CZ84799A3 - Expresní systém neurotrofického faktoru a farmaceutický přípravek obsahující takový expresní systém - Google Patents

Description

(57) Anotace:

Nový způsob léčení onemocnění motorických neuronů a zvláště amyotrofické laterální slerózy, který spočívá v systémovém podávání expresního systému pro expresi neurotrofických faktorů.

CZ 847-99 A3

176 636/HK • ♦ · ·· · · • · · ♦ * · • · · ··· 99 ·· ·*·· • · · « 9 9

99

9 · 9

9 9 9

999 999 • · ·· «· ?/ &<#-5η Ίί

Expresní systém neurotrofického faktoru a přípravek obsahující takový expresní systém f armaceuti cký

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká nového způsobu léčení onemocnění motorických neuronů, zvláště pak amyotrofické laterální sklerózy (ALS). Dále se vynález týká vektorů a farmaceutických přípravků, které umožňují prodlouženou expresi terapeutických faktorů, a které jsou vhodné pro léčení ALS. Předkládaný vynález se týká léčení ALS systémovým podáváním terapeutických genů.

Dosavadní stav techniky

Amyotrofická laterální skleróza (ALLS) , známá též jako Charcotova nemoc nebo Lou Gehrigova nemoc, byla poprvé popsána Charcotem v roce 1865. ALS je fatální nemoc vedoucí k degeneraci motorických neuronů a kortikospinálního traktu. ALS má incidenci 2,5/100 000 a prevalenci 6 až 10/100 000, přičemž tendence je stále rostoucí, a to znamená, že ALS trpí přinejmenším 90 000 lidí v rozvinutých zemích, většinou dospělých, ale relativně mladých (mezi 50 a 60 lety) . Nemoc je doprovázena progresivní paralýzou, vedoucí k totální ztrátě motorických a respiračních funkcí a posléze k smrti, a sice se spožděním dvou až osmi let (průměr je tři roky) od objevení prvních symptomů.

% případů ALS je familiárního původu a zbývajících 95 % jsou případy sporadické. Patofyziologický původ sporadické formy ALS zůstává stále neznámý. Bylo však navrženo několik hypotéz. Degenerace motorických neuronů by mohla být důsledkem změn v metabolismu glutamátu, které

4 4

444 44

4 4

4

4444

• 4

44 způsobují zvýšení koncentrace této excitující aminokyseliny v motorické kůře a v míše . (hypotéza excitoxická, viz přehled Rothstein, .1995). Byla také předložena možnost autóimunitní složky na základě přítomnosti autoprotilátek proti kalciovým kanálům citlivým k napětí u jistých pacientů (přehled Appel et al., 1995) . Stejně tak je možný vliv faktorů vnějšího prostředí, jako je např. expozice- určitým virům (přehled Gastaut, 1995) nebo hliníku (Yase,' 1984).

Studie prováděné na hereditární formě ALS ukázaly, že za patologii ve 20 % familiární formy jsou zodpovědné bodové mutace v genu pro superoxiddismutázu (SOD) obsahující měď a zinek, lokalizovanou na chromosomu 21q22-l (Rosen et al., 1993, přehled Rowland, 1995). Tyto mutace přitom nesnižují dismutázovou aktivitu SOD (přehled Rowland, 1995) , Mutované enzymy produkují potenciálně cvtotoxické hydroxylové radikály, které nevznikají činností SOD divokého typu (Yim et al., 1996). Podrobný výzkum funkčních vlivů -mutací na enzymatickou aktivitu SOD a v důsledku, toho na životnost buněk by měl vést k porozumění patofyziologie familiární formy ALS, což by mohlo přispět i k objasnění patofyziologie všech forem ALS.

Výzkum faktorů schopných ovlivnit přežívání motorických neuronů ukázal roli některých neurotrofických faktorů jako potenciálních neuroprotektorů (viz přehledy Windebank, 1995, Henderson 1995). Ochranný vliv na motorické neurony in vitro byl pozorován zvláště u BDNF (Oppenheim et al., 1992, Yan etal.., 1992, Sendtner et al., 1995, Hendeson et al., 1993, Vejsada et al., 1995), NT-3 (Henderson et al., 1993), GDNF (Henderson et al., 1994, Oppenheim et al., 1995)., tří cytokinů, tj . CNTF, . LIF (přehled Henderson et al., 1995) a kardiotrofin-1 (Pennica et al., 1996), IGF-1 (Lewis et al., 1993) a členů rodiny FGF (Hughes et al., 1993.).. Ze všech

těchto údajů vyplývá, že zmíněné neurotrofické faktory zvyšují přežívání motorických neuronů v různých experimentálních podmínkách. Avšak použití neurotrofických faktorů na zvířecích modelech ALS nebo v klinických testech s lidskými pacienty neposkytlo dosud přesvědčivé výsledky. Takové použití nikdy neprokázalo terapeutický účinek a vždy bylo doprovázeno nežádoucími druhotnými.účinky jako je např. ztráta hmotnosti, záněty, horečky atd., což omezilo zájem o použití trofických faktorů pro léčení ALS a vedlo k předčasnému ukončení první klinické studie ALS-CNTF, kterou prováděl Regeneron a kde- se jednalo o systémové podávání (Barinaga et al., 1994). Takže dosud nebylo možné ani potvrdit zájem o neurotrofické faktory pro léčeni ALS ani využít jejich vlastnosti pro možné terapeutické použití.

V důsledku těchto skutečností v současnosti není žádný prostředek vedoucí k vyléčení ALS a pouze několik léků má nějaký terapeutický účinek. Rilutek® je v podstatě jediné,, co je dnes pro léčení dostupné. Podávání riluzolu (Rilutek®) umožňuje zpomalit postup nemoci, ale na motorických funkcích se· neprojevuje žádný terapeutický účinek. Kromě toho, klinické testy založené na podávání CNTF byly předčasně ukončeny pro nedostatek výsledků (Barinaga et al., 1994). V důsledku toho dnes existuje skutečně silná potřeba mít k dispozici prostředek pro léčení' poruch motorických neuronů, zejména ALS. ,

Podstata vynálezu

Předmětem předkládaného vynálezu je zejména nový přístup k léčení nemocí motorických neuronů, jako je např. ALS, založený na genové terapii. Předkládaný vynález popisuje .. vektorový systém, umožňující přežívání motorických neuronů, • ·

zasažených tímto stavem, a to přímou podporou prostřednictvím účinné a dlouhodobé exprese určitých trofických faktorů. .

První aspekt předkládaného vynálezu se týká způsobu léčení ALS, . který spočívá v systémovém podávání nukleové kyseliny kódující neurotrofický faktor. Další aspekt vynálezu se týká použití nukleové kyseliny kódující nurotrofický faktor pro přípravu farmaceutického přípravku určeného pro léčení ALS. Další . aspekt vynálezu spočívá v konstrukci určitých vektorů umožňujících expresi terapeuticky účinného množství (vzhledem k ALS). trofických faktorů. Další aspekt vynálezu se týká podávání.expresního systému, který umožňuje produkci jednoho nebo několika trofických. faktorů, a také farmaceutického přípravku, který obsahuje uvedený expresní systém. Vynález se také týká vytvoření nových vektorů, které umožňují koexpresi (současnou expresi) trofických faktorů in vivo.

Předkládaný vynález se tedy podrobněji týká nového způsobu léčení ALS, založeného.na kontinuální in vivo expresi trofických faktorů.

