DD230940A1 - Verfahren zur bestimmung und praeparation von humanem iga - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung und Praeparation von humanem IgA. Es ist das Ziel, ein Verfahren zur praeparativen Abtrennung sowie zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von Human-IgA bzw. Antikoerpern der IgA-Klasse aus biologischen Fluessigkeiten anzugeben, das sich durch hohe Spezifitaet, hohe Sensitivitaet, Reproduzierbarkeit sowie einer moeglichen Standardisierung auszeichnet. Die Aufgabe besteht darin, ein Verfahren zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von Human-IgA im Serum und verschiedenen Koerperfluessigkeiten sowie zur praeparativen Isolierung von Human-IgA aus biologischen Fluessigkeiten zu schaffen, welches auf der Verwendung eines neuen immunologischen Reagens beruht. Die Aufgabe wird geloest, indem als neues immunologisches Reagens die monoklonalen Antikoerper der Serie BL-IgA/1 bis 5, einzeln oder in beliebiger Kombination miteinander, zum Einsatz kommen. Diese Antikoerper werden von den Hybridomen H-BL-IgA/1 bis 5 sezerniert.

Description

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Ziel der Erfindung

Die Erfindung hat das Ziel, ein Verfahren zur präparativen Abtrennung sowie zur hochempfindlichen qualitativen und quantitativen Bestimmung von Human-lgA bzw. Antikörpern der IgA-Klasse, die in biologischen Flüssigkeiten enthalten sind, anzugeben, welches außer der hohen Spezifität durch hohe Sensitivität und Reproduzierbarkeit sowie eine mögliche Standardisierung bei niedrigen Kosten gekennzeichnet ist.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von Human-lgA in Serum und verschiedenen Körperflüssigkeiten, wie z. B. Schleimhautsekreten, Speichel oder Kolostrum sowie zur präparativen Isolierung von Human-lgA aus biologischen Flüssigkeiten zu schaffen, welches auf der Verwendung eines neuen immunologischen Reagens beruht.

Die Aufgabe wird dadurch gelöst, daß als neues immunologisches Reagens die monoklonalen Antikörper der Serie BL-IgA/1 bis 5, einzeln oder in beliebiger Kombination miteinander, zum Einsatz kommen.

Diese monoklonalen Antikörper haben definierte Bindungseigenschaften, wobei die Spezifität für die humane α-Kette von entscheidender Bedeutung ist. Die Antikörper der Serie BL-lgA/1 bis 5 werden von den an der Sektion Biowissenschaften der Karl-Marx-Universität Leipzig hergestellten Hybridomen H-BL-IgA/1 bis 5 sezerniert und können in praktisch ausreichender Menge zu jeder Zeit hergestellt werden.

Zur präparativen Isolierung werden die monoklonalen Antikörper BL-lgA/1 bis 5 an feste Trägermaterialien gebunden. Dafür eignen sich alle bisher für die Affinitätschromatographie eingesetzten Materialien, wiez. B. Zellulose, Sepharose und dergleichen mehr. Die Ankopplung der Antikörper wird bekannterweise durch kovalente Bindung vorgenommen. Dabei ist zu prüfen, ob die Antigenbindungsfähigkeit der Antikörper erhalten bleibt. Die Antikörper, die in solcher Art unlöslich gemacht wurden, werden danach mit der IgA-haltigen Flüssigkeit in Kontakt gebracht. Bei der dabei auftretenden Adsorption wirken sich niedrige Temperaturen zwischen +2 und +6°C günstig aus. Das an die unlöslich gemachten monoklonalen Antikörper gebundene Human- IgA wird von den nicht spezifisch gebundenen Komponenten der Ausgangsmischung freigewaschen. Durch bekannte PH-Veränderungen oder durch Verwendung von Desorbentien wird anschließend das Human-lgA vom Adsorbens abgelöst und in eine stabile, lagerungsfähige Form übergeführt.

Zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von humanem IgA werden als Nachweisreagens monoklonale Antikörper der Serie BL-lgA/1 bis 5, einzeln oder in beliebiger Kombination miteinander, eingesetzt, wobei sie gegebenenfalls mit einem Marker gekoppelt sind.

Das IgA muß dazu vorher an eine feste Phase adsorbiert werden und gegebenenfalls von störenden Begleitstoffen befreit werden. Hierzu eignet sich besonders die spezifische Bindung an ein Anti-lgA-Reagens, wie z. B. ein konventioneller heterologer Anti-lgA-Antikörper oder auch ein oder mehrere Glieder der Serie monoklonaler Antikörper BL-lgA/1 bis 5, die ihrerseits in einer bekannten Weise an einen festen Träger gekoppelt oder adsorbiert sind. Das IgA kann aber auch als Antikörper, der gegen ein bestimmtes Antigen gerichtet ist, welches selbst direkt oder indirekt an eine feste Phase gekoppelt ist, an die Testphase gebunden werden. Entscheidend ist, daß bei der technischen Ausführung immer ein Überschuß an adsorptiven Stellen an der festen Phase für das in der Testprobe enthaltene IgA bzw. Antikörper vom IgA-lsotyp vorhanden ist und somit, bei ausreichender Zeit für die Diffusion, diese Komponenten quantitativ gebunden werden. Bei Testproben mit hohen IgA-Gehalt bzw. Antikörperkonzentrationen werden solche Proportionen durch Verdünnen erreicht.

Das gebundene IgA wird dann durch monoklonale Antikörper BL-lgA/1 bis 5 nachgewiesen und/oder quantifiziert. Dazu werden die monoklonalen Antikörper selbst mit einem Marker gekoppelt. Der Marker kann kovalent oder adsorptiv angekoppelt werden. Als diesbezügliche Marker eignen sich Radioisotope, wie z. B. ^12SJod, organische Farbstoffe oder Enzyme, wie z. B. alkalische Phosphatase oder Meerrettichperoxidase. Die Ankopplung dieser Marker geschieht in bekannter Art und Weise. Weiterhin ist es aber auch möglich, daß an die monoklonalen Antikörper BL-lgA/1 bis 5 eine Komponente angekoppelt wird, die ihrerseits einen Marker bindet. So kann an die BL-lgA-Antikörper ein Anti-Enzym-Antikörper kovalent, z. B. durch Glutardialdehyd oder andere Methoden, gebunden werden. Es ist vorteilhaft, wenn dazu ein monoklonaler Anti-Meerrettichperoxidase-Antikörper der Serie BL-POD verwendet wird. Dieser Chimärenantikörper ist dann in der Lage, Meerrettichperoxidase zu binden, die ihrerseits durch eine Substratumsetzung als hochempfindlicher Indikator dient.

Es ist aber auch möglich, den zur Bestimmung des Human-lgA benutzten Antikörper BL-lgA/1 bis 5 durch Anti-Mausimmunglobuiin-Antikörperzu quantifizieren. Hierzu ist es notwendig, diesen Doppelantikörper zu markieren. Auch hierfür sind Radiosotope, Farbstoffe oder Enzyme geeignet. Eine bevorzugte Variante bestrebt in der Ankopplung von Meerrettichperoxidase.

Die Herstellung eines Konjugates von Anti-Mausimmunglobulin-Antikörper mit einem Anti-Enzym-Antikörper ermöglicht die Verwendung von Enzymen mit niedrigen Reinheitsgrad. Besonders geeignet zur Ankopplung sind monoklonale Anti-Enzym-Antikörper, wie z. B. die Glieder der Serie monoklonaler Anti-Meerrettichperoxidase-Antikörper BL-POD. Eine andere Variante besteht darin, daß der Indikatorantikörper BL-lgA/1 bis 5 durch eine Brücke eines Anti-Mausimmunglobulin-Antikörpers mit einem Maus-Anti-F-^/m-Antikörpers gekoppelt wird, der seinerseits das jeweilige Enzym bindet, welches über die Substratumsetzung die Quantifizierung des Human-lgA gestattet. Diese Variante ist besonders dann anzuwenden, wenn ein monoklonaler Anti-Meerrettichperoxidase-Antikörper der Serie BL-POD benutzt wird. Die monoklonalen Antikörper der Serie BL-lgA/1 bis 5 weisen besonders günstige Bindungseigenschaften zum Human-lgA auf. Außerdem können die monoklonalen Anti-lgA-Antikörper ständig mit gleichen Eigenschaften reproduziert werden. Dier Erfindung soll nachstehend an Ausführungsbeispielen näher erläutert werden.

