WO1998011213A1 - Methode de traitement de la sclerose laterale amyotrophique - Google Patents

Methode de traitement de la sclerose laterale amyotrophique Download PDF

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WO1998011213A1
WO1998011213A1 PCT/FR1997/001589 FR9701589W WO9811213A1 WO 1998011213 A1 WO1998011213 A1 WO 1998011213A1 FR 9701589 W FR9701589 W FR 9701589W WO 9811213 A1 WO9811213 A1 WO 9811213A1
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WO
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cntf
gdnf
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Application number
PCT/FR1997/001589
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Georg Haase
Axel Kahn
Philippe Kennel
Jacques Mallet
Frédéric Revah
Original Assignee
Rhone-Poulenc Rorer S.A.
Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale
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    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/185—Nerve growth factor [NGF]; Brain derived neurotrophic factor [BDNF]; Ciliary neurotrophic factor [CNTF]; Glial derived neurotrophic factor [GDNF]; Neurotrophins, e.g. NT-3
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy

Definitions

  • the present invention relates to a new method for the treatment of motoneural diseases and in particular of amyotrophic lateral sclerosis. It also relates to vectors and pharmaceutical compositions allowing the prolonged expression of therapeutic factors, usable for the treatment of ALS. More specifically, the present invention relates to the treatment of ALS by systemic administration of therapeutic genes.
  • ALS Amyotrophic lateral sclerosis
  • Lou Gehrig's disease was first described by Charcot in 1865.
  • ALS is a fatal disease resulting from the degeneration of motor neurons and corticospinal tracts .
  • ALS With an incidence currently of 2.5 / 100,000 and constantly increasing, a prevalence of 6-10 / 100,000, ALS affects 90,000 people in developed countries, mostly adults still young (between 50 and 60 years old) ).
  • the disease is accompanied by progressive paralysis, leading to the complete loss of motor and respiratory functions and then to death within two to eight years after the appearance of the first symptoms (three years on average).
  • ALS cases are of familial origin and 95% of cases are sporadic.
  • the pathophysiological origin of sporadic forms of ALS remains unknown.
  • Several hypotheses have been proposed. Motor neuron degeneration could result from an alteration in the metabolism of glutamate leading to an increase in the concentrations of this excitatory amino acid in the motor cortex and the spinal cord (hypothesis "excitotoxic", reviewed in Rothstein, 1995).
  • the possibility of an autoimmune component has also been invoked on the basis of the presence of autoantibodies against voltage-sensitive calcium channels in some patients (reviewed in Appel et al., 1995).
  • the involvement of environmental factors such as exposure to certain viruses (reviewed in Gastaut, 1995), or to aluminum (Yase, 1984) is also possible.
  • ALS hereditary forms of ALS have shown that point mutations in the copper and zinc superoxide dismutase gene, located on chromosome 21q22- l, are responsible for the pathology in 20% of familial forms (Rosen et al., 1993, reviewed in Rowland. 1995). These mutations do not cause a decrease in the dismutase activity of SOD (reviewed in Rowland, 1995).
  • the mutated enzymes produce potentially cytotoxic hydroxyl radicals which are not produced by wild SOD (Yim et al., 1996).
  • the present invention aims in particular to propose a new approach for the treatment of motor neuron pathologies. such as ALS. based on gene therapy. More particularly, the present invention describes vector systems making it possible to directly promote the survival of the motor neurons involved in these pathologies, by the efficient and prolonged expression of certain trophic factors.
  • a first aspect of the invention relates to a method of treating ALS comprising the systemic administration of a nucleic acid coding for a neurotrophic factor.
  • Another aspect of the invention relates to the use of a nucleic acid encoding a neurotrophic factor for the preparation of a pharmaceutical composition intended for the treatment of ALS.
  • Another aspect of the invention lies in the construction of particular vectors, allowing the expression of therapeutically effective amounts with respect to ALS of trophic factors.
