DD152864A1

DD152864A1 - Verfahren zur quantitativen bestimmung von steroidhormonen

Info

Publication number: DD152864A1
Application number: DD22346980A
Authority: DD
Inventors: Ulla Wollenberger; Frieder Scheller; Peter Atrat
Original assignee: Ulla Wollenberger; Frieder Scheller; Peter Atrat
Priority date: 1980-08-22
Filing date: 1980-08-22
Publication date: 1981-12-09

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Konzentrationsbestimmung von Steroidhormonen, insbesondere Testosteron, Cortisol und 4-Androsten-3, 17-dion mittels einer mikrobiellen Elektrode. Das Ziel der Erfindung besteht darin, bei geringem Arbeitsaufwand kurze Messzeiten und einen niedrigen Chemiekalienverbrauch zu erreichen. Erfindungsgemaess wird auf die Oberflaeche einer Elektrode eine Schicht immobilisierter Mikroorganismen von vorzugsweise Nocardia sp. gebracht. Dieser Sensor wird in eine Loesung mit einem kuenstlichem Elektronenakzeptor (z.B. 2,6-Dichlorphenol-indophenol oder Phenanzin-methosulfat) eingetaucht und mit einer Gegenelektrode verbunden, wonach ein konstantes Potential eingestellt wird. Nach Zugabe des zu bestimmenden Steroidhormones wird die Vergroesserung des Stromflusses gemessen. Dieses Verfahren ist besonders fuer den Einsatz in der pharmazeutischen Industrie und in der Arzneimittelforschung geeignet.

Description

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U· Wollenberger Dr. P₀ Scheller Dr. P. Atrat

"Verfahren zur quantitativen Bestimmung: von Steroidhormonen"

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Konzentration von Steroidhormonen, insbesondere von Testosteron, 4~Androsten-3,17-dion und Cortisol mittels einer mikrobiellen Elektrode« Das Verfahren ist besonders für den Einsatz in der pharmazeutischen Industrie und in der Arzneimittelforschung geeignet*

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen Steroidhormone der Uebennierenrinde, z. B. Cortisol, besitzen entzündungshemmende und antiallergische Eigenschaften und haben Einfluß auf den Kohlehydrat-Wasser- und Elektrolythaushalt des Körpers (S. M. Rapoport, Medizinische Biochemie, VEB Verlag Volk und Gesundheit Berlin 1975). Die Bestimmung ist daher von pharmakologischem und diagnostischem Interesse. Die relativ einfache und weitverbreitete fluorimetrische Bestimmungsmethode für Cortisol benötigt u. a. konzentrierte Schwefelsäure, besitzt relativ geringe Spezifität und zeigt eine nichtspezifische Fluoreszenz durch Plasmakomponenten und potentielle Interferenzen durch verschiedene Arzneimittel, Andere Methoden z. B. Radioimmunoassay benötigen teure Reagenzien, wie markiertes Cortisol, und großen technische! Aufwand. (J. H. H. Tijssen u. a. Clin. Chim. Acta WO (1980) 39).

Androgene, wie Testosteron und Androstendion, haben neben ihrer geschlechtsspezifischen Wirkung auch anabole Eigenschaften. Ihre Bestimmung ist daher wesentlich für die klinische

Diagnostik. Die herkömmlichen Bestimmungsmethoden für Testosteron, wie Hochdruckflüssigkeitschromatographie und Radioimmunoassay (Methods in Enzymology Vol. 36, Hrsg. B. W. 0» Malley u. J. C. Hardman, Acad. Press, Uew York 1975) erfordern einen großen apparativen Aufwand und schwer zugängliche teure Chemikalien»

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist es, ein technisch einfaches Verfahren zur Bestimmung von Steroidhormonen zu entwickeln. Dabei sollen kurze Meßzeiten und durch Immobilisierung von Mikroorganismen ein niedriger Chemikalienverbrauch, geringer Arbeitsaufwand und niedrigere Kosten erreicht werden.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, die Bestimmung von Steroidhormonen durch Kopplung von geeigneten Mikroorganismen mit Redoxelektroden durchzuführen. Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß eine Elektrode, die mit einer Schicht immobilisierter Zellen von Mikroorganismen bedeckt ist, in eine Meßlösung mit bekannter Konzentration eines künstlichen Elektronenakzeptors (Mediator) eingetaucht und gegenüber einer Bezugselektrode ein konstantes Potential eingestellt wird. Es wird abgewartet, bis ein konstantes Stromsignal erreicht ist. Dann wird eine Steroidhormonlösung zu der Meßlösung gegeben und die Änderung des Stromflusses gemessen. Bei Einstellung des Qxidationspotentials im Grenzstromgebiet wird der reduzierte Mediator anodisch, bzw. bei Einstellung des Reduktionspotentials im Grenzstromgebiet der oxidierte Mediator kathodisch angezeigt. Vorzugsweise wird das Potential so gewählt, daß eine Zunahme des Stroms gemessen wird·

Als Elektrodenmaterial verwendet man erfindungsgemäß Glaskohle, Graphit oder Gold·

Die immobilisierten Zellen sind Zellen von vorzugsweise Nocardia sp. Sie enthalten eine Steroid- Δ -Dehydrogenase und· können deshalb 3-Keto-4-en-steroide unter Reduktion eines Elektronenakzeptors oxydieren (siehe Abbildung),

K. Nocardia sp. ⁺ Mediator^ ^- Mediator_red# +

Mit dem Verfahren wird somit ein Stromsignal in Abhängigkeit von der Konzentration des Steroid- Zs -Dehydrogenase-Substrates gemessen.