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Anwendungsbeispiele

Beispiel 1: Bestimmung der Konzentration von Human-lgA in Körperflüssigkeiten oder in Zellkulturüberständen durch den monoklonalen Antikörper der Serie BL-IgA mittels Festphasenradioimmuntechnik.

1. Mikrotiterplatten aus Plaste (Polystyren oder Polyvin ylchlorid) werden mit dem monoklonalen Antikörper BL-lgA/2 beschichtet. Dazu werden die Vertiefungen der Platte mit BL-lgA/2 (1-5цд/тІ) gefüllt und für 12h bei +4⁰C inkubiert.

2. Dreimaliges Waschen mit 0,05% Tween 20/PBS (0,15 M NaCI, 0,01 M Phosphat, pH 7,4).

3. Blockierung unbesetzter adsorptiver Bindungsstellen der Plaste durch Inkubation mit 2% neonatatem Kälberserum für 15min.

4. Dreimaliges Waschen mit 0,05% Tween 20/PBS.

5. Herstellen einer Verdünnungsreihe von gereinigtem Human-lgA (0,1 ng/ml bis 1цд/тІ). Von der Testprobe werden ebenfalls Verdünnungen hergestellt, die im optimalen Meßbereich der Methode liegen, wenn die IgA-Konzentration zu hoch ist. Die Verdünnung des IgA-Standards und der Testproben erfolgt in 1 % neonatalem Kälberserum. Jeweils 100μΙ der einzelnen Konzentrationsstufen des IgA-Standards und der Testprobe werden in die Vertiefungen der Mikrotiterplatte eingefüllt und für 12 h bei +4⁰C inkubiert.

6. Dreimaliges Waschen mit 0,05% Tween 20/PBS.

7. Zugabe von jeweils 100μΙ des ¹²⁵J-markierten monoklonalen Antikörpers BL-lgA/1 und Inkubation für4-12h bei +4⁰C zur Quantifizierung des gebundenen Human-lgA. Statt des markierten BL-lgA/1 kann auch ein Antikörper verwendet werden, der eine Determinante erkennt, die auf der L-Kette lokalisiert ist (z. B. mit dem Anti-L-Ketten Antikörper BL-Ig-L/1.).

8. Dreimaliges Waschen mit 0,05% Tween 20/PBS.

9. Messung der in den einzelnen Vertiefungen gebundenen Radioaktivität in einer Gammastrahlungsmeßkette. 10. Aufstellung einer Eichkurve an Hand der Zählraten der Vertiefungen mit den unterschiedlichen IgA-

Standardkonzentrationen. Die Konzentration des IgA in der Testprobe wird an Hand der jeweiligen Zählrate mittels der aufgestellten E ich kurve ermittelt

Beispiel 2: Bestimmung der Konzentration von Human-lgA durch den monoklonalen Antikörper BL-lgA/1 mit Festphasenradioimmunassay.

1.-4. Gleiches Verfahren wie in den Punkten 1 bis 4 des Beispiels 1, wobei jedoch statt des monoklonalen Antikörpers BL-lgA/2 der BL-lgA/1 verwendet wird.