  • Another aspect of the invention relates to the administration of expression systems allowing the production of one or more trophic factors. as well as pharmaceutical compositions comprising said expression systems. She also relates to the creation of new vectors allowing the co-expression of trophic facts in vivo
  • the present invention therefore relates more precisely to a new method of treating ALS based on the continuous in vivo expression of trophic factors
  • the present invention now shows that it is possible to obtain in vivo a particularly piononce therapeutic effect by in vivo production of neurotrophic factors.
  • the Applicant has in particular shown that the injection in vivo of expression systems of neurotrophic factors, by the systemic, allowed to obtain a continuous production of therapeutic factor and that this production was sufficient to obtain a therapeutic benefit in motor neuron pathologies, in particular ALS
  • the Applicant has shown that the systemic administration of these expression systems led to a very significant increase in lifespan, accompanied by an improvement in the evoked motor response as determined by electromyography
  • This route of administration makes it possible to obtain an appropriate bioavailability of neurotrophic factors, without effect of toxicity
  • This approach th rapeutique thus makes it possible to produce therapeutically active quantities of molecules, while remaining below the threshold of toxicity of these molecules
  • a protein of the size of a neurotrophic factor, administered in a systemic way does not penetrate the nervous system that with low efficiency due to the existence of the blood-brain barrier, the
  • a first object of the invention therefore resides in a method of treating ALS comprising the administration, by the systemic route, of a system for the expression of a neurotrophic factor. Another object of the invention also lies in the use of a system for expressing a neurotrophic factor for the preparation The invention also relates to a method for prolonging the life span of mammals suffering from ALS comprising the administration, by systemic route, of a system of expression of a neuiotrophic factor
  • the term “expression system” designates any construct allowing the expression in vivo of a nucleic acid coding for a neurotrophic factor.
  • the expression system comprises a nucleic acid coding for a neurotrophic factor.
  • This nucleic acid can be a DNA or a RNA
  • a cDNA, a gDNA or a hybrid DNA that is to say a - say a DNA containing one or more introns of the gDNA, but not all
  • the DNA can also be a synthetic or semi-synthetic, and in particular a DNA artificially synthesized to optimize the codons or create reduced forms
  • the transcptional promoter can be any functional promoter in a mammalian cell, preferably a human one. It can be the promoter region naturally responsible for the expression of the neurotrophic factor considered when it is capable of functioning in the cell or the organism. concerned They can also be regions of different origin (responsible for the expression of other proteins, or even synthetic) In particular, they can be promoter regions of eukaryotic or viral genes For example, it can be act from promoter regions derived from the genome of the target cell Among the eukaryotic promoters, any promoter or derived sequence may be used which stimulates or represses the transcription of a gene in a specific or non-specific manner, mductible or not, strong or weak II can be act in particular as ubiquitous promoters (promoter of the HPRT, PGK, ⁇ -actin, tubulin, etc.
  • promoters of intermediate filaments promoter of GFAP genes, desmin, vimentin, neurofilaments, keratin, etc.
  • promoters of therapeutic genes for example the promoter of MDR genes. CFTR, Factor VIII, ApoAl, etc.
  • tissue-specific promoters promoter of the pyruvate kinasc gene, villin, intestinal fatty acid binding protein, smooth muscle ⁇ -actin, etc.
  • promoters responding to a stimulus steroid hormone receptor, retinoic acid receptor, etc.
  • they may be promoter sequences originating from the genome of a virus, such as, for example, the promoters of the adenovirus E 1 A and MLP genes, the CMV early promoter, or the RSV LTR promoter, etc.
  • these promoter regions can be modified by adding activation or regulatory sequences, or allowing tissue-specific or majority expression
  • a constitutive eukaryotic or viral promoter It is more particularly a promoter chosen from the promoter of the gencs HPR1, PGK, ⁇ -actin, tubulin or the promoter of the El A and MLP genes adenovirus, the CMV early promoter, or the RSV LTR promoter
  • the expression cassette advantageously comprises a signal sequence directing the product synthesized in the secretory pathways of the target cell.
