KR20000070272A - 수질 운동 뉴런 중으로의 아데노바이러스 벡터 매개-유전자전달방법 - Google Patents
수질 운동 뉴런 중으로의 아데노바이러스 벡터 매개-유전자전달방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 핵산의 근조직 투여에 의한, 핵산의 운동 뉴런으로의 전달 방법 및 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 외상 및 신경퇴행성 질환과 같은 신경계의 병리 치료방법에 관한 것이다.
Description
신경퇴행성 질환
근위축성 측색 경화증(ALS) 및 유아의 척수성 근위축과 같은 운동 뉴런 질환은 종종 쇠약하게하고 치유적인 치료를 어렵게 한다. 예를 들면, ALS는 심하게 무기력성이고 항상 치명적이다. 100,000명당 2.5명꼴로 꾸준한 증가 일로에 있고, 100,000명당 6 내지 10명꼴로 유행하는[참조문헌:Leigh, Pathogenic mechanisms in amyotrophic lateral sclerosis and other motor neurons disorders in Neurodegenerative diseases by CALNE, Saunders W.B. Eds, Philadelphia, U.S.A., 1994], ALS는 선진국에서 90,000명의 환자가 걸리며 이들은 거의 대부분 60대 성인들이다. 질환은 마비, 운동 및 호흡기 기능의 완전한 상실, 및 궁극적으로는 최초의 임상적인 증후 출현 2 내지 8년 후 사망(발병 3년 후 평균 지속기간)으로 이끄는 진행성 운동 뉴런 변성을 특징으로 한다. ALS는 환자 중 5%는 유전성이고 사례의 95%는 산재성이다. 염색체 21q22-1에 자리잡은 Cu/Zn 수퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD1)를 암호화하는 유전자내 점 돌연변이는 가족병 사례의 20%에서 병리의 원인이 되고 있다[참조문헌:Rosen et al., Mutations in Cu/Zn superoxide dismutase gene are associated with familial amyotrophic lateral sclerosis, Nature, 362, 59-62, 1993, review in Rowland, Amyotrophic lateral sclerosis; Human challenge for neuroscience, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 1251-1253, 1995]. 산재성 형태의 병리생리학적 토대는 알려지 않은 채로 남아있다. 비록, Rilutek의 사용으로 ALS 환자에 생존 확률에 있어 적당한 증가를 제공하지만, 이러한 질환에 이용될 수 있는 치유적인 치료책은 존재하지 않는다.
유아의 척추성 근위축은 상염색체 열성 질환으로서, 가장 심한 형태의 경우(SMA 1형), 유럽과 북미에서 유아 16,000 내지 25,000명당 1명꼴로 걸린다. SMA-1 환자는 생후 3개월이 되기 전에 허약성을 보이며 앉은 자세로 결코 지탱될 수 없다. 평균 기대수명은 8개월이며, 2 살이 되기 전에 사망율은 95%이다[참조문헌:Crawford and Pardo, The neurobiology of childhood spinal muscular atrophy, Neurobiol. of Disease, 3, 97-110, 1996]. 질환은 SMN 유전자에서의 돌연변이와 연관되어 있다[참조문헌:Lefebvre et al., Identification and characterization of a spinal muscular atrophy determining gene, Cell, 80, 155-165, 1995]. 이러한 질환에 이용될 수 있는 치유책은 존재하지 않는다.
신경영양 인자
운동 뉴런 질환에 대한 유망한 치료제로서 신경영양 인자가 제안되었다[참조문헌:Thoenen et al., Exp. Neurology 124,47-55, 1993]. 사실, 배양상태에서의 배아 운동 뉴런의 생존은 뉴로트로핀 계열의 멤버, 예를 들면, 뇌 유도 신경영양 인자(BDNF), 뉴로트로핀-3 (NT-3), NT-4 (NT-4/5), 사이토킨, 예를 들면, 모양체 신경영양 인자(CNTF), 백혈병 억제인자(LIF) 및 카디오트로핀-1, 교세포 계통-유도된 신경영양 인자(GDNF), 인슐린-유사 생장인자-1 (IGF-1) 및 FGF 계통의 멤버[참조문헌:review in Henderson, Neurotrophic factors as therapeutic agents in amyotrophic lateral sclerosis: potential and pitfalls. In Serratrice G.T. and Munsat T.L. eds. Pathogenesis and therapy of amyotrophic lateral sclerosis. Advances in Neurology, 68, pp. 235-240, 1995. Lippincott-Raven publishers, Philadelphia; Pennica et al., Cardiotrophin-1, a cytokine present in embryonic muscle, supports long-term survival of spinal motoneurons. Neuron, 17, 63-74, 1996]에 의해 증진된다.
생체내에서, 배아 발생 중에 자연 발생하는 운동 뉴런사의 감소가 CNTF[참조문헌: Oppenheim et al., Control of embryonnic motoneuron survival in vivo by ciliary neurotrophic factor. Science, 251, 1616-1618, 1991], BDNF[참조문헌:Oppenheim et al., Brain-derived neurotrophic factor rescues developing avian motoneurons from cell death. Nature, 360, 755-757, 1992], GDNF[참조문헌:Oppenheim et al., Developing motor neurons rescued from programmed and axotomy-induced cell death by GDNF, Nature, 373, 344-346, 1995], 및 카디오트로핀-1[참조문헌:Pennica et al., 1996]로 관찰되었다. 신생아 설치류에서의 급성 말초 신경 축색절개 후 레트로그레이드 운동 뉴런사로부터의 보호가 몇몇 인자로 증명되었다[참조문헌:Sendtner et al., Ciliary neurotrophic factor prevents the degeneration of motor neurons after axotomy, Nature 345, 440-441, 1990, Sendtner et al., Ciliary neurotrophic factor prevents degeneration of motor neurons in mouse mutant progressive motor neuronopathy. Nature, 358, 502-504, 1992; Sendtner et al., Brain-derived neurotrophic prevents the death of motoneurons in newborn rats after nerve section. Nature, 360, 757-759, 1992; Vejsada et al., Quantitative comparison of the transient rescue effects of neurotrophic factors on axotomised motoneurons in vivo. Eur. J. Neurosci., 7, 108-115, 1995], 또한, CNTF 및 /또는 BDNF의 보호효과가 유전된 진행성 운동 변성의 두 쥐 모델에서 기재되었다[참조문헌:Sendtner et al., 1992; Mitsumoto et al., Arrest of motor neuron disease in wobbler mice cotreated with CNTF and BDNF. Science, 265, 1107-1110, 1994].
신경영양 인자가 다수의 실험 조건하에서 운동 뉴런 생존을 증진시킴을 보여주는 데이터는 이들 분자가 인간의 병리에서 운동 뉴런의 감수성을 감소시킬 수 있음을 암시한다. 그러나, 환자에 있어 영양인자의 사용은 전신투여 후 이들의 불량한 생체 이용율로 해서 제한이 따른다.
전신투여된 신경영양 인자는 저수율로 신경계를 침투하는 데, 그 이유는 혈액-뇌 장벽이 존재하기 때문이다. 주사된 인자 중 극소량만이 운동 뉴런, 십중팔구 신경근 시냅스 수준에 도달한다[참조문헌:Dittrich et al., Ciliary neurotrophic cancer:pharacokinetics and acute phase response. Ann. Neurol., 35, 151-163, 1994, Yan et al., 1994]. 더욱이, 영양인자는 신속히 분해되고 전신투여 후 짧은 반감기를 보인다(래트에서 CNTF의 경우 2.9분, Dittrich et al., 1994, Cedarbaum et al., A double-blind placebo-controlled clinical trial of subcutaneous recombinant human ciliary neurotrophic factor (rHCNTF) in amyotrophic lateral sclerosis. Neurology, 46, 1244-1249, 1996]. 결과적으로, 운동 뉴런 수준에서 치료농도에 도달할 가능성을 갖도록 하기 위해서는 고용량이 투여되어야 한다. 그러나, 이러한 용량은 부작용을 일으키기 쉽다. 이는 ALS 환자에 주사된 재조합 CNTF를 이용한 임상 시도에서 설명된다. 동물에서 치료효과를 내는 것으로 나타난 주사용량은[참조문헌:Mitsumoto et al., 1994] 인간에서는 독성 역치 이상이었고[참조문헌:Miller et al., A placebo-controlled trial of recombinant human ciliary neurotrophic (rhCNTF) factor in amyotrophic lateral sclerosis, Annals Neurol., 39, 256-260, 1996], 기침, 무력증, 오심, 체중감소 및 심지어는 최고용량에서 증가된 사망율과 같은 부작용이 관찰된 반면에, CNTF 치료의 어떠한 유익한 효과도 검출해 낼 수 없었다[참조문헌:Miller et al., 1996].
따라서, 신경영양 인자의 임상적인 사용은 적당한 생체내 전달 양식의 개발을 요한다. 치료 유전자 전달은 목적 트랜스진의 생체내 연속 및/또는 표적화된 생산과 같이, 단백질의 직접 투여에 비해 잠재적인 장점을 제공한다.
유전자 요법
유전자 요법이 각종 질환의 관리 및 치료를 위한 효과적인 접근법으로서 급속히 대두되고 있다. 효과적인 유전자 요법의 실례는 문헌에서 일상적으로 나타나고 있다(예를 들면, Roth et al., Nature Medicine, Vol. 2, 985-991 (1996)].
벡터로서 변성 바이러스의 투여를 포함한 유전자 요법은 특히 신경퇴행성 질환의 치료를 위한 유망한 접근법을 구성한다. 유전자 요법에 현재 사용 중에 있는 바이러스로는 아데노바이러스[참조문헌:Le Gal La Salle et al., Science 259, 988-990], 허피스 바이러스, 아데노 수반 바이러스 및 레트로바이러스가 있다. 연구결과 이들 벡터, 및 특히 아데노바이러스는 중추신경계의 세포를 매우 높은 효율로 감염시킬 수 있는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 치료 유전자를 포함하는 재조합 아데노바이러스의 중추신경계 중으로의 직접 주사에 의한 중추신경계의 병리의 치료방법(특히 추촉성에 의한)의 개발을 가능하게 하였다(WO94/08026 참조, 이의 내용은 본원에서 참조로 인용).
척수와 관련된 신경퇴행성 질환 또는 외상의 경우, 유전자 요법은 신경영양 인자 또는 생장인자를 암호화하는 유전자와 같은 치료 유전자를 운동 뉴런에 전달함으로써 운동 뉴런의 변성을 퇴치하는 방법을 제공한다. 그러나, 선행방법은 유전자를 운동 뉴런 중으로 특이적으로 전달할 수 있는 간편한 방법의 부족으로 제한이 따른다. 본 발명은 이러한 문제점을 극복한다.
발명의 개요
본 발명은 유전자를 운동 뉴런 중으로 선택적으로 전달하기 위한 특별히 효율적인 방법에 대해 설명한다.
본 발명의 일면은 핵산을 핵산이 운동 뉴런으로 전달되는 근조직으로 투여하는 단계를 포함하는, 핵산을 포유류 운동 뉴런에 전달하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 일면은 핵산을 핵산이 운동 뉴런으로 전달되는 선택된 수질 기능 수준과 관련된 신경 결합 부위에 최근접한 근세포에 투여하는 단계를 포함하는, 핵산을 포유류 운동 뉴런에 전달하는 방법이다.
본 발명의 다른 일면은 단백질을 암호화하는 핵산을 핵산이 운동 뉴런으로 전달되어 발현되는 근조직에 투여하는 단계를 포함하는, 포유류 운동 뉴런에서의 단백질 제조방법이다. 바람직한 양태로서, 단백질은 신경근 연접부의 후-시냅스 말단에서 생성된다.
본 발명은 핵산을 핵산이 운동 축색 말단의 말초 또는 측부 스프라우팅을 유도하는 근조직에 투여하는 단계를 포함하는, 운동 축색 말단의 말초 또는 측부 스프라우팅 유도방법을 제공한다. 바람직한 양태로서, 핵산은 신경영양 인자 또는 생장인자와 같은 단백질을 암호화한다.
본 발명의 다른 일면은 핵산을 핵산이 운동 뉴런으로 전달되고 축색 변성에 대해 보호하는 포유류 근조직에 투여하는 단계를 포함하는, 축색 변성에 대한 보호방법이다.