5. Zugabe von jeweils 100 μΙ verschiedener Konzentration von Human-lgA (0,1 ng/ml bis 100 ng/ml, der Verdünnungslösung allein und der Testprobe, eventuell in verschiedenen Verdünnungsstufen. Dazu werden 100 μΙ ^12SJ-markiertes Human-lgA in geeigneter Konzentration pipettiert. Die beiden Komponenten werden durch Vibration gemischt und anschließend erfolgt die Inkubation für 12h bei +4⁰C.

6. Dreimaliges Waschen mit 0,05% Tween 20/PBS.

7. Messung der in den einzelnen Vertiefungen gebundenen Radioaktivität in einer Gammastrahlungsmeßkette.

8. Aufstellung einer Eichkurve durch Auftragen des B/B₀-Quotienten gegen die Konzentration des zur Hemmung eingesetzten IgA-Standards. Der B/B₀-Quotient entspricht dem Verhältnis der Zählrate des gebundenen ¹²⁵J-markierten Human-lgA bei Anwesenheit und Fehlen von nichtmarkierten IgA.

9. Bestimmung der Konzentration des in der Testprobe enthaltenem Human-lgA an Hand des jeweiligen B/B₀-Üuotienten und der Eichkurve.

Beispiel 3: Bestimmung von IgA-Antikörpem gegen das Hämagglutininantigen des Influenzavirus durch den monoklonalen Antikörper BL-lgA/1 mittels Enzymimmunbrückentechnik.

1. Mikrotiterplatten aus Plaste (Polystyren oder Polyvinylchlorid) werden mit dem Hämagglutininantigen des Influenzavirus beschichtet, indem dieses in Gebrauchskonzentration in die Vertiefungen der Platte eingefüllt und für 12 h bei +4°C inkubiert wird.

2. Dreimaliges Waschen mit 0,05% Tween 20/PBS.

3. Blockierung unbesetzter adsorptiver Bindungsstellen der Plaste durch Inkubation mit 2% neonatalem Kälberserum für 15min.

4. Dreimaliges Waschen mit 0,05% Tween 20/PBS.

5. Zugabe von jeweils 100μΙ

a) verschiedener Verdünnungsstufen eines IgA-anti-Hämagglutinin-Antikörper enthaltendes Referenzserums (Positivkontrolle),

b) verschiedener Verdünnungsstufen eines Normalserums (Negativkontrolle),

c) verschiedener Verdünnungsstufen der Testprobe

Inkubation für 12h bei +4⁰C.

6. Dreimaliges Waschen mit 0,05% Tween 20/PBS.

'. Zugabe von jeweils 100μΙ BL-lgA/1 in Gebrauchskonzentration (ca.50ng/ml). Inkubation für 2-4h bei +4⁰C.

8. Dreimaliges Waschen mit 0,05% Tween 20/PBS.

9. Zugabe von jeweils 100μΙ Ziege-anti-Mausimmunglobulin-Serum in Gebrauchskonzentration (ca. 1 -.200 verdünnt). Inkubation für 1 h bei +4⁰C.

10. Dreimaliges Waschen mit 0,05% Tween 20/PBS.

11. Zugabe von jeweils 100μΙ monoklonalem Anti- Meerrettichperoxidase-Antikörper BL-POD/11 in Gebrauchskonzentration (ca.50ng/ml). Inkubation für 1 h bei +4°C.

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12. Dreimaliges Waschen mit 0,05% Tween 20/PBS.

13. Zugabe von jeweils 100 μΙ Meerrettichperoxidase in Gebrauchskonzentration. Es können weniger gereinigte Präparate des Enzyms verwendet werden. Inkubation für 1 h bei +4⁰C.

14. Dreimaliges Waschen mit 0,05 % Tween 20/PBS.

15. Zugabe von jeweils 100μΙ Substratgemisch, bestehend aus H₂O₂ und ortho-Phenylendiamin.

16. Nach 5-60min Entwicklungszeit wird die Substratumsetzung durch Zugabe von 100 μΙ 4N H₂SO₄ abgestoppt und die Extinktion photometrisch bestimmt.