  • This signal sequence may be the natural signal sequence of the product synthesized, but it may also be any other sequence. functional signal, or an artificial signal sequence
  • the expression cassette generally comprises a region situated at 3 ', which specifies a transc ⁇ ptional end signal and a polyadenylation site.
  • the trophic factors which can be used in the context of the invention essentially fall into three families, the neurotrophin family, the neurokine family, and the TGF beta family (for review, see Henderson Adv Neurol 68 (1995) 235).
  • BDNF brain-derived neurotrophic factor
  • NT-3 or NT-4/5 The brain-derived neurotrophic factor (BDNF), described by Thoenen (Trends in NeuroSci. 14 (1991) 165), is a protein of 118 amino acids and molecular weight 13.5 kD.
  • BDNF stimulates the formation of neurites and the survival in culture of ganglion neurons of the retina, cholinergic neurons of the septum as well as dopaminergic neurons of the mesencephalon (reviewed by Lindsay in Neurotrophic Factors, Ed, (1993) 257, Press Academy).
  • the DNA sequence coding for human BDNF and for rat BDNF has been cloned and sequenced (Maisonpierre et al., Genomics 10 (1991) 558), as well as in particular the sequence coding for pig BDNF (Leibrock and al., Nature 341 (1989) 149). Although its properties are potentially interesting, the therapeutic application of BDNF faces various obstacles. In particular, the lack of bioavailability of BDNF limits any therapeutic use.
  • the brain-derived neurotrophic factor (BDNF) produced in the context of the present invention may be human BDNF or animal BDNF.
  • Neurotrophin 3 is a secreted protein of 1 19 aa which allows the survival in vitro of neurons even at very low concentrations. (Henderson et al. Nature 363,266-270 (1993)). The sequence of cDNA encoding human NT3 has been described (Hohn et al., Nature 344 (1990) 339).
  • the TGF-B family includes the neurotrophic factor derived from glial cells.
  • the neurotrophic factor derived from glial cells, GDNF (L.-F. Lin et al., Science, 260, 1130-1 132 (1993)) is a protein of 134 amino acids and a molecular weight of 16 kD. It has the essential capacity to promote in vitro the survival of dopaminergic neurons and motor neurons (reviewed in Henderson. 1995).
  • the glial cell derived neurotrophic factor (GDNF) produced in the context of the present invention may be human GDNF or animal GDNF.
  • the cDNA sequences encoding human GDNF and rat GDNF were nailed and sequenced (L.-F. Lin, D. Doherty. J.
  • CNTF Central NeuroTrophic Factor
  • CNTF is a neurokine capable of preventing the death of neurons. As previously indicated, clinical trials were terminated prematurely due to lack of results. The invention now allows for prolonged and continuous in vivo production of CNTF, alone or in combination with other trophic factors, for the treatment of ALS.
  • the cDNA and the human and murine CNTF gene were cloned and sequenced (EP385,060; WO91 / 04316.
  • neurotrophic factors which can be used in the context of the present invention are, for example IGF-1 (Lewis et al., 1993) and Fibroblast Growth Factors (FGFa, FGFb).
  • IGF-1 Lewis et al., 1993
  • FGFa Fibroblast Growth Factors
  • IGF-I and FGFa are very interesting candidates.
  • the sequence of the FGF ⁇ gene has been described in the literature, as well as vectors allowing its expression in vivo (WO95 / 25803).
  • genes coding for BDNF, GDNF, CNTF and NT3 are very particularly advantageous for the implementation of the present invention.
  • the expression system of the invention allows the production of a single neurotrophic factor in vivo.
  • the expression system only has one expression cassette.
  • the expression system of the invention allows the production in vivo of a neurotrophic factor chosen from neurotrophins, neurokines and TGFs. