CZ9734U1

CZ9734U1 - Synthetické analogy Desmopressinu chráněné v N-terminální sekvenci proti endopeptidasovému štěpení

Info

Publication number: CZ9734U1
Application number: CZ200010360U
Authority: CZ
Inventors: Jan Rndr Csc Jezek; Jiri Ing Csc Velek; Tomislav Rndr Drsc Barth; Vlasta Rndr Velkova; Alena Mudr Csc Machova; Linda Rndr Csc Hauzerova; Jana Doc Rndr Csc Barthova; Nevena Doc Dr Pencheva; Hans Prof Dr Vilhardt; Jana Mgr Suchankova; Vaclav Rndr Csc Kasicka; Karel Ing Csc Ubik
Original assignee: Stav Organick Chemie A Biochem
Priority date: 2000-02-03
Filing date: 2000-02-03
Publication date: 2000-03-10

Description

Technické řešení se týká synthetických analogů Desmopressinu vzorce I 5 Mpa-Tyr-Phe-Gln-Asn-Gln-Asn-Cys-Pro-[D-Arg]-GlyNH₂ (I) chráněných v N-terminální sekvenci proti endopeptidasovému štěpení.

Dosavadní stav techniky

Desmopressin (INN), synthetický analog peptidového hormonu vasopresinu, přirozené látky nacházející se v zadním laloku hypofyzy (přívěsku mozkového), je využíván v substituční léčbě Diabetes insipidus. Jeho účinek je závislý na farmaceutické formě, ve které je podáván. Při perorálním podání v tabletách je využita k biologickému účinku jen nepatrná část léčiva a to zřejmě z více důvodů, jako jsou biodostupnost látky k ledvinným receptorům přes intestinální stěnu a potenciální inaktivace především v gastrointestinálním traktu. Synthetické obměny provedené v molekule peptidu (náhrada cysteinu kyselinou merkaptopropionovou a záměna L-formy argininu D-stereoisomerem) zvýšily jak lipofilitu látky tak její metabolickou stabilitu. Byly eliminovány účinky aminopeptidasového působení (cysteinaminopeptidasa) a trypsinu resp. trypsinu podobných enzymů. Obměna struktury peptidu však zpřístupnila peptidové vazby N-terminální oblasti endopeptidasám, které byly v této oblasti u vasopresinu, a to díky přítom20 nosti N-koncové aminoskupiny na cysteinu, neaktivní. Jedním z příkladů může být chymotrypsin hydrolyzující peptidové vazby tvořené aromatickými aminokyselinami. Produkty chymotryptického štěpení Desmopressinu jsou látky neúčinné na renálních receptorech ale mající účinek v centrálním nervovém systému. Pro některé látky, fragmenty Desmopressinu, byla získána právní ochrana (CZ užitný vzor č. 5976: Rozvětvené linearisované analogy vasopresinu).

Stabilizaci inkriminovaných peptidových vazeb lze řešit na různých úrovních. K ochraně byla použita substituce dusíku peptidové vazby methylovou skupinou (náhrada vodíku methylem). Z definice chymotryptického účinku je zřejmá jeho neúčinnost v dané oblasti peptidového řetězce.

Podstata technického řešení

Předmětem technického řešení jsou synthetické analogy Desmopressinu, chráněné v N-terminální sekvenci proti endopeptidasovému štěpení, které mají v N-terminální sekvenci methylovaný dusík peptidové vazby mezi Mpa a Tyr, vzorce I

Mpa-N(CH₃)Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-[D-Arg]-GlyNH₂ (I) nebo mají methylovaný dusík peptidové vazby mezi Tyr a Phe, vzorce II

Mpa-Tyr-N(CH₃)Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-[D-Arg]-GlyNH₂ (II)

Sloučeniny vzorce I a II se připraví výstavbou peptidového řetězce na pevné fázi a oxidací cyklické části. Oba peptidy jsou chráněny proti hydrolytickému působení enzymů v modifikova40 ných peptidových vazbách.