본 발명의 또다른 일면은 신경활성 물질을 암호화하는 핵산을 핵산이 운동 뉴런으로 전달되는 포유류 근조직에 투여하는 단계를 포함하는, 신경계 손상의 치료방법이다. 바람직한 양태는 신경 손상 및 신경퇴행성 질환, 예를 들면, 근위축성 측색 경화증 및 유아의 척추성 근위축의 치료이다.
본 발명의 바람직한 일면은 뉴로트로핀-3을 암호화하는 유전자를 포함하는 복제 결손 아데노바이러스를 근위축성 측색 경화증을 앓고 있는 포유류의 근조직에 투여하는 단계를 포함하는, 근위축성 측색 경화증의 치료방법이다.
본 발명은 1997년 1월 17일자로 출원한 제08/785,074호의 부분 연속출원이다.
본 발명은 핵산을 근조직에 투여하는 단계를 포함하는, 핵산을 운동 뉴런에 전달하는 방법에 관한 것이다. 좀더 구체적으로 말하면, 본 발명은 치료 유전자의 근육내 투여에 의한 신경계의 병리치료 방법, 및 수질 운동 뉴런 중으로의 유전자 전달에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 유전자를 근육내 투여용으로 적합한 형태로 포함하는 조성물에 관한 것이다.
도 1: 아데노바이러스-β-갈락토시다제를 비복근에 근육내 주사한 후, 요추수준에서 래트 척수의 수직절편(50 ㎛)의 β-갈락토시다제 표지,
-다수의 운동 뉴런 세포체의 확산 표지 (△),
-세포체 및 신경돌기 수준에서의 소수 운동 뉴런의 더욱 강렬한 표지,
운동 뉴런의 전형적인 형태가 드러남 (▲).
도 2: A와 동일, 좀더 높은 배율. 아데노바이러스-β-갈락토시다제를 비복근에 근육내 주사한 후, 요추수준에서 래트 척수의 수직절편(50 ㎛)의 β-갈락토시다제 표지,
도 3: 아데노바이러스-β-갈락토시다제를 비복근에 근육내 주사한 후, 요추수준에서 래트 척수의 수직절편(50 ㎛)의 β-갈락토시다제-면역세포화학 동시-표지(캘시토닌 유전자 관련 펩티드(CGRP)),
도 4: AD-NT3 처리 pmn 마우스의 생존곡선.
도 5: 아데노바이러스 처리 pmn 동물에서 최대치를 넘는 좌골신경 자극 후 근육 활동전위의 진폭.
도 6: 아데노바이러스 주사 뒤의 면역반응. 사전 주사 및 비-사전 주사 마우스 근육내 β-갈락토시다제 활성.
도 7: 네이키드 DNA 주사의 평가.
패널 A: 네이키드 DNA와 아데노바이러스의 비교.
패널 B: 뱃치 제제의 영향.
패널 C: 신생아 마우스에서 CMV와 RSV 프로모터의 비교.
패널 D: 성체 마우스에서 CMV와 RSV 프로모터의 비교.
도 8: AdNT-3±AdCNTF 근육내 주사 후 pmn-마우스의 생존.
각 처리그룹에서 pmn-마우스의 생존은 조사된 동물의 백분율(100%)로 표현하였다. AdNT-3-처리 동물(굵은선; n = 16) 및 AdNT-3+AdCNTF 동시처리 동물(회색선; n = 11)의 생존은 비처리(실선; n = 14) 또는 AdLacZ 벡터 주사된 마우스(대쉬선; n = 12)과는 확연하게 상이하다(p＜0.005). 삼각형: 평균 생존시간.
도 9: AdNT-3±AdCNTF 처리 후 횡경막 신경내 미엘린화 섬유의 수.
25일째 되는 날에, 비처리 및 AdlacZ 주사 pmn 마우스의 횡경막 신경내 미엘린화 섬유의 수는 비처리 한배 새끼들(263, n = 4)에서 보다 훨씬 작았다(각각 122, n = 8 및 120, n = 6). 그러나, 처리된 pmn 마우스의 신경은 비처리 pmn 마우스보다 더 많은 미엘린화 섬유를 함유하였다(AdNT-3: 164, n =8, *, p＜0.05; AdNT-3+AdCNTF:192, n =8, ***, p＜0.001). 또한, 35일째 되는 날에, 미엘린화 섬유의 수는 비처리(118, n = 10) 또는 AdlacZ-주사 pmn 마우스(115, n=8)에서 보다는 AdNT-3+AdCNTF 처리에서 더 높았고(157, n =10, p＜0.01, **); 이러한 결과는 20%까지의 섬유손실의 감소에 상당한다. 이 시기에, AdNT-3만으로 처리한 pmn 마우스(130, n = 7)와 모든 대조군 동물(n = 18) 간의 차이는 경계선 유의성을 나타내었다(p = 0.054). 작은 막대는 SEM을 표시한다.
도 10: 생후 25일된 AdNT-3 ±AdCNTF 처리 pmn 마우스로부터 횡경막 신경의 전자현미경 사진.
A: 비처리 pmn 마우스; B: AdlacZ 처리 pmn 마우스; C: 정상의 한배 새끼; D: AdNT-3 처리 pmn 마우스; E: AdNT-3+AdCNTF 처리 pmn 마우스; F-G: 비처리(F) 및 AdNT-3+AdCNTF 처리 pmn 마우스(G)로부터의 신경의 고배율도. 비처리(A, B, F) pmn 마우스에 비해 처리 마우스(D, E, G)에서 미엘린화 축색의 증가된 수에 주목하라. 처리 마우스에서의 축색는 정상 마우스 및 또한 비처리 pmn 마우스에서 보다 작아지는 경향이 있고; 비처리 pmn 마우스에서의 신경 단면적은 종종 처리된 pmn 마우스에서 보다 좀더 컸으며, 이는 쉬반 세포의 증식과 Bungner 밴드(A, F) 형성을 반영한다.
도 11: 처리 및 비처리 pmn 마우스로부터의 근육내 말단 신경지배 패턴
아세틸콜린에스테라제-은 방법으로 염색한 생후 4주된 pmn 마우스 (e-f) 및 비처리 한배 새끼들(a, b)의 표면상의 둔근. a: 길이가 긴 말단 축색에 의해 공급된 다수의 종판을 보이는 종판대의 개략도. 근육 스핀들의 감각 신경지배 또한 가시적이다(좌측). b: 작은 신경 가지로부터 출현하고 5 개의 종판을 제공하는 5 개의 길이가 긴 축색 다발. 신경 가지에 가장 근접한 두 개의 종판의 축색만이 짧은 거리에 걸쳐 뒤따를 수 있다. c: 비처리 pmn 마우스. 종판대의 개략은 말단 축색 및 분리된 종판의 상실을 보여준다. 신경 가지는 두 개의 축색만으로 이루어지며 변성된 축색의 파편을 함유한다. d: 비처리 pmn 마우스. 말단 축색 다발은 근육의 비교적 잘 보존된 부분이다. 신경지배 패턴은 정상적인 마우스(b)에서의 것을 닮았으나, 축색는 불규칙한 형상을 띠고 말단 가지는 정세(精細)된다. e: AdNT3-처리 pmn 마우스. 신경 가지(좌측)로부터 출현하는 하나의 말단 축색는 두 연속적인 랑비에 결절에서 분지되고 각각 3 및 4-5 가지를 형성하며(화살표), 종판 그룹을 제공한다. f: AdNT3-+AdCNTF 처리 pmn 마우스. 3 개의 말단 축색는 반복적으로 분지되며 다수의 종판을 공급한다. 이들 축색 중 하나의 최종 랑비에 결절은 3 개의 종판을 공급하는 3 개의 짧은 가지를 생성하는데, 이 중 하나는 말단 스프라우트에 의해 4 개의 종판을 공급한다(화살표).
보정 막대: 100 ㎛ (a, e) 및 25 ㎛ (b, d-f).
본 발명은 유전자를 운동 뉴런 중으로 선택적으로 전달하기 위한 특히 효율적인 방법을 설명한다. 본 발명은 근육내 투여에 의해 유전자를 운동 뉴런 중으로 특이적으로 전달할 수 있음을 보여준다. 본 출원인은 본원에서, 아데노바이러스가 신경근 연접부(운동 종판) 수준에서 유리하게 흡수되고, 운동 뉴런 축색를 따라 역행성 수송에 의한 운동 뉴런(척수의 전각(前角))의 세포체까지 수송됨을 기술한다. 영양인자를 발현하는 재조합 아데노바이러스의 근육내 주사는 특별히 매력적인 투여방식을 제공한다. 근육내 주사 후, 아데노바이러스는 마이오튜브를 감염시키게 되고, 따라서 영양인자는 운동 뉴런의 시냅스 말단에서 생성되고 순환시 연속 방출되게 된다. 근육내 주사는 주사된 재조합 아데노바이러스의 역행성 수송을 초래하고, 따라서 구심성 운동 뉴런의 고수율 감염이 일어난다[참조문헌:Finiels et al., Specific and efficient gene transfer strategy offers new potentialities for the treatment of motor neurone diseases. Neuroreport, 7, 373-378, 1995]. 이러한 결과는 척수내에서의 트랜스진의 생성으로 이어진다.
치료 유전자의 근육내 투여는 역행성 수송에 의한 운동 뉴런의 신규하고 매우 특이적인 감염방법을 구성한다. 본 발명은 외상 및/또는 퇴행의 위치에 따라, 작용시키고자 하는 수질 단계를 정확히 표적화할 수 있게 해준다. 특히, 본 발명은 유리하게는, 신경근 연접부의 정확한 지도에 따른 상이한 수질 기능 단계의 운동 뉴런을 특이적이고 일방적으로 감염시킬 수 있게 해준다. 본 발명은 더욱 확산되고 운동 뉴런에 한정되지 않는 수질 이상발달 조직 중으로의 추촉성 주사보다 덜 외상성이고 더욱 특이적인 것으로 밝혀졌다.
정의
하기 정의된 용어가 본 발명 전반에 걸쳐서 사용되며, 본 발명의 범위와 실행을 이해하는 데 도움이 된다.
"폴리펩티드"란 공유결합된 아미노산 잔기로 구성된 중합체 화합물이다. 아미노산은 하기 화학식을 갖는다.
화학식
아미노산은 측쇄 R에 기초하여 7 가지 그룹으로 분류된다: (1) 지방족 측쇄, (2) 하이드록실산 (OH) 그룹을 함유하는 측쇄, (3) 황 원자를 함유하는 측쇄, (4) 산성 또는 아미드 그룹을 함유하는 측쇄, (5) 염기성 그룹을 함유하는 측쇄, (6) 방향족 환을 함유하는 측쇄, 및 (7) 측쇄가 아미노 그룹에 융합된 이미노산인 프롤린.
"단백질"은 생존 세포에 구조적 또는 기능적인 역할을 하는 폴리펩티드이다.
본 발명의 폴리펩티드 및 단백질은 글리코실화되거나 비글리코실화될 수 있다.
폴리펩티드 또는 단백질의 "변이체"는 폴리펩티드 또는 단백질로부터 유도되고 폴리펩티드 또는 단백질의 적어도 하나의 생물학적 성질을 보유하는 유사체, 단편, 유도체, 또는 돌연변이체이다. 폴리펩티드 또는 단백질의 각종 변이체가 존재할 수 있다. 이들 변이체는 단백질을 암호화하는 구조 유전자의 뉴클레오티드 서열 차이로 특징지워진 대립유전자 변이일 수 있거나, 차별적인 스플라이싱 또는 후 전사 변형을 수반할 수 있다. 당업자는 단일 또는 복수개의 아미노산 치환, 결실, 첨가, 또는 교체를 지닌 변이체를 생성할 수 있다. 이들 변이체는 특히; (a) 하나 이상의 아미노산 잔기가 보존 또는 비보존성 아미노산으로 치환되는 변이체, (b) 하나 이상의 아미노산이 폴리펩티드 또는 아미노산에 첨가되는 변이체, (c) 하나 이상의 아미노산이 치환체 그룹을 포함하는 변이체, 및 (d) 폴리펩티드 또는 단백질이 혈청 알부민과 같은 또다른 폴리펩티드와 융합되는 변이체를 포함할 수 있다. 이들 변이체를 얻는 기술, 예를 들어 유전학(억제, 결실, 돌연변이 등), 화학, 및 효소학적 기술이 당업자에게 공지되어 있다.
이러한 대립유전자 변이, 유사체, 단편, 유도체, 돌연변이체, 및 변형체, 예를 들어 교호 mRNA 스플라이싱 형태 및 교호 후 전사 변형 형태가 폴리펩티드의 생물학적 성질을 보유하는 폴리펩티드 유도체를 생성하는 경우, 이들은 본 발명의 범위내에 포함되는 것으로 간주된다.
