DD149875A3 - PROCESS FOR MICROBIAL PRODUCTION OF A MIXTURE OF CITRIC ACID AND ISOZITRONIC ACID - Google Patents
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Abstract
Patentansprüche: 1. Verfahren zur mikrobiellen Herstellung eines Gemisches von Zitronensäure und Isozitronensäure durch Hefen auf verschiedenen Kohlenstoffquellen, dadurch gekennzeichnet, dass der Nährlösung in der Wachstumsphase gerade soviel einer Stickstoffquelle zugesetzt wird, dass man eine Biomassekonzentration 5 bis 15 g/l erhält, und dass in der anschließenden Produktionsphase in an sich bekannte Bedingungen für eine Zitronensäureakkumulation (saurer pH, Abfangen der Säure, Vorhandensein von Effektoren, gute Belüftung u.dgl.) eingehalten werden. 2. Verfahren nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass beide Phasen, die Wachstums- und die Produktionsphase, als räumlich voneinander getrennte Prozessstufen durchgeführt werden.1. A process for the microbial production of a mixture of citric acid and isocitric acid by yeasts on different carbon sources, characterized in that the nutrient solution in the growth phase just enough of a nitrogen source is added to obtain a biomass concentration 5 to 15 g / l, and that in the subsequent production phase in known per se conditions for a citric acid accumulation (acidic pH, trapping of the acid, presence of effectors, good ventilation, etc.). 2. The method according to claim 1, characterized in that both phases, the growth and the production phase, are performed as spatially separated process stages.
Description
170 314 -170 314 -
Die Erfindung "betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Gemisches von Zitronen- und Isozitronensäure durch Hefen iait Kohlenstoffquellen wie n-Alkane, Zucker oder kurzkettige aliphatisch^ sauerstoffhaltige Verbindungen.The invention relates to a process for the preparation of a mixture of citric and isocitric acids by yeasts with carbon sources such as n-alkanes, sugars or short-chain aliphatic oxygen-containing compounds.
Die Akkumulation der Zitronensäuren durch Hefen erfolgt "bekanntermaßen nach Abschluß der ϊ/achstuinsphase, was sich durch eine maximale Hefebiomassekonzentration und Erschöpfung der Stickstoffquelle anzeigt. Allgemein wird so verfahren, daß .ein Zitronensäurenbildender Stamm, meist der Gattung Candida zugehörig, in einer Impfkultur herausgezogen wird und mit dieser eine Fermentationslösung beimpft wird, die neben üblichen IJährsalzen und evtl. Supplinen. eine geeignete Kohlenstoffquelle in Konzentrationen enthält, die der zu erzielenden Menge des Zitronensäurengemisches entspricht und zur Abstumpfung der Säuren meist Kalziumkarbonat enthält. Zahlreiche Erfindungen berücksichtigen die Beeinflußbarkeit der' an der Synthese beteiligten Enzyme durch bestimmte chemische Agenzien und beschreiben den Zusatz von Schwermetallionen und anderer Effektoren, wodurch die Säurenausscheidung erhöht oder aber die Bildung der Zitronensäure auf Kosten der Isozitronensäure gefördert wird. ' Ton den Hefen der Gattung Candida werden besonders Stämme der Art Candida lipolytica als besonders leistungsfähig beschrieben. Auch die Züchtung von Hochleistungsstämmen durch Mutation ist bekannt. Auch werden Arten, wie Candida zeylanoides angeführt, die sich besonders für eine Zitronensäurenproduktion eignen sollen. Die Mengen der ausgeschiedenen Säuren werden sehr unterschiedlich angegeben..Sie können im günstigsten'Falle bei 200 g/l Zitronen- plus Isozitronensäuren liegen, obwohl Angarte η zwischen 50 bis 100 g/l am häufigsten sind. .The accumulation of the citric acids by yeasts is "known to occur after completion of the ϊ / achstuinsphase, which is indicated by a maximum Hefebiomassekonzentration and depletion of the nitrogen source.Generally, the procedure is that .a citric acid-forming strain, mostly belonging to the genus Candida, is pulled out in a seed culture and inoculation with a fermentation solution containing, in addition to customary salts and possible supplines, a suitable source of carbon in concentrations corresponding to the amount of citric acid mixture to be obtained and mostly containing calcium carbonate for deadening the acids, numerous inventions take into