17. Feststellen des IgA-anti-Hämagglutinin-Titers an Hand der Extinktionswerte der Verdünnungsstufen des Testserums im Vergleich zur Negativ- und Positivkontrolle.

Beispiel 4: Bestimmung von IgA-Antikörpern gegen das Hämagglutininantigen des Influenzavirus durch den monoklonalen

Antikörper BL-lgA/1, der kovalent mit Peroxidase gekoppelt ist

1.-6. Gleiches Verfahren wie in den Punkten 1 bis 6 des Beispieles 3

7. Zugabe von jeweils 100μΙ BL-lgA/1, an den hochgereinigte Meerrettichperoxidase gekoppelt ist. Die Kopplung kann mit

Glutardialdehyd oder Perjodat ausgeführt werden. Inkubation für 2h bei +4⁰C. 8.-11. Gleiches Verfahren wie in den Punkten 14 bis 17 des Beispieles 3

Beispiel 5: Nachweis von membrangebundenen oder zytoplasmatischen IgA von Lymphozyten durch den monoklonalen Antikörper BL-lgA/1 und indirekte Immunfluoreszenz.

1. Mikroskopobjektträger aus Glas werden mit einer geeigneten polykationischen Substanz zur Vermittlung der Adhärenz lebender Zellen beschichtet.

2. Auf die so beschichteten Objektträger werden 20 μΙ der zu untersuchenden Zellsuspension (1 — 5- 10^е Zellen/ml) auf getropft. Nach 30min noch nicht adhärierende Zellen werden durch kurzes Eintauchen in PBS abgespült.

3. Fixierung der Zellen für 10min mit Methanol. Anschließend wird in PBS gespült.

4. Inkubation der adhärierenden Zellen für 30 min mit 20μΙ BL-lgA/1 in Gebrauchskonzentration (ca. 10μg/ml). Diese Inkubation wird bei +4⁰C in einer feuchten Kammer ausgeführt.

5. Spülen in PBS durch dreimaligen Wechsel.

6. Inkubation der Zellen mit 20μΙ FITC-Ziege-anti-Mausimmunglobulin-Antikörpemfür 1 h bei +4⁰C in einer feuchten Kammper.

7. Wiederholung von Punkt 5.

8. Eindecken und sofortige fluoreszenzmikroskopische Auswertung oder vorherige Anfertigung von Dauerpräparaten. Beispiel 6: Immunhistologischer Nachweis von Zellen mit zytoplasmatischem IgA durch den monoklonalen Antikörper

BL-lgA/1 und indirekte Immunfluoreszenz

1. Von dem zu untersuchenden Gewebe werden 5μσι starke Kryostatschnitte hergestellt und auf vorbereitete Mikroskopobjektträger aufgezogen.

2.-7. Gleiches Verfahren wie in den Punkten 3 bis 8 des Beispieles 5

Beispiel 7: Präparative Abtrennung von Human-lgA aus Vollserum mittels trägerfixiertem monoklonalem Antikörper BL-lgA/1.

1. Sepharose4Bwird nach der Methode von PORATH et al. (Nature 215 [1967] 1491) mit Zyanbromid aktiviert. Zu 30ml gepackter aktivierter Sepharose werden 100 mg BL-lgA/1 gegeben und angekoppelt. Nach Waschen mit PBS werden reaktive Gruppen durch Behandlung für 1 h mit 0,1 % Ethanolamin geblockt. Anschließend wird mit 0,05% Tween 20/PBS gewaschen und die BL- lgA/1-beladene Sepharose in eine Säule gepackt.

2. Langsames Überleiten von 200 ml Humanvollserum bei +4⁰C. Waschen mit 0,05%Tween 20/PBS im Durchflußverfahren bis die Waschlösung proteinfrei ist.

3. Elution mitO,5MGIyzin/HCI-Puffer(pH2,8). Sofortige Neutralisation des Eluats und Dialyse gegen PBS. Anschließend Einengung durch Ultrafiltration und Bestimmung der IgA-Konzentration sowie der Reinheit.