"핵산"은 뉴클레오티드로 불리는 공유 결합된 아단위로 구성된 중합체 화합물이다. 핵산은 폴리리보핵산(RNA) 및 폴리데옥시리보핵산(DNA)을 포함하고, 둘 모두 일본쇄 또는 이본쇄일 수 있다. DNA는 cDNA, 게놈 DNA, 합성 DNA, 및 반합성 DNA를 포함한다. 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 센스 서열로 불린다.
"조절 영역"은 제 2 핵산 서열의 발현을 조절하는 핵산 서열을 의미한다. 조절 영역은 본래 특정 핵산(상동 영역)의 발현을 담당하는 서열을 포함하거나 상이한 기원(상이한 단백질 또는 심지어 합성 단백질의 발현을 담당하는)의 서열을 포함할 수 있다. 특히, 이러한 서열은 특이적 또는 비특이적 방법 및 유도성 또는 비유도성 방법으로 유전자의 전사를 촉진하거나 억제하는 진핵세포 또는 바이러스 유전자의 서열 또는 유도 서열일 수 있다. 조절 영역은 복제 기원, RNA 스플라이스 부위, 인핸서, 전사 종결 서열, 표적 세포의 분비 경로 중으로 폴리펩티드를 인도하는 시그널 서열, 및 프로모터를 포함한다.
"이종 공급원"의 조절 영역은 발현된 핵산과 본래 관련이 없는 조절 영역이다. 이종 조절 영역 중 상이한 종으로부터의 조절 영역, 상이한 유전자로부터의 조절 영역, 하이브리드 조절 서열, 및 자연에서는 생기지 않지만 당업자에 의해 고안되는 조절 서열이 포함된다.
"벡터"는 본 발명에 따른 핵산을 숙주 세포로 전달하는 수단이다. 용어 "벡터"는 시험관내, 생체외 또는 생체내에서 핵산을 세포 중으로 도입시키는 바이러스 및 비-바이러스 수단 모두를 포함한다. 비-바이러스 벡터는 플라스미드, 리포솜, 전기적으로 하전된 지질(사이토펙틴), DNA-단백질 복합체, 및 바이오단백질을 포함한다. 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 아데노 수반 바이러스, 폭스, 배큘로바이러스, 백시니아, 허피스 심플렉스, 엡스타인-바 및 아데노바이러스 벡터를 포함한다. 본 발명에 따른 핵산뿐만 아니라, 벡터는 하나 이상의 조절 영역, 및/또는 핵산 전달 결과를 선택, 측정, 및 모니터링하는데 유용한 선별 마커를 포함할 수 있다(조직으로의 전달, 발현 기간 등).
"약학적으로 허용가능한 담체"는 투여방법에 있어 약학적으로 허용가능하고, 멸균되며, 적당한 분산제 또는 습윤제 및 현탁제를 이용하여 제형된 수성 또는 유성 현탁물일 수 있는 희석제 및 충진제를 포함한다. 특정 약학적으로 허용가능한 담체 및 활성 화합물:담체의 비는 조성물의 용해도 및 화학적 성질, 특정 투여양식, 및 표준 약제 실시에 의해 결정된다.
"운동 뉴런"은 수의근의 움직임을 관장하는 뉴런이다.
일반 분자 생물학
재조합 DNA 기술은 당업자에게 공지되어있다. 재조합 분자의 클로닝 및 발현의 일반적인 방법은 본원에서 참조문헌으로 인용되는 문헌[참조: Maniatis (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratories, 1982), and Ausubel (Current Protocols in Molecular Biology, Wiley and Sons, 1987)]에 기재되어있다.
핵산
본 발명은 근육내 투여가 핵산 서열을 운동 뉴런에 전달하는 수단을 제공하는 발견에 관한 것이다. 본 발명의 핵산은 바람직하게는 신경활성 물질을 암호화하고; 이 물질은 신경 세포에 유익한 효과를 부여할 수 있다. 이는 과량의 내인성 물질의 결여 또는 감소를 보상할 수 있는 물질일 수 있다. 다르게는, 이는 세포에 새로운 성질을 부여하는 물질일 수 있다.
신경활성 물질은 안티센스 서열 또는 단백질일 수 있다. 본 발명의 실시에 적당한 단백질 중에는 생장인자, 신경영양 인자, 사이토킨, 신경전달물질 합성 효소, 효소, 신경전달물질 수용체 및 호르몬 수용체가 있다.
바람직하게는, 생장인자는 콜로니 촉진 인자(G-CSF, GM-CSF, M-CSF, CSF 등), 섬유아세포 생장인자(FGFa, FGFb) 또는 맥관 세포 생장인자(VEGF)이다. 신경영양 인자 중, 바람직한 인자는 모양체 신경영양 인자(CNTF), 교 세포 성숙 인자(GMFa, b), GDNF, BDNF, NT-3, NT-5 등이다.
신경영양 인자 NT-3가 특히 바람직하다. NT-3를 암호화하는 완전한 뉴클레오티드 서열은 WO91/03569에 기재되어 있고, 이의 본문 내용은 본원에서 참조문헌으로 인용된다.
바람직한 사이토킨은 인터루킨 및 인터페론이다. 본 발명의 범위내에 포함되는 효소는 신경전달물질의 생합성을 위한 효소(티로신 하이드록실라제, 아세틸콜린 트랜스퍼라제, 글루탐산 데카복실라제) 및 리소솜 효소(헥소사미니다제, 아릴술파타제, 글루코세레브로시다제, HGPRT)이다. 유리 라디칼의 독소제거와 관련된 효소(수퍼옥사이드 디스뮤타제 I, II 또는 III, 캐털라제, 글루타치온 퍼옥시다제)가 바람직하다. 수용체는 안드로겐 수용체(Kennedy 병과 관련됨)를 포함한다.
이들 단백질은 본래 형태 또는 이의 변이체 또는 단편 형태로 이용될 수 있다.
신경활성 물질도 안티센스 서열일 수 있다. 안티센스 핵산을 이용하는 유전자 발현의 다운 조절은 해독 또는 전사 수준에서 달성될 수 있다. 본 발명의 안티센스 핵산은 바람직하게는 내인성 신경활성 물질을 암호화하는 핵산 또는 상응하는 메신저 RNA와 특별하게 하이브리드화할 수 있는 핵산 단편이다. 이들 안티센스 핵산은 이들의 안정성 및 선택성을 개선시키기 위해 임의로 변형된 합성 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 이들은 또한 세포에서의 발현이 내인성 신경활성 물질을 암호화하는 mRNA 전부 또는 일부와 상보적인 RNA를 생성하는 DNA 서열일 수 있다. 안티센스 핵산은 EP 140308에 기재되어있듯이, 반대 방향으로, 내인성 신경활성 물질을 암호화하는 핵산의 전부 또는 일부를 발현시켜 제조될 수 있다. 안티센스 서열의 길이는 내인성 신경활성 물질의 발현을 다운-조절하거나 차단할 수 있는 한 본 발명의 실시에 적당하다. 바람직하게는, 안티센스 서열은 길이가 최소 20 뉴클레오티드이다. 안티센스 핵산의 제조 및 사용, 안티센스 RNA를 암호화하는 DNA 및 올리고 및 유전자 안티센스의 사용이 WO92/15680에 기재되어있고, 이의 본문 내용은 본원에서 참조문헌으로 인용된다.
핵산은 천연 또는 인공 기원일 수 있다. 이는 본질적으로 게놈 DNA(gDNA), 상보 DNA(cDNA), 하이브리드 서열 또는 합성 또는 반합성 서열일 수 있다. 이는 인간, 동물, 식물, 박테리아 또는 바이러스 기원 등일 수 있다. 이는 당업자에게 공지된 기술, 특히 라이브러리 스크리닝, 화학 합성, 또는 다르게는 라이브러리 스크리닝에서 얻어진 서열의 화학 또는 효소학적 변형을 포함하는 혼합법에 의해 얻어질 수 있다. 이는 바람직하게는 cDNA 또는 gDNA이다.
조절 영역
일반적으로, 본 발명의 핵산은 하나 이상의 조절 영역에 연결된다. 적절한 조절 영역 또는 영역들의 선택은 일상적인 문제로서, 당업자의 수준내에 있다.
조절 영역은 운동 뉴런에서 기능성 전사를 위한 프로모터 영역, 및 전사 종결 및 폴리아데닐화 부위를 위한 시그널을 규정하는, 해당 유전자의 3'에 위치된 영역을 포함할 수 있다. 모든 이들 요소는 발현 카세트를 구성한다.
본 발명에 사용될 수 있는 프로모터는 구성 프로모터 및 조절 (유도성) 프로모터 모두를 포함한다. 프로모터는 본래 핵산의 발현을 담당할 수 있다. 이는 또한 이종일 수 있다. 특히, 이는 진핵세포 또는 바이러스 유전자의 프로모터 서열일 수 있다. 예를 들면, 이는 감염될 세포의 게놈에서 유도된 프로모터 서열일 수 있다. 또한, 이는 사용된 아데노바이러스를 포함한 바이러스 게놈에서 유도된 프로모터 서열일 수 있다. 이러한 관점에서, 예를 들면, E1A, MLP, CMV 및 RSV 유전자 등의 프로모터가 언급될 수 있다.
추가로, 프로모터는 활성 또는 조절 서열 또는 조직 특이성 또는 주된 발현을 허락하는 서열의 첨가에 의해 변형될 수 있다(에놀라제 및 GFAP 프로모터 등). 또한, 핵산이 프로모터 서열을 함유하지 않을 경우, 이는 이러한 서열 하부에 바이러스 게놈 중에 삽입될 수 있다.
본 발명의 실시에 유용한 몇몇 프로모터는 편재 프로모터(예, HPRT, 비멘틴, 액틴, 튜불린), 중간 필라멘트 프로모터(예, 데스민, 신경섬유, 케라틴, GFAP), 치료 유전자 프로모터(예, MDR타입, CFTR, 인자 VIII), 조직 특이성 프로모터(예, 평활근 세포내의 액틴 프로모터), 분할 세포에서 선호적으로 활성화되는 프로모터, 자극에 반응하는 프로모터(예, 스테로이드 호르몬 수용체, 레티논산 수용체), 테트라사이클린-조절된 전사 조정제, 사이토메갈로바이러스 즉시-초기, 레트로바이러스 LTR, 메탈로티오네인, SV-40, E1a 및 MLP 프로모터이다. 테트라사이클린-조절된 전사 조정제 및 CMV 프로모터는 WO 96/01313, US 5,168,062 및 5,385,839에 기재되어 있고, 이의 내용은 본원에서 참조문헌으로 인용된다.
벡터
앞서 논의했듯이, "벡터"는 본 발명에 따른 핵산을 숙주 세포로 전달하는 수단이다. 바람직한 벡터는 바이러스 벡터, 예를 들면 레트로바이러스, 허피스 바이러스, 아데노바이러스 및 아데노 수반 바이러스이다.
바람직하게는, 바이러스 벡터는 복제 결손으로, 즉, 이들은 표적 세포에서 자가 복제할 수 없다. 일반적으로, 본 발명의 범위내에 사용되는 복제 결손 바이러스 벡터의 게놈은 감염 세포에서 바이러스의 복제에 필요한 최소 하나의 영역이 결여되어있다. 이들 영역은 당업자에게 공지된 기술에 의해 제거되거나(전부 또는 일부), 비기능적으로 만들어질 수 있다. 이들 기술은 필수(복제를 위한) 영역에 하나 이상의 염기의 완전 제거, 치환(기타 서열에 의해, 특히 삽입된 핵산에 의해), 부분 결실 또는 첨가를 포함한다. 이러한 기술은 시험관내(분리된 DNA상에서) 또는 제자리에서, 유전자 조작 기술을 이용하거나 돌연변이제의 처리에 의해 수행될 수 있다.
바람직하게는, 복제 결손 바이러스는 바이러스 입자를 캡시드화하는데 필요한 게놈 서열을 보유한다.