Předkládaný vynález ukázal., že je možné získat zvláště významný terapeutický účinek in vivo. tím, že se produkují in vivo neurotrofické faktory. Přihlašovatel zvláště ukázal, že injekcí in vivo expresního systému neurotrofického faktoru (pro systémové podávání) je možné dosáhnout kontinuální produkce terapeutických faktorů, a tato produkce je dostatečná, k dosažení ' terapeutického prospěchu v případě onemocnění motorických neuronů, zvláště ALS. Přihlašovatel tak ukázal, že systémové podávání takových expresních systémů vede k významnému prodloužení ’ života, které je navíc doprovázeno zlepšením vyvolané motorické odpovědi, jak bylo zjištěno elektromyografií. Popsané výsledky ' ukazují, že takový způsob podávání poskytuje vhodnou. biologickou

0000 ·0 • 0 0 0 0 ř 0 · · · • 0 00 0 000 0 0 0 ) 0-0 0 0

Takže ďokorice i když faktoru, podávaného dostupnost neurotrofických faktorů, bez toxických účinků. Tento terapeutický přistup tak dovoluje, aby bylo produkováno terapeuticky účinné množství molekul, které přitom zůstává pod prahem toxicity těchto molekul.

protein velikosti neurotrofického systémovým způsobem, proniká do nervového systému s velmi malou účinností vzhledem k hematoencefalické bariéře, způsob podle předkládaného vynálezu neočekávaně vede k tomu, že je dosaženo významného terapeutického účinku. Kromě toho způsob podle vynálezu dovoluje použít takové dávky terapeutického faktoru, které jsou pod hranicí toxicity a nezpůsobují druhotné účinky.

Prvním předmětem předkládaného vynálezu je proto, způsob léčení ALS spočívající v podávání, a sice systémovým způsobem, expresního systému neurotrofického faktoru. Dalším, předmětem vynálezu je použití expresního systému neurotrofického faktoru pro výrobu farmaceutického přípravku určeného pro léčení ALS systémovým podáváním. Vynález se dále týká způsobu prodloužení života savců trpících ALS, který spočívá v podávání, a sice systémovým způsobem, expresního systému neurotrofického faktoru.

Termín expresní systém v předkládaném vynálezu znamená jakýkoliv konstrukt, který umožňuje in vivo expresi nukleové kyseliny kódující neurotrofický faktor pod kontrolou promotoru transkripce (jde tedy o expresní kazetu), Nukleová kyselina může být buď DNA nebo RNA. Pokud jde o. DNA, může to být cDNA, gDNA nebo hybridní DNA, což je taková DNA, která obsahuje jeden nebo několik intronů z gDNA, ale ne všehny jako gDNA. DNA může být také syntetická nebo semi-syntetická DNA, zvláště DNA syntetizovaná uměle kvůli tomu, aby se optimalizovaly kodony nebo aby se vytvořily redukované formy, • · · ······ · · · · •« · · · · · · ·· · • · · · · · ··'·.· • · · · · · ·» ······ • · · · · · · · · • · · ·» ·· * · ·· · ·

Promotor'transkripce může být jakýkoliv promotor funkční v savčí buňce, výhodně v lidské buňce. Může to být promotorový úsek přirozeně odpovídající za expresi neurotrofického faktoru za předpokladu, že je. schopen funkce v požadované buňce nebo organismu. Může to být také promotorový úsek jiného původu (odpovědný za expresi.jiného proteinu nebo dokonce i syntetický úsek). Zejména to může být promotorový úsek z eukaryotického nebo virového genu. Tak např. to může být promotorový úsek z genomu cílové buňky. Z eukaryotických promotorů je možné použít jakýkoliv promotor nebo odvozenou sekvenci, které stimuluji nebo potlačují, transkripci genu takovým způsobem, že je specifická nebo nespecifická, indukovatelná nebo neindukovatelná, silná nebo slabá. Mohou to byt převládající promotory (HPRT, PGF, α-actin, tubulin, atd.), promotory intermediárních vláken (promotory genů pro GFAP, desmin, vimentin, neurofilamenta, keratin atd.), promotory terapeutických genů (jako je např. promotor genu MDR, CFTR, faktoru VIII, ApoAI atd.), tkáňově specifické promotory (jako např..' promotory genů ' pro pyruvátkinázu, villin,, intestinální protein vážící mastné kyseliny, α-actin v hladkých svalech atd.) anebo dokonce promotory, které odpovídají na určitý stimul (receptury steroidních hormonů, receptor kyseliny retinové apod.). Podobně promotorové sekvence mohou být sekvence pocházející z virového genomu, jako jsou např. promotory adenovirových genů E1A a MLP, časný promotor CMV nebo případně promotor z LTR viru RSV nebo z LTR viru MMTV atd. Navíc tyto promotorové úseky mohou být modifikovány tím, že se přidají aktivační nebo regulační sekvence, nebo sekvence dovolující tkáňově specifickou nebo převládající expresi.

V předkládaném vynálezu je výhodné použití konstitutivního . eukaryotického nebo virového promotoru.

• ·· ·· ···· ·· ·· ·« · · ·· · ···· ·*· · · * · · · · • · ··· · · · ······ • · · · ·· · · · • · · · · ·« · · · · · ·

Zejména to může být promotor vybraný ze skupiny obsahující promotory genů pro HPRT, PGK, α-actin nebo tubulin, nebo promotory adenovirových genů E1A a MLP, časný promotor CMV nebo dokonce, promotor z LTR viru RSV.

Kromě toho expresní kazeta výhodně obsahuje také signální sekvenci, která směruje syntetizovaný produkt do sekreční dráhy cílové buňky. Taková signální sekvence může být přirozená signální sekvence syntetizovaného produktu, ale může to být také jiná funkční signální sekvence, nebo umělá signální sekvence.

Expresní kazeta obsahuje obecně také úsek situovaný na 3'-konec, který definuje signál pro ukončení transkripce a polyadenylační místo.

Trofické faktory použité v předkládaném vynálezu se v podstatě rozdělují do 3 základních rodin:

rodina neurotrofinu,

- rodina neurokinu, a rodina TGF-beta (viz přehled Henderson, Adv. Neurol. 68, 1995, 235) .

Výhodné pro tento vynález je použití BDNF, NT-3 nebo NT-4/5 z rodiny neurotrofinu.

Mozkový neurotrofický faktor (BDNF), který popsal Thoenen '(Trends in Neurosci. 14, 1991, 165), je protein obsahující 118 aminokyselin s molekulovou hmotností 13.5 kD. BDNF stimuluje in vitro vytváření neuritů a přežívání buněk v kultuře gangliových neuronů retiny, cholinergních neuronů septa a také dopaminergní.ch neuronů středního mozku (přehled Lindsay, Neurotrophic Factors, ed., 1993, 257, Academie

Press). Sekvence DNA kódující lidský BDNF a krysí BDNF byly klonovány a sekvencovány (Maisonperre et al., Genomics 10,. 1991, 558), a zejména také sekvence kódující prasečí BDNF

9 9 9

9 9 • ·· ··’···· • * · · · · · « · ·· · · ·

9 9 · 9 Λ 9

9 9 9 9 9 99

999 999

9

9 9 9 (Leibrock et al., Nátuře 341, 1989, 149). Ačkoliv vlastnosti

BDNF jsou potenciálně zajímavé, terapeutické podávání BDNF narážín na různé překážky. Zejména nedostatečná biologická dostupnost BDNF omezuje jeho terapeutické použití. Mozkový neurotrofický faktor (BDNF) produkovaný podle předkládaného vynálezu múze být buď lidský BDNF nebo zvířecí BDNF.