account the influence of 'on the Synthesis involved enzymes by certain chemical agents and describe the addition of heavy metal ions and other effectors, thereby increasing the acid excretion or promoted the formation of citric acid at the expense of isocitric acid In particular, strains of the species Candida lipolytica are described as particularly effective in the yeasts of the genus Candida. Also, the breeding of high-performance strains by mutation is known. Also, species such as Candida zeylanoides are listed, which are particularly suitable for a citric acid production. The amounts of excreted acids are given in very different ways. They may, in the most favorable case, be 200 g / l citric plus isocitric acids, although angages η are the most frequent between 50 and 100 g / l. ,
170 314 -^-170 314 - ^ -
Ein Nachteil der bekennten Verfahren besteht darin, daß allgemein eine hohe Biomassekonzentration angestrebt ist, was jedoch nicht in jedem Fall erwünscht ist, weil eine hohe Biomassekonzentration einen entsprechend hohen Aufwand an Ausgangsprodukten, an Rühr-und Belüftungsenergie sowie a.j3 Reinigungsoperationen erforderteA disadvantage of the known method is that a high biomass concentration is generally desired, which is not desirable in every case, because a high biomass concentration required a correspondingly high amount of starting materials, stirring and aeration energy and a.j3 cleaning operations
Zweck der Erfindung ist die Herstellung eines Gemisches von Zitronensäure und Isozitronensäure in hoher Ausbeute mit verringertem Einsatz an Ausgangsaaterialieη·The purpose of the invention is the preparation of a mixture of citric acid and isocitric acid in high yield with reduced use of starting material.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, die Mengenverhältnisse der Nährstoffe zu modifizieren.The invention is therefore based on the object to modify the proportions of nutrients.
Erfindungsgemäß erfolgt die Herstellung des Zitronensäuregeiaisches derart, daß die eigentliche Produktionsphase unter .Limitation durch die Stickstoffquelle durchgeführt wird» Das bedeutet, daß man dem Medium gerade soviel einer Stickstoff— quelle zufügt, wie für eine ungestörte Vermehrung der Hefe— bioffiasse zu einer für die nachfolgend hohe Zitroneη säurebildung optimalen Menge nötig ist. Überraschenderweise liegt diese Menge bei niedrigen Konzentrationswerten β Bei Werten zwischen 5 und 7 g Hefetrockensubstanz γ/ird bereits das Maximum der Zitronensäurenakkumulation erreicht, welches über einen weiten Bereich bis etwa 15 g/l, beibehalten wirdoAccording to the invention, the production of the citric acid is carried out in such a way that the actual production phase is carried out by imitation by the nitrogen source. This means that just as much of a nitrogen source is added to the medium as an undisturbed propagation of the yeast compound high Zitroneη acid formation optimal amount is needed. Surprisingly, this amount is at low concentration values. At values between 5 and 7 g of yeast dry matter, the maximum of the citric acid accumulation has already been reached, which is maintained over a wide range up to about 15 g / l
Im einzelnen wird »vie folgt gearbeitet: Hefe vorzugsweise der Gattung Candida wird unter aseptischen und aeroben Bedingungen in einem Medium angezüchtet, daß gerade soviel einer Stickstoffquelle enthält, um eine Biomasse-1 menge zwischen 5.bis 15 g/l (als Trockensubstanz) zu bilden» Als Anhaltswert für die Bemessung der Menge der Stickstoffquelle - meist ein Ammoniumsalz — dient die Beziehung.:Specifically working »vie follows: yeast, preferably of the genus Candida is grown under aseptic and aerobic conditions in a medium that contains just as much of a nitrogen source, a biomass 1 volume between 5th to 15 g / l (as dry matter) to As a reference value for the calculation of the amount of nitrogen source - usually an ammonium salt - serves the relationship .:
angestrebte Menge BiomasseTargeted amount of biomass
N-Quelle (auf N berechnet) in g/l = in g/1 N source (calculated to N) in g / l = in g / 1
12,512.5
wobei von einem Eiweißgehalt der Hefe von 50 % ausgegangen wird.assuming a yeast protein content of 50 % .