레트로바이러스는 분할 세포를 감염시키는 통합성 바이러스이다. 레트로바이러스 게놈은 두개의 LTR, 캡시드화 서열 및 세가지 암호화 영역(gag, pol 및 env)을 포함한다. 재조합 레트로바이러스 벡터의 작제에 관해 기재되어있다: 참조, 특히, EP 453242, EP178220, Bernstein 등 Genet.Eng.7 (1985) 235; McCormick, BioTechnology 3 (1985) 689 등 참조. 재조합 레트로바이러스 벡터에서, gag, pol 및 env 유전자는 일반적으로 전체 또는 부분적으로 결실되어, 관련 이종 핵산 서열로 대체된다. 이들 벡터는 상이한 타입의 레트로바이러스, 예를 들면, HIV, MoMuLV("쥐 몰로니 백혈병 바이러스"), MSV("쥐 몰로니 육종 바이러스"), HaSV("하비 육종 바이러스"); SNV("비장 괴사 바이러스"); RSV("라우스 육종 바이러스") 및 프렌드 바이러스로부터 작제될 수 있다. 결손 레트로바이러스 벡터에 관해서는 WO95/02697에 기재되어있다.
일반적으로, 핵산 서열을 함유하는 재조합 레트로바이러스를 작제하기 위해, LTR, 캡시드화 서열 및 암호화 서열을 함유하는 플라스미드가 작제된다. 이 작제물은 패키징 세포주를 형질감염하는데 사용되고, 이 세포주는 플라스미드에서 결여된 레트로바이러스 기능을 트랜스로 제공할 수 있다. 일반적으로, 패키징 세포주는 gag, pol 및 env 유전자를 발현할 수 있다. 이러한 패키징 세포주, 특히 세포주 PA317(US4,861,719); PsiCRIP 세포주(WO90/02806) 및 GP+envAm-12 세포주(WO89/07150)는 선행 분야에 기재되어있다. 추가로, 재조합 레트로바이러스 벡터는 전사 활성을 억제하는 LTR내의 변형체 및 gag 유전자의 일부를 포함할 수 있는 확장성 캡시드화 서열을 함유할 수 있다[참조문헌: Bender et al., J. Virol. 61 (1987) 1639]. 재조합 레트로바이러스 벡터는 당업자에게 공지된 표준 기술에 의해 정제된다.
아데노 수반 바이러스(AAV)는 안정하고 부위 특이적인 방법으로, 감염되는 세포의 게놈 중으로 통합될 수 있는 비교적 작은 크기의 DNA 바이러스이다. 이들은 세포 생장, 형태 또는 분화에 영향을 미침이 없이 광범위한 세포를 감염시킬 수 있고, 이들은 인간 병리와는 관련된 것으로 보이지 않는다. AAV 게놈은 클로닝, 서열 분석 및 특징규명되었다. 이는 대략 4700 염기를 포함하고 바이러스의 복제 기원으로 작용하는, 각 말단에 대략 145 염기의 역 종결 반복(LTR) 영역을 함유한다. 게놈의 나머지는 캡시드화 기능을 운반하는 두개의 필수 영역으로 나뉜다: 바이러스 복제 및 바이러스 유전자의 발현과 관련된 rep 유전자를 함유하는 게놈의 좌측부; 및 바이러스의 캡시드 단백질을 암호화하는 cap 유전자를 함유하는 게놈의 우측부.
시험관내 및 생체내에서의 유전자 전달을 위한 AAV에서 유도된 벡터의 사용에 관해 기재되어있다(WO 91/18088; WO 93/09239; US 4,797,368, US 5,139,941, EP 488 528 참조). 이들 공보는 rep 및/또는 cap 유전자가 결실되고 관련 유전자에 의해 치환되는 다양한 AAV-유도 작제물, 및 시험관내(배양 세포 중) 또는 생체내(직접 유기체 중으로)에서 관련 유전자를 전달하는 이들 작제물의 사용에 관해 기재하고 있다. 본 발명에 따른 복제 결손 재조합 AAV는 두개의 AAV 역 종결 반복(ITR) 영역에 의해 플랭킹된 관련 핵산 서열을 함유하는 플라스미드, 및 AAV 캡시드화 유전자(rep 및 cap 유전자)를 운반하는 플라스미드를, 인간 허피스 바이러스(예를 들면 아데노바이러스)로 감염된 세포주 중으로 공형질감염시켜 제조될 수 있다. 생성된 AAV 재조합체는 표준 기술에 의해 정제된다.
따라서, 본 발명은 또한 게놈이 AAV ITR에 의해 플랭킹된 신경활성 물질을 암호화하는 핵산을 암호화하는 서열을 포함하는 AAV-유도 재조합 바이러스에 관한 것이다. 본 발명은 또한 AAV로부터 두개의 ITR에 의해 플랭킹된 신경활성 물질을 암호화하는 핵산을 암호화하는 서열을 포함하는 플라스미드에 관한 것이다. 이러한 플라스미드는 그 자체로 핵산 서열을 전달하기 위해 사용될 수 있고, 경우에 따라서는, 플라스미드가 리포솜 벡터(슈도-바이러스) 중으로 혼입된다.
바람직한 양태에서, 벡터는 아데노바이러스 벡터이다.
아데노바이러스는 본 발명의 핵산을 각종 세포 타입에 효율적으로 전달하도록 변형될 수 있는 진핵 DNA 바이러스이다.
다양한 혈청타입의 아데노바이러스가 존재한다. 이들 혈청타입 중, 본 발명의 범위내에서, 타입 2 또는 타입 5 인간 아데노바이러스(Ad 2 또는 Ad 5) 또는 동물 기원의 아데노바이러스(WO94/26914 참조)의 이용이 선호된다. 본 발명의 범위내에 사용될 수 있는 동물 기원의 아데노바이러스는 개, 소, 쥐(예: Mav1, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), 양, 돼지, 새, 및 원숭이(예: SAV) 기원의 아데노바이러스를 포함한다. 바람직하게는, 동물 기원의 아데노바이러스는 개 아데노바이러스, 좀더 바람직하게는 CAV2 아데노바이러스이다(예, Manhattan 또는 A26/61주 (ATCC VR-800)).
바람직하게는, 본 발명의 복제 결손 아데노바이러스 벡터는 ITR, 캡시드화 서열 및 관련 핵산을 포함한다. 좀더 바람직하게는, 아데노바이러스 벡터의 적어도 E1 영역은 비기능적이다. E1 영역에서 결실은 바람직하게는 Ad5 아데노바이러스에서 뉴클레오티드 455에서 3329(PvuII-BglII 단편) 또는 382에서 3446(HinfII-Sau3A 단편)에 걸쳐있다. 기타 영역, 특히 E3 영역(WO95/02697), E2 영역(WO94/28938), E4 영역(WO94/28152, WO94/12649 및 WO95/02697), 또는 후기 유전자 L1-L5도 또한 변형될 수 있다.
바람직한 양태에서, 아데노바이러스 벡터는 E1 영역(Ad 1.0)에 결실을 가진다. E1-결실된 아데노바이러스의 예는 EP 185,573에 기재되어있고, 이의 본문 내용은 본원에서 참조문헌으로 인용된다. 또다른 바람직한 양태에서, 아데노바이러스 벡터는 E1 및 E4 영역(Ad 3.0)에 결실을 가진다. E1/E4-결실된 아데노바이러스의 예는 WO95/02697 및 WO96/22378에 기재되어있고, 이의 본문 내용은 본원에서 참조문헌으로 인용된다. 또다른 바람직한 양태에서, 아데노바이러스 벡터는 E4 영역 및 핵산 서열이 삽입되는 E1 영역에 결실을 가진다(FR94 13355 참조, 이의 본문 내용은 본원에서 참조문헌으로 인용됨).
본 발명에 따른 복제 결손 재조합 아데노바이러스는 당해 분야의 숙련인에게 공지된 기술에 의해 제조될 수 있다[참조문헌: Levrero et al., Gene 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917]. 특히, 이들은 특히 해당 DNA 서열을 운반하는 아데노바이러스와 플라스미드간의 상동 재조합에 의해 재조될 수 있다. 상동 재조합은 아데노바이러스 및 플라스미드를 적절한 세포주 중으로 공형질감염킨 후에 시행된다. 사용되는 세포주는 바람직하게는 (i) 상기 요소에 의해 형질전환 가능하고, (ii) 바람직하게는 재조합의 위험을 피하기 위해 통합된 형태로, 복제 결손 아데노바이러스의 게놈 일부를 상보할 수 있는 서열을 함유해야 한다. 사용 가능한 세포주의 예로는 게놈 중에 통합된 Ad5 아데노바이러스의 게놈의 좌측부(12%)를 함유하는 인간 배 신장 세포주 293(Graham et al., J.Gen.Virol.36 (1977) 59), 및 출원 WO94/26914 및 WO95/02697에 기재된 바와 같이, E1 및 E4 기능을 상보할 수 있는 세포주가 있다. 재조합 아데노바이러스는 당업자에게 익히 공지된 표준 분자 생물학 기술을 이용하여 회수 및 정제된다.
약학적 투여
본 발명에 따른 공정은 각 수질 기능 단계의 운동 뉴런을 정확하게 표적화할 수 있다. 따라서, 치료될 손상 부위에 따라, 이러한 부위와의 신경 결합을 운반하는 근육에 투여된다. 본 발명에 따르면, 각종 주사의 현명한 선택에 의해, 다양한 수준으로 분포된 다수의 수질 운동 뉴런을 특이적이고 일방향으로 감염시킬 수 있다.
바람직한 양태에서, 상지근(이두근, 삼두근)으로의 투여는 경부 수준에서 운동 뉴런 중으로 유전자를 전달할 수 있거나; 흉부근(흉근)으로의 투여는 흉부 수준에서 유전자를 운동 뉴런으로 전달할 수 있거나; 하지근(비복근)으로의 투여는 요추 및 천골 수준에서 유전자를 운동 뉴런 중으로 전달할 수 있다.
기타 근육도 물론 이들 운동 뉴런 중으로 투여하는데 사용될 수 있고, 기타 운동 뉴런도 표적화될 수 있다. 이를 위해서는, 표적화된 수질 단계에 따라, 투여를 위한 최상의 적절한 근육(들)을 결정하는데 신경근 연접부의 정확한 지도를 사용할 수 있다. 이러한 지도는 당업자에게 입수 가능하다[참조문헌: Nicholopoulos et al., J. Comp.Neurol. 217, 78-85; Peyronnard et Charon, Exp.Brain Res. 50, 125-132]. 감염의 편리성을 입증할 수질 단계에 따라, 해당 단계에 의해 신경지배되는 것으로 알려진 하나 이상의 근육이 선택될 수 있다.
근육내 투여는 각종 방법에 의해 수행될 수 있다. 제 1 양태에 따르면, 이는 상당수의 운동 종판에 영향을 미치기 위해 동일한 근육의 몇몇 지점에서의 주사에 의하여 수행된다. 이 양태는 고려된 근육 중으로 신경 삽입 지점이 확인되지 않는 경우에 특히 효율적이다. 신경 삽입 지점이 위치선정될 수 있는 경우, 유리하게는 상기 지점 또는 근처에서의 1회 이상의 주사에 의해 투여된다. 이 양태에 따르면, 전달 효율은 투여된 벡터의 많은 분량이 신경근 연접부 수준에서 흡수되기 때문에 보다 크다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 근육내 투여는 동일 근육의 몇몇 지점에서의 주사에 의하여 수행된다.
본 발명의 또다른 바람직한 양태에서, 근육내 투여는 신경의 삽입 지점 또는 근처에서의 주사(들)에 의하여 수행된다.
본 발명의 바람직한 주제는 게놈 중에 핵산을 혼입하는 아데노바이러스 벡터의 근육 투여를 포함하는 운동 뉴런 중으로의 핵산 전달 방법이다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 방법은 동일한 근육의 몇몇 지점에서의 주사(들)에 의하거나, 신경 삽입 지점이 위치선정될 수 있을 경우, 상기 지점 또는 근처 수준에서의 1회 이상의 주사에 의해 수행된다.
약학 조성물
본 발명에 따른 사용을 위해, 벡터 또는 네이키드 DNA 형태의 핵산은 바람직하게는 주사 제형을 위해 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체와 배합된다. 이들은 특히 등장액, 멸균액, 식염수 용액(모노나트륨 또는 디나트륨 포스페이트, 나트륨, 칼륨, 칼슘 또는 마그네슘 클로라이드 등 또는 이러한 염의 혼합물), 또는 경우에 따라서, 멸균수 또는 생리 식염의 첨가로 주사액을 구성하는 건조, 특히 동결-건조된 조성물일 수 있다.