Neurotrofin 3 (NT3) je secernovaný protein složený ze

119 aminokyselin, který umožňuje přežívání neuronů in vitro dokonce ve velmi nízkých koncentracích (henderson et al., Nátuře 363, 266-270, 1993). Sekvence cDNA kódující lidský NT3 již byla popsána (Hohn et al., Nátuře 344, 1990, 339).

Rodina TGF-B obsahuje zejména neurotrofický faktor gliových buněk. Tento neurotrofický faktor gliových buněk, GDNF (L.-F. Lin et al., .Science 260, 1130-1132, 1993) je protein obsahující 134 aminokyselin s molekulovou, hmotností 16 kD. Má kapacitu podporovat in vitro přežívání dopaminergních neuronů a motorických neuronů (přehled viz Henderson, 1995) . Neurotrofický faktor gliových buněk (GDNF) produkovaný podle předkládaného vynálezu může být buďto lidský, nebo zvířecí GDNF. Sekvence cDNA kódující lidský GDNF nebo krysí GDNF byly klonovány a sekvencovány (L. -F. Lin, D. Doherty, J. Lile,. S. Besktesh, F. Collins, Science 260, 1130-1132, 1993). '

Dalším neurotrofickým faktorem, který může být použit podle předkládaného vynálezu, je zejména CNTF . (ciliární neurotrofický. faktor) . CNTF je néurokin schopný . zabránit smrti neuronů. Jak již bylo. zmíněno dříve, klinické testy byly předčasně ukončeny pro nedostatek výsledků. Předkládaný vynález nyní umožňuje dlouhotrvající a souvislou produkci in vivo CNTF, buďto samotného nebo v kombinaci s dalšími ·« ···· • · »

*· ·· • · · * • ·· · • · · · · · · • · • · · · trofickými faktory, pro léčení ALS. DNA pro lidský a myší gen CNTF byla kolonována a sekvencována (EP 385060, W.O 91/04316).

Dalším neurotrofickým faktorem, který může být použit podle předkládaného vynálezu, je např. IGF-1 (Lewis . et al., 1993) nebo růstové faktory fibroblastů (FGFa, FGFb). Zejména IGF-1 a FGFa jsou zajímavými kandidáty. Sekvence genu FGFa byla popsána v odborné literatuře společně s vektory umožňujícími expresi in vivo (WO 95/25803).

Geny kódující. BDNF, GDNF, CNTF a NT3 jsou zvláště zajímavé z hlediska použití podle předkládaného vynálezu.

První způsob provedení předkládaného vynálezu, tj . expresní sytém podle vynálezu, umožňuje produkci jednoho neurotrofického faktoru in vivo. V takovém případě expresní systém obsahuje pouze expresní kazetu. Výhodně umožňuje expresní systém podle předkládaného vynálezu in vivo produkci neurotrofického faktoru vybraného ze skupiny obsahující neurotrofiny, neurokiny a TGF. Výhodněji se jedná o faktor vybraný ze skupiny obsahující BDNF, GDNF, CNTF, NT3, FGFa a IGF-I.

Podle jiného způsobu provedení umožňuje expresní systém podle předkládaného vynálezu in vivo expresi dvou neurotrofických faktorů. V takovém případě obsahuje expresní systém buďto dvě expresní kazety nebo jedinou expresní kazetu umožňující simultánní expresi dvou nukleových kyselin (tzv. bicistronová jednotka). Když expresní systém obsahuje dvě expresní kazety, tyto kazety užívají shodné nebo různé promotory.

Výhodně expresní systém podle předkládaného vynálezu umožňuje produkci in vivo kombinace následujících neurotrofických faktorů: BDNF a GDNF, BDNF a NT3, GDNF a NT3, CNTF a BDNF, CNTF a NT3, CNTF a GDNF.

• «· ·«···· ·♦ 99 • « · · « · · · · · * • · · · · . · · · · 9

9 999 9 99 999 999

9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 99 9 9 9 9 9 9

Přihlašovatel prokázal, že . výhodné podání dvou neurotrofických faktorů se projevilo významným terapeutickým účinkem.· V expresním systému pro expresi 2 neurotrofických faktorů jsou použity promotory buď shodné nebo. podobné účinnosti a shodné nebo podobné počty kopií nukleových kyselin. Obecně tedy množství obou faktorů produkovaných in vivo je dostatečně podobné. Avšak za . určitých podmínek může být výhodné produkovat různá množství každého z faktorů.

V takovém případě je možné použít . buďto . různě silné promotory, nebo takový systém, kde jsou přítomné různé počty kopií různých genů, anebo podávat odlišné dávky.

V expresním systému podle předkládaného vynálezu je expresní kazeta (případně expresní kazety) výhodně součástí vektoru. Zvláště to může být virový nebo plazmidový vektor.

V případě, že expresní systém obsahuje několik expresních kazet, kazety mohou být neseny několika samostatnými vektory nebo mohou být všechny v jednom vektoru.

Vektor může být standardní plazmidový vektor obsahující, kromě expresní kazety (případně kazet) podle vynálezu, replikační počátek a markerový gen. Bylo popsáno mnoho různých typů zlepšených vektorů postrádajících markerový gen nebo replikační počátek (PCT/FR96/00274) nebo majících např. podmíněný replikační počátek (FR95/10825). . Takové vektory jsou výhodné pro použití podle předkládaného vynálezu.

Vektor může být také virový vektor. Byly zkonstruovány různé vektory na základě virů s vynikajícími vlastnostmi v přenosu genů. Patří sem např. adenoviry, retroviry, AAV a herpetický virus. Pro použití jako vektorů pro přenos genů je genom těchto virů modifikován tak, .že nejsou schopny autonomní replikace v buňce. Takové viry se pak nazývají replikačně defektní viry. Obecně je virový genom modifikován

'00 • 0 0 · 0 0 · 0 • 0 · '0·0'0 0 0 00 000000 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 >0 tak, že úseky nezbytné v trans pro virovou replikaci se nahradí expresní kazetou (případně kazetami).

Podle předkládaného vynálezu je.výhodné použití virových vektorů odvozených z adenovirů. Adenoviry jsoul· viry obsahující lineární dvouřetězcovou DNA velikosti přibližně 36 kb (kilobazí). Jejich genom obsahuje zvláštní sekvence, tzv, obrácené koncové repetice (ITR) na každém konci, enkapsidační sekvenci (psí) a časné a pozdní‘geny. Hlavní časné geny jsou obsaženy v úsecích El, E2, E3 a E4. Z těchto genů jsou zvláště nezbytné pro množení viru geny obsažené v úseku El.. Hlavní pozdní geny leží v úsecích LI až L5. Gelý genom adenovirů Ad5 byl sekvencován a je přístupný v databázi (viz GeneBank M73260). Stejným způsobem byly sekvencovány čisti nebo i cel.é genomy jiných adneovirů (Ad2, Ad7, Adl2 atd.) .

Pro použití jako vektory pro přenos genů byly připraveny různé konstrukty, které obsahují různé terapeutické geny. Zvláště se,jedná o konstrukty již dříve popsané, které jsou součástí stavu techniky, což jsou adenoviry, ze kterých byl odstraněn úsek El nezbytný pro virovou replikaci a místo něho byly vloženy sekvence heterologní DNA (Levrero et al., Gene 101, 1991, 195, Gosh-Choudhury et al., Gene 50, 1986, 161).

Avšak pro zlepšení vlastností vektorů bylo navrženo vytvoření dalších delecí nebo modifikací v genomu adenovirů. Takže byly vneseny bodové mutace teplotně-senzitivní do mutanta. tsl25, vedoucí k inaktivací DNA vazebného proteinu (DBP) velikosti 72 kD (Van der Vliet et al., 1975) . Jiné vektory obsahuj í delece , v dalším úseku nezbytném propagaci viru, což je úsek E4.

regulaci exprese pozdních genů, stability pozdní jaderné RNA,. potlačení exprese proteinů hostitelské buňky a účinnosti pro replikaci a/nebo

Úsek E4 se podílí na

« 0 0 0 • 9 0 0 • 0 ····

0 00 ♦ 0 0

0 0

000 000

0

9 0 0 replikace virové DNA. Adenovirové vektory, ve kterých chybí úseky El a E4, se vyznačují značným základním šumem transkripce a velmi omezenou expresí virových genů. Takové vektory byly popsány např. · v patentových přihláškách WO94/28152, WO95/02697 a WO96/22378. Kromě toho byly popsány i vektory, které mají modifikace na úrovni genu IVa2 (W096/10088) .

Rekombinantní adenoviry popsané v odborné literatuře byly připravovány z adenovirů patřících k různým sérotypům. Existují adenoviry různých sérotypů, které se poněkud liší strukturou a vlastnostmi, ale mají srovnatelnou genetickou organizaci. Rekombinantní adenoviry mohou být lidského nebo zvířecího původu. Pokud se jedná o adenoviry lidského původu, je třeba zmínit zejména třídy adenovirů skupiny C, zvláště pak adenoviry typu 2, 5, 7 nebo 12 (Ad2, Ad5, Ad7 nebo Adl2). Mezi adenoviry zvířecího původu je třeba zvláště zmínit adenoviry psů, zejména všechny kmeny adenovirů CAV2 (např. kmen Manhattan nebo A26/61, ATCC VR-800). Další adenoviry zvířecího původu jsou uvedeny v patentové přihlášce WO94/26914, na kterou se tímto plně odkazujeme.

Ve výhodném provedení předkládaného vynálezu rekombinantní adenovirus je lidský adenovirus skupiny C, nej výhodněj i je to adenovirus. Ad2 nebo Ad5.

Rekombinantní adenovirus je připravován v enkapsidační linii, tj. takové buněčné linii, která je schopna komplementovat v trans jednu nebo více deficitních funkcí rekombinantního adenovirového genomu. Jedním z příkladů takové linie je linie 293, do které byla integrována část adenovirového genomu. Přesněji je buněčná linie 293 linie lidských ledvinných embryonálních buněk, které obsahují levou koncovou část (přibližně 11 až 12 %) genomu adenovirů

• · ·	toto to	·« to	•	• to#· •	• to toto • ·· to
• ·	•	• ·	•	• ·	··· ···
• »	*	to	•	• to	• to
• · ·	• ·	• to		. to·	• to ··

sérotypu 5 (Ad5) , která obsahuje levou ITR, enkapsidační úsek, usek El včetně El a Elb, úsek kódující protein pIX a část úseku kódujícího protein pIVa2. Tato- linie je schopna komplementovat v trans rékombinantní adenovirus defektní v úseku El, tj . postrádající úsek El nebo. jakoukoliv část úseku El, a produkovat virový kmen ve velmi vysokém titru. Linie je schopna produkovat v permisivní teplotě (32 °C) kmen viru obsahující teplotně-senzitivní mutaci E2. Byly popsány také jiné buněčné linie schopné komplementovat úsek El,, založené především na-, buňkách lidského plicního karcinomu A549 (WO 94/28152) nebo na lidských retinoblastech (Hum. Gen. Ther. 1996, 215). Podobně byly popsány buněčné linie schopné komplementace v trans několika funkcí adenoviru. Je možné uvést zvláště buněčné linie komplemetující úseky El a E4 (Yeh et al., J. Virol 70, 1996, 559, Cancer Gen. Therapy 2, 1995, 322, Krogliak et al., Hum. Gen. Ther. 6, 1995, 1575) a buněčné linie komplementující úseky El' a E2 (WO 94/28152, WO 95/02697, WO 95/27071). Rékombinantní adenoviry jsou produkovány zpravidla tak, že se vnese virová DNA do buněk enkapsidační buněčné linie, pak přibližně po 2 nebo 3 dnech následuje.buněčná lýze (cyklus adenovirů je přibližně 24 až 36 hodin). Po lýze buněk se izolují rékombinantní virové částice centrifugací v gradinetu chloridu česného. Alternativní metoda’ je popsána v patentové přihlášce FR 96/08164, na kterou se tímto odkazujeme.

Expresní kazeta s terapeutickým genem (případně geny) může být vložena do různých míst genómu rékombinantního adenoviru, a to způsobem, který je v oboru známý. . Tak především může být vložena do místa delece úseku El. Podobně může být vložena do místa úseku E3, buďto navíc nebo místo původní sekvence. Stejně tak může být vložena místo • 9 99 » 9 ♦ I ·· ··♦·

9 ' 9 • 9 deletovaného úseku E4. Pro konstrukci vektorů nesoucích dvě expresní kazety, jedna může být vložena na úrovni úseku El a druhá na úrovni úseku ,E3 nebo E4. Obě kazety také mohou být vloženy do stejného úseku.

Jak již bylo zmíněno dříve, v případě expresního systému obsahujícího několik expresních kazet, mohou být kazety neseny několika samostatnými vektory, nebo mohou být všechny v jednom vektoru. Předkládaný vynález je zaměřen na zlepšení vektorů, které jsou zejména účinné v lokalizovaném přenosu in vivo terapeuticky' účinných množství GDNF, BDNF, NT3 nebo CNTF. Předkládaný vynález se týká systémového injekčního podávání expresního systému, který obsahuje dva vektory pro přenos .genů, z nichž každý nese gen kódující neurotrofický faktor. Předkládaný vynález se , také týká systémového injekčního. podávání expresního . systému obsahujícího bicistronový vektor, který umožňuje koexpresi dvou . genů. Výhodně se předkládaný vynález týká systémového injekčního podávání expresního systému, který^: obsahuje dva vektory, z nichž jeden nese gen kódující ČNTF a druhý nese gen kódující BDNF, nebo jeden nese gen kódující GDNF a druhý nese gen kódující NT3.

Výhodněji je vektor pro přenos adenovirový vektor. Přihlašovatel skutečně prokázal účinnost použití adenoviru kódujícího neurotrofický faktor, injikováného i.v., pro léčení ALS na různých zvířecích modelech ALS. Konkrétně výsledky uvedené v příkladech ukazují poprvé na zvířecím modelu familiární formy ALS, a sice myši FALS_G93a/ významné prodloužení délky života doprovázené, současně zlepšením elektromyografické výkonnosti. Dosud bylo jediným řešením pro pacienty trpící ALS podávání riluzolu (Rilutek®), který o několik měsíců prodlužuje - přežívání trpících. Bylo

• ·· *	·· •	·· •	•	···· •	·· 99 • 9 9 9
• ·	•	• ·	•	• ·	9 99 999
• ·	•	•	•	• ·	9 9
• · ·	··	• ·		* ·	99 9 9

prokázáno, že riluzol podávaný myším FALS_G93_A je schopen prodloužit průměrnou délku života o 13 dní (Gurney et al., 1996). Je možné předpovědět, že jakýkoliv způsob: léčení, který prodlouží život o více než 13 dní u myšího modelu FALS_G93a, bude schopen poskytnout pacientovi terapeutický prospěch lepší než riluzol. Výsledky uvedené zde v příkladech ukazují, že přístup podle předkládaného vynálezu . umožňuje prodloužení průměrné délky života u myší FALS_g93a o přibližně 30 dnů. To je velmi významné prodloužení délky života a je to poprvé, co byl demonstrován terapeutický prospěch takové důležitosti na modelech ALS.

