Zeiß JENA)· Das Streulicht wurde mit einem Turmon mit Vorsatzlinse (VEB Carl Zeiß JENA) als Lichtsammeleinrichtung 16 registriert· Es wurden ein DNA-Histogramm mit einem CV von 5,9 % und ein Streulichthistograimn erhalten mit einem CV von 16 %₉ das die Größenverteilung der EAT-Zellen angibt·

Claims

Erfindungsanspruch

Meßkammer für mikroskopische Einzelzellmessungen in Verbindung mit Fluoreszenzmikroskopen, gekennzeichnet dadurch, daß eine Hüllstromkammer (13) in einen Meßkanal (12) einer Meßküvette (11), die mit einem Auslaßstutzen (22) und einem Schleppstromzuführungsstutzen (28) ausgestattet ist, hineinragt und der Meßkanal (12) sich in einer Meßregion (10) zu einem flachen Streifen reduziert, wobei der flache Streifen in der Meßregion (10) durch einen aus polierten Glasplatten bestehenden Grundkörper der Meßküvette (11) und einen von oben her abschließenden Deckglas (21) gebildet wird, und daß ein Ep!beleuchtungssystem eines.Mikroskops mit einer Quecksilberhöchstdrucklampe (14) senkrecht zum Deckglas (21) und/oder ein Laser (18) mit einer Fokussierungsoptik (17), dessen Strahlung senkrecht zur Achse der Epibeleuchtung durch die Meßküvette (11) hindurchtritt, angeordnet ist, und daß als Lichtsammeieinrichtung bekannte Mikroskopobjektive (15), beispielsweise in einem Objektivrevolver, und/oder eine Lichtsammeieinrichtung in Laserstrahlrichtung, beispielsweise ein Teleskop mit Vorsatzlinse (16), verwendet werden.

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