바람직한 멸균 주사제는 무독성 비경구적으로 허용가능한 용매 또는 희석제 중의 용액 또는 현탁액일 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체의 예로는 식염수, 완충 식염수, 등장 식염수(예, 모노나트륨 또는 디나트륨 포스페이트, 나트륨, 칼륨, 칼슘 또는 마그네슘 클로라이드, 또는 이러한 염의 혼합물), 링거 용액, 덱스트로스, 물, 멸균수, 글리세롤, 에탄올, 및 이들의 배합물이 있다. 1,3-부탄디올 및 멸균 고정유가 용매 또는 현탁 매질로 편리하게 이용된다. 합성 모노- 또는 디-글리세라이드를 포함하는 블랜드 고정유가 이용될 수 있다. 올레산과 같은 지방산도 주사제에 이용된다.
투여에 사용되는 바이러스 용량은 다양한 파라미터의 함수, 특히 고려된 투여 부위(근육), 주사 횟수, 발현될 유전자 또는 다르게는 원하는 치료 기간의 함수로서 조절될 수 있다. 일반적으로, 본 발명에 따른 재조합 아데노바이러스는 104내지 1014pfu, 바람직하게는 106내지 1011pfu의 분량 형태로 제형 및 투여된다. 용어 pfu(플라크 형성 단위)는 바이러스 용액의 감염력에 상응하고, 적절한 세포 배양물을 감염시켜 일반적으로 15일 후, 감염된 세포의 플라크 수를 측정하여 결정된다. 바이러스 용액의 pfu 역가 측정 기술은 문헌에 상세히 기록되어있다.
바람직한 양태에서, 조성물은 약 1 x 109pfu/100 ㎕의 농도로 NT-3 유전자(AdNT-3)을 포함하는 아데노바이러스를 포함한다.
핵산도 또한 네이키드 DNA 형태로 투여될 수 있다. 네이키드 DNA의 제형방법 및 이를 포유류 근조직으로의 투여방법은 US 특허 5,580,859 및 5,589,466에 기재되어있고, 이의 내용은 본원에서 참조문헌으로 인용된다.
본 발명에 따른 조성물은 앞서 기술된 바와 같이 운동 뉴런으로의 투여에 특히 유용하다.
운동 뉴런 손상의 치료
본 발명에 따른 공정은 수질 외상 또는 운동 뉴런 퇴행성 질환의 치료에 특히 유리하다. 수질 외상은 좀더 구체적으로는 좀더 높은 중심으로부터 생기는 구심성이 박탈되어 변성을 야기하는 운동 뉴런 수준에서 절개에 상응한다. 예를 들어, 본 발명에 따른 역행성 수송에 의해 아병변 운동 뉴런 중으로 생장인자를 암호화하는 유전자의 전달은 이러한 변성을 감소시키거나 막는 가능성을 제공한다.
운동 뉴런의 신경병은 근위축성 측색 경화증, 척추성 근위측 타입 I(Werdnig Hoffman병), 타입 II 또는 III(Kugelberg-Welander병), 연수 척추성 근위축(예: Kennedy병)을 포함한다. 생장인자 또는 본 발명에 따른 변성을 겪는 운동 뉴런에 향신경 효과를 제공하는 것으로 알려진 기타 분자를 암호화하는 유전자의 전달도 또한 이러한 타입의 병리 치료를 위한 새로운 경로를 제공한다.
본 발명 공정의 효능은 동물 모델, 예를 들면 척수의 부분 또는 완전 절개 모델(Wobbler 마우스-근위축성 측색 경화증 연구를 위한 동물 모델(Leestma J.E., Am.J.Pathol., 100, 821-824)); mnd 마우스(운동 뉴런 변성: 아미오트로픽 측면 경화증 연구를 위한 동물 모델(Messer et al., 1992, Genomics. 18, 797-802)); pmn 마우스(진행성 운동 뉴런 신경병: 발생동안 운동 뉴런 변성 연구를 위한 동물 모델), 및 SOD* 마우스에서 입증될 수 있고: 트랜스제닉 마우스는 실시예에서 설명하듯이, 아미오트로픽 측면 경화증의 가족성 형태를 담당하는 Cu/Zn SOD의 돌연변이 형태를 발현시킨다. 인간에 대한 혼입, 내성 및 안전성은 인간 배 수질 뉴런의 배양의 시험관내 모델에서 시험될 수 있다.
본 발명은 설명적이면서 비제한적인 것으로 간주되어야 하는 하기 실시예에 의해 좀더 상세히 기술될 것이다. 실시예 1은 마커 유전자를 포함하는 복제 결손 아데노바이러스를 이용하여 근육내 주사에 이어 운동 뉴런내에서 감염 및 역행성 수송을 입증한다. 실시예 1은 추가로 숙주 면역 시스템 및 염증 반응에 대한 아데노바이러스 벡터의 효과를 입증한다. 실시예 2는 근위축성 측색 경화증의 두 동물 모델에서 AdNT-3의 효능을 입증한다. 실시예 3은 근조직으로 네이키드 DNA의 투여에 이은 마커 유전자의 발현을 입증한다.
실시예 1. 온전한 래트 또는 척수의 흉부 반절개된 래트에서 비복근 중으로 아데노바이러스-β-갈락토시다제의 주사
본 실시예는 비복근 중으로 유전자를 혼입하는 아데노바이러스의 투여에 의해 요추 운동 뉴런 수준에서 β-gal 유전자의 전달에 관해 기술하고 있다.
좀더 특히는, 본 연구는 하지 중 하나 또는 둘 모두에서 동물을 마비시키는 효과를 지닌 저 흉부 수준에서 수행된 래트 척수의 부분 또는 완전 절개 모델에서 수행된다. 이러한 절개는 운동 뉴런에서 상부 중심에서 발생하는 구심성을 박탈하고 변성을 유도한다. 역행성 수송에 의해 아병변 운동 뉴런을 감염시키기 위해 투여한다.
본 실시예에 사용된 아데노바이러스 벡터는 Ad.RSV.βgal 벡터이다. 이 벡터는 복제에 필요한 서열이 결여되어 있지만, 상기 벡터에 의해 감염될 수 있는 세포 중으로 침투하는데 필요한 서열 및 이 아데노바이러스의 캡시드화에 필요한 모든 필수 서열을 포함한다. 이는 또한 RSV 프로모터의 통제하에 있는 이.콜라이 β-갈락토시다제 유전자를 운반한다. 결손 재조합 아데노바이러스 Ad.RSVβgal의 작제에 관해서는 문헌[참조: Stratford-Perricaudet et al., J.Clin.Invest.90 (1992) 626]에 기재되어있다. 간단히 말해, 아데노바이러스 Ad.RSVβgal은 돌연변이체 아데노바이러스 Ad-d1324(Thimmappaya et al., Cell 31 (1982) 543)와 플라스미드 pAd.RSVβgal(Akli et al., 1993)간의 생체내 상동 재조합에 의해 얻어진 결손 재조합 아데노바이러스(E1 및 E3 영역이 결실됨)이다.
플라스미드 pAd.RSVβgal은 5'에서 3' 방향으로,
- ITR 서열, 복제 기원, 캡시드화 시그널 및 인핸서 E1A를 포함하는 Ad5 아데노바이러스의 좌측 말단에 상응하는 PvuII 단편;
- RSV 프로모터(라우스 육종 바이러스)의 통제하에 β-갈락토시다제를 암호화하는 유전자,
- 플라스미드 pAd.RSVβgal 및 아데노바이러스 d1324간에 상동 재조합을 허용하는 Ad5 아데노바이러스 게놈의 제 2 단편을 함유한다.
ClaI 효소를 이용한 선형화 후, 플라스미드 pAd.RSVβgal 및 아데노바이러스 d1324는 상동 재조합을 위해 칼슘 포스페이트의 존재하에 세포주 293 중으로 공형질감염시킨다. 이렇게 생성된 재조합 아데노바이러스는 플라크 정제에 의해 선별된다. 분리 후, 재조합 아데노바이러스 DNA는 세포주 293에서 증폭되고, 이는 약 1010pfu/㎖의 역가를 지닌 비정제된 재조합 결손 아데노바이러스를 함유하는 배양 상등액을 야기한다. 바이러스 입자는 공지 기술(특히: Graham et al., Virology 52 (1973) 456 참조)에 따라 세슘 클로라이드 구배상에서 원심분리하여 정제된다. 아데노바이러스는 포스페이트 완충 식염수(PBS)에서 정제된 형태로 사용된다.
비복근중으로 아데노바이러스 Ad-RSV-β-gal(107pfu/주사)를 3회 주사한 후, 곧바로 동물은 척수가 반절개된다(또는 다르게)(저 흉부 수준, 이는 하지 중 하나에서 동물을 마비시키는 효과를 가짐). Hamilton 시린지를 이용하여 주사 지점당 9 ㎕의 아데노바이러스를 주사한다.
근육에서 척수까지 일어나는 역행성 수송을 위한 최소 시간인, 주사 후 4일째에 동물을 죽인다(4% 파라포름알데히드 관류). 척수의 세 블록을 경추, 흉부 및 요추 수준에서, 50 ㎛의 두께로 세로로 절개한다. 바이러스에 감염된 세포를 확인할 수 있는 β-갈락토시다제를 관찰하도록 절편을 처리한다. 몇몇 절편을 추가로 특이하게 운동 뉴런을 표지할 수 있는 항-캘시토닌 유전자 관련 펩티드(CGRP) 면역세포화학 분석한다.
β-갈락토시다제는 기질, X-gal을 이용하여 관찰되며, 반응 산물은 청색을 나타낸다.
캘시토닌 유전자 관련 펩티드 CGRP는 운동 뉴런의 특정 마커인 신경 전달 물질이다. 이는 퍼옥시다제 및 효소 기질로 디아미노벤지딘에 커플링된 2차 항체를 이용한 면역세포화학 분석에 의해 관찰되고; 반응 산물은 밤색을 나타낸다.
β-갈락토시다제의 발견은 오로지 반절개된 래트의 경우 아병변 요추 수준, 및 주사에 상응하는 측면에서, 감염된 운동 뉴런의 존재를 확인할 수 있다.
두가지 타입의 표지, 즉 다수의 운동 뉴런의 세포체의 확산 표지, 및 세포체 및 좀더 제한된 수의 운동 뉴런의 신경 돌기의 좀더 강한 표지가 얻어진다(사진 A 및 B). 표지 강도의 차이점은 아마도 주사 부위에 매우 가까운 단지 몇 운동 뉴런이 바이러스를 강하게 흡수할 수 있다는 사실로 인한 것이다.
β-갈락토시다제 관찰과 연관된 항-CGRP 면역세포화학 분석은 실제로 모든 CGRP-양성 세포체(즉, 운동 뉴런)이 바이러스에 의해 감염됨을 입증할 수 있다(사진 C).
아데노바이러스의 근육내 주사 후 면역/염증 반응에 미치는 효과:
면역성:
역학조사는 30세 이상의 인구 중 60% 정도가 아데노바이러스 타입 5에 대해 항체를 가질 수 있음을 암시한다[참조문헌: Matsuse et al., Immunohistochemical and in situ hybridisation detection of adenovirus early region 1A (E 1A) gene in the microglia of human brain tissue.J.Clin.Pathol., 47, 275-277, 1994]. 인간에서 이러한 예비면역성의 존재는 재조합 아데노바이러스의 주사 효율을 제한할 수 있다. 이러한 가능성을 시험하기 위해, 낮은 분량의 결손 Ad-RSVβgal(106pfu)를 마우스에 피하 예비주사하여 동물을 미리 면역시킨다. 예비면역 주사 후 3 주째에, Ad-RSVβgal (2.5 108pfu)를 근육내 투여한다. 근육내 주사 후 일주일째에, 근육내 βgal 발현을 원래 동물 및 예비주사된 동물과 비교한다. 트랜스진에 대한 면역 반응을 피하기 위해, βgal에 내성인 트랜스제닉 동물을 이용하여 실험한다. Ad 1.0 또는 3.0(dl1007) 벡터를 이용하여 실험을 행한다. 광도계 분석에 의해 근육내 βgal 발현을 정량한다. 예비주사되지 않은 동물과 비교하여 예비주사된 동물에서 관찰된 효소 활성의 퍼센티지는 도 6에 도시되어있다.
결론
본 자료는 예비주사가 단지 적절한 형태로 근육내 아데노바이러스 유전자 전달의 효율에 영향을 미침을 암시한다. 근육내 주사 후 3주째에, 예비주사된 동물에서 트랜스진의 발현 수준은 예비주사되지 않은 동물에서 관찰된 것의 90%이다.