Claims (16)

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   Erfindungsanspruch:

   1. Verfahren zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von humanen IgA, dadurch gekennzeichnet, daß als Nachweisreagens monoklonale Antikörper der Serie BL-lgA/1 bis 5, die mit alpha-Ketten-spezifischen Determinanten reagieren, einzeln oder in beliebigen Kombinationen miteinander, die gegebenfalls mit einem Marker gekoppelt sind, für direkte und indirekte Nachweisreaktionen eingesetzt werden.
2. 2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß durch direkte, kovafente oder adsorptive Ankopplung eines Markers, wie z. B. eines Radioisotops, eines organischen Farbstoffs, eines Enzyms oder eines Anti-Enzym-Antikörpers, an ein Glied der monoklonalen Antikörperserie BL-lgA/1 bis 5, dieser als Indikatorreagens zum Nachweis oder zur quantitativen Bestimmung von humanem IgA verwendet wird.
3. 3. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß das als Indikatorreagens für humanes IgA dienende Glied der Serie BL-lgA/1 bis 5 durch eine Komponente nachgewiesen wird, die mit dieser spezifisch reagiert und direkt mit einem Marker versehen ist, oder einen solchen direkt oder indirekt binden kann.
4. 4. Verfahren nach Punkt 1,2 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß Glieder der monoklonalen Antikörperserie BL-lgA/1 bis 5 einzeln oder in Kombination miteinander, direkt oder indirekt mit einem Marker gekoppelt, zum Nachweis und zur quantitativen Bestimmung von antigenspezifisch gebundenen IgA-Antikörpem, die an eine mit dem Antigen beladene Testphase adsorbiert sind, verwendet werden.
5. 5. Verfahren nach Punkt 1,2 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß Glieder der monoklonalen Antikörperserie 3L-lgA/1 bis 5 einzeln oder in Kombination miteinander, direkt oder indirekt mit einem Marker gekoppelt, zum Nachweis oder zur quantitativen Bestimmung von IgA benutzt werden, welches entweder durch Glieder der Serie BL-lgA/1 bis 5 oder ein anderes immunologisches Anti-lgA-Reagens, die selbst an einen festen Träger gekoppelt sind, spezifisch gebunden worden ist.
6. 6. Verfahren nach Punkt 1,2,4 und 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Glieder der Serie BL-lgA/1 bis 5 nach an sich bekannten Verfahren mit ¹²⁵JOd markiert werden.
7. 7. Verfahren nach Punkt 1,2,4 und 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Glieder der Serie BL-lgA/1 bis 5 mit einem Anti-Enzym-Antikörper nach an sich bekannten Methoden gekoppelt werden.
8. 8. Verfahren nach Punkt 7, dadurch gekennzeichnet, daß ein monoklonaler Anti-Merrettichperoxidase-Antikörper der Serie BL-POD verwendet wird.
9. 9. Verfahren nach Punkt 1,2,4 und 5, gekennzeichnet dadurch, daß ein Enzym nach an sich bekannten Methoden angekoppelt wird.
10. 10. Verfahren nach Punkt 9, gekennzeichnet dadurch, daß Meerrettichperoxidase angekoppelt wird.
11. 11. Verfahren nach Punkt 1,3,4 und 5, gekennzeichnet dadurch, daß nach einem an sich bekannten Verfahren ein Enzym-anti-Mausimmunglobulin-Antikörper-Konjugat hergestellt wird und zum Nachweis der Indikatorreagenzien der Serie BL-lgA/1 bis 5 verwendet wird.
12. 12. Verfahren nach Punkt 11, gekennzeichnet dadurch, daß ein Meerrettichperoxidase-anti-Mausimmunglobulin-Konjugat verwendet wird.
13. 13. Verfahren nach Punkt 1,3,4 und 5, gekennzeichnet dadurch, daß nach einem an sich bekannten Verfahren ein Konjugat von Anti-Enzym-Antikörpern und Anti-Mausimmungiobulin hergestellt wird und zum Nachweis der Indikatorreagenzien der Serie BL-lgA/1 bis 5 verwendet wird.
14. 14. Verfahren nach Punkt 13, gekennzeichnet dadurch, daß ein Konjugat von Anti-Mausimmunglobulin und einem Glied der monoklonalen Antikörperserie BL-POD verwendet wird.
15. 15. Verfahren nach Punkt 1,2,3,4 und 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Indikatorreagenzien für IgA der Serie BL-lgA/1 bis durch einen Enzym-(Anti-Enzym-Antikörper)-Komplex nachgewiesen oder quantifiziert werden, der durch eine Brücke aus Anti-Mausimmunglobulin-Antikörpern immunspezifisch angekoppelt wird.
16. 16. Verfahren nach Punkt 15, dadurch gekennzeichnet, daß ein Meerrettichperoxidase-Anti-Peroxidase-Komplex verwendet wird, der monoklonale Anti-Peroxidase-Antikörper der Serie BL-POD enthält.