-1 CZ 9734 U1

Příklady provedení

Vysvětlení zkratek

Mpa

MBHA

Boc Acm

Tyr(Cl₂-Bzl)

Trt

DIEA

DCM

HOBt ester DCC DMF DMAP

TFA

RP - HPLC

Kyselina β-merkaptopropionová,

Methoxybenzhydrylamin, t-Butoxycarbonyl,

Acetamidomethyl,

Dichlorbenzyl-tyrosin,

Trityl,

Diisopropylethylamin,

Dichlormetan,

Hydroxybenztriazolový ester,

Dicyklohexyl karbodiimid,

Dmethylformamid,

Dimethylaminopyridin,

Kyselina trifluoroctová,

Vysokoúčinná kapalinová chromatografie na reversní fázi.

Příklad 1

Látka I byla synthetisována metodou na pevné fázi dle Merrifíelda. K synthese byla použita MBHA pryskyřice (substituce 0,57 mmol/g). Jako semipermanentní chránění byla použita tertbutyloxykarbonylová skupina (Boc). Postranní řetězce byly chráněny takto: Mpa aCys skupinou Acm, N(CH₃)Tyr měl hydroxyl chráněný skupinou Cl₂-Bzl, Asn(Trt) a D-Arg skupinou tosylovou. Synthesa byla prováděna v 0,3 mmol měřítku. Byl použit následující protokol synthesy:

1. Neutralizace pryskyřice 10 % DIEA v DCM, dvakrát po pěti minutách.

2. Promytí pryskyřice DCM, třikrát po jedné minutě.

3. Kondensace funkční skupiny piyskyřice s trojnásobným molámím přebytkem HOBt esterem chráněné (Boc) příslušné aminokyseliny po jednu hodinu. (Ester byl připraven z příslušné chráněné (Boc) aminokyseliny a HOBt působením DCC ve směsi DCM-DMF (poměr 9 : 1) při teplotě 0 °C a dobu třiceti minut. Od vzniklého esteru byla odfiltrována dicyklohexylmočovina, která byla promyta DCM a filtrát zahuštěn za laboratorní teploty a poté byl přidán DMF do výsledné koncentrace cca 0,1 M. Výjimkou byla kondensace N(CH₃) aminokyseliny (tyrosinu), kdy byla kondensace prováděna PyBrop/DMAP). Průběh reakce byl monitorován kvalitativním Kaiserovým testem (s výjimkou průběhů kondensací aminokyselin na N(CH₃) zakončení). Pokud byl Kaiserův test negativní, následoval další reakční krok (viz 4). Pokud byl Kaiserův test positivní, byl přidán DMAP, popřípadě byla pryskyřice promyta DCM a kondensace opakována s nově připraveným aktivním esterem.

4. Odstranění Boc skupiny bylo dosaženo působením 50 % TFA v DCM po dobu 30 minut. Poté byla pryskyřice promyta 4 x 50 ml (1 minutové působení) DCM.

Po ukončení synthesy byla pryskyřice se zakotveným peptidem vysušena do konstantní váhy.

Odštěpení peptidu z pryskyřice spolu s odštěpením chránících skupin bylo provedeno kapalným fluorovodíkem ve směsi s anisolem (poměr 9 : 1) při 0 °C. Fluorovodík byl vyfoukán dusíkem při 0 °C, a anisol extrahován studeným diethyletherem (4 x 50 ml). Peptid byl rozpuštěn ve 20% kyselině octové (5 x 50 ml), pryskyřice odfiltrována a roztok peptidu lyofilisován. Cyklisace peptidu: Lyofilisát peptidu byl rozpuštěn v 100 ml roztoku 20% kyseliny octové a za intensivní45 ho míchání a při laboratorní teplotě byl přidán 0,1 M jodu v methanolu tak, aby na jednu S-Acm funkci přišlo 5 ekvivalentů jodu. Průběh reakce byl sledován RP-HPLC. Reakce byla zastavena přidáním 100 ml H₂O po dosažení maximální tvorby produktu. Jod byl odstraněn vytřepáním do tetrachlormetanu a vodná fáze lyofilisována. Čistota peptidu byla analysována RP HPLC a

-2CZ 9734 U1 určením hmotového spektra. Peptid byl isolován preparativní RP HPLC na přístroji fy Knauer a koloně 250 x 16 mm plněné Sepharonem SG X 08 (změní 10 pm). Peptid byl na kolonu nastříknut v množství 50 mg a z kolony eluován roztokem metanol-voda o lineárně stoupající koncentraci (1 % za minutu, rychlostí 8,5 ml/min.) v 0,1% TFA. Analytická RP-HPLC byla provedena na přístroji firmy Spectra Physics, použitá kolona 250 x 4 mm byla naplněná Sepharonem SG X 08 (změní 10 pm), průtok 1 ml/min.

Příklad 2

Látka II byla synthetisována stejným způsobem: Postranní skupiny aminokyselin byly chráněny jako v případě případu 1 s výjimkou tyrosinu, kde ochrana hydroxylu byla provedena 2-Brío benzylem. Synthetický protokol sledoval postup udaný v příkladu 1, s výjimkou připojení tyrosinu na Boc N(CH3)Phe, kdy kondensace byla provedena PyBrop/DMAP. Cyklisace, čištění a analytika isolovaného peptidu byly provedeny jako v příkladu 1.

Příklad 3

Kapilární zonová elektroforesa (CZE): Analysa čistoty připravených peptidů byla prováděna metodou CZE se zdrojem vysokého napětí 0-15 kV. Separačním prostorem byla křemenná kapilára s vnějším polyimidovým povlakem o vnitřním průměru 0,056 mm, vnějším průměrem 0,200 mm, celkové délce 315 mm a efektivní délce (od startu k detektoru) 200 mm. Peptidy byly analysovány v 0,5 M kyseliny octové, nebo v roztoku o složení 0,04 M Tris a 0,04 M Tricinu pH 8,1. Vzorek byl nanášen manuálně a měření bylo prováděno při laboratorní teplotě. Separace probíhala v režimu konstantního napětí 10,0 kV a proud dosahoval hodnot 9,5-10,8 μΑ. Detekce byla prováděna spektrofotometricky při 206 nm.

Příklad 4

Hmotová spektrometrie jednotlivých peptidů byla prováděna metodou FAB, která spočívá v ionisaci testovaných vzorků pomocí urychlených atomů xenonu. Vzorek byl umístěn na glycerinovou matrici. Snímání spekter bylo prováděno vícekanálovou analysou při nízké rozlišovací schopnosti. Byl použit třísektorový hmotový spektrometr YAB-EQ s geometrií BEQQ vyrobený firmou VG Analytical Manchester. Iontový zdroj pracoval při urychlovacím napětí 8 kV.

Příklad 5

Aminokyselinové složení peptidů: Peptidy byly hydrolysovány v 6 M HC1 při teplotě 110 °C po dobu 20 hodin ajednotlivé aminokyseliny separovány na přístroji D-500 (Durrum corp.). Zastoupení prolinu a cystinu nebylo vyhodnocováno.

Claims

NÁROKY NA OCHRANU

1. Synthetické analogy Desmopressinu chráněné v N-terminální sekvenci proti endopeptidasovému štěpení, mající v N-terminální sekvenci methylovaný dusík peptidové vazby mezi Mpa

5 a Tyr, vzorce I

Mj>a-N(CH₃)Tyr-Phe-Gln-Asn-Cy^-Pro-[D-Arg]-GlyNH₂ (I), nebo mající methylovaný dusík peptidové vazby mezi Tyr a Phe, vzorce II Mpa-Tyr-N(CH₃)Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-[D-Arg]-GlyNH₂ (II).