Die übrigen Bestandteile des Mediums - LiLneralsalze und \ abhängig von der Bedürftigkeit de-s Hefestammes auch Supp— ι line (wie z»B. Hefeautolysat) werden nach bekannter Bej Ziehung auf die Menge der vorgelegten Stickstoffquelle , abgestellt. Die Kohlenstoffquelle und das Kalziurakarbo- : nat (als eine andere Substanz zum Abfangen der Säuren) : können, bereits zu Beginn der Kultivierung in voller.Höhe oder aber der Teil, der ausschließlich zur Zitronensäure- ; synthese diont, nach Abschluß der V/achstumsphase zugesetzt werden. Die Menge des ICalziumkarbonats ist zweckmäßigerweise so zu bemessen, daß der pH-V7ert erst gegen Ende des Prozesses kleiner als 3 wird· Nach Abschluß der Wachstumsphase wird der Prozeß unter aeroben und aseptischen Bedingungen für etwa 3-5 Tage fortgesetzt.The other components of the medium - and LiLneralsalze \ depending on the need of the yeast strain also Supp- ι line (such "B autolysate.) Are in a known Bey contraction, parked on the amount of nitrogen source submitted. The carbon source and the calcic acid carbonate (as another substance to trap the acids): may, already at the beginning of the cultivation in full height or else the part exclusively to the citric acid; Synthesis diont, be added after completion of the growth phase. The amount of calcium carbonate is expediently to be such that the pH value does not become less than 3 until the end of the process. After completion of the growth phase, the process is continued under aerobic and aseptic conditions for about 3-5 days.
Es ist durchaus im Sinne der Erfindung, wenn der für eine Zi-. troneηSäurenproduktion vorgesehene Hefestamm in einer gesonderten Vermehrungsstufe kultiviert wird und die eigentliche Zitronensäuresynthese in einer zweiten oder in mehreren Stufen erfolgt, wobei die einzelnen Stufen räumlich getrennt, in eigenen Fermentoren durchgeführt werden können*It is perfectly within the meaning of the invention, if for a Zi-. troneηSäurenproduktion cultured yeast strain is cultivated in a separate propagation stage and the actual citric acid synthesis takes place in a second or in several stages, the individual stages spatially separated, can be performed in their own fermentors *
Eine erfindungsgemäße Trennung in mindestens zwei Phasen erlaubt den Zusatz solcher Substanzen zur Phase der Zitronen— ' Säurenausscheidung, welche diese beeinflussen oder den Anteil der Isozitronensäure zugunsten des Anteils der Zitronensäure verringern und umgekehrt. Solche Substanzen sind z. B. Eisen-, Blei-, Zink- und Manganionen, Fluoracetat oder -zitrat, ; Methanol sowie bestimmte Vitamine wie Thiamin oder vitaminhaltige Substrate, wie Hefeautolysat· *A separation according to the invention in at least two phases allows the addition of such substances to the phase of citric acid excretion, which influence these or reduce the proportion of isocitric acid in favor of the proportion of citric acid and vice versa. Such substances are for. Ferric, lead, zinc and manganese ions, fluoroacetate or citrate; Methanol and certain vitamins such as thiamine or vitamin-containing substrates, such as yeast autolysate · *
Folgende Beispiele verdeutlichen das erfindungsgemäße Verfah- ; ren: :The following examples illustrate the method according to the invention; ren::
'. Beispiel Λ . · '. Example Λ . ·