    Anwendungsgebiet der Erfindung

    Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur qualitativen und quantitativen Bestimmung sowie zur Präparation von Human-lgA. Die Erfindung dient zur Bestimmung von IgA bzw. von Antikörpern des IgA-Isotyps in Körperflüssigkeiten von Patienten, was für die Diagnostik von verschiedenen Krankheiten von Bedeutung ist.

    Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

    Zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von IgA werden hauptsächlich Präzipitationsreaktionen eingesetzt. Verbreitet sind die radiale Immundiffusion nach Mancini sowie nephelometrische Methoden zur quantitativen Bestimmung. Alle diese Methode basieren auf der spezifischen Bindung Jes Human-lgA durch ein heterologenes Anti-lgA-Serum. Die Spezifität und die Avidität dieses Antiserums ist für die Genauigkeit, die Sensitivität und Reproduzierbarkeit der Bestimmungsmethode verantwortlich. Konventionelle antiseren unterliegen jedoch dem generellen Nachteil, daß die Qualität der Antiseren von Tier zu Tier und selbst von Blutabnahme zu Blutabnahme bei dem gleichen Spendertier Schwankungen unterworfen ist. Zudem ist das Antiserum einer einmaligen Blutabnahme nur für eine begrenzte Zahl von Bestimmungen ausreichend. Die nephelometrischen Nachweistechniken sind an eine kostenaufwendige apparative Ausrüstung gebunden, die nicht zu den Standardausrüstungen in klinisch-immunologischen Einrichtungen gehört. Die radiale Immundiffusion nach Mancini kommt zwar ohne diese Geräte aus, ist aber weniger sensitiv. Zudem wird die quantitative Bestimmung, die auf der Messung der Größe der Präzipitationshöfe beruht, die bei der radialen Diffusion des in der Testprobe enthaltenen IgA in ein Anti-lgA-Serum enthaltenes Gel auftreten, unter anderem auch von dem Molekulargewicht des Antigens beeinflußt. Das Molekulargewicht ist jedoch beim IgA nicht einheitlich, da es sowohl in monomerer Form (H₂L2-Molekül mit einem Sedimentationswert von 7S) als auch in polymeren Formen von 9,11,13 und 17S auftreten kann. Da der Anteil dieser Formen in den Testproben unterschiedlich ist, kann auch der Vergleich mit ähnlichen Standards diesen Mangel nicht beheben.

    Ein weiterer Mangel der üblichen Verfahren besteht darin, daß sie nicht für die Bestimmung von Antikörpern des IgA-lsotyps gegen ein beliebiges Antigen ausgelegt sind. Die Präparation von IgA wird in einer bekannten Kombination verschiedener biochemischer Methoden, die Salzprazipitation, verschiedene Formen von Elektrophoresen und lonenaustauschchromatographien einschließen, ausgeführt. Diese Methoden sind sehr zeit- und materialaufwendig.