CZ9803U1 - Synthetické analogy Desmopressinu chráněné v C-terminální sekvenci proti karboxyamidasovému štěpení - Google Patents

Description

Oblast techniky 'V

Technické řešení se týká synthetických analogů Desmopressinu vzorce _d 5 Mpa-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-[D-Arg]-GlyNH₂ chráněných v C-terminální sekvenci proti karboxyamidasovému štěpení.

Dosavadní stav techniky

Desmopressin (INN), synthetický analog peptidového hormonu vasopresinu, přirozené látky nacházející se v zadním laloku hypofyzy (přívěsku mozkového), je využíván v substituční léčbě Diabetes insipidus. Jeho účinek je závislý na farmaceutické formě, ve které je podáván. Při perorálním podání v tabletách je využita k biologickému účinku jen nepatrná část léčiva a to zřejmě z několika důvodů, jako je biodostupnost látky k ledvinným receptorům přes intestinální stěnu a potenciální inaktivace především v gastrointestinálním traktu. Synthetické obměny provedené v molekule peptidu (náhrada cysteinu kyselinou merkaptopropionovou a záměna L-formy argininu D-stereoisomerem) zvýšily jak lipofilitu látky tak její metabolickou stabilitu. Karboxyterminální část řetězce je již záměnou L-argininu D-argininem chráněna proti štěpení trypsinem nebo enzymy s podobnou aktivitou. Zůstává však amidická vazba koncového glycinu, která je přístupná působení karboxyamidopeptidasy odštěpující koncový glycinamid. Následkem působení tohoto enzymu vzniká DesGlyNH₂ peptid, který je funkčně neaktivní. Byly připraveny analogy Desmopressinu, které byly modifikovány v karboxyterminální části peptidu tak, aby byla eliminována hydrolysa amidické vazby glycinamidu resp. odštěpení glycinamidu enzymy karboxyamidasového charakteru.

Podstata technického řešení

Předmětem technického řešení jsou synthetické analogy Desmopressinu chráněné v C-terminální sekvenoi proti karboxyamidasovému štěpení, obecného vzorce I Mpa-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-A (I) kde A je [D-Arg]GlyNHR (látka I) nebo [D-Arg]NHR (látka II), kde R je alkyl obsahující 1 až 4 atomy uhlíku.

Synthetické analogy Desmopressinu se vyrobí tak, že na pryskyřici obsahující navázané funkční skupiny obecného vzorce NH R-CH₂, kde R je alkyl obsahující 1 - 4, zejména 2 atomy uhlíku, se působí hydroxybenztriazolovým esterem N-chráněné příslušné aminokyseliny sekvence Desmopresinu a po ukončení celého požadovaného peptidu se peptid s pryskyřicí vysuší, uvolní se z pryskyřice spolu s chránícími skupinami směsi fluorovodíku s anizolem, peptid se rozpustí ve zředěné kyselině octové, zlyofilizuje a provede se jeho cyklizace uzavřením disulfidického můstku, načež se izoluje, zejména vysokoúčinnou kapalinou chromatografií.

Příklady provedení

Vysvětlení zkratek

Mpa - Kyselina β-merkaptopropionová,

-1 CZ 9803 Ul

Boc	- t-Butoxycarbonyl,
Acm	- Acetamidomethyl,
Tyr (Cl2-Bzl)	- Dichlorbenzyl-tyrosin,
Trt	- Trityl,
DIEA	- Diisopropylethylamin,
DCM	- Dichlormetan,
HOBt ester	- Hydroxybenztriazolový ester
DCC	- Dicyklohexyl karbodiimid,
DMF	- Dmethylformamid,
DMAP	- Dimethylaminopyridin,
TFA	- Kyselina trifluoroctová,
RP-HPLC	- Vysokoúčinná kapalinová chromatografie na reversní fázi.
MS	- hmotová spektrometrie
CZE	- kapilární zonová elektroforesa.

Příklad 1

Látka I byla synthetisována metodou na pevné fázi dle Merrifielda. K synthese byla použita speciální pryskyřice NH(Et)-CH₂ - nosič (substituce 0,83 mmol/g pryskyřice). Jako semipermanentní chránění byla použita tertbutyloxykarbonylová skupina (Boc). Postranní řetězce byly chráněny takto: Mpa a Cys skupinou Acm, Tyr(2-Br-Z),' Asn(Trt), De-Arg(Tos). Synthesa byla prováděna v 0,3 mmol měřítku. Byl použit následující protokol synthesy:

1. Neutralizace pryskyřice 10 % DIEA v DCM, dvakrát po pěti minutách.

2. Promytí pryskyřice DCM, třikrát po jedné minutě.

3. Kondensace funkční skupiny pryskyřice s trojnásobným molámím přebytkem HOBt esterem (Boc) chráněné příslušné aminokyseliny po jednu hodinu. Ester byl připraven z příslušné chráněné (Boc) aminokyseliny a HBot působením DCC ve směsi DCM-DMF (poměr 9 : 1) při teplotě 0 °C a dobu třiceti minut. Od vzniklého esteru byla odfiltrována dicyklohexylmočovina, která byla promyta DCM a filtrát zahuštěn za laboratorní teploty a poté byl přidán DMF do výsledné koncentrace cca 0,1 M. Průběh reakce byl monitorován kvalitativním Kaiserovým testem. Pokud byl Kaiserův test negativní následoval další reakční krok (viz 4). Pokud byl

Kaiserův test negativní následoval další reakční krok (viz 4). Pokud byl positivní byl přidán DMAP, popřípadě byla pryskyřice promyta DCM a kondensace opakována s nově připraveným aktivním esterem.

