CZ98293A3 - Amino acid compound - Google Patents

Amino acid compound Download PDF

Info

Publication number
CZ98293A3
CZ98293A3 CZ93982A CZ98293A CZ98293A3 CZ 98293 A3 CZ98293 A3 CZ 98293A3 CZ 93982 A CZ93982 A CZ 93982A CZ 98293 A CZ98293 A CZ 98293A CZ 98293 A3 CZ98293 A3 CZ 98293A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
leu
gly
ala
ser
lys
Prior art date
Application number
CZ93982A
Other languages
English (en)
Inventor
Eric Paul Dixon
Edward Marion Johnstone
Sheila Parks Little
Franklin Harpold Norris
Original Assignee
Lilly Co Eli
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lilly Co Eli filed Critical Lilly Co Eli
Publication of CZ98293A3 publication Critical patent/CZ98293A3/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4711—Alzheimer's disease; Amyloid plaque core protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/95—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/04—Screening involving studying the effect of compounds C directly on molecule A (e.g. C are potential ligands for a receptor A, or potential substrates for an enzyme A)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Aminokyselinová sloučenina
Oblast techniky
LO
OO
Vynález se týká aminokyselinové sloučeniny, proteázy a příbuzných DNA sloučenin.
Dosavadní stav techniky
Peptidových zbytků 42 až 43, známých jakožto β-amyloidní peptid (β/Α4), se používá při ošetřování Alzheimerovy nemoci a Downova syndromu. Výzkumní pracovníci se domnívají, že abnormální akumulace této 4 kilodaltonové (kd) bílkoviny v mozku je způsobena štěpením větší prekurosrové bílkoviny, nazývané amyloidní prekursorová bílkovina (APP). K normálnímu štěpeni APP dochází v oblasti A4, což naznačuje, že k alternativnímu štěpení dochází, jestliže se generuje normální plná délka. Koncovým aminozbytkem β/Α4 je nejčastěji asparagová kyselina Asp, což naznačuje, že proteáza, která se štěpí mezi methioninem (Met) v poloze 596 (Met 5?ό za použiti číslovacího systému podle J. Kamnga a kol., Nátuře 325, str. 733, 1987) a Asp=-,? APP by generovala amyloid. Proto preteázy, které štěpi APP, takže vzniká β/Α4, jsou důležité pro charakterizaci Alzheimerovy nemoci a Downova syndromu .
V minulosti se výzkumnici zaměřovali na charakterizaci abnormálního štěpení prostřednictvím klasické techniky čištění bílkovin. Tyto výzkumy vedly k charakterizaci částečně čištěné 68 ki1odaltonová proteázy, která štěpí vazbu Met-Asp syntetického peptidu. C. Abraham a kol., Neurobioiogy of Aging 11A, str. 303, (1990). V roce 1991 Abraham a jeho spolupracovníci porovnávali obrazec štěpení 68 kd proteázy známými serinovými proteázami. C. Abraham a kol., Biochemicsl and Biophysicai Research Communications, 174, str. 790, (1991). Následně stejní výzkumní pracovníci uvedli, že aktivita, popisovaná v dřívějších studiích, byla ve skutečnosti působením dvou nezávislých proteáz. Jedna byla identifikována jakožto na vápníku závislá serinová proteáza a druhá kol·., Journal of CelluAbraham a kol., Journal Nebyla popsána ani strujako cystě i twtai i oproteaza. C. Abraham a lar Biochemistry, 15, str. 115 (1991): C. of Neurochemistry, 57, str. 5109 (1991).
kxura ani charakteristiky těchto proteáz.
Podstata vyn álezu
Podstatou vynálezu je nová aminokyselinová sloučenina s ná sledujíc! aminokyselinovou sekvenci
Met Lys 1 Lys Leu Met 5 Val Val Leu Ser Leu Ile Ala Ala Ala Trp Ala
10 15
Glu Glu Gin Asn Lys Leu Val His Gly Gly Pro Cys Asp Lys Thr Ser
20 25 30
His Pro Tyr Gin Ala Ala Leu Tyr Thr Ser Gly His Leu Leu Cys Gly
35 40 45
Gly Val Leu Ile His Pro Leu Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Lys
50 55 60
Lys Pro Asn Leu Gin Val Phe Leu Gly Lys His Asn Leu Arg Gin Arg
65 70 75 80
Glu Ser Ser Gin Glu Gin Ser Ser Val Val Arg Ala Val Ile His Pro
85 90 95
Asp Tyr Asp Ala Ala Ser His Asp Gin Asp Ile Met Leu Leu Arg Leu
100 105 110
Ala Arg Pro Ala Lys Leu Ser Glu Leu Ile Gin Pro Leu Pro Leu Glu
115 120 125
Arg Asp Cys Ser Ala Asn Thr Thr Ser Cys His Ile Leu Gly Trp Gly
130 135 140
Lys Thr Ala Asp Gly Asp Phe Pro Asp Thr Ile Gin Cys Ala Tyr Ile
145 150 155 160
His Leu Val Ser Arg Glu Glu Cys Glu His Ala Tyr Pro Gly Gin Ile
165 170 175
Thr Gin Asn Met Leu Cys Ala Gly Asp Glu Lys Tyr Gly Lys Asp Ser
180 185 190
Cys Gin Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Gly Asp His Leu Arg
195 200 205
Gly Leu Val Ser Trp Gly Asn Ile Pro Cys Gly Ser Lys Glu Lys Pro
210 215 220
Gly Val Tyr Thr Asn Val Cys Arg Tyr Thr Asn Trp Ile Gin Lys Thr
225 230 235 240
Ile Gin Ala Lys 244 označovaná jakožto SEQ ID No : 1 nebo její funkční ekvivalent.
Vynález se tyká nového enzymu, který je strukturálně odlišný od dříve popsaných enzymů a který štěpí APP a generuje amylloidogenni fragmenty velikosti očekávané pří štěpení Metsf6-Asp597. Proto je nový enzym velice užitečný pro další charakterizaci Al2heimerovy nemoci a Downova syndromu. Kromě toho použití podle vynálezu může vést k ošetřováni těchto nemocí a příbuzných nemocí.
Až dosuid nebylo dostatek prostředků k diagnostikování Alzheimerovy nemoci u lidí, pokud se nemoc sama neprojevila kompletní demencí. Potvrzeni demence jako důsledek Alzheimerovy nemoci vyžaduje posmrtné zkoumáni mozku postiženého nemocného jedince, ynález umožňuje diagnostikovat Alzheimerovu nemoc nebo sklon k vývoji Alzheimerovy nemoci ještě za života pacientů.
Pro lepší porozumění vynálezujsou zde jednotlivé výrazy nyní definovány:
Buňkami 293 se míní v široké míře dostupná transformovaná buněčná řada lidské primární embryonální ledviny, kterou popsal F.L. Graham a kol., Journal of General Virology, 36, str. 59 až 72 (1977). Tato buněčná řada se například může získat u organizace American Type Cuiture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, 10852 - 1776 (ATCC) pod objednacím číslem ATCC CRL 1573.
