DD145765A1 - Verfahren zur erzeugung eines zellwandlytischen enzymkomplexes - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erzeugung eines zellwandlytischen Enzymkomplexes, geeignet zur Sphäroplastenpräparation. Es ist das Ziel der Erfindung, ein Mannanase und Glucanase enthaltendes Enzympräparat zu gewinnen, mit dem man in beliebig en Mengen und in guten Ausbeuten unter Vermeidung proteolytischer Prozesse Mikroorganismen erzeugen kann, die weitgehend von der Zellwand befreit sind. Es wurde ein Verfahren entwickelt, mit dessen Hilfe es möglich ist, jahreszeitlich unabhängig ein Enzympräparat in beliebigen Mengen zu gewinnen und damit weitgehend zellwandbefreite Mikroorganismen bei gleichzeitiger Ermittlung von Ausbeute und Lyse-Rate isotopmarkierter Sphäroplasten zu erzeugen. Wichtige Produktionsstämme können durch die Sphäroplastenbildung besser erforscht und kontrolliert werden hinsichtlich labiler Strukturen, die ohne vorherigem Zellwandabbau nicht zugänglich sind.

Description

I'itel der Erfindung

Verfahren zur Erzeugung eines zellwandlytischen Enzymkomplexes

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Submersverfahren zur Gewinnung eines zellwandlytischen Enzymkomplexes, der. Mannanase, Glucanass und Chitinase enthalte Das rohe Enzympräparat kann sehr vorteilhaft zur Gewinnung von Sphäroplasten eingesetzt werden«, Sphäroplasten können als weitgehend zellwandbefreite osmolabile Mikroorganismen 'Verwendung finden bei der Kontrolle von Produktionsstämmen hinsichtlich, labiler Strukturen, die ohne vorherigem Zellwandabbau nicht zugänglich sind_e

Eine weitere Anwendungsmöglichkeit der Erfindung besteht in der Gewinnung eines Ensympräparates, das als Ausgangsmaterial zur Isolierung der darin enthaltenen Enzyrae genutzt werden kann*

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Die bisher eingesetzten Enzympräparate zur Sphäroplasten« bzw« Protoplastengewinnung wurden fast ausschließlich aus. aeia Verdauungssaft dor Weinbergschnecke'Helix pomatia gewonnen.., die jedoch jahreszeitlich begrenzt zu erhalten sind und außerdem' unter Naturschutz stehen«,

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Ferner enthält das aus Helix pomatia gewonnene Enzympräparat nur eine geringe Mannanaseaktivität, dagegen aber eine stärkere Proteaseaktivitat, so daß die Lyse der Zellen schlechter zu steuern ist» In der Literatur werden weitere Verfahren zur Gewinnung . von lytischen Enzymen beschrieben_s die allerdings den Nachteil habenj daß keine Mannanase ausgewiesen wird (DOS 226170, BWP 130422, 69330 und 78202). Das Vorhandensein von Mannanase gewinnt jedoch spezielle Bedeutung für den lytischen Abbau der Hefezellwand, die in größerem Umfang Mannan enthält. .

Das in der Literatur beschriebene Verfahren zur Protoplast enerζeugung bzw. Lyse von Hefen hat den Nachteil, daß unter den genannten Bedingungen kein oder nur ein unvollständiger Abbau der-Zellwand bei Candida-Arten erfolgte (VSSAlTSEi,M. , KRATJECr,Z. , and BIELY,P. (1977) Z. AlIg. Mikrobiol. 17, 391-402)*

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines jederzeit im präparativen Maßstab darstellbaren Enzymkomplexes, der es gestattet, in beliebigen Mengen und in guten Ausbeuten Mikroorganismen zu gewinnen, die weitgehend von der Zellwand befreit sind,

Darlegung des Wesens der Erfindung . ·

Aufgabe der Erfindung ist es, mit Hilfe eines einfachen Verfahrens einen lytischen Enzymkomplex zu gewinnen, mit dessen Hilfe sich Sphäroplasten aus Mikroorganismen im •präparativen Maßstab darstellen lassen. Gleichzeitig sollen Ausbeute und Lyse-Rate der Sphäroplasten durch Einsatz isotop-markierter Verbindungen ermittelt werden«, ·

Es stellte sich vorteihaft heraus, daß zur Adaption an andere Mikroorganismen deren Zellwände als. C-Quelle eingesetzt werden»

Die Aufgabe wurde dadurch gelöst, daß ein Mikroorganismus, 'beispielsweise der Stamm Arthröbacter GJM-I unter submersen Bedingungen in einem Nährmedium mit Zellwand der zu lysierenden Organismen als C-Quelle und Ammqniumsulfat als IT-Quelle bei einem pH-Wert von 7 und einer 'Temperatur von 2o~35 C unter Rührung und Belüftung kultiviert wird«, Nach einer Kultivierungszeit von 2~5 Tagen wird eine gute '!/tische Aktivität erreicht«

Die als Schüttelkulturen oder in Ferinentoren durchzuführenden Hauptkulturen werden mit einer 24-stündigen Vorkultur beimpft«

Als Impfmaterial für die Vorkultur dienen Kulturen auf Sehrägagar .