In einem Hührfermentor von 1 1 Volumen werden 550 ml einer "Nährlösung folgender Zusammensetzung sterilisiert:In a Hührfermentor of 1 1 volume 550 ml of a "nutrient solution of the following composition are sterilized:
" 0,4 i> NH4Cl"0.4 i> NH 4 Cl
0,1 % KH2PO4 : ·; ν- 0,05 ίο MgSO4 ...7 H2O0.1 % KH 2 PO 4 : ·; ν- 0.05 ίο MgSO 4 ... 7 H 2 O
0,5 %. Hefe extrakt (70 #)0.5 %. Yeast extract (70 #)
0,5 % CaCO3 0.5 % CaCO 3
20 ml Para,ffinöl-(η-Paraffine c-jo~20 ml of Para, ffinöl- (η-paraffins c -jo ~
Der Fermentor wird danach mit 40 ml einer gut gev/achsenen, 18 Stunden alten Schüttelkultur von Candida lipolytica "beimpft. Die Nährlösung der Schiittelkultur hatte die gleiche Zusammensetzung wie oben abgegeben* Es wird mit 50 l/h Luft belüftet und die Temperatur auf 30 + 10 0C gehalten* Nach 40 h ist die Biomassesynthese be endet, die Ferrnentationslösung enthält 1,5 % Hefetrocken-The fermentor is then inoculated with 40 ml of a well-agitated, 18-hour shake culture of Candida lipolytica. "The culture broth nutrient solution had the same composition as above. * Air is vented at 50 l / h and the temperature is raised to 30 + 10 0 C held * After 40 h, the biomass synthesis is terminated, the Fermentation solution contains 1.5 % yeast dry
Die Fermentationslösung wird unter aseptischen Bedingungen Id einen sterilisierten Fermentor vom gleichen Typ wie oben überführt, in dem über eine Regeleinrichtung ein pH—,.'ert νου 4,5 bis 5 mit Hilfe von ständig aufgeschlämmter 10 %iger Kalkmilch konstant gehalten wird. Außerdem wird mit 60 1-Laft/h belüftet. Nach 10 Stunden wird aseptisch 100 ml Paraffiaöl (η-Paraffine C,q - C2q) zugegeben» Nach weiteren 80-Stunden ist die Fermentation' beendet· Das "Volumen der Fermentation slösung beträgt 305 ml«The fermentation solution is transferred under aseptic conditions Id to a sterilized fermenter of the same type as above, in which a pH - value of 4.5 to 5 is kept constant by means of a regulating device with the aid of constantly slurried 10% lime milk. In addition, it is aerated with 60 1-Laft / h. After 10 hours aseptically add 100 ml paraffia oil (η-paraffins C, q - C 2 q) »After another 80 hours the fermentation is over · The" volume of the fermentation solution is 305 ml "
Die Ausbeute beträgt - auf das Ausgangsvolumen von 600 ml "berechnet - 31 g/l Zitronen- und 60 g/l Isozitronensäure·The yield is - calculated to the initial volume of 600 ml - 31 g / l citric and 60 g / l isocitric acid ·
1 1 einer Nährlösung, die mit Leitungswasser aufgefüllt wird, eathält1 l of a nutrient solution, which is filled up with tap water, eathält
1,5 ml Paraffinöl (n~?araffine C^0- C20)1.5 ml paraffin oil (n ~ araffine C ^ 0 - C 20 )
0,6 g N (als NH.Cl)0.6 g of N (as NH.Cl)
0,5 g KH2PO4 0.5 g KH 2 PO 4
0,2 g MgSO4 · 7 H2O0.2 g of MgSO 4 .7H 2 O
0,02 g CaCl2 0.02 g CaCl 2
2,5 g Hefeextrakt (70 % Trockensubstanz)2.5 g yeast extract (70 % dry matter)
Je 100 ml dieses Mediums werden in-zehn 500 ml Schüttelkolben gefüllt, sterilisiert und mit 10 ml einer Impflösung von Candida lipolytioa beimpft· Es wurde 30 Stunden bei 30 C geschüttelt.In each case 100 ml of this medium are filled with 10 ml 500 ml shake flasks, sterilized and inoculated with 10 ml of a cocaine solution of Candida lipolytioa. Shake at 30 ° C. for 30 hours.