4. Promytí pryskyřice 3,50 ml DMF (1 min) a 3,50 ml DCM (1 min).

5. Odstranění Boc skupiny bylo dosaženo působením 50 % TFA v DCM po dobu 30 minut.

6. Poté byla pryskyřice promyta 4,50 ml (1 minutové působení) DCM.

Po ukončení synthesy byla pryskyřice se zakotveným peptidem vysušena do konstantní váhy. Odštěpení peptidu z pryskyřice spolu s odštěpením chránících skupin bylo provedeno kapalným fluorovodíkem ve směsi HF: anisol (poměr 9 : 1) při 0 °C. Fluorovodík byl vyfoukán dusíkem při 0 °C, a anisol extrahován studeným diethyletherem (4 x 50 ml). Peptid byl rozpuštěn ve 20 % kyselině octové (5 x 50 ml), pryskyřice odfiltrována a roztok peptidu lyofilisován.

Cyklisace peptidu: Lyofilisát peptidu byl rozpuštěn v 100 ml roztoku 20 % kyseliny octové a za intensivního míchání a při laboratorní teplotě byl přidán 0,1 M jodu vmethanolu tak, aby na jednu S-Acm funkci přišlo 5 ekvivalentů jodu. Průběh reakce byl sledován RP-HPLC. Reakce byla zastavena přidáním 100 ml H₂O po dosažení maximální tvorby produktu. Jod byl odstraněn vytřepáním do tetrachlormetanu a vodná fáze lyofilisována. Čistota peptidu byla analysována RP HPLC a určením hmotového spektra. Peptid byl isolován preparativní RP HPLC na přístroji fy Knauer a koloně 250 x 16 mm plněné Sepharonem SG X 08 (změní 10 pm). Peptid byl na kolonu nastříknut v množství 50 mg a z kolony eluován roztokem metanol-voda o lineárně

-2CZ 9803 Ul stoupající koncentraci (1 % za minutu, rychlostí 8,5 ml/min.) v 0,1 % TFA. Analytická RPHPLC byla provedena na přístroji firmy Spectra Physics, použitá kolona 250 x 4 mm byla naplněná Sepharonem SG X Cl8 (změní 10 pm), průtok 1 ml/min.

Příklad 2

Látka II byla synthetisována stejným způsobem jako v příkladu 1. Postranní skupiny aminokyselin byly chráněny jako v příkladu 1 a synthetický protokol sledoval postup udaný v příkladu 1. Cyklisace, čištění a analytika isolovaného peptidu bylo provedeno jako v příkladu 1.

Příklad 3

Kapilární zonová elektroforesa (CZE): Analysa čistoty připravených peptidů byla prováděna metodou CZE se zdrojem vysokého napětí 0-15 kV. Separačním prostorem byla křemenná kapilára s vnějším polyimidovým povlakem o vnitřním průměru 0,056 mm, vnějším průměrem 0,200 mm, celkové délce 315 mm a efektivní délce (od startu k detektoru) 200 mm. Peptidy byly analysovány v 0,5 M kyseliny octové, nebo v roztoku o složení 0,04 M Tris a 0,04 M Tricinu pH 8,1. Vzorek byl nanášen manuálně a měření bylo prováděno při laboratorní teplotě. Separace probíhala v režimu konstatního napětí 10,0 kV a proud dosahoval hodnot 9,5 - 10,8 μΑ. Detekce byla prováděna spektrofotometricky při 206 nm.

Příklad 4

Hmotová spektrometrie jednotlivých peptidů: Měření bylo prováděno metodou FAB, která spočívá v ionisaci testovaných vzorků pomocí urychlených atomů xenonu. Vzorek byl umístěn na glycerinovou matrici. Snímání spekter bylo prováděno vícekanálovou analysou při nízké rozlišovací schopnosti. Byl použit třísektorový hmotový spektrometr YAB-EQ s geometrií BEQQ vyrobený firmou VG Analytical Manchester. Iontový zdroj pracoval při uiychlovacím napětí 8 kV.

Příklad 5

Aminokyselinové složení peptidů. Peptidy byly hydrolysovány v 6 M HC1 při teplotě 110 °C po dobu 20 hodin a jednotlivé aminokyseliny separovány na přístroji D-500 (Durrum corp.). Zastoupení prolinu a cystinu nebylo vyhodnocováno.

Claims (1)

1. NÁROKY NA OCHRANU

   1. Synthetické analogy Desmopressinu chráněné v C-terminální sekvenci proti karboxy30 amidasovému štěpení obecného vzorce I

   Mpa-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-A (I) kde A je [D-Arg]GlyNHR (látka I) nebo [D-Arg]NHR (látka II), kde R je alkyl obsahující 1 až 4 atomy uhlíku.