Die Maxima der Mannanase- und.Glucanasebilduhg fallen zeitlich nicht zusammen* Eine lytische Gesamtaktivität erhält man nach einer Kultivierung von mindestens 2 Tagen« Die Hauptkultur wird nach 5° - 17° Stunden abgeerndet, Das Zentrifugat wird im Vakuum eingeengt, steril filtriert, anschließend gegen Aqua dest« oder Puffer dialysiert und lyophilisiert.

Das erhaltene Dialysat ist frei von Protease. Das so erzeugte Präparat wird zur kontrollierten Gewinnung von SpMroplasten eingesetzte Die Sphäroplastensuabeute und Lyse-Rate kann nach erfolgter Fütterung der Mikroorganismen mit einer uniform C-mar-

kieren Aminosäure über die C-Freisetzung bestimmt werden«

Der roh© Snzymkomplex kann jedoch auch so-eingesetzt. werdenj daß Mikroorganismen lysieren, wodurch eine bessere Freisetzung der in der Zelle vorhandenen Proteine ermöglicht wird» . :

Eine so durchgeführte Proteinfreisetzung kann, im technischen Maßstab angewandt, zum qualitätsverbessernden Aufschluß in der ETahrungs- und Futtermittelindustrie genutzt werden«

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Ausführungsbeispiel 1

Die Staminhärtung des Arthrobacter.GJM-I erfolgt in Schrägagarröhrcheä· Das Agarmedium hat folgende Zusammensetzung:

1o g Hefeextrakt

1o g Pep-ton

35 S Agar . ; ...

1g Kohlenhydrat auf 1 1 Aqua de'st *

Die 5OO ml Schüttelkolben für die Vor- und Hauptkultur ent halten 200 ml nährlösung mit folgender Zusammensetzungί

7,50 g

2,32 g

3,75 g ^₂₄

1,50 g Hefeextrakt 20,0 g Kohlenhydrat . 10,0 mg FeSO₄ · 7HgO 314 mg MgSO₄ · 7H₂O 74,5 mg GaGl₂ · 6H₂O mit Aqua dest. ad 1 1

Sterilisation: 3O Minuten bei 121°0.

Die Züchtung des Impfmaterials zur Beimpfung der Vorkultur erfolgt auf Schrägagarröhrchen bei 3° G. Der Bakterienrasen von 2 Kulturröhrchen wird mit 5 ßil Kulturmedium abgeschwemmt und in 200 ml Medium zur Vorkultur überführt. Diese Vorlcultur wird 4-8 h bei 3^ G geschüttelt. Dänach werden je 10 ml Vorkultur in 200 ml Hauptkultur überführt« Die Hauptkulturv/ird mindestens 2 Tage bei.3O⁰C geschüttelt«

Aufarbeitung der Kulturlösung

Die Arthrobacterkultüren werden zentrifugiert und die Überstände im Vakuum auf ca. 1/1ο bis 1/5 eingeengte Das Konzentrat wird sterifiltriert und dialysiert (Ausschlußgröße to ooo - 20 ooo Dalton)· Die Dialyse erfolgt bei ο - 4- C gegen Aqua dest. Das Dialysat wird lyophilisiert«, Das erhaltene weiße Produkt besteht zu etwa 3°~^°% aus Proteine

Bestimmung der Mannanase- und Glucanaseaktivität

Bei diesem Test wird Mannan bzw_e Glucan enzymatisch gespalten und anschließend werden die reduzierenden Einheiten nach dem SOMOGYI-IiELSON-TeSt bestimmt.

Eine Enzymeinheit (U) ist dabei die Enzymaktivität, die bei Jo C in einer Minute 1 ^imol monomeres Produkt bzw_e Produktäquivalent freisetzte

Die Ansätze von 5⁰⁰/ul enthalten:

250^1 o,1 M Phosphatpuffer (Sörensen) pH 7,6 bei Mannanase

bzw« pH 5,0 bei Glucanase 2oo fi.1 einer 1 mg/ml enthaltenden Mannanlösung bzw_o Glucansuspension

50 /ι! der zu prüfenden Enzymlösung

Die Ansätze werden 1 Stunde bei 5° G inkubiert und die enzymatisch^ Hydrolyse wird danach durch Zugabe von 1 ml der alkalischen Kupferreagenslösung nach SOMOGYI gestoppt (SOMOGYI, M. (1952) J. Biol. Chem. 1^, 19)·

Zu allen Proben werden gleiche Ansätze mi.t inaktiviertem Enzym zur. Bestimmung des Blindwertes mitgeführt» In den so erhaltenen Proben werden anschließend die reduzierenden Zucker bestimmt.