Als Elektronenakzeptor wird vorzugsweise 2,6-Dichlorphenolindophenol oder Phenanzin-methosulfat eingesetzt· Das erfindungsgemäSe Verfahren hat den Vorteil, daß auch geringe Probemengen schnell und ohne besonderen Aufwand bestimmt werden können. Im Vergleich zu anderen enzymatischen Verfahren entfällt die aufwendige Enzymisolierung, da die Enzyme der isolierten Mikroorganismen ausgenutzt werden. Das Verfahren kann beispielsweise in der pharmazeutischen Industrie zur Prozeßkontrolle bei der Steroidhormonherstellung eingesetzt werden«

Ausführungsbeispiel

Die Erfindung soll nachstehend an 2 Ausführungsbeispielen erläutert werden.

Beispiel 1

Auf die Oberfläche der Glaskohleelektrode wird ein 4 x 4 mm großes Stück der Membran mit Zellen mit einem Nylonnetz fixiert« Als Immobilisierungsmedium wurde Polyacrylamid verwendet. Das Potential der präparierten rotierenden Glaskohleelektrode wird mittels eines Polarographen auf + 200 mV gegenüber einer gesättigten Kalomelelektrode eingestellt. Das Stromsignal wird über den Polarographen mit einem x-y-Schreiber registriert. Die Temperatur wird mittels eines Thermostaten auf 30⁰C gehalten. Durch den Anschluß eines Motors an den * Sensor rotiert dieser mit einer konstanten Rührgeschwindigkeit, wodurch eine gleichmäßige Durchmischung der Meßlösung gewährleistet ist.

Der mikrobielle Sensor wird in die Meßzelle eingetaucht, die 5 ml von O„01 M Pyruphosphatpuffer pH 9,0 mit 0,2 mi 2,6-Dichlorphenol-indophenol enthält· Nach Erreichen eines Konstanten Stromsignals werden 250 /Ul einer 0,5 тЫ Testosteronlösung in die Meßlösung dazugegeben« Der Strom erhöht sich entsprechend der Bildung des reduzierten 2,6-Dichlorphenol-indophenols durch die Dehydrierung des Steroid-A-rings und Einbaus einer Doppelbindung zwischen C- und Cp. Analog dazu werden jeweils 250 /Ul Testosteron in unterschiedlichen Konzentrationen zugegeben und eine Eichkurve aufgenommen·

Die Bestimmung der Konzentration einer Probenlösung an Testosteron wird analog durchgeführt und die Auswertung auf der Grundlage der Eichkurve vorgenommen·

Beispiel 2

Zellen von Kocardia opaca, die in Polyacrylamidgel eingeschlossen sind, werden direkt vor eine Kohleelektrode gebracht о Ein Nylongewebe dient zur Befestigung dieser Schicht vor der Elektrode· Der präparierte mikrobielle Sensor taucht in die Meßlösung ein, die auf 3O⁰C temperiert ist. Dieser Sensor wird zusammen mit einer gesättigten Kalomel-Bezugselektrode (GKE) über einen Polarographen mit Schreiber angeschlossen· Außerdem ist der Sensor mit einem Motor verbunden, so daß er ständig gleichmäßig rotiert, was eine gute Durchmischung und reproduzierbare Diffusionsgeschwindigkeiten garantiert· Als Meßlösung dient 0,01 M Pyruphosphatpuffer pH 9,0, Dieser Lösung werden 500 /Ul Phenanzin - methosulfatlösung zugesetzt, so daß die Konzentration 0,5 mM beträgt. Der Sensor wird gegenüber der GKE auf ein konstantes Potential von - 100 mV polarisiert· Nach Einstellen des Grundstroms werden 250 /Ul einer 1 mM Cortisollösung zugesetzt und die Zunahme des reduzierten Elektronenmediators amperometrisch gemessen· Zur Aufnahme einer Eichkurve werden jeweils 250 ,ul unterschiedlich konzentrierte Cortisollösungen zugegeben. Im Kon-

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zentrationsbereieh von 0,05 mM bis 0,5 тМ Cortisol hängt der Oxidationsstrom des reduzierten Phenanzinmethosulfats linear von der Konzentration ab₀

Cortisolkonzentrationsbestimmungen erfolgen analog zur Eichung und die Auswertung aufgrund der Eichkurve«

Claims

Erf indan gsanspruch

1. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Steroidhormonen, dadurch gekennzeichnet, daß eine Elektrode, die mit einer Schicht immobilisierter Mikroorganismen bedeckt ist, in eine Lösung, die einen künstlichen Elektronenakzeptor enthält, eingetaucht wird, nach Verbindung mit einer Gegenelektrode die Einstellung eines konstanten Stroms abgewartet und nach Zugabe des Steroidhormons die Änderung des Stromflusses bei einem konstanten Potential gemessen wird.

Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Elektrode aus Glaskohle, Graphit oder Gold besteht.
3. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismen vorzugsweise Hocardia sp. eingesetzt werden»

4· Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Änderung des anodischen oder des kathodischen Stroms gemessen wird, vorzugsweise die Änderung, die zu einer Vergrößerung des Stroms führt.
5. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Elektronenakzeptor vorzugsweise 2,6-Dichlorphenol-indophenol oder Phenanzin-methosulfat eingesetzt werden.