Buňkami AV12 se míní jiná v široké míře dostupná buněčná řada, která se může získat v organizaci ATCC pod objednacím číslem ATCC CRL 9595.
Amyloidogenickým fragmentem se míní APP fragment obsahující β/Α4 peptid.
Funkční sloučeninou SEQ ID No:1 se míní sloučenina obsahující SEQ ID NO:1, která je schopná štěpit APP.
Kunitzovitou doménou se míní proteázový inhibitor podobný sojovému trypsinovému inhibitoru nebe sekvenci nukleové kyseliny kódující proteázový inhibitor, který je podobný sojovému trypsinovému inhibitoru. Například Kunitzova preteázová inhibitorová (KPI) oblast APP, kterou popsal P. Ponte a kol., Nátuře 331. str. 525 (1988) nebo R.E. Tanzi a kol. Nátuře 331, str. 28 (1988) nebo N. Kitaguchi a kol. Nátuře 331, str. 530 (1988) představuje Ku4 nítzovitou doménu.
pRc/Zymem s© míní modifikovaný pRc/CMV eukaryotický expresní vektor, přičemž pRo/CMV vektor je obchodně dostupný (Invitrogen Corporation, 3985 Sorrento - Valley Blvd., Suitě B, San Diego, California 92121). Plasmid pRc/Zyme zahrnuje lidský cytomegalovirový promotor a zesilovač transkripce, hovězí růstový hormonový polyadenylační signál, neomycinový resistenční gen, beta-laktamasový gen, užitečný jakožto signální znak ampicillínové odolnosti v E. coli a četné jiné skutečnosti, jak je popsáno v 1991 Invitrogen Catalog, str. 29 a stejně jako NOtl/SalI inzert 1451 páru bázi, který zahrnuje celou Zymovou kódující oblast.
pSZymem se mini modifikovaný E.coli klonovací vektor pSPORT-1™ (popsal E.Y. Chen a kol., DNA, 4, str. 165, 1985), přičemž plasmid pSPORT-l?M je obchodně dostupný (Gibco-BRL, 8400 Helgerman Court, Gaithersburg, Maryland 20877). Plasmid obsahuje původní replikační formu vektoru pUC, přičemž tento plasmid popsal C. Yanisch-Perron a kol., Gene, 33, str. 103 až 119 (1985); beta-laktamazový gen, který přispívá ampici11inové odolnosti; Notl/Sall inzert 1451 páru bázi, který obsahuje celou kódující oblast Zymu, jakož také jiné charakteristiky.
Části SEQ ID NO:1 se zde mini alespoň 6 následných aminokyselinových zbytků SEQ ID NO:1.
mRNA se míní ribonukleová kyselina (RNA), která se transkribuje in vivo nebo in vitro, včetně například RNA transkriptů, připravených in vitro transkripcí kódujících sekvencí DNA RNA polymerázou.
SEQ ID NO:1 nebo jejím funkčním ekvivalentem se míní SEQ ID NO:1 nebo konzervativní obměna aminokyselinové sekvence SEQ ID NO:1, kde konzervativní obměna vede ke sloučenině, která má v podstatě stejné biologické, biochemické, chemické, fyzikálni
a strukturální kvality j ako SEQ ID: 1 .
SEQ ID NO:3 se míní DNA sekvence ATG GCT GGC GGC ATC ATA
GTC AGG G.
SEQ ID NO:4 se míní DNA sekvence AAC CGA ATC TTC AGG TCT
TCC TGG GG.
SEQ ID NO:5 se míní DNA sekvence TCG CTC TCT CCT GGG GAC
ACA GA. S ° míní DNA sekvence CCA GGT GCT ATT CCA TGT
SEQ ID NO: 6
ATG TCA TAG SEQ ID NO: 7 se míní DNA sekvence TCT GTG TCC CCA GGA GAG
AGC GA SEQ ID NO: 8 se míní DNA sekvence ATA GTG AAG CTG TCT TCT
CAA T. Trans fekcí f| se i míní jakýkoliv přenos nukleové kyseliny do
hostitelské buňky, s integrací nebo bez integrace nukleové kyseliny do genomu hostitelské buňky.
Zyme znamená aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:1 nebo její funkční ekvivalent.
Pásovou konfiguraci podobnou zymu se mini jedna nebo dvě pásové konfigurace volené ze dvou pásových konfigurací, označovaných zde jakožto restrikční fragmentový polymorfísm. Jeden obrazec má pás páru bází 2400 nikoliv však pás páru bází 2500. Jiný obrazec má pás 2500 nikoliv však pás páru bází 2400.
Vynález se tedy týká shora uvedených aminokyselinových sloučenin, označovaných zde jakožto SEQ ID NO:1 nebo jejich funkčního ekvivalentu. Obzlváště výhodnou je aminokyselinová sloučenina, kterou je SEQ ID NO:l.
Pracovníkům v oboru je známo, že určité obměny SEQ ID NO:1 selhávají při měnění funkce aminokyselinových sloučenin. Například některé hydrofobní aminokyseliny mohou být zaměněny za jiné hydrofobní aminokyseliny, navzájem se mohou zaměňovat aminokyseliny s podobnými postranními řetězci, aminokyseliny se zásaditými skupinami mohou vzájemně zaměňovat s aminokyselinami s jinými zásaditými skupinami, aminokyseliny s kyselými skupinami se mohou vzájemně zaměňovat s aminokyselinami s jinými kyselými skupinami, malé aminokyseliny se mohou zaměňovat s jinými malými aminokyselinami nebo se mohou provádět jiné konzervativní změny. Tyto obměněné aminokyselinové sloučeniny, která mají v podstatě tutéž funkci a působí v podstatě stej-ně jako příkladná aminokyselinová sloučenina jsou ve vynálezu rovněž zahrnuty.
Pracovníkům v oboru je známo, že se taxo bílkovina může syntetizovat různými způsoby. Všechny aminokyselinové sloučeniny podle vynálezu se mohou připravovat chemickými způsoby dobře v oboru známými, včetně syntézy peptidu v pevné fázi nebo rekombinantniho způsobu. Oba takové způsoby jsou popsány v americkém patentovém spise číslo 4 617149. Rekombinantní způsoby jsou výhodné, když je žádoucí vysoký výtěžek. Obecný způsob konstrukce jakékoliv žádoucí DNA sekvence popsal Brown a kol., Methods in Enzymology, 68, str. 109 (1979).
Jiné způsoby produkce jsou v oboru dobře známy. Exprese v eukaryotických buňkách se může dosáhnout přes SEQ ID NO:2, jak dále popsáno. Například se mohou připravovat aminokyselinové sloučeniny v eukaryotických buňkách za použití opičího viru 40, cytomegaloviru nebo expresních vektorů odvozených od viru nádoru myších mléčných žláz, obsahujících DNA, který zakodovává SEQ ID N0:l. Jak je v oboru dobře známo, jsou některé viry také vhodnými vektory. Například jsou užitečnými adenovirus, očkovací virus (vaccinia virus), virus oparu, tyčinkovitý virus (baculovirus) a virus sarkoma. Takové způsoby jsou popsány v americkém patentovém spise číslo 4 775624. Některé obměněné způsoby exprese popsal J. Sambrook a kol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, kapitola 16 a 17 (1989).
Podle jiného provedení zahrnuje vynález sloučeniny nukleové kyseliny, které máji sekvence nukleové kyseliny kodujici SEQ ID NO:1. Jak je pracovníkům v oboru známo, aminokyselinové sloučeniny podle se mohou zakodovávat četnými rozličnými sekvencemi nukleové kyseliny v důsledku degenerace genetického kódu, přičemž se většina aminokyselin zakodovává více než jedním aminokyselinovým tripletem. Jelikož tyto alternativní sekvence nukleové kyseliny by zakodovávaly stejné aminokyselinové sekvence, týká se vynález dále těchto alternativních sekvenci aminokyselin. S výhodou je sloučeninou aminokyseliny DNA, mající smysl nebo nemající smysl mRNA. Nejvýhodnéjší provedení DNA sloučeniny, která zakodovává Zyme má sekvenci:
Ί
ATGAAGAAGC TGATGGTGGT GCTGAGTCTG ATTGCTGCAG CCTGGGCAGA 50
GGAGCAGAAT AAGTTGGTGC ATGGCGGACC CTGCGACAAG ACATCTCACC 100
CCTACCAAGC TGCCCTCTAC ACCTCGGGCC ACTTGCTCTG TGGTGGGGTC 150
CTTATCCATC CACTGTGGGT CCTCACAGCT GCCCACTGCA AAAAACCGAA 200
TCTTCAGGTC TTCCTGGGGA AGCATAACCT TCGGCAAAGG GAGAGTTCCC 250
AGGAGCAGAG TTCTGTTGTC CGGGCTGTGA TCCACCCTGA CTATGATGCC 300
GCCAGCCATG ACCAGGACAT CATGCTGTTG CGCCTGGCAC GCCCAGCCAA 350
ACTCTCTGAA CTCATCCAGC CCCTTCCCCT GGAGAGGGAC TGCTCAGCCA 400
ACACCACCAG CTGCCACATC CTGGGCTGGG GCAAGACAGC AGATGGTGAT 450
TTCCCTGACA CCATCCAGTG TGCATACATC CACCTGGTGT CCCGTGAGGA 500
GTGTGAGCAT GCCTACCCTG GCCAGATCAC CCAGAACATG TTGTGTGCTG 550
GGGATGAGAA GTACGGGAAG GATTCCTGCC AGGGTGATTC TGGGGGTCCG 600
CTGGTATGTG GAGACCACCT CCGAGGCCTT GTGTCATGGG GTAACATCCC 650
CTGTGGATCA AAGGAGAAGC CAGGAGTCTA CACCAACGTC TGCAGATACA 700
CGAACTGGAT CCAAAAAACC ATTCAGGCCA AG 732
která se zde definuje jakožto SEQ ID NO;2. Výhodnými jsou však také takové aminokyselinové sloučeniny, které mají smysl nebo nemají smysl mRNA .
Vynález se rovněž týká vektorů nukleové kyseliny, které kódují SEQ ID NO:1 nebo jejich funkčních ekvivalentů. Výhodnými vektory nukleové kyseliny jsou vektory, které zahrnují DNA. Nejvýhodnějšími jsou DNA vektory, které zahrnují sekvenci DNA, kterou je SEQ ID NO;2. Obzvláště výhodným DNA vektorem je plasmid pSZyrne.
E . co l i/pSZyrne , který obsahuje klonovaci vektor SEQ ID NO;2, je deponován a je součásti zásobní kul
bsahují ci
ry s b irky
z. ;, Agr i -
'-· / Re o ři-
í rn čí s 1 em
nap riklad
Servi ce, U.S, Department of Agricultur
61604, no 29. dubna 1992 pod objednacím
NRRL B-l3971. SEQ ID NO; 2 se muže izotovat z plasmid·, jakožto 1451 pár bází Notl/Sall restrikční fragment. Jiné fragmenty 15' pro získání SEQ ID NO;2.
Kromě toho DNA sekvence se může syntetizovat za použití obchodně Uos ř,·... pu ό·.:’.;. - : · l-o o , s, h DNA s yutět i ze r ů, jako je například jednotka ABS (Applied Biosystems, 350 Lincoln Centre Dri8 ve, Foster City, CA 94404) 38OB DNA syntetizer. DNA sekvence se také mohou, generovat po 1ymerázovou řetězovou reakci (PCR), popsanou v americkém patentovém spise čislo 4 889818.
Restrikční fragmenty těchto vektorů se rovněž opatřují. Výhodnými fragmenty jsou 1451 pár bází Notl/Sall restrikční fragment, 803 pár bází BsrBX/Esp3I restrikční fragment a 815 pár bází EcoNI/Bfal restrikční fragment pSZymu.
Kromě toho DNA vektory podle vynálezu s výhodou zahrnují promotor pro puzeni exprese SEQ ID NO:2 nebo jeho funkční ekvivalent. Takové vektory s promotorovými funkcemi v lidských embrionálních ledvinových buňkách (buňky 293), AV12 buňkách, kvasničných buňkách nebo buňkách Escherichia coli jsou výhodné. DNA expresním vektorem je nejvýhodněji plasmid pRc/Zyme.
Plasmid pSZyme, izolovaný z E. coli o sobě známými způxoby, se snadno modifikuje ke konstruování expresních vektorů, které produkují Zyme v nejrůznějších organismech, včetně například E. coli, kvasnicích rodu Saccharomycetes a Sf9 buněk, odvozených od ovarií vojnice rodu Spodoptera (běžně používaný hostitel pro tyčinkoví té virové expresní systémy. (Tuto techniku popsal J. Sambrook a kol., Moleoular Cloning: A Laboratory Manual, kapitola 16 a 17 (1989).
Současná literatura popisuje techniky pro konstruování AV12 expresních vektorů a transfekce AV12 hostitelských buněk, viz například americký patentový spis číslo 4 992373. Současná literatura popisuje také četné techniky pro konstruování 293 expresních vektorů 293 a pro transfekci hostitelských buněk 293.
Konstrukce protokolů, používaných pro buňky 293, může být použita pro konstrukci analogických vektorů pro jiné buněčné řady toliko s případnou náhradou vhodných regulátorových prvků o sobě známými způsoby. Promotory, kterých se může použít, zahrnují například thimidinkinázový promotor, metal Iothioni nový promotor, tepelný šok jako promotor, immunoglobulinový promotor nebo různé virálni promotory, jako je například· promotor viru nádoru mléčných myších žláz, SV40 promotor, promotory viru oparu nebo promotory BK viru. Kromě toho se při prováděni způsobu podle vynálezu může použít uměle konstruovaných promotorů odvozených od konsen9 su sekvencí nebo vytvořených jakožto hybridy jiných promotorů.
DNA Sloučeniny podle vynálezu zahrnují také příměry a nukleotidové sondy. Sloučeniny nukleové kyseliny s aslespoň 18 po sobě jdoucími páry bází, které kódují SEQ ID NO:l nebo její část, jsou ve vynálezu rovněž zahrnuty. Jakožto nejvýhodnější primery a nukleotidové sondy se uvádějí: SEQ ID NO:3 a SEQ ID NO:4. Pracovníci v oboru znají techniku spojenou s těmito dobře známými primery a nukleotídovými sondami.
Například všechny nebo část SEQ ID NO:3 a SEQ ID N0:4 se může používat k hybridizaci na kódovací sekvenci. Sekvence s plnou délkou se pak může generovat za použití po 1ymerázového řetězcového reakčmiho (PCR) zesíleni za použiti o sobě dobře známých způsobů. Sekvence s plnou délkou se může následně subklonovat do jakéhokoliv zvoleného vektoru.
Nebo se mohou SEQ ID NO:3 a SEQ ID N0:4 radioaktivně značit na konci 5' k vytříděni cDNA souboru (library) o sobě známými způsoby. Kromě toho každý kus Zyme-kodujíci DNA, který je vázán na filtr, se může sytit celými mRNA k reverzní transkripci mRNA transkriptů, které váže.
Primery a nukleotidové sondy se mohou získat způsoby v oboru o sobě známými. Například, když se izoluje pSZyme, může se izolovat zvolený fragment použitím restrikčních enzymů a následnou gelovou separací.
Vynález se také týká genomíckého klonu Zymu. Výhodným genoraickým klonem je 4,0 kilobáze HindlII fragment z lidského chromosomového 19 souboru, který hybridizuje na fragmenty DNA, které kódují SEQ ID NO:1. Toho lze dosáhnout hybridizaci SEQ ID NO:2 nebo její části. Například SEQ ID NO:3 a SEQ ID N0:4 se může radioaktivně značit a používat k sondování 19 souboru k jeho identifikaci a k izolaci odpovídající genomové DNA.
Vynález se také týká způsobu díagnozování Alzheimerovy nemoci, přičemž je donorem lidská DNA:
1) provádí se digesce s restrikčnim enzymem Tag I,
2) provádí se hybridizaoe značenou Zyme DNA k odhalení Zymu příbuzné configurace pásu a
3) porovnávají se podobně digerované a hybridizované konfigurace pásu členů donorové rodiny, které vykazují nebo nevykazují symptomy Alzheimerovy nemoci.
Při výhodné zkoušce zjišťování Alzheimerovy nemoci se používá vzorku krve jakožto zdroje donoru lidské DNA.
Když se genomová DNA získá podle vynálezu a když se polymorfismus restrikční fragmentové délky, odvozený od Zyme identifikuje podle vynálezu, provádí se zbylá část procesu provádět o sobě známým způsobem. Například americký patentový spis popisuje číslo 4 666828 takový proces. Četné odkazy na literaturu, například B. Lewin, Genes, str. 78 (1987) popisuji techniky a teorii polymorfismu restrikční fragmentové délky.
Vynález se rovněž týká hostujících buněk, které obsahuji nukleové kyseliny podle vynálezu.Výhodnou hostující buňkou je oocyt. Výhodným je oocyt, který je injektován nRNA nebo DNA sloučeninami majícími smysl podle vynálezu. Výhodnějším je oocyt, který je injektován nRNA nebo DNA sloučeninami majícími smysl podle vynálezu spolu s DNA nebo mRNA, které kóduji APP. Nejvýhodnějšími jsou oocyty podle vynálezu, které se injektuji ve smyslu mRNA.
Jinými výhodnými jsou hostující buňky, které se transfektuji vektorem, který zahrnuje SEQ ID NO:2. Výhodné SEQ ID NO:2 transfektujici hostující buňky zahrnují buňky 293, AV12, kvasinky a buňky E. coli. Nejvýhodnějšími hostujícími buňkami 293 a E. coli jsou 293/pRC/Zyme, E.co 1 i/psZyme.
Výhodnou je rovněž hostující buňka, která je transfektována DNA vektorem, který zahrnuje SEQ ID NO:2 a DNA vektor, který zahrnuje kódující sekvenci APP. Buňky 293, AV12 buňky, kvasničné buňky a buňky E. coli jsou obzvláště užitečnými kotransf1ektujícimi hostujicimi buňkami.
OOcytová hostující buňka se může konstruovat způsobem, který popsal Lúbbert a kol., Proceedings of the National Academy of Sciences (Spojené státy americké), 84, str. 4332 (1987). DNA nebo RNA, které kódují APP (obě aminokyselinové formy 695 a 751) se mohou získat způsobem, který popsal Selkoe a kol., Proceedings of the National Academy of Sciences (Spojené státy americké), 85, str. 7341 (1988). I jiná transfekce hostující buňky je v oboru dobře známy. Kotransfekce buněk se může provádět o sobě známými vynéiezu. Zkouškami me, přičemž se Zyme je se aktivira Zyme způsoby (například Gorman a kol., Molecular and Ceilular Biology, 2, str. 1044, 1982).
Vynález se proto také týká způsobu konstruování hostitelské buňky schopné exprese SEQ ID NO:1, přičemž tento způsob zahrnuje transfekci hostující buňky DNA vektorem, který obsahuje DNA sekvenci, která kóduje SEQ ID NO:1. Při výhodném způsobu se jakožto hostujících buněk používá buněk 293. Tyto buňky 293 se mohou získat z ATCC pod objednacím číslem ATCC CRL 1573. Při jiném výhodném způsobu se jakožto hostujících buněk používá buněk AV12. Tyto buňky AV12 se mohou získat z ATCC pod objednacím číslem ATCC CRL 9595. Při dalším výhodném způsobu se jakožto hostujících buněk používá kvasinek rodu Saccharomycetes nebo bacterium E. co 1 i.
Výhodný způsob používá expresního vektoru, který zahrnuje buňky SEQ ID NO:2 v buňkách 293. Obzvláště výhodným je pro tento účel pRc/Zyme.
Jiný výhodný způsob zahrnuje (a) DNA vektor, který obsahuje SEQ ID NO:2 a (b) DNA expresní vektor, který kóduje ΆΡΡ kódující sekvenci. Podle nejvýhodnějšiho způsobu se používá DNA vektoru pRc/Zymu. Tranfektováné hostující buňky se mohou kultivovat za dobře známých podmínek pro pracující v oboru, například se dosahuje SEQ ID NO:1 exprese, čímž se produkuje Zyme v transfektováné hostující buňce.
Kromě toho se vynález týká způsobu identifikace DNA homologru do nukleotidové sondy podle vynálezu, při kterém se kombinuje zkoušená kyselina nukieová s nukleotidovou sondou za hybridizačních podmínek a identifikuje se taková zkoušená nukieová kyselina, která hybriduje. Výhodnými nukleotidovými sondami pro použití při tomto způsobu jsou SEQ ID NO:3 a SEQ ID N0:4. Hybridizační techniky jsou o sobě dobře známy, viz J. Sambrook a kol., Molecu1 ar Cloning: A Laboratcry Manual, kapoitola 16 a 17, 1989.
Vynález rovněž zahrnuje zkoušky za použití sloučenin podle se zjišťuje, zdal.i je látka ligandem pro Zyuvádí do styku se zkoušenou látkou, monitorufyzikáině stanovitelnými prostředky a identifikujo se látky, které vzájemně působí se Zyme nebo které ovliv12 ftuj i Zyme.
Výhodnými zkouškami podle vynálezu jsou zkouška buněčné kultury, vysoce účinná kapalinová chromatografie (HPLC) nebo zkouška konkurenční reakce při syntéze.
Při výhodných zkouškách buněčných kultur se používá oocytů, AV12, E. coli, kvasinek nebo buněk 293, které vykazuji koexpresi nukleových kyselin, které kódují Zyme a APP. Tyto zkoušky buněčných kultur, vykazujících koexpresi, které jsou výhodné, zahrnuji zkoušky s použitím 293/pRc/Zyme. Podle výhodné zkoušky se používá kvasinkových buněk a sloučenin DNA, které kódují aminokyseliny 587 až 606 APP. Jeden způsob prováděni kvasnicové zkoušky popsal Smith a Kohorn, Proceedings of the National Academy of Sciences (Spojené státy americké), 88, str. 5159 (1991), přičemž se používá Zyme kodujici DNA a APP kódující DNA, která zahrnuje štěpící místa kodonů Met596/Aspso 7·
Nejvýhodnějši oocytové zkoušky vykazují expresi mRNA. Nejvýhodnější zkoušky buněčné kultury používají Westernovu skvrnovou analýzu (Western Blot analysis) nebo APP radioaktivně značeného APP jakožto fyzikálně zjistitelný prostředek. Výhodná je zkouška HPLC, při které se použává substrátu v plné délce, eukaryotioky odvozené APP.
Nejvýhodnějši je konkurenční zkouškou, pří které látka konkuruje s Kunitzovitou oblastí genového produktu pro vázáni Zyme. Nejvýhodnějši konkurenční zkouška Zyme/Kunítzova oblasti používá APP značeného radioisotopem.
Zkoušky buněčné kultury se mohou provádět způsobem který podrobně popsal F. Ausubel a kc-i., Current Protocols in Molecular Biology (1989), str. 9.1 až 9.5. Zkouška HPLC se může provádět v podstatě způsobem, který popsal Hirs a Timasheff, vyd. Methods in Enzymology, svazek 91, sekce V a VI, 1983. Vazební nebo konkurenční zkouška Zyme/Kunitzovité oblasti se může provádět způsobem který popsal J. Bennet a H. Yamamura, Neurotransmitter Receptor Binding, 1985, kapitola 3.
Vynález také zahrnuje způsob pro identifikaci nebo čištění Zyme, při kterém se sytí zkoušená bílkovina anti-Zyme protilátkou, eliminuje se anti-Zyme protilátka, která se neváže a zjišťu13 je se anti-Zyme protilátka, která zůstává vázána ikové zkoušky protilátek jsou v oboru známy.
Následující příklady praktického provedení vynález objasňují, nijak jej však neomezují.
Příklady provedení vynálezu
Přiklad 1
Produkce Zyme v buňkách 293
Lyofi 1izovaný podíl E.coli pSZyme se může obstarat u organizace Nothern Regional Research Laboratories, Peoria, Ilinois, Spojené státy americké 61604 pod objednacím číslem NRRL B-18971 a může se ho přímo použít při dále popsaném působu. Kultura je uložena s NRRL.
Plasmid pSZyme se izoluje z kultury E. coii/pSZyme cesiumchloridovým čištěním. Plasmid pSZyme se pak digeruje se Sáli a Notl. Získaný fragment je lineární. DNA ligásy se použije k ligaci tohoto Sáli a Notl fragmentu a Sall-HindlII linkeru do předem 1iearizovaného pRc plasmidu™ (Invitrogen, katalogové # V750-20).
Konkureční E.coli buňky se pak transfektují nově vytvořeným pRc/zyme vektorem, který obsahuje SEQ ID NO:2 a selektují se z těchto buněk, které zahrnují resistenční gen pro ampicillin růstem na prostředí obsahujícím ampicillin.
Po trasnsfekci pRc/Zyme vektoru do E. coli se provádí následující plasmidová příprava k izolaci pRc/Zyme vektoru. K transfekoi 293 buněk vektorem pRc/Zyme se používá způsobu, který vyvinul Chen a Okavama, C. Chen a H. Okayama, Molecular and Cellular Biology, 7, str. 2745, 1987. Těchto buněk se používá ve zkoušce buněčné kultury, popsané v příkladu 2.
Selekce antibiotika G418 (geneticin) zahrnuje v tomto stupni výrobu stabilních transformantů v buňkách 293. Kolonií, které rosnou v přítomnosti G413, se pak používá jakožto zdroje Zyme.
Příklad 2
Zkouška buněčné kultury
Buňky lidské embrionální ledviny (buňky 293) se kotransfektují za použití pRcZyme a APF-kodujíčího vektoru. V jednom případě se vektor kódující 695 aminokyselinu APP (která je prosta Kunitzovité oblasti) kotransfektuje s pRcZamem. V jiném případě se vektor kódující 751 aminokyselinu APP (která má Kunitzovitou oblast) kotransfektuje s pRcZymem.
Transfekce se dosahuje použitím o sobě známého způsobu transfekce fosforečnanem vápenatým. Jiné transfekční protokoly, jak popsal například J. Sambrook a kol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, kapoitola 16 a 17, 1989, jsou také účinné. Amyloidogenické fragmenty se zjišťuji, když se použije aminokyselinu 695 (bez KFI) kódující sekvence cestou analyzy Western bloť, popsaná ve shora uvedené publikaci J. Sambrooka za použití antisera na karboxykoncových aminokyselinách bílkoviny APP. Anti BX6, jak popsal T. Oltersdorf a kol., Journal of Biological Chemistry, 265, str. 4492 až 4497, 1991 se používá při této zkoušce. Amyloidogenické fragmenty se nestanoví, jestliže se použije 751 aminokyseliny (s KPI) APP.
Přiklad 3
HPLC zkouška
APP s plnou déikou se produkuje v buňkách, které jsou infikovány baculovirem kódujícím APP. Provádění tohoto způsobu popsal J. Knops a kol., Journal of Biological Chemistrry, 266, str. 7285, 1991. APP se inkubuje v přítomnosti aktivního Zyme a zkoušené sloučeniny. APP fragmenty se následně odděl! vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC). Každý shromážděný fragent se pak podrobuje mikrosekvenci o sobě známým způsobem, který popsal například Hirs a Timasheff, vyd., Methods in Enzymology, svazek 91, sekce V a VI , 1983. Množství generovaných amyloidogenických fragmentů (které zakončují bud na Met;?,, nebo na Asp;—?) se porovnávají s množstvím, generovaným v nepřítomnosti zkoušené slou15 čeniny ke stanovení schopnos me .
zkoušené sloučeniny ovlivňovat ZyPřiklad 4
Konkurenční zkouška Zyme/Kunitzovité oblasti
Peptid, představující KPI oblast APP, se syntetizuje a značí isotopem jodu-125 p-?J) . Konkurenční zkouška vázání se pak provádí způsobem, který popsal J.P. Bennet a H. Yamamura, Neurotransmitter Receptor Bíndíng 61, 1985. Zyme se pak váže na plastické mikrotitrové důlky jako při tradiční zkoušce ELISA. Jeden takový typický protokol pro tento stupeň popsal F. Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, 2, str. 11.1 až 11.3, 1989. Značená oblast KPI, a neznačená konkurenční sloučenina se následně přidají do důlků mikrotitrové destičky s 96 důlky. Důlky se pak promyjí. Zbylý isotop se zapíše k výpočtu relativní afinity neznačené konkurenční sloučeniny k Zymu.
Příklad 5
Izolace genomového klonu
Genomový soubor, specifický pro genomový soubor lidského chromosomu 19 v bakteriofagu Charon 21A, se získá v organizaci American Type Culture Collection, 12301 Prklawn Drive, Rockville, Maryland, Spojené státy americké 20852 (ATCC) (katalogové číslo 57711). Tento fág se transfektuje do E. coli K802 rec A- hostujícího kmene (katalogové číslo 47026). Titr fágu je 6,5 až 7,0 x 10* destičky tvořících jednotek na mikrolitr. Genomový klon genu, kódujícího Zyme se izoluje borů (například Sambrook a běžnou technikou třídění fagových souko1., MoIecuiar Cloning: A Laboratory
1989) .
cDNA nukleotidová sonda se syntetizuje
Manual, str. 2.6 až 2.114, Radioaktivně značená za použiti polymerázové řet Schowaiter a Scmmer, Anaiyt 1989), specifickým vázáním vyčištěný fragment pRc-Zymu
~ c v 4 i-e akce (kterc u pcpsal napři
<-< o 1 U Λ i. Bi ochemístry, 117, str. 90 až
SEQ ID NO:5 a SeQ ID NO:6 primer
DNA EcoRI/Notl (Bi o-Rad Laboratoř
P.O. Box 708, Rockville Center, New York, Spojené státy americké, 11571, katalogové číslo 732 až 6010).
Hybridizace a promyti se provádí při teplotě 65 “C, jak je popsáno v instrukční příručce pro skvrnovou membránu Zeta-nukleotidové sondyy™ (Bio-Rad katalogové číslo 164-0153). Údajný primární Zyme bakteriofág se ukládá v SM pufru obsahujícím 2 až 3 kapky chloroformu. Jednotlivá homogenní destička (711-4) se následně izoluje z terciárního vytřídění (tercíary scrsen).Izo1ace lambda bakteriofagu DNA pozitivního hybridizací in šitu na Zyme se provádí o sobě známým způsobem.
Čištěný lambda fág Zyme DNA se digeruje s HindlII a podrobuje se elektroforezi na gelu 1% agarose/TBE (0,1 M Tris-HCl pH 8,3, O, 1 M kyselina boritá, 1 mM ethylendiamintetraoctová kyselina). Separovaná DNA se pak přenáší na skvrnovou membránu zeta-nukleotidové sondy™ (0,5 x TBE pufr, konstantně 80 voltů za 1 hodinu), jak je popsáno v sekci 2.5 instrukční příručky pro zeta-nukleotidovou sondu^M) za použití nedenaturačních podmínek, pak se denaturuje (0,4M hydroxid sodný po dobu 10 minut), jak je popsáno v sekci 2.8 instrukční příručky pro zeta-nukieotidovou sondu™.
Používá se radioaktivně značená nukleotidová sonda, zahrnující BamHI/Xbal fragment pRc/Zyme se statisticky značenou DNA (obchodně dostupnou u společnosti Boehringer Mannheim Corporation, 9115 Hague Road, P.O. Box 50414, Indianopo1is, Indiana, Spojené státy americké 46250-0414, katalogové číslo 1004760) ke stanovení, zdali 3' kódující sekvence je nalezena v našem klonu. Hybridizaca a promyti na shora uvedenou membránu Zeta-nukleotidové sondy™ se provádí shora popsaným způsobem a autoradiografie ukázala homolog na 3' oblasti Zyme.
K potvrzení, že fág 711-4 obsahuje v kodujicí oblasti 5' Zyme, se opět použije polymerazové řetězové reakce za použiti SEQ ID N0:7 a SEQ ID N0:8 ke specifickému zesílení 470 páru bází z terciárního destičkového čištěného chrcmosomu 19 Zyme fágové DNA podle Kainze a kol., Analyticai· Biochemistry, 202, str. 46, A992. Tento DNA fragment se čistí, pak se subklonuje do pUC 19 expresního piasmidu, shora popsaného.Identita DNA sekvencí odpovídající sekvencím 1 až 33 kodujicí oblasti 5' Zyme cDNA a pří17 dávné následné 272 nukleotidy 5' Zyme kódující -oblasti je potržena DNA sekvenční analýzou za použití o sobě známých způsobů.
Plasmidové depozity
Podle ustanovení Budapešťské dohody mezinárodního ukládání mikroorganismů pro patentované způsoby je následující kultura uložena ve stálé sbírce kultur v organizaci Northern Regional Sesearch Center (NRRL), Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture, 1815 N. University Street, Peoria, Illinois, 61604:
Uložený materiál Objednací číslo
E.coli K12/pSZyme NRRL B-18971
Půmyslová využitelnost
Sloučeniny, charakterizující neurologická onemocnění, jako je Alzheimerova nemoc a Downúv syndrom.