Jiný model ALS představují myši pmn, které jsou charakterizovány časnou a rychlou degenerací motorických neuronů a průměrná délka života těchto myší je 40 dnů. Výsledky uvedené zde v příkladech ukazují, že přístup podle předkládaného vynálezu vedl k prodloužení průměrné délky života myší pmn ze 40 na 53 dnů, což je významné zlepšení představující více než 30%. Prodloužení života u ošetřovaných myší pmn je doprovázeno také významným snížením degenerace jejich motorických neuronů.

Všechny výsledky získané . pomocí nového přístupu dle předkládaného vynálezu ukazují vůbec poprvé významné zlepšení různých klinických, elekťromyografických a histologických parametrů u dvou různých modelů ALS.

Produkce in vivo trofických faktorů podle předkládaného vynálezu je dosaženo systémovým podáním. Výsledky uvedené zde v příkladech ukazují, že tento způsob podávání vede k pravidelné a souvislé produkci trofických faktorů v těle pacienta samotného, přičemž tato produkce je dostatečná k dosažení významného terapeutického účinku. Systémové podávání je výhodně v podobě intravenózní nebo • ·· ·· ···· ·· ·· ·· · · · · · ···· • · · . · · · · ·· · • · ··· · · · ······ ··· · · · · · · ' • · · ♦ · ·« ♦« · · * · intraarteriální injekce. Zvláště výhodná je intravenózní injekce. Tento způsob podávání je výhodný z hlediska jeho snášenlivosti a snadné dosažitelnosti. Je také navíc výhodný proto, že umožňuje injikovat větší objemy než při intramuskulární injekci a opakovaným způsobem.

Předkládaný vynález se také . týká jakéhokoliv farmaceutického přípravku, který obsahuje expresní systém pro dva neurotrofické faktory. Farmaceutický přípravek podle předkládaného vynálezu výhodně obsahuje farmaceuticky přijatelné vehikulum v, případě formulace pro injekci. Může to být sterilní isotonický roztok soli (dihydrogenfosforečnan sodný nebo hydrogenfosforečnan sodný, chlorid sodný, draselný, vápenatý nebo hořečnatý, atd., nebo směsi takových solí) . Nebo se může o jednat o přípravek suchý, zejména lyofilizovaný přípravek, který přidáním sterilní vody nebo fyziologického séra vytvoří roztok pro injekci. Mohou se užít další excipienty, jako např. stabilizující proteiny (zejména lidský sérový albumin, viz FR96/03074) nebo hydrogel. Přičemž hydrogel může být připraven z jakéhokoliv biokompatibilního a netoxického polymeru (homo- nebo hetero-). Takové polymery byly např. popsány v přihlášce WO93/0-8845. Některé z těchto polymerů, zvláště např. polymery vycházející z etylenoxidu a/nebo propylenoxidu, jsou komerčně dostupné.

Kromě toho, když se expresní systém skládá může být výhodné přidat do podle vynálezu chemické nebo usnadňuje přenos genů. V této souvislosti je třeba zmínit zvláště kationtové , polymery polylysinového typu, (LKLK)_n, (LKKL)_n, které jsou popsány v přihlášce WO 95/21931, polyetylenimin (viz WO 96/17823) a DEAE-dextran nebo kationtové či lipofektantové lipidy.

z plazmidových vektorů, farmaceutického přípravku biochemické agens, které

44

4 4

4 4

444 444

4

44

4 4

4 4

4444

4 4

4 4

4 4

444 44

4 4 4

4 4 4

4 4

Jejich, vlastností je kondenzovat DNA a podporovat asociaci DNA s buněčnou membránou. K lipofektantovým agens patří např. lipopolyaminy (lipofectamin, transfectam, jak jsou popsány v přihláškách WO 18863 nebo WO 96/17823, různé kationtové nebo neutrální lipidy. (DOŤMA, DOGS, DOPE atd.) a také peptidy jaderného původu (viz WO 96/25508), případně ještě upravené tak, aby směřovaly do určité tkáně. Příprava přípravku podle vynálezu použitím takových chemických vektorů se provádí jakoukoliv technikou odborníkovi známou, obecně zcela jednoduše prostým smícháním různých složek.

Podávané dávky expresního systému podle předkládaného vynálezu závisí na mnoha faktorech, zejména na typu použitého vektoru, na druhu zúčastněných neurotrofických faktorů, na typu použitého promotoru, na stadiu nemoci a také na době léčení. Obecně platí, že expresní systém je podáván v dávkách obsahujících 0,1 až 500 mg DNA na 1 kg, výhodně 1 až 100 .mg DNA/1 kg. Obecně jsou užívány dávky přibližně 10 mg DNA/1 kg.

Co se týče rekombinantních adenovirů,. ty jsou formulovány a podávány v dávkách od 10⁴ do 10¹⁴ pfu, výhodně 10⁶ až 10¹⁰ pfu. Termín pfu (plaque forming unit) charakterizuje infekčnost (infekční s.ílu) roztoku adenovirů, kterou' lze stanovit infekcí vhodné buněčné kultury, a pfu je pak (obvykle po 15 dnech) měřítkem počtu infikovaných oblastí buněk. Technika stanovení titru pfu. virového roztoku je dobře popsána v odborné literatuře.

Vlastní injikování může být provedeno mnoha různými způsoby, zvláště pak pomocí injekční stříkačky nebo pomocí perfúze. Výhodné je podání pomocí injekční stříkačky. Kromě toho lze provádět opakované injikování, aby byl ještě dále zvýšen terapeutický účinek. '

4 4 • 44 ·· 4444 ·· • 44 · · · · 4 4 · • 4 4 · * · 44 444

4 4 44 4 4

444 44 44 44 44

Podle různých variant provedení předkládaného vynálezu lze přístup podle vynálezu. kombinovat s podáváním riluzolu. Vynález se také týká farmaceutického, přípravku, který obsahuje expresní systém podle vynálezu a farmakologicky účinné množství riluzolu, a to buď pro simultánní podávání nebo pro podávání v časových intervalech.

Výsledky uvedené v následující části ilustrují předkládaný vynález, aniž by ho jakkoliv omezovaly. Ukazují zvláště výhodné vlastnosti předkládaného vynálezu, který podle našich znalostí představuje poprvé terapeutický užitek u ALS.

Popis obrázků >

..Obr. 1. Srovnání elektromyografické výkonnosti myší FALS_G93a bez nebo s podáním expresního systému pro kombinaci CNTF-GDNF.

Obr. 2. Srovnání elektromyograf ické výkonnosti myší FALS_g93a bez nebo s podáním expresního systému pro NT3.

Obr. 3. Srovnání přežívání myší pmn bez nebo s podáním expresního systému pro CNTF. Přežívání pmn myší (ve dnech) je vyjádřeno v procentech analyzovaných zvířat. Počet myší, kterým se podával expresní systém CNTF je 100 %, n=7 (silná čára), neošetřované myši,

100 %, n=14 (normální čára).

Obr. 4. srovnání degenerace motorických neuronů pmn myší bez a s podáním expresního systému CNTF. Počet myelinizovaných vláken. frenickěho nervu byl vyšetřován ve stáří myši 25 dnů. Výsledky: myši pmn s expresním systémem. CNTF (145, n=10), neošetřované myši pmn bez expresního systému CNTF (122, n=8), myši ·# ······ 44 4 4 • 4 · · 4 4 · 4 4 4 4

4 4 · 4 4 44 ·

4 4 4 4 · 44 44

4 4 4 4 4 4

4 4 44 4 4 44 44 44 pmn ošetřované AdlacZ (111, n=8), normální myši Xt (263, n=4). Vertikální úsečky představují střední chybu průměru (SEM).

Příklady provedení vynálezu

1. Materiál a metody

Všechny experimenty adenoviru, injikování do v zabezpečené laboratoři popisované v další· části . (konstrukce myší, funkční měření) byly prováděny typu L3.

1.1. Zvířata

Bylo připraveno několik linií transgenních myší exprimujících mutované formy SOD zodpovědné za familiární formy ALS, aby byl získán myší model tohoto patologického stavu. Transgenní myší nadměrně exprimující mutovanou lidskou SOD, ve které je glycin 93 nahrazen alaninem (myši FALS_G93a) se vyznačovaly progresivní degenerací motorických neuronů, která se projevovala paralý.zou končetin a nakonec smrtí ve věku 4 až 6 měsíců (Gurney et al., 1994). První klinické příznaky spočívaly v třesu končetin přibližně v 90 dnech, pak ve zkrácení kroku ve 125 dnech (Chiu et al., 1995) . Na histologické úrovni, asi od 37. dne bylo možné pozorovat v motorickcýh , neuronech vakuoly mitochondriálního původu a ztráty motorických neuronů byly pozorovatelné od 90. dne (Chiu et al., 1995). Napadení myelinizovaných axonů bylo pozorovatelné hlavně ve ventrální dřeni a také v malé míře v dorsální oblasti. Na úrovni motorických plaků byl pozorován jev, kdy docházelo ke kompenzující kolaterální reinervaci (Chiu et al., 1995).

• ·9 9 * «·«« «· · ·

9 9 9 9 9 9 99 9

9 9 9 9 9 9 99 9

999 9 99 999 999

9 99 9 9 9 9

Pro příklady byly vybrány myši FALS_g93a. Tyto myši představují velmi. dobrý zvířecí model pro výzkum patofyziologických mechanismů ALS a také pro vývoj terapeutické strategie. Skutečně sdílejí s familiárními formami ALS společný patofiziologický původ (a sice mutaci SOD) a také řadu shodných histopatologických a elektromyografických chrakteristik.

V laboratoři jsme chrakteřizovali elektromyografickou výkonnost myší FALS_g93a a ukázalo se, že splňují Lambertova

kritéria pro ALS (Kennel	et al., 1996): .
1).	redukce počtu motorických kolaterální inervací,	j ednotek	s	doprovodnou
2)	přítomnost spontánní a fascikulace předních	denervační a zadních	aktivity, končetin,	tj	fibrilace
3)	modifikace rychlosti	motorické	kondukce	korelující se

snížením vyvolané motorické odpovědi,

4) žádné senzorické napadení.

Ukázali jsme také, že napadení faciálního nervu bylo řídké, dokonce i u starých myší FALS_g93a, což je shodný rys s pacienty..

Myši FALS_g93a pocházeli od firmy Transgenic Alliance (L'Arbresle, Francie). Březí samice byly dodávány každý týden a byly ' ponechány, aby porodily . v laboratorním chovu. Nedospělí myší heterozygoti, u kterých se začala rozvíjet nemoc, byli identifikováni pomocí PCR na vzorku DNA extrahované z odebraného kousku ocasu.

Existují i další zvířecí modely s degenerací motorických neuronů (Sillevis-Smitt a De Jong, 1989, Price et al., 1994), buďto po akutní neurotoxické lézi (po ošetření IDPN s excitotoxiny) nebo v důsledku genetické poruchy (myši wobbler, pmn, nebo Mnd, pes HCSMA) . Z těchto zvířecích modelů

	··	·<	«·*·	·«
• ·	• ·	' ·	•	• · ·
• ·	• · ·	•	• ·	*1«
• ·	• *	•	• ·	•
	··	• ·	·· .	• ·

jsou zvláště dobře charakterizované myši pmn, a to jak na klinické, tak histologické (Schmalbruch, 1991) a elektromyografické úrovni (Kennel, 1996) . Mutace pmn je přenášena autosomálně recesivním způsobem a bylo zjištěno, že leží na 13. chromosomu. U homozygotních myší pmn se vyvine svalová atrofie a paralýza, které se projeví na zadních končetinách ve věku 2 až 3 týdnů a pak se generalizují. Všechny neošetřované myši pmn umírají před dosažením věku šesti až sedm týdnů. Degenerace jejich motorických neuronů začíná na úrovni nervových zakončení a končí masivní ztrátou myelinizovaných vláken motorických nervů a zejména frenického nervu (bráničního nervu), který zajišťuje inervaci bránice (Schmalbruch 1991) . Ve srovnání s myšmi FALS_G93A svalová denervace je velmi rychlá a není doprovázena žádnými známkami reinervace novým růstem axonových kolateráiních vláken. Z hlediska elektromyografie je postup svalové denervace charakterizován tím, že se objevuje fibrilace a významné snížení amplitudy svalové odpovědi vyvolané supramaximální elektrickou stimulací nervu (Kennel et al., 1996).

Linie transgenních myší Xt/pmn byla využita jáko další myší model ALS. Tyto myši byly získány prvním křížením samic C57/B156 nebo DBA2 se samcem Xt pmn⁺/Xt⁺ pmn (kmen 129), po kterém následovalo druhé křížení potomků Xt pmn⁺/Xťpmn⁺ heterozygotních samic (NI) s původním samcem. Z potomků (N2) byly vybrány pro další křížení dvojití. heterozygoti Xt pmn⁺/Xt⁺pmn (zvaní myši Xt pmn} nesoucí alelu Xt (která se projevuje fenotypem s nadpočetným prstem extra digit) a alelu pmn (kterou lze určit pomocí PCR).

999

• «	4 9	•	···· •	99 9 9 9
• *	9 9 9	•	• ·	999
• - ·	•	. ·	•	• ·	9
··	··	··		··	99

2. Expresní systémy

2.1. Plazmidové vektory

Mohou se použít různé plazmidové vektory umožňující expresi jednoho nebo dvou heurotrofických faktorů. Tak např. je možné uvést plazmidy pCRII-BDNF a. .pSh-Ad~BDNF, které obsahují expresní a sekreční kazetu pro BDNF (viz WO 95/25804). Také je možné zmínit plazmidy p-LTR-IX-GDNF obsahující nukleovou kyselinu kódující gen CNTF řízený promotorem LTR (viz WO 95/26408) a také plazmid p-LTR-IXpreNGF/CNTF obsahující sekvenci genu CNTF za signální sekvencí. betaNGF, a dále invertovanou repetici (ITR) z adenovirového genomu, LTR sekvenci promotoru viru Rousova sarkomu (RSV), enkapsidační sekvenci a také adenovirové sekvence nezbytné pro homologní rekombinaci. V podstatě je zřejmé, že jakýkoliv plazmid obsahující replikační počátek a markerový gen se může použít pro vytvoření expresního systému podle předkládaného vynálezu tak, že se do takového plazmidu vloží jedna nebo několik expresních kazet neurotrofického faktoru. Plazmidy mohou být připraveny jak v eukaryotickém tak i prokaryotickém hostiteli.

2.2. Adenovirus

Jak již vylo uvedeno v předchozím textu, virové vektory, a zejména adenoviry, jsou zvláště výhodné pro provedení předkládaného vynálezu.

Rekombinantní adenoviry použité v následujících příkladech byly získány homologní rekombinaci způsoby, které jsou v oboru známy. Ve stručnosti lze shrnout, že jsou vytvořeny v buňkách 293 rekombinaci mezi fragmenty 'linearizovaného virového genomu (dl324) a plazmidem

·· ···· ·· ·· • · · · · · · • · · ' · · · · • · · · ··· ··· • · · · · · ·· 0 · · · · · obsahujícím levou ITR, enkapsidační sekvence, transgen a také jeho promotor, a dále virové sekvence, které umožňují rekombinaci. Viry byly namnoženy v buňkách 293. Pravidelně jsou znovu purifikovány v laboratoři typu P3. Virové genomy mohou být připraveny podobně v prokaryotických buňkách způsobem, který je popsán v patentové přihlášce WO 96/25506.

Konkrétně byly použity následující viry:

Ad-ČNTF: Rekombinantní adenovirus sérotypu Ad5, který obsahuje expresní kazetu genu CNTF. vloženou do genomu v místě deletovaného úseku El. Tato expresní kazeta obsahuje. cDNA kódující CNTF, jejíž exprese je řízena transkripčním promotorem (v tomto případě LTR z RSV) . Podrobnosti o konstrukci jsou popsány v·přihlášce WO 94/08026. Alternativní konstrukty obsahují dodatečné delece v úseku E4, což bylo popsáno v přihlášce WO 96/22378, nebo v úseku E3.

Ad-GDNF: Rekombinantní adenovirus sérotypu Ad5, který obsahuje expresní kazetu genu GDNF vloženou do genomu v místě deletovaného úseku El. Tato expresní kazeta obsahuje cDNA kódující GDNF,. jejíž exprese je řízena transkripčním promotorem(v tomto případě LTR z RSV) . Podrobnosti o konstrukci jsou popsány v přihlášce WO 95/26408. Alternativní konstrukty obsahují dodatečné delece v úseku E4, což bylo popsáno v přihlášce WO 96/22378.

Ad-NT3: Rekombinantní. adenovirus sérotypu Ad5, který obsahuje expresní kazetu genu NT3 vloženou do genomu v místě deletovaného úseku El. Tato expresní kazeta obsahuje cDNA kódující NT3, jejíž exprese je řízena transkripčním promotorem (v tomto případě LTR z RSV). Podrobnosti ó konstrukci jsou popsány v přihlášce • v ♦ · · ·· ····

WO 95/26408. Alternativní konstrukty obsahují dodatečné delece v úseku E4, což bylo popsáno v přihlášce WO 96/22378.

Ad-BDNF: Rekombinantní adenovirus sérotypu Ad5, který obsahuje expresní kazetu genu BDNF vloženou do genomu v místě deletovaného úseku El. Tato expresní kazeta obsahuje cDNA kódující ' BDNF, jejíž exprese je řízena transkripčním promotorem (v tomto případě LTR z RSV). Podrobnosti o konstrukci jsou popsány v přihlášce WO 95/25804. ' Alternativní konstrukty obsahují dodatečné delece v úseku Έ4, což bylo popsáno v přihlášce WO 96/22378.

Ad-FGFa: Rekombinantní adenovirus sérotypu Ad5, který obsahuje expresní kazetu genu FGFa vloženou do genomu v místě deletovaného úseku El. Tato expresní kazeta obsahuje cDNA kódující FGFa, jejíž exprese, je řízena transkripčním promotorem (v tomto případě LTR z RSV). Podrobnosti o konstrukci jsou popsány v přihlášce. WÓ 95/25803. Alternativní konstrukty obsahují dodatečné delece v úseku E4, což bylo popsáno v přihlášce WO 96/22378.

Funkčnost kostruovaných virů byla· ověřována tak, že byly infikovány fibroblasty v buněčné kultuře. Přítomnost příslušného neurotrofického faktoru byla zjišťována v supernatantu z buněčné kultury testem ELISA a/nebo ověřením tro.fického působení takového superanatatu na primární kulturu neuronů.

3. Podávání rekombinantního adenoviru

Adenoviry kódující neurotrofické faktory podle předkládaného vynálezu byly podávány intravenózním způsobem • · »····· · · • · · · · · ··· · ·· ··· · · · ······ · dospělým nebo novorozeným zvířatům. U dospělých myší FALS_G93a bylo injikováno 10⁹ pfu každého adenoviru (v celkovém objemu 200 μΐ) do kaudální žíly pomocí injekční mikrostříkačky typu Hamilton®.' U novorozných myší pmn (stáří 2 identifikovaných nepřítomností injikováno 2xl0⁹ pfu (celkový, objem 20 μΐ suspenze do retinální cévy pomocí injekční mikrostříkačky insulinového typu s jehlou velikosti 30g. Novorozená zvířata byla lehce enestetizována éterem a ve stavu hypotermie.

až 3 dny) nadpočetných prstů, bylo adenovirové

4. Další použití techniky.

Elektromyografie

Pokud to jejich fyzický stav dovolil, byla zvířata anestetizována intraperitoneální injekci směsi diazepamu (Valium®, Roche, Francie) a hydrochloridu ketaminu (Kétalar®, Parke-Davis, Francie) v dávkách. 2 ^g/g a 60 μg/g tělesné hmotnosti.

Použitý elektromyograf byl přístroj poslední generace (Keypoint®), který měl všechno nezbytné programové vybavení pro zpracování elektromyografickcých signálů. Přístroj byl Dantecu poskytnut na leasing (Les Ulis, Francie).

Eletromyografická stimulodetekce: evokovaná motorická odpověď (REM) ’

Když se na nerv aplikuje elektrický šok, svaly inervované tímto nervem jsou místem elektrické odpovědi. Ta přetrvává po určitou dobu (tzv. distální latence), která odpovídá době vedení stimulu až k synapsi, ke které nutno ještě přičíst čas potřebný pro přenos signálu v synapsi.

44

4 4 4

4 4 9

499 449

4 • 4 9 4

Amplituda signálu je přitom, úměrná počtu inervovaných svalových vláken.

Z čistě praktických důvodů byl vybrán pro stimulaci ischiadický nerv oživující motorickou odpověď evokovanou na úrovni lýtkového svalu. Pět jehlových elektrod (Dantec) bylo implantováno, a napojeno na elektromyograf podle následujícího schématu:

a) 2 stimulační elektrody jsou umístěny tak, že jedna (aktivní) je umístěna na dráhu ischiadického nervu, druhá (referenční) elektroda je umístěna na kořen ocasu,

b) Jsou implantovány dvě detekční elektrody, a to tak, že jedna je implantována do lýtkového svalu' (aktivní elektroda) a druhá na odpovídající šlachu (referenční elektroda),

c) nakonec je jedna elektroda uzemněna a je implantována mezi dvě aktivní elektrody do stehna zvířete.

měří se amplituda a latence REM svalu, když se stimuluje jeho motorický nerv. To se provádí 200 ms se supramaximální intenzitou, která odpovídá 150 % intenzity dovolující získat maximální akční . potenciál. U dospělé myši, pokud jsou zkoumané svaly a nervy zdravé, a v podmínkách uvedených v předchozím textu, je amplituda evokované .odpovědi větší nebo shodná s 80 mV, a latenční čas obecně odpovídá 0.6 ms.

Histologické analýzy

Zvířata byla usmrcna předávkováním chloroformem a intrakardiálně perfundovány roztokem glutaraldehydu. Byly izolovány frenické nervy, vyjmuty a poté fixovány oxidem osmičelým a zality do epoxidu. Frenické nervy byly odříznuty těsně úbránice, a řezy o tloušťce 3 jim byly barveny • ·· ·· ···· ·· ·· ···· ·· · ····

0 0 0 0 0 0 0 Φ • a · · · · »· ··· ··· ······· · * ··· ·· ·· ·· ·· ·· parafenyldiaminem a .poté analyzovány za pomoci optického mikroskopu.

5. Podávání.expresního systému, který exprimuje gen CNTF

Injekce adenovirového vektoru

Adenovirový vektor byl injíkován do homozygotních myší

Xt⁺pmn/Xt⁺pmn‘ (myši pmn) ve stáří 2 až 3 dny, které byly identifikovány podle nepřítomnosti nadbytečných prstů. Suspenze adenoviru CNTF byla připravena naředěním zásobního roztoku adenoviru pufrovaným fyziologickým roztokem (PBS) na 2xl0² pfu/ μΐ a podán za podmínek popsaných v oddíle 3. Plazmid AdlacZ kódující β-galaktosidázu z E. coli (StratfordPerricaudet, 1992) byl použit jako kontrolní adenovirový vektor.

Výsledky

Analýzy lidských fibroblastů infikovaných AdCNTF pomocí northernových , přenosů ukázaly, že jsou přítomny dva rekombiantní transkripty o velikostech 1,1 a. 1,6 kb. Testy ELISA prokázaly přítomnost rekombinantních proteinů v supeřnatantech po infekci různých typů buněk.

Všechny neošetřované myši pmn v experimentálních sériích byly mrtvé. před dosažením stáří 2 měsíců a. jejich průměrná doba života byla 40,4 ± 2,4 dnů (n=14). Podávání kontrolního vektoru AdlacZ nezměnilo nijak dobu života myší pmn. Naproti tomu myši pmn ošetřované intarvenózními injekcemi AdCNTF přežívaly až 73 dnů. Průměrná doba života myší pmn AdCNTF byla . významně prodloužena na (N=7, p<0,011)(Rozdíly mezi výsledky pro

Xt/pmn, neošetřované homozygotní myši ošetřovaných 52,7 ± 3,9 dnů zdravé myši *· ·· 4·44 • · · 4 · • · · · 4 · · · • 4 · 4 · 4 4 ··· ·· 44 44 ·· 44 • · · • · 4 ··· 444 • ·

44 a ošetřované myši pmn byly analyzovány Studentovým t-testem. Výsledky jsou uvedeny jako průměr ± střední chyba průměru SEM) .

Aby bylo možné určit, zda prodloužení života myší pmn ostřovaných AdCNTF skutečně odráží zvýšení počtu vláken frenického nervu,. bylo provedeno vyšetření optickým mikroskopem 25. dne, kdy se ukázalo, že u neošetřovaných myší pmn a u myší pmn ošetřovaných intravenózně AdlacZ se snížil počet myelinizovaných vláken na 122 ±13 (n=6). a . 111 ± 11 (n=8) ve srovnání s tím, že zdravé myši měly 2 63 ± 8 myelinizovaných .vláken (n-4). Počet myelinizovaných vláken u myší pmn, kterým byl inj.ikován AdCNTF, byl významně větší u kontrolních zvířat (145 ± 11, n=10, p<0,05). Takže ošetření myší pmn s AdCNTF způsobilo snížení ztráty myelinizovaných vláken o 20 % (obr. 4).

6. Podávání expresního systému, který produkuje kombinaci CNTF-GDNF

10⁹ pfu každého zadenovirů Ad-CNTF a Ad-GDNF bylo injikováno (do kaudální žíly) pomocí injekční mikrostříkačky celkovém objemu 200 μΐ do 4 jedinců myši FALS_G93a ve stáří 99 dnů. V průběhu času se pak sledovala elektromyografická výkonnost zvířat a srovnávala se s kontrolní skupinou. Stejně tak se zaznamenávala průměrná délka života.

Elektromyografie .

Výsledky získané z elektromyografie jsou uvedeny na obr. 1. Bylo pozorováno snížení amplitudy evokované motorické odpovědi (REM) v nervu lýtkového svalu u ošetřovaných myší FALS_G93a (AdCNTF + AdGDNF) stejně jako u myší neošetřovaných. Toto snížení odráží proces postupné denervace, který je • 44 44 4444 44 44

4 4 4 4 · 4 4 4 4 · · · · 4 4 4 44 *

444 4 44 444 444

4 · 44 4 4 4

Claims (4)

1. charakteristický pro ALS. Avšak u ošetřovaných myší byla amplituda REM systematicky vyšší než u kontroly,. což ukazuje zpomalení funkčního napadení po ošetření.

   Délka života

   Délka života , zvířat v experimentech je uvedena v následujících tabulkách.

   Ošetřovaná zvířata

   Č. zvířete smrť ve_:stáří ' 1779-5 188 1779-6 170 1779-7 176 1779-8 155 průměr 172,5 .. střední chyba . 6, 8 6

   Neošetřovaná zvířata

   Č. zvířete smrt ve stáří 35-5 142 35-8 135 35-9 151 . 35-50 125 35-60 147 35-90 155 průměr 142,5 , střední chyba 4,51

   ΦΦ ·· ΦΦΦ· ·· ·· φ · φ φ φ φφφφ φ φφφ φ φ φ φφφ φφφ φφ φ φφφ φ φ φφ φφ φφ φφ φφ

   Výsledky ukazují, že všechna zvířata z ošetřované skupiny zemřela ve vyšším nebo shodném stáří, než bylo stáří nejstaršího žijícího zvířete v kontrolní skupině. Tyto výsledky také ukazují prodloužení délky života u ošetřovaných zvířat o 30 dnů v průměru ve srovnání s kontrolními zvířaty. Výsledky byly velmi neočekávané, a ve- srovnání s 13 dny po podání Riluteku®. ukazují velké terapeutické možnosti při uplatnění přístupu podle vynálezu.

   7. Podávání expresního systému, který produkuje NT3

   7a. Podávání expresního systému, který produkuje NT3, myším ve stáří 99 dnů

   10⁹ pfu adenoviru Ad-NT3 bylo injikováno do kaudální žíly pomocí injekční mikrostříkačky v celkovém objemu 200 μΐ do 4 myší FALS_g93a starých 99 dnů. Byla pak sledována časová závislost elektromyografické výkonnosti zvířat a porovnána s kontrolní skupinou. Získané výsledky jsou uvedeny na obr.
2. 2. a ukazují, že u ošetřovaných zvířat byla amplituda REM vyšší než u kontrolních, což ukazuje na zpomalování funkčního napadení po ošetření.

   7b. Podávání expresního systému, který produkuje NT
3. 3, myším ve stáří 3 dnů

   10⁸ pfu adenoviru Ad-NT3 bylo injikováno do spánkové žíly pomocí injekční mikrostříkačky v celkovém objemu 20 μΐ do myší FALS_G93a starých 3 dny.

   Následující tabulky ukazují délku života ošetřovaných a neošetřovaných zvířat.

   ·· • ·· ·* ···· ·· · · · · · • · · ♦ · · • · · · · · · • · · · · · * ··· ·· · · ·· ·· • · ··· ··· • · ·· ··

   Ošetřovaná zvířata

   Č. zvířete Smrt ve stáří 73-1 161 73-2 173 73-3 178 73-4 184 73-5 186 73-6 187 . 73-7 187 73-8 191 ' 73-9 196 73-10 197 74-1 162 74-2 177 . 74-3 177 . 74-4 179 74-5 180 74-6 183 74-7 186 37-1 162 37-2 176 37-3 181 37-4 · 189 37-5 190 37-6 190 průměr 181,4 SEM 2,1

   44 44
4. 4 4 4 4 4

   4 4 4 4 4

   44 444 444

   4 4 4

   44 44 44

   4 4 4

   444 4 4 4

   4 · · 4 · • 4 4 4 4 4

   4 4 4 4 4

   444 44 44