ββ
Danach beträgt der η-Gehalt der Fermentationslösung Ό,Ό08 g/l und die/Biomassekonzentration 7,5 g/l· Zu jedem Kolben werden aseptisch zugegeben 8 g CaCO-, 15 ml Paraffinöl und die Kolben werden 4 Tage bei 30 0C geschüttelt. Die Ausbeute beträgt 50 g/l Zitronen- und 55 g/l Isozitronensäure·Thereafter, the η content of the fermentation solution is Ό, Ό08 g / l and the / biomass concentration 7.5 g / l · Aseptically added to each flask 8 g CaCO-, 15 ml paraffin oil and the flasks are shaken for 4 days at 30 0 C. , The yield is 50 g / l citric acid and 55 g / l isocitric acid ·
Beispiel 3Γ. . . . '." :\'.':"' ' .Λ-. . -" '' .'. .'. . Es werden das gleiche Medium und die gleiche Verfahrensdurchführüng wie bei Beispiel 2 benutzt» lediglich wird das Paraffinöl durch Zucker (20 g/l Glukose für die Wachstuinsphase und 50 g/l für die Produktionsphase) ersetzt· Die Ausbeute an Zitronensäure (Isozitronensäure wurde nicht bestimmt).beträgt 35 g/l· .: ; . , ; Example 3 Γ. , , , '.': \ '.': "' ' .Λ-. , -.. '.'.. '' 'Will be used the same medium and the same Verfahrensdurchführüng as in Example 2 »only the paraffin oil is sugar (20 g / l glucose for the Wachstuinsphase and 50 g / l for the production phase) The yield of citric acid (isocitric acid was not determined) is 35 g / l · ·: ·,;
0,8 . g/l . N (als0.8. g / l. N (as
20 ν ml " v η-Paraffine (20 v ml of " v " η-paraffins (
.0,5 g £H2P04.0.5 g £ H2 P0 4
0,2 g MgSOA « .7 H2O0.2 g MgSO A ".7 H 2 O
H-H-
0,02 g . CuSO4 0.02 g. CuSO 4
: 0,01 g ' ZnCl2 : 0.01 g of ZnCl 2
0,02 ' g CoSO4 · 7 H2O ,0.02 'g CoSO 4 .7H 2 O,
0,02 g MnSO4 · 4 H2O0.02 g MnSO 4 .4H 2 O
" 0,02 g CaCl2 "0.02 g of CaCl 2
werden mit Leitungswasser auf 1· 1 aufgefüllt, je 100 ml in "zehü ; Schürt elkolber1)' von 500 ml; Volumen: gefüllt, sterilisiert, mit 10 ml einer Impflösung von Candida guilliermondii beimpft und 40 Stunden bei "'30 0C geschüttelt. Danach beträgt der N- ,. Gehalt der Feriiientationslösung 0,02 g/l und die Biomassekon— zeniration 10/g/l.. Zu -jedem. Schüttelkoroeü v/er^en unter aseptischen Bedingungen 1' ml einer .10 ?iigen Hefeautolysatlösung und 5g CaCOo zugegeben. ,are filled with tap water to 1 · 1, "zehü; Stokes elkolber 1) 'by 500 mL; volume: filled, sterilized, inoculated with 10 ml of an inoculum of Candida guilliermondii and for 40 hours at" per 100 ml in '30 0 C shaken , Thereafter, the N-,. Content of the fermentation solution 0.02 g / l and the biomass concentration 10 / g / l .. To each. Shake corpus added under aseptic conditions 1 ml of 10% yeast autolysate solution and 5 g CaCO 2. .
Ss v/ird 4 2c>ge bei 30 0C geschüttelt. Die Ausbeute beträgt 10 g/l Zitronen- und 25 g/l IsiDzitron en säure.Shake vigorously at 30 ° C. for 4 sec. The yield is 10 g / l citric and 25 g / l IsiDzitron acid.
Claims (2)
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DD17031473A DD149875A3 (en) | 1973-04-09 | 1973-04-09 | PROCESS FOR MICROBIAL PRODUCTION OF A MIXTURE OF CITRIC ACID AND ISOZITRONIC ACID |
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