Claims (1)

  1. FATENTOVÉ ~ N Á E'O K“Y---
    1. Aminokyselinová sloučenina obsahující aminokyselinovou sekve no i
    Met 1 Lys Lys Leu Met 5 Val Val Leu Ser Leu 10 Ile Ala Ala Ala Trp 15 Ala Glu Glu Gin Asn 20 Lys Leu Val His Gly 25 Gly Pro Cys Asp Lys 30 Thr Ser His Pro Tyr 35 Gin Ala Ala Leu Tyr 40 Thr Ser Gly His Leu 45 Leu Cys Gly Gly Val 50 Leu Ile His Pro Leu 55 Trp Val Leu Thr Ala 60 Ala His Cys Lys Lys 65 Pro Asn Leu Gin Val 70 Phe Leu Gly Lys His 75 Asn Leu Arg Gin Arg 80 Glu Ser Ser Gin Glu 85 Gin Ser Ser Val Val 90 Arg Ala Val Ile His 95 Pro Asp Tyr Asp Ala 100 Ala Ser His Asp Gin 105 Asp Ile Met Leu Leu 110 Arg Leu Ala Arg Pro 115 Ala Lys Leu Ser Glu 120 Leu Ile Gin Pro Leu 125 Pro Leu Glu Arg Asp 130 Cys Ser Ala Asn Thr 135 Thr Ser Cys His Ile 140 Leu Gly Trp Gly Lys 145 Thr Ala Asp Gly Asp 150 Phe Pro Asp Thr Ile 155 Gin Cys Ala Tyr Ile 160 His Leu Val Ser Arg 165 Glu Glu Cys Glu His 170 Ala Tyr Pro Gly Gin 175 Ile Thr Gin Asn Met 180 Leu Cys Ala Gly Asp 185 Glu Lys Tyr Gly Lys 190 Asp Ser Cys Gin Gly 195 Asp Ser Gly Gly Pro 200 Leu Val Cys Gly Asp 205 His Leu Arg Gly Leu Val Ser Trp Gly Asn Ile Pro Cys Gly Ser Lys Glu Lys Pro
    210 215 220
    Gly Val Tyr Thr Asn Val Cys Arg Tyr Thr Asn Trp Ile Gin Lys Thr 225 230 235 240
    Ile Gin Ala Lys 244 označovanou jakožto SEQ IZ> NO; 1, nebo její funkční ekvivalent
    2 . Aminokyselinová s 1 o uč e n i na obsahuj ící sekven kyše líny, která kočuje sir učeni nu podle nároku I nebo 3. S1 o uče ni na nuk letové kyseliny podl e nároku 2 , kter sekvenoi ATGAAGAAGC TGATGGTGGT GCTGAGTCTG ATTGCTGCAG CCTGGGCAGA 50 GGAGCAGAAT AAGTTGGTGC ATGGCGGACC CTGCGACAAG ACATCTCACC 100 CCTACCAAGC TGCCCTCTAC ACCTCGGGCC ACTTGCTCTG TGGTGGGGTC 150 CTTATCCATC CACTGTGGGT CCTCACAGCT GCCCACTGCA AAAAACCGAA 200 TCTTCAGGTC TTCCTGGGGA AGCATAACCT TCGGCAAAGG GAGAGTTCCC 250 AGGAGCAGAG TTCTGTTGTC CGGGCTGTGA TCCACCCTGA CTATGATGCC 300 GCCAGCCATG ACCAGGACAT CATGCTGTTG CGCCTGGCAC GCCCAGCCAA 350 ACTCTCTGAA CTCATCCAGC CCCTTCCCCT GGAGAGGGAC TGCTCAGCCA 400 ACACCACCAG CTGCCACATC CTGGGCTGGG GCAAGACAGC AGATGGTGAT 450 TTCCCTGACA CCATCCAGTG TGCATACATC CACCTGGTGT CCCGTGAGGA 500 GTGTGAGCAT 3CCTACCCTG GCCAGATCAC CCAGAACATG TTGTGTGCTG 550 GGGATGAGAA GTACGGGAAG GATTCCTGCC AGGGTGATTC TGGGGGTCCG 600 CTGGTATGTG GAGACCACCT CCGAGGCCTT GTGTCATGGG GTAACATCCC 650 CTGTGGATCA AAGGAGAAGC CAGGAGTCTA CACCAACGTC TGCAGATACA 700 CGAACTGGAT CCAAAAAACC ATTCAGGCCA AG 732 nebo její funkční ekvivalení : nebo její část. 4 . Vťk-.or .ik;et?vé kvseiinv :a Λ A hrnující sl o uče ni
    kyseliny podle nároku 3.
    ”· 3'ú- vek.1/;: podle něrok-.. 4, kterým je pSZyme.
    t :·~.η s f 1 ekxovaná vektorem nukleové kyseliny
    7. Genomový kion Zyme obsahující 4,0 kiicbázový HindlII fragment souboru lidského chromosomu 19, který hybrídizuje na fragmenty DNA sloučeniny podle nároku 3 za podmínek vhodných pro selektivní hybridizaci.
    Způsob diagnostiky Alzheimerovy nemoci nebo sklonu k Alzheimerově nemoci, vyznačující se tím, že
    a) se odebere vzorek DNA pacienta,
    b) provádí se digesce s restrikčním enzymem,
    c) provádí se hybridizace digerované DNA se značenou nukleotidovou sekvencí odpovídající sloučenině SEQ ID N0:2 nebo její části a
    d) porovnávají se hybridizačni obrazce podobně digerovaných a hybridizovaných pásových konfigurací členů donorové rodiny, které vykazují nebo vykázaly symptomy Alzheimerovy nemoci.
    9. Zkouška stanovení, zdali zkoušená látka je funkčním ligandem pro bílkovinu definovanou jako SEQ ID NO:1, vyznačující se t i m , že
    a) se uvádí do styku bílkovina se zkoušenou látkou,
    b) monitoruje se bílkovinová aktivita fyzikálně zjistitelnými prostředky a
    c) identifikuji se tyto látky, které vzájemně působí nebo které ovlivňují aktivitu bílkoviny se zřetelem na kontrolu bez zkoušené látky.
    10. Způsob exprese sekvence nukleové kyseliny podle nároku 2 v transfektováné hostitelské buňce, vyznačující se tím, že se kultivuje transfektovaná hostitelská buňka za podminbek vhodných pro expresi genu.
CZ93982A 1992-05-28 1993-06-23 Amino acid compound CZ98293A3 (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US89154292A 1992-05-28 1992-05-28

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ98293A3 true CZ98293A3 (en) 1994-02-16

Family

ID=25398377

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ93982A CZ98293A3 (en) 1992-05-28 1993-06-23 Amino acid compound

Country Status (17)

Country Link
US (1) US5733768A (cs)
EP (1) EP0576152B1 (cs)
JP (1) JP3568552B2 (cs)
KR (1) KR930023465A (cs)
AT (1) ATE227343T1 (cs)
AU (1) AU670080B2 (cs)
BR (1) BR9302075A (cs)
CA (1) CA2096911C (cs)
CZ (1) CZ98293A3 (cs)
DE (1) DE69332462T2 (cs)
ES (1) ES2185621T3 (cs)
FI (1) FI932425A7 (cs)
HU (1) HUT69612A (cs)
IL (1) IL105793A0 (cs)
MX (1) MX9303082A (cs)
NO (1) NO931889L (cs)
PL (1) PL299053A1 (cs)

Families Citing this family (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5986054A (en) 1995-04-28 1999-11-16 The Hospital For Sick Children, Hsc Research And Development Limited Partnership Genetic sequences and proteins related to alzheimer's disease
US6531586B1 (en) 1995-04-28 2003-03-11 The Hospital For Sick Children Genetic sequences related to Alzheimer's Disease
US6210919B1 (en) 1995-04-28 2001-04-03 Hsc Research And Development Limited Partnership Genetic sequences and proteins related to alzheimer's disease
US6329163B1 (en) 1995-06-07 2001-12-11 Elan Pharmaceuticals, Inc. Assays for detecting β-secretase inhibition
US5744346A (en) * 1995-06-07 1998-04-28 Athena Neurosciences, Inc. β-secretase
US5942400A (en) * 1995-06-07 1999-08-24 Elan Pharmaceuticals, Inc. Assays for detecting β-secretase
AU732508B2 (en) * 1996-01-26 2001-04-26 Governing Council Of The University Of Toronto, The Nucleic acids and proteins related to Alzheimer's disease, and uses therefor
AU4480797A (en) * 1996-09-13 1998-04-02 Dana-Farber Cancer Institute Protease m, a novel serine protease
EP1084240A1 (fr) * 1998-06-05 2001-03-21 Aventis Pharma S.A. Polypeptides possedant une activite de type beta-secretase
FR2779444A1 (fr) * 1998-06-05 1999-12-10 Rhone Poulenc Rorer Sa Polypeptides possedant une activite de type beta-secretase et capables de cliver le precurseur naturel du peptide beta-amyloide (app)
EP1092767B1 (en) * 1998-07-02 2006-10-11 Fuso Pharmaceutical Industries, Ltd. Serine protease-specific monoclonal antibody and utilization thereof
CN1300320C (zh) * 1998-09-24 2007-02-14 法玛西雅厄普约翰美国公司 阿尔茨海默氏疾病分泌酶
US20040234976A1 (en) * 1998-09-24 2004-11-25 Gurney Mark E. Alzheimer's disease secretase, app substrates therefor, and uses therefor
US6699671B1 (en) 1998-09-24 2004-03-02 Pharmacia & Upjohn Company Alzheimer's disease secretase, APP substrates therefor, and uses therefor
US6844148B1 (en) 1998-09-24 2005-01-18 Pharmacia & Upjohn Company Alzheimer's disease secretase, APP substrates therefor, and uses therefor
US6245884B1 (en) 1998-10-16 2001-06-12 Vivian Y. H. Hook Secretases related to alzheimer's dementia
US6313268B1 (en) 1998-10-16 2001-11-06 Vivian Y. H. Hook Secretases related to Alzheimer's dementia
US7115410B1 (en) * 1999-02-10 2006-10-03 Elan Pharmaceuticals, Inc. β-secretase enzyme compositions and methods
US7456007B1 (en) 1998-12-31 2008-11-25 Elan Pharmaceuticals, Inc. β-secretase enzyme compositions and methods
CN1390232A (zh) 1999-02-10 2003-01-08 艾兰制药公司 人β分泌酶、抑制剂、其组合物和用途
US20020049303A1 (en) * 1999-06-28 2002-04-25 Tang Jordan J. N. Catalytically active recombinant memapsin and methods of use thereof
EP1196609A2 (en) 1999-06-28 2002-04-17 Oklahoma Medical Research Foundation Catalytically active recombinant memapsin and methods of use thereof
US20090162883A1 (en) * 1999-09-23 2009-06-25 Pharmacia & Upjohn Company Alzheimer's Disease Secretase, APP Substrates Thereof, and Uses Thereof
US7514408B1 (en) 1999-12-02 2009-04-07 Elan Pharmaceuticals, Inc. β-secretase enzyme compositions and methods
ATE365922T1 (de) * 2000-10-27 2007-07-15 Mount Sinai Hospital Corp Verfahren zur erkennung von eierstockkrebs mittels menschlichem kallikrein (hk6)
CA2360219A1 (en) 2000-10-27 2002-04-27 Mount Sinai Hospital Method for detecting alzheimer's disease
US20040121947A1 (en) * 2000-12-28 2004-06-24 Oklahoma Medical Research Foundation Compounds which inhibit beta-secretase activity and methods of use thereof
US20060234944A1 (en) * 2001-10-23 2006-10-19 Oklahoma Medical Reseach Foundation Beta-secretase inhibitors and methods of use
CA2464736A1 (en) * 2001-10-23 2003-05-15 Oklahoma Medical Research Foundation Beta-secretase inhibitors and methods of use
CA2468651A1 (en) * 2003-06-13 2004-12-13 Eleftherios P. Diamandis Detection of neurodegenerative diseases
AU2006279896A1 (en) * 2005-08-10 2007-02-22 Oklahoma Medical Research Foundation Truncated memapsin 2 for use for treating Alzheimer's disease

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU661270B2 (en) * 1990-03-05 1995-07-20 Cephalon, Inc. Chymotrypsin-like proteases and their inhibitors
US5252463A (en) * 1990-06-22 1993-10-12 The Du Pont Merck Pharmaceutical Company Clipsin, a chymotrypsin-like protease and method of using same
WO1992003542A1 (en) * 1990-08-17 1992-03-05 Boston University PROTEASES CAUSING ABNORMAL DEGRADATION OF AMYLOID β-PROTEIN PRECURSOR
US5292652A (en) * 1990-10-05 1994-03-08 Athena Neurosciences, Inc. Amyloidin protease and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
NO931889D0 (no) 1993-05-25
BR9302075A (pt) 1993-11-30
JPH0662855A (ja) 1994-03-08
FI932425L (fi) 1993-11-29
AU670080B2 (en) 1996-07-04
EP0576152B1 (en) 2002-11-06
EP0576152A1 (en) 1993-12-29
FI932425A0 (fi) 1993-05-27
NO931889L (no) 1993-11-29
HU9301557D0 (en) 1993-10-28
ES2185621T3 (es) 2003-05-01
DE69332462D1 (de) 2002-12-12
IL105793A0 (en) 1993-09-22
KR930023465A (ko) 1993-12-18
ATE227343T1 (de) 2002-11-15
AU3986493A (en) 1993-12-02
US5733768A (en) 1998-03-31
CA2096911A1 (en) 1993-11-29
CA2096911C (en) 2004-11-02
MX9303082A (es) 1994-06-30
HUT69612A (en) 1995-09-28
FI932425A7 (fi) 1993-11-29
DE69332462T2 (de) 2003-07-10
JP3568552B2 (ja) 2004-09-22
PL299053A1 (en) 1994-02-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ98293A3 (en) Amino acid compound
EP0920498B1 (en) Hamster ef-1alpha transcriptional regulatory dna
WO2000068266A1 (en) Amyloid precursor protein protease and related nucleic acid compounds
EP0584343B1 (en) Recombinant calf intestinal alkaline phosphatase
LI et al. Expression of human dopamine β-hydroxylase in Drosophila Schneider 2 cells
US5453362A (en) Eukaryotic transcription protein; host cell factor
US5686598A (en) Genes associated with retinal dystrophies
US6093397A (en) Amyloid precursor protein protease
Van Raay et al. A novel ribosomal protein L3-like gene (RPL3L) maps to the autosomal dominant polycystic kidney disease gene region
WO1997046678A9 (en) Nucleic acids and polypeptides related to presenilin
WO1997046678A1 (en) Nucleic acids and polypeptides related to presenilin
US5705380A (en) Identification of a gene encoding TULP2, a retina specific protein
WO1998046756A9 (en) Secreted protein ssp-1 compositions and therapeutic and diagnostic uses therefor
CA2373507A1 (en) Prp-like gene
WO1998046756A1 (en) Secreted protein ssp-1 compositions and therapeutic and diagnostic uses therefor
Cook et al. The amino terminus of polyomavirus middle T antigen is required for transformation
EP0780472A2 (en) Stress proteins
JPH10201487A (ja) 哺乳動物のｆｉｎ−１核酸および蛋白質配列およびその使用
WO1998041621A1 (en) Aspergillus fumigatus auxotrophs, auxotrophic markers and polynucleotides encoding same
US5776762A (en) Obesity associated genes
JP2000509255A (ja) 感覚神経障害と関連した遺伝子ファミリー
US5770432A (en) Obesity associated genes
WO2001075103A1 (fr) Nouveau polypeptide, proteine humaine 9 de toxine de scorpion a chaine courte, et polynucleotide codant pour ce polypeptide
WO2002002613A1 (fr) Nouveau polypeptide, proteine humaine de liaison 38.72 au sterol de type oxygene, et polynucleotide codant ce polypeptide
WO2001094591A1 (en) A novel polypeptide-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 10 and the polynucleotide encoding said polypeptide