염증 반응:
Ad 1.0 및 Ad 3.0에 의해 생성된 염증을 비교하기 위해서, 마우스 비복근을 β-갈락토시다제를 암호화하는 Ad 1.0 E3+ 또는 Ad 3.0 (dll014) 109tdu로 주사한다. 트랜스진에 대한 염증 반응을 피하기 위해서 βgal에 내성이 있는 트랜스진 동물을 사용하여 주사를 수행한다. 주사하고 2 일 내지 7 일 후, PBS 주사된 근육에서 어떠한 염증도 보이지 않는다. 대조적으로, 모든 Ad-주사 근육은 Ad 1.0 E3+=Ad 3.0 (조건당 n=2)에 대해 필적할만한 강도를 갖는 가변수의 염증 병소를 나타낸다. βgal 발현이 근섬유, 및 또한 근내막 및 근외막에서 검출된다. 표지된 근육 핵은 Ad 3.0 보다 Ad 1.0 E3+가 더 높다.
결론
이러한 단기 실험은 Ad 1.0에 비하여 Ad 3.0의 근육내 주사 후, 염증 반응 또는 표지된 세포 수의 향상을 나타내지 않는다. 그러나, Ad 3.0이 장기간 트랜스진 발현의 향상된 안정성 부여는 조사되어야 할 숙제이다.
실시예 2. 근위축성 측색 경화증 모델로서 인식되는 동물에서 본 발명의 실시예
동물 모델
pmn 마우스: 진행성 운동 신경병 (pmn) 돌연변이체는 자발적으로 나타나고, 장애는 상염색체 열성방식으로 전달된다[참조문헌: Schmalbruch and Skovgaard-Jensen, Progressive motor neuropathy (pmn), a new neurological mutant in the mouse. Mouse Genome, 87, 113, 1990]. 돌연변이된 유전자는 알려져 있지 않지만 염색체 6에 위치한다. 동종접합체 pmn/pmn 마우스는 미골-두개골 운동 뉴런 변성으로 고통받고 아마도 호흡기 근육 신경지배제거로 인하여 생후 5 내지 7 주 후에 죽는다. 횡격막 신경의 상세한 조직병리학적 연구는 질환이 말초 축색 변성, 및 최인접 축색과 세포체의 상대적인 보존으로의 다잉 백 (dying back) 과정으로 인한 것임을 나타낸다[참조문헌: Schmalbruch et al., A new mouse mutant with progressive motor neuropathy. J. Neuropathol. Exp. Neurol., 50, 192-204, 1991]. 근전도 사진 분석[참조문헌: Kennel et al., Neuromuscular function impairment is not caused by motor neuron loss in FALS mice: an electromyographical study. Neuroreport, 7, 1427-1431, 1996; Kennel et al., Electromyographical and motor performance strudies in the pmn mouse model of neurodegenerative disease. Neurobiology of Disease, 3, 137-147, 1996]은 pmn 마우스가 ALS 환자에서 발견되는 특징적 특성, 예를 들면, 순수 신경 패턴, 섬유성연축의 존재, 감소된 운동 수행 속도를 제시함을 나타낸다. 대조적으로, 운동 단위 활동전위의 확대와 같은 기타 ALS 특성은 pmn 마우스에서 관찰되지 않는다.
SOD*마우스: 가족형의 ALS의 원인이 되는 돌연변이형 Cu/Zn SOD를 발현시키는 트랜스제닉 마우스가 작제되었다. 아미노산 위치 93 (SOD*)에서 알라닌에 대한 치환 글리신을 운반하는 인간 SOD를 과잉발현시키는 동물은 태어난지 4 내지 6 개월에 마비 및 죽음을 초래하는 진행성 운동뉴런 변성을 나타낸다[참조문헌: Gurney et al., Motor neuron degeneration in mice expressing a human Cu, Zn superoxide dismutase mutation. Science, 264, 1772-1775, 1994]. 최초의 임상적 징후는 태어난지 90 일경에 미세한 지절 떨림에 이어 125 일째에 보폭 길이 감소로 이루어진다 (Chiu et coll., 1995). 조직학적 연구는 37 일경에 미토콘드리아 기원의 액포 출현 및 90 일부터의 운동뉴런 손실을 보여준다[참조문헌: Chiu et al., Age-dependant penetrance of disease in a transgenic model of familial amyotrophic lateral sclerosis. Mol. Cell. Neurosci., 6, 349-362, 1995]. 보상성 측부 신경재식은 신경근 연접부 수준에서 관찰될 수 있다 (Chiu et al., 1995). SOD*마우스는 ALS을 특징지우는 모든 전rl생리학적 램버트 기준을 나타낸다 (Kennel et al., 1996). 그러나, SOD*마우스에 대한 릴루졸의 불충분한 치료 효과는 이들이 가장 심각한 형태의 질환을 나타낼 수 있음을 제시한다.
AdNT-3 작제물:
마우스 NT-3 유전자는 완전한 NT-3 프리프로서열을 포함하는 1045 bp PCR-단편으로서 분리되고 아데노바이러스 게놈의 역 종결 반복부(ITR), 캡시드화 서열 및 후속의 상동성 재조합에 필요한 아데노바이러스 서열을 함유하는 셔틀 플라스미드의 EcoRV 부위에 클로닝된다. NT-3의 전사는 라우스 (Rous) 육종 바이러스 (RSV) LTR 프로모터에 의해서 조절되고 NT-3 유전자 및 3' 인접 아데노바이러스 pIX 유전자에 존재하는 폴리 A 시그널에 의해서 종결된다. 복제-결손 아데노바이러스 벡터 AdNT-3은 영역 E1 및 E3에서 결실되고, AdRSVβgal의 ClaI-제한 게놈으로의 선형화 pAdNT-3 플라스미드의 생체내 상동 재조합에 의해 수득된다 [참조문헌: Stratford-Perricaudet et al., Widespread long term gene transfer to mouse skeletal muscle and heart. J. Clin. Invest. 90, 626-630, 1992].
실시예 2A: NT3를 암호화하는 아데노바이러스의 pmn 마우스 근육으로 투여:
pmn-마우스를 태어난지 3 내지 4 일째에 상기와 같이 RSV 프로모터의 조절하에 있는 쥐 NT-3를 암호화하는 아데노바이러스 벡터로 주사한다. 아데노바이러스 용량 (동물당 100 ㎕ 중의 109pfu)을 3가지 근육 그룹, 비복근, 삼두근 상완근 및 흉곽 동의 장근에 일방향으로 주사한다.
주사 절차 후 트랜스진 발현을 먼저 반딧불 루시페라제 유전자를 암호화하는 아데노바이러스 벡터 (Adluc)를 사용하여 시험한다. 25 일 후, 루시페라제 활성의 99%가 주사된 근육 그룹에서 발견되었고, 소량의 활성만이 간 (0.4 %), 심장 (0.1 %) 및 폐 (0.1 %)에서 검출되었으며, 횡격막과 비장에서는 어떠한 활성도 발견되지 않았다.
Ad-NT3 벡터의 투여 후, 아데노바이러스 NT-3 전사체가 15 일 내지 35 일부터 주사된 비복근에서 검출되고, 이는 NT-3 유전자 전달 후, 4 주 이상의 발현을 나타낸다. 어떠한 아데노바이러스 NT-3 전사체도 척수를 제외하고 다양한 기타 조직에서 검출되지 않는다.
25 일째에, AdNT-3 주사된 비복근은 NT-3 면역반응성 (Ad-NT-3 주사된 근육에서 300 ng/g 습윤 중량 대 비주사 동물에서 2.4 ng/g)에 있어 100 배 이상의 증가를 나타낸다. 동시에, NT-3 면역반응성이 AdNT-3 처리 pmn-마우스의 혈청에서 검출되고 비-주사 마우스에서 기준선을 약 11 ng/ml까지 초과하였다.
Ad-NT3 처리는 pmn 마우스의 수명을 향상시킨다:
모든 비처리 pmn-마우스는 57 일 전에 죽고 이의 평균 생존기간은 40.2 ± 2.4 일 (n=14)이다 (도 4). 근육내 주사에 의해 투여된 대조군 벡터 Ad-lacZ는 pmn-마우스의 생존을 변화시키지 않는다 (40.0 ± 2.5 일, n=12). 대조적으로, AdNT3 벡터로 처리된 pmn-마우스는 89 일까지 생존한다. 이의 평균 수명은 평균 수명에 있어 50 % 증가를 나타내는 61.3 ± 2.5 일 (n=16, p<0.001)로 현저하게 향상된다. 5 배 높은 아데노바이러스 용량 (5 x 109pfu)으로 처리된 일부 pmn-마우스는 수명에 있어 추가의 향상을 나타낸다 (49/57/61 일, 평균 56 일).
Ad-NT3는 신경근 기능을 향상한다:
AdNT-3 처리된 pmn-마우스에 있어 질환 진행을 명확하게 특징지우기 위해서 근전도 사진 (EMG) 연구가 3가지 EMG-파라미터를 사용하여 수행된다: i) 비복근에서의 자발적인 신경지배제거 활성 (섬유성연축), ii) (비복근에 기록된) 좌골 신경에 적용된 최대초과 전기 자극에 의해 유발한 반응 (복합 근육 활동전위, CMAP)의 진폭, 및 iii) 횡격막으로부터 기록된 자발적 전기 활성.
i) 섬유성연축은 기능성 신경지배제거 과정의 개시를 표시한다; 이는 AdNT-3 처리 pmn-마우스 및 비처리 pmn-마우스에서 모두 17 일 전에 발생한다.
ii) 비복근의 CMAP의 진폭은 연령에 따라 증가하고 정상 마우스에서 태어난지 45 일째에 80 내지 90 mV의 고평부에 도달한다. 비처리 pmn-마우스에서 정상의 40 %에 상응하는 최대 20 내지 30 mV이 아마도 진행중인 신경지배제거로 인하여 추가의 증가 (도 5) 없이 20 일경에 도달된다. AdNT-3 처리는 pmn-마우스에서 CMAP 진폭의 상당한 회복을 유도한다: 3 주째에 이것은 정상 마우스의 70 %를 나타낸다. pmn 마우스에 있어서 CMAP의 진폭은 단독으로 주사된 마우스의 우지 및 좌지 사이에는 차이가 없다.
iii) 횡격막의 신경지배제거가 아마도 pmn 마우스 질환의 진행과정을 결정하므로, 35 일째에 이러한 근육의 전기 활성에 대한 AdNT-3 처리의 효과가 조사된다. 흡기상은 활성 버스트(burst)를 특징으로 하고, 반면에 호기상은 전기적 무반응을 특징으로 한다. 버스트의 임펄스 패턴내의 포지티브-네거티브 편향("턴 turn")의 수는 운동 단위 방전의 수에 대한 측정이다. 흡기 버스트당 "턴"의 수는 건강한 한배 새끼 (각 그룹에서 n=4)에 비하여 비처리 pmn-마우스에서 65 %까지 감소되고; 버스트의 최대 진폭은 두 그룹 모두에서 동일하다. AdNT-3로 처리된 pmn-마우스에서 버스트당 "턴"의 수는 현저하게 증진되지 않지만, 최대 진폭은 비처리 pmn-마우스에 비하여 상당히 증가한다 (표 1).
| 대조군 (n=4) | 비처리 pmn (n=4) | NT3 처리 pmn (n=4) | |
| 호기 버스트의 평균 지속기간 (ms) | 138.8 ± 4.4 | 77.2 ± 7.7(p < 0.003)a | 99.1 ± 14.1(P < 0.003)b(P < 0.22)c |
| 버스트당 턴의 평균 수 | 119.4 ± 6.0 | 40.7 ± 8.5(p < 0.001)a | 46.9 ± 5.5(P < 0.001)b(P < 0.57)c |
| 최대 진폭의 평균 (μV) | 626 ± 95 | 695 ± 78(p < 0.61)a | 1062 ± 70(P < 0.011)b(P < 0.018)c |
| a: 대조군 대 비처리 pmnb: 대조군 대 NT3-처리 pmnc: 비처리 pmn 대 NT3-pmn |
건강한 한배 새끼 및 비처리 pmn-마우스에서 각각 626 + 95 mV 및 695 + 78 mV이지만, AdNT-3-처리 pmn-마우스 (p<0.02)에서 1062 + 70 mV이다. 호흡 버스트내 스파이크 진폭의 증가는 AdNT-3이 pmn-마우스에서 운동 단위 크기의 증가를 유발함을 제시하고, 이는 운동 축색 말단의 말초 또는 측부 스프라우팅의 유도를 입증한다. 근전도 사진 분석으로부터의 결론이 처리 및 대조군 pmn 동물의 종판 신경지배의 조직학적 분석에 의해 입증된다.