;. ' ., -6- 21 5 1 9 5 :

Ausführungsbeispiel 2 .

Anzucht der Hefe und Spharoplastenpraparation Hefezellen von Candida spec. H werden in einem Flüssigkeitsmedium folgender Zusammensetzung bei 28 C unter Schütteln kultiviert!

1 g IiH₂PO₄ 0.26 mg FeCl '

0.16 g K₂HPO₄ 0.38 mg MnOl₂-.

0.5 g FaCl 0.11 mg KJ

0.7 g MgSO₄ * 7H₂O 0.11mg CuSO₄^H₂O

0.4 g Ca(NO_x),, · 4H_o0 O.5O mg H₅BO₄

O₄

20 g Glucose Q_e36 mg ZnSQ_z

I.34 g Harnstoff 0*25 mg Na₂MoO₄

0.1 mg Biotin . mit Aqua dest, ad

Soll später die Sphäroplastenbildung bzw. die Lyse durch Messung der Radioaktivität bestimmt werden, so wird Stunden vor der Ernte der Hefekultur C(U)-L-LeUcin gefüttert.

Die Hefezellen werden aus der" Kulturflüssigkeit abzentrifugiert, mit einer 1?oigen Kaliumchloridlösung gewaschen und anschließend 30 Minuten bei 28 C in 40 ml Vorinkubationsmedium geschüttelt«

Danach werden die Hefezellen zweimal in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 6jO), der zur osmotisehen Stabilisierung 0,6 M Mannit enthält, gewaschen und schließlich bis zu 200 mg/ml Hefefeuchtmasse im gleichen Puffer suspendiert.

Each Zusatz von Arthrobacter-Snzymkomplex (bis zu 2ο mg/ml) wird bei 28 C auf einem Reziprokschüttler inkubiert_e Nach 5 - 15 Minuten ist eine Sphäroplastenausbeute von etwa 90 Prozent erreicht»

dar Sphäroplastenausbeute und dsr Lyse-Sate

Nach der'Vorinkubation wäscht man die radioaktive Hefe und stellt zwei voluiaengleiche Hefesuspensionen mit 50""2OO mg/ml Feuchtmasse im Präparationspuffer her« V/ährend die eine Suspension mit Enzytakostplex-(bis zu 20 mg/ml) versetzt wird.» dient die andere als Kontrolle· "

Ansatz und Kontrolle schüttelt man bsi 2O-3O C. In bestimmten zeitlichen Abständen werden aus Kontrolle und Ansatz je 200 /ul Proben in je 1 ml osmotisch stabilisierten Präpar'ätionspuffer, 1 ml nicht stabilisierten Präparationspuffer** sowie zu je 2 ml Pffotonol pipettiert'·

Durch Zufügen von Oberflächenaktiven Substanzen kann eine "'C-Gesasatfreisetzung .von nahezu lOOji erzielt werden. Die Protosolprobsn dienen, der Bestimmung der " C-GesaGitinkorporationo Sie werden 20 h bsi. 55 C inkubiert und anschließend in lO mi Diox&nszintillator in Probegläser zur Szintillationsciessußg überführt.

Dia anderen Proben werden sofort lO min bei 56OÖ g zentrifugiert, und, j β 5OO,ul der Überstände werden in i0 ml Dioxaßszintillator gegeben. Zsecks Abklingen der Chemilumineneszenz lagert man die Proben 24 ii tfsi 4 C und vermißt anschließend in einem LKB liallac 81ΟΟΟ liquid seintillation counter.

Claims (2)

1. Erfindungsanspruch

   1. Verfahren zur Erzeugung eines zellwandlytischen Enzymkomplexes durch submerse Kultivierung eines Mikroorganismus, beispielsweise des Stammes Arthrobacter GJM-I, gekennzeichnet dadurch» daß ein Stamm unter subiaersen Bedingungen in einem Nährmedium mit Zellwand &? zu Iysierenden Organismen als C-Quelle und Anmoni-umsulfat als N-Quelle bei einem pH-Wert von 7 ^und einer Temperatur ⁷
   viert wird«

   Temperatur von 20 - ß5 C unter Rührung und Belüftung kulti-
2. 2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß das KuI-turfiltrat des Mikroorganismus zu einem rohen Enzymkomplex aufgearbeitet wird·