축색 변성에 대한 Ad-NT3 보호
AdNT3 처리 pmn 마우스의 연장된 수명 및 향상된 신경근 기능이 횡경막을 시경지배하는 횡격막 신경 섬유 수의 증가에 의해 반영된다. 25 일째에 광학 현미경 사진은 비처리 pmn-마우스 및 AdlacZ 처리 pmn-마우스의 축색 수가 정상 한배 새끼 (n=4)에서 263 ± 8 미엘린화 섬유에 비하여 각각 122 ± 13 (n=6) 및 120 ± 11 (n=8)로 감소함을 나타낸다. AdNT3 주사된 pmn 마우스의 횡격막 신경의 미엘린화 섬유의 수는 현저하게 더 높고 (165 ± 15, n=8, P<0.05), 이는 미엘린화 섬유의 손실에 있어 30 % 감소에 상응한다. 35 일째 되는 날에, 여러 비처리 pmn-마우스가 이미 죽었을 때, 차이는 10 일전 보다 덜 명백하지만, AdNT-3 처리 pmn-마우스는 비처리 (118 ± 4, n=10) 또는 AdlacZ-주사 pmn-마우스 (115 ± 4, n=8) 보다 더 많은 미엘린화 섬유 (130 ± 7, n=8)를 함유한다.
AdNT-3 및 AdCNTF 공동처리의 강화 효과
NT-3의 효과는 pmn-모델에서 신경보호 작용에 대해 공지된 분자인 CNTF에 의해서 증진된다 [참조문헌: Sendtner et al., Nature 373, 344-346 (1995); Sagot et al., Eur J. Neurosci. 7, 1313-1322 (1995)]. 마우스를 AdNT-3와, CNTF의 생물학적으로 활성 및 분비형을 암호화하는 아데노바이러스 벡터인 AdCNTF로 병용 처리한다. 공동처리된 pmn-마우스의 평균 수명 (66 ± 7.6 일, n=11, 도 8)은 비록 차이가 통계학적인 유의성 이하이지만 각각의 단독 처리 (AdNT-3: 61.3 ± 2.5 일, n=16; AdCNTF: 52.9 ± 4.4 일, n=13) 보다 더 높은 경향이 있다. 그러나, 3개월 이상 (최대 105 일) 생존하는 모든 pmn-마우스는 AdNT-3 + AdCNTF 그룹에 속한다.
태어난지 25 일째에, AdNT-3과 AdCNTF로 공동처리된 동물은 192 ± 11 횡격막 신경 섬유 (n=8)를 갖지만, AdNT-3 또는 AdCNTF 단독으로 처리된 동물은 각각 164 ± 15 및 167 ± 21 (n=4) 섬유를 갖는다 (도 9 및 10). 35 일째에, AdNT-3+CNTF 그룹의 수는 157 ± 10 (n=10)으로 감소되고, AdNT-3 그룹 (130 ± 7, p<0.05) 및 대조군 그룹 (각각 비-처리: 118 ± 4, n=10; AdlacZ-주사: 115 ± 4, n=8, p<0.01)에서 상당히 더 높다. 따라서, 25 일 및 35 일째에, 미엘린화 섬유의 손실은 AdNT-3만을 투여받은 동물에서 보다 AdNT-3 외에 AdCNTF를 투여받은 동물에서 30 % 및 20 % 더 적다.
AdNT-3 및 AdCNTF로의 처리는 근육 신경재식을 유도한다.
전기생리학적 발견은 AdNT-3 처리 pmn-마우스에 신경재식 현상을 제시한다. 그러므로, 아세틸콜린에스테라제-은을 사용하는 표면 둔근에서의 말단 신경지배 패턴 [참조문헌: Namba et al., Am. J. Clin. Pathol. 47. 773-783 (1967); Gurney et al., J. Neurosci. 12, 3241-3247 (1992)]을 조사한다. 정상 마우스에서, 단일 말단 축색은 보통 하나의 종판 (도 11a 및 b)을 제공하고 소수의 축색만이 최종 랑비에 결절에서 분지되어 2 개의 종판을 공급한다. 비처리 pmn-마우스에서, 근육내 신경 가지의 축색 수는 대폭 감소되고, 말단 축색의 소수의 다발만이 신경으로부터 출현하고, 다수 종판은 축색이 부족하다 (도 11c). 여전히 축색에 연결된 종판은 정상 마우스에서와 동일한 일대일 신경지배 패턴을 나타낸다: 말단 축색과 이의 말단 가지 모두 둔한 비대부를 갖고, 말단 가지는 정세된다(도 11d). 호은성 과립은 변성된 축색의 진행과정을 표시하고 또한 신경 가지내에 존재한다. 일부의 장소에서 미세한 스프라우트가 파괴된 축색의 말단 및 또한 랑비에 결절로부터 출현하지만, 이러한 스프라우트는 얇고 (아마도 비-미엘린화됨) 보통 종판에 도달하지 않는다. 근육 스핀들의 감각 신경지배가 보존된다.
도 11e는 AdNT-3 처리 pmn-마우스 중 하나의 패턴을 도시한다. 가지로부터 출현한 말단 축색 다발은 좀더 두드러지고 축색은 연속 랑비에 결절에서 분지되어 각각은 여러 종판을 공급한다. AdNT-3+AdCNTF 처리 후, 4마리 pmn-마우스에서 분석하니, 근육의 종판대는 포도형 방식으로 배열된 종판을 공급하는 십자형 축색으로 채워져 있다. 이러한 마우스에서, 축색이 없는 종판은 사실상 없다. 종판에 도달하는 축색은 짧고 대부분 랑비에 절로부터 출현하지만, 종종 다른 종판 (말단 스프라우트, 도 11f)으로부터도 출현한다. 이어서 다시 제 2 종판을 공급하는 말단 스프라우트를 갖는 종판을 제공하는 말단 스프라우트를 관찰하는 것은 보기 드문 일이 아니다.
pmn 연구의 결론
Ad-NT-3의 근육내 주사는 pmn 마우스에 수명에 있어 50 % 증가를 제공한다. 수명에 대한 NT-3의 효과를 담당하는 것으로 보이는 생리학적 메커니즘이 결정되었다: 변성으로부터 축색의 보호 및 말단 수준에서 측부 스프라우팅의 자극.
pmn-마우스의 축색 생존 및 최대 수명에 대한 결합된 AdNT-3 및 AdCNTF 공동처리 효과는 AdNT-3 또는 AdCNTF 단독 처리된 것들 보다 더욱 명백하다. 이는 pmn-마우스에서, 이러한 두 인자가 별개의 운동 뉴런 아집단에 작동하고, 운동 뉴런 변성의 다른 단계에서 중요하거나 근육 세포 (Helgren et al., Cell 76, 493-504 (1994) 또는 쉬반 세포와 같은 비-신경 세포에 차별적으로 영향을 미침을 제시한다. 이러한 발견은 또한 상이한 계열에 속하는 향신경성 인자를 동시 투여하는 치료 포텐셜을 강조한다.
이러한 결과는 질환의 유전적 동물 모델의 수명에 대한 생체내 유전자 전달의 효과의 최초의 입증을 구성한다. 또한, 이러한 연구는 운동뉴런 질환에 대한 아데노바이러스 매개 유전자 치료 사용을 위한 강력한 근거를 제공한다. 사실상, 재조합 NT-3 단백질의 전신 주사에 의해서는 필적할만한 결과를 수득할 수 없다. NT-3의 아데노바이러스-매개 투여는 전신 단백질 투여에 비하여 NT-3의 생체 이용율 프로필을 변경시킨다. 단백질은 신경근 연접부의 후 시냅스 말단과 신경 세포체 모두에서 생성되고, 순환시 연속적으로 방출된다.
실시예 2B: 향신경성 인자를 암호화하는 아데노바이러스의 SOD*마우스의 근육으로의 투여
동물 공급:
돌연변이체 동물은 Transgenic Alliance에 의해 제공된다. SOD*동물은 동시에 동일한 처리를 받은 마우스의 수명에 있어서 50 일 차이까지의 수명의 광범위한 다양성을 제시한다. 결과적으로, 통계학적으로 유의한 결과에 도달하기 위해서는 다수의 동물이 필요하다.
일반적 방법
동물을 상이한 아데노바이러스 작제물 (AdNT-3, AdCNTF, AdBDNF, AdGDNF, AD-βgal)로 상이한 연령에서 주사한다. 좌골 신경의 최대초과 자극 후 비복근에서 유발한 운동 반응을 10 일 마다 각각의 동물에서 기록된다. 릴루졸과의 비교가 또한 수행된다.
AdNT-3의 근육내 주사의 효과
근육내 주사를 RSV 프로모터의 조절하에 마우스 NT-3을 암호화하는 아데노바이러스 벡터로 신생아 및 성체 동물에서 수행한다. 동물을 1차 근전도 사진 결손의 출현 직전에 생후 4 내지 5 주째에, 또는 생후 13 주째에 1차 임상적 증후 출현 시기에 주사시킨다 (표 2).
데이터는 SOD*마우스에 Ad-NT3의 근육내 주사가 비주사 대조군에 비하여 9 내지 14 일의 수명 증가를 일으킴을 나타낸다. 관찰된 차이는 통계학적으로 유의하다. 흥미롭게도, 수명의 증가는 동물이 13 주째, 즉, 1차 증후의 출현 시기에 주사될 경우 관찰된다.
다른 실험에서 β-Gal 또는 NT3를 암호화하는 아데노바이러스를 인간 SOD의 돌연변이 형태 (93Gly -> Ala)를 발현시키고 진행성 운동뉴런 변성을 나타내며 지절의 마비와 4 내지 6 개월 내의 사망을 초래하는 트랜스제닉 마우스 종인 3 내지 4 주령의 FALSG93A마우스에 주사한다 (Gurney et al., 1994).
동물당 총 5.108내지 109pfu를 주사하고, 각각의 비복근 및 이두근에 1/4씩 분포시킨다. 치사율을 측정한다. 비처리 동물은 142.4 +/- 4.5 일 생존하고, Ad-B-Gal 주사 동물 (147.8 +/- 3.0)과 통계학적으로 상이하다. 그러나, Ad-NT3 주사된 동물은 162.86 +/- 5.75 일 생존한다. 7 마리의 ad-NT3 처리 동물 중 6 마리가 비처리 동물보다 더 오래 생존한다. 동일 그룹 중 5 마리는 ad-G-Gal 처리 동물보다 더 오래 산다. 이러한 결과는 아데노바이러스를 발현시키는 뉴로트로핀의 주사가 ALS의 마우스 모델에서 질환의 진행을 느리게 할 수 있음을 입증한다.
좌골 신경 자극 후 비복근에서 유발한 운동 반응을 상이한 연령에서 조사한다. 매우 큰 다양성이 이 파라미터에 대해 관찰된다. 각 동물의 질환 진행과정에 따라 규칙적인 감소가 관찰되지만 (Kennel et al., 1996), 이러한 질환의 속도 및 정도는 수명과 상관시킬 수 없다. Ad-NT3 처리시 이러한 파라미터의 유의할만한 변화도 관찰되지 않는다.
하기의 기타 재조합 아데노바이러스를 근육내에 주사시 SOD*마우스에 있어 수명에 대한 어떠한 현저한 효과도 관찰되지 않는다: 출생시 Ad-GDNF, Ad-CNTF, AD-BDNF 주사; 5 또는 13 주째에 Ad-GDNF 주사; 출생시 Ad-GDNF+Ad-BDNF 또는 Ad-GDNF+AdCNTF의 병행 주사; 또는 5 주에 AdGDNF+Ad-CNTF 주사.
릴루졸의 효과:
릴루졸은 ALS에 대한 FDA 공인 처방이다. 릴루졸은 또한 ALS의 트랜스제닉 마우스 모델에서 사망으로의 중간 시간을 지연시키는 것으로 나타났다. 이러한 마우스는 인간 ALS의 가족형 중 하나에서 발견되는 돌연변이 중 하나를 생성하는 인간 수퍼옥사이드 디스뮤타제를 발현시킨다. 릴루졸은 벤조티아졸류의 일원이다. 화학적으로, 릴루졸은 2-아미노-6-(트리플루오로메톡시)-벤조트리아졸이다.
SOD*마우스에 대한 릴루졸의 효과는 3 가지 상이한 프로토콜로 시험한다. 생후 5 주부터 SOD*마우스로의 4 및 8 mg/일/kg의 경구투여는 수명에 어떠한 효과도 일으키지 않았다.
릴루졸을 인간 환자 수명에 13 일 증가를 일으키는 것으로 보고된 조건인 100 ㎍/ml의 농도로 SOD*마우스의 식수에 전달한다 [참조문헌: Gurney et al., Pathogenic mechanisms in familial amyotrophic lateral sclerosis due to mutation of Cu, Zn superoxide dismutase. Path Biol., 44, 51-56, 1996]. 이것은 약 20 내지 25 mg/kg/일 용량에 상응하고, SOD*마우스의 수명에 대한 어떠한 효과도 관찰되지 않는다 (처리된 동물 151.8+6.26, n=11).
결론:
인간의 임상에 효과적인 것의 2.5 내지 16 배 범위의 농도 (100 mg/환자/일, 즉, 약 1.5 mg/kg/일)에서 릴루졸은 SOD*마우스 수명에 대해 어떠한 효과도 일으키지 않는다. 이것은 SOD*마우스가 심각한 형태의 ALS를 나타냄을 제시한다. 이러한 발견은 SOD*마우스가 산발성 형태 보다 더 이른 개시와 더 불충분한 예후를 나타내는 것으로 생각되는 가족형 ALS에 대한 모델을 나타낸다는 사실에 의해서 보강된다 [참조문헌: Rowland, Amyotrophic lateral sclerosis: Human challenge for neuroscience. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 1251-1253, 1995; Gurney et al., 1996].
데이터는 SOD*마우스의 근육내 주사된 Ad-NT3가 대조군에 비하여 9 내지 14 일 범위의 수명 증가를 일으킴을 나타낸다. 이러한 증가는 상당한 것이다. 3 가지 흥미로운 특성에 주목하여야 한다:
a) 수명의 증가는 주사가 질환의 첫 번째 임상적 징후를 보이는 성체 마우스에서 수행되는 경우 관찰된다.
b) NT3 단백질의 SOD*마우스로의 주사 후 치료 또는 수명 증가는 관찰되지 않는다. 그러므로, pmn 마우스에 대해서, 결과는 유전자 전달을 통한 치료 단백질 운반의 장점을 입증한다.
c) SOD*마우스 수명 증가는 릴루졸 처리시 관찰할 수 없다. 이것은 SOD*마우스에서 수명 증가를 일으키는 처리가 인간 환자에서 릴루졸보다 더 나은 효과를 일으키는 것으로 예측할 수 있음을 제시한다.
치료 효과는 또한 포낭내 투여 (WO94/08026 참조)를 사용함으로써 또는 기타 영양 인자를 발현시키는 바이러스로 수득될 수 있다.
실시예 3: 네이키드 DNA의 근육내 투여
pmn 또는 SOD*마우스를 사용하는 데이터는 영양 인자를 발현시키는 재조합 아데노바이러스의 근육내 주사가 이들 동물에 치료 효과를 일으킬 수 있음을 예시한다. 관찰된 효과는 운동 뉴런의 역행성 감염 및 척수내 영양 인자 발현에 연관될 수 있다. 또한, 영양 인자는 감염된 근육으로부터 순환시 방출된 후 이의 활성을 발휘할 수 있다. 이러한 경우에, 근육내 향신경성 유전자 전달을 위한 효율적인 방법은 아데노바이러스 감염으로 관찰되는 효과와 유사한 유리한 효과를 생성할 수 있다.
골격근에서의 유전자 전달은 네이키드 DNA의 직접 주사 후 달성될 수 있다 [참조문헌: Wolff et al., Direct gene transfer into mouse muscle in vivo. Science, 247, 1465-1468, 1990]. 분비되는 단백질을 암호화하는 유전자의 근육내 전달의 여러 예가 공개되었고, 트랜스진 발현의 수준은 생리학적 효과를 생성하기에 충분하다. 운동뉴런 장애에 대한 네이키드 DNA 전달의 잠재적인 치료 포텐셜의 연구가 수행되었다.
Ad 및 네이키드 DNA 주사 후 트랜스진 발현의 비교
마우스 비복근을 CMV 프로모터의 조절하에 루시페라제 (AdCMVLuc)를 발현시키는 재조합 아데노바이러스 또는 동일한 트랜스진 (pCMVLuc)을 발현시키는 플라스미드로 주사한다. AdCMVLuc의 109pfu의 주사 후, 루시페라제 100 내지 300 pg가 주사된 근육에서 검출된다. 이러한 값은 pCMVLuc의 주사 후 관찰되는 것에 필적할 만하다 (도 7, 패널 a). 그러나, 그룹내의 다양성은 아데노바이러스 벡터에 비하여 네이키드 DNA를 사용할 때 훨씬 더 높다. 사실상, 네이키드 DNA 사용시 전형적으로 트랜스진 발현 수준에서 2 내지 3 log의 차이가 관찰되지만, 아데노바이러스 사용시 1 log 내에 속하는 변이가 관찰된다.
유전자 전달/ 발현 효율에 잠재적으로 영향을 미치는 파라미터의 분석
프로모터 RSV/CMV: CMV 프로모터는 신생 마우스에서 사용시 상당한 트랜스진 발현을 제공한다. 성체 동물에 주사시, RSV 프로모터는 주사 72 시간 후 CMV로 관찰되는 것보다 10 배 더 많은 루시페라제 발현 수준을 초래한다. 그러나, 주사 30 일 후 유사한 수준이 두 작제물에서 관찰된다 (도 7, 패널 c 및 d).
주사시 연령: 성체 또는 신생 동물에서의 주사는 주사 30 일 후 참수되는 경우 상당한 수준의 트랜스진 발현을 생성한다. 대조적으로, 주사 72 시간 후 참수되는 경우, RSV 도출된 루시페라제 발현의 수준은 성체보다 신생 동물에서 10 배 더 높지만, 반대의 상황이 CMV 프로모터로 관찰된다 (도 7).
뱃치 제조: 루시페라제 발현의 10 배 차이가 표준 시판 키트를 사용하여 제조된 동일한 플라스미드의 상이한 두 실험 뱃치 간에 관찰될 수 있다 (도 7). 대조적으로, 생산조에 의해서 제조된 상이한 뱃치를 사용하는 경우 발현된 트랜스진의 수준은 일정하다 (도시되지 않음). 이것은 플라스미드 제조의 통제된 조건에 대한 필요를 강조한다.
주사된 근육, 성, 주사 양식: 주사된 근육 (삼두근 대 비복근), 성, 주사 양식 (경피 대 수술)에 따른 주된 차이는 관찰되지 않는다.
네이키드 DNA 실험의 결론:
결과는 네이키드 DNA의 근육내 주사가 아데노바이러스의 근육내 주사 후 관찰되는 것에 상응하는 트랜스진 발현 수준을 생성함을 나타낸다. 그러나, 동물간 다양성은 아데노바이러스보다 네이키드 DNA에서 훨씬 더 높다. 데이터는 또한 주사될 플라스미드의 조절된 생성의 필요성을 강조한다.
본원에 기재된 모든 참조문헌이 참조로 인용된다.
당업자는 본 발명이 목적을 수행하고 언급된 결과와 장점 및 이의 고유성을 수득하기 위해서 잘 변형됨을 쉽게 이해할 것이다. 본원에 기재된 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 방법, 절차 및 기술은 바람직한 양태의 대표로서 제시되어 있고, 예시 목적이며, 본 발명의 범위에 대한 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 발명의 취지 내에 포함되거나 청구의 범위에 의해 정의되는 이의 변화 및 기타 용도가 당업자에게 일어날 수 있다.
Claims (31)
- 핵산을 핵산이 운동 뉴런으로 전달되는 근조직에 투여하는 단계를 포함하는, 하나 이상의 핵산을 포유류 운동 뉴런으로 전달하는 방법.
- 단백질을 암호화하는 하나 이상의 핵산을 핵산이 운동 뉴런으로 전달되어 발현되는 근조직에 투여하는 단계를 포함하는, 포유류 운동 뉴런에서의 단백질 제조방법.
- 제 2 항에 있어서, 단백질이 신경근 연접부의 후-시냅스 말단에서 생성되는 방법.
- 제 2 항에 있어서, 운동 뉴런이 구심성 운동 뉴런이고 핵산이 척수에서 발현되는 방법.
- 하나 이상의 핵산을 핵산이 운동 축색 말단의 말초 또는 측부 스프라우팅을 유도하는 근조직에 투여하는 단계를 포함하는, 운동 축색 말단의 말초 또는 측부 스프라우팅 유도방법.
- 제 5 항에 있어서, 핵산이 단백질을 암호화하는 방법.
- 하나 이상의 핵산을 핵산이 운동 뉴런으로 전달되어 축색 변성에 대해 보호하는 포유류 근조직에 투여하는 단계를 포함하는, 축색 변성 보호방법.
- 하나 이상의 신경활성 물질을 암호화하는 하나 이상의 핵산을 핵산이 운동 뉴런으로 전달되는 포유류 근조직에 투여하는 단계를 포함하는, 신경계 손상의 치료방법.
- 제 8 항에 있어서, 손상이 신경손상인 방법.
- 제 8 항에 있어서, 손상이 신경퇴행성 질환인 방법.
- 제 10 항에 있어서, 질환이 근위축성 측색 경화증 또는 유아의 척추성 근위축인 방법.
- 뉴로트로핀-3을 암호화하는 유전자를 포함하는 복제 결손 아데노바이러스 및 CNTF를 암호화하는 유전자를 포함하는 복제 결손 아데노바이러스를 근위축성 측색 경화증을 앓고 있는 포유류의 근조직에 투여하는 단계를 포함하는, 근위축성 측색 경화증의 치료방법.
- 제 1 항에 있어서, 핵산이 벡터에 삽입되는 방법.
- 제 13 항에 있어서, 벡터가 아데노바이러스, 레트로바이러스, 허피스 바이러스 및 아데노 수반 바이러스로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법.
- 제 14 항에 있어서, 벡터가 복제 결손 아데노바이러스인 방법.
- 제 15 항에 있어서, 아데노바이러스가 E1 영역의 전부 또는 일부, 및 아데노바이러스 게놈의 E3 및/또는 E4 영역의 전부 또는 일부가 결핍되는 방법.
- 제 15 항에 있어서, 아데노바이러스가 인간 기원의 아데노바이러스인 방법.
- 제 15 항에 있어서, 아데노바이러스가 동물 기원의 아데노바이러스인 방법.
- 제 15 항에 있어서, 핵산이 아데노바이러스 게놈 중으로 E1, E3 또는 E4 영역에 삽입되는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 핵산이 신경활성 물질을 암호화하는 방법.
- 제 20 항에 있어서, 핵산이 생장인자, 신경영양 인자, 사이토킨, 신경전달물질 합성 효소, 효소, 또는 수용체를 암호화하는 방법.
- 제 20 항에 있어서, 핵산이 신경활성 물질을 운동 뉴런에서 발현될 수 있도록 하는 시그널을 포함하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 운동 뉴런이 경부 수질 운동 뉴런이고, 상지근에 투여가 이루어지는 방법.
- 제 23 항에 있어서, 근육이 이두근 및/또는 삼두근인 방법.
- 제 1 항에 있어서, 운동 뉴런이 흉부 수질 운동 뉴런이고, 흉부근에 투여가 이루어지는 방법.
- 제 25 항에 있어서, 근육이 흉근인 방법.
- 제 1 항에 있어서, 운동 뉴런이 요추 및/또는 천골 수질 운동 뉴런이고, 하지근에 투여가 이루어지는 방법.
- 제 27 항에 있어서, 근육이 비복근인 방법.
- 제 1 항에 있어서, 투여가 동일 근육의 수 지점에서의 주사를 포함하는 방법.
- 핵산이 운동 뉴런으로 전달되는 선택된 수질 기능 수준과 연관된 신경 결합 부위에 최근접한 근조직에 핵산을 투여하는 단계를 포함하는, 하나 이상의 핵산을 포유류 운동 뉴런으로 전달하는 방법.
- 제 1, 2, 5, 7, 8, 및 30 항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 핵산이 뉴로트로핀-3 및 CNTF를 암호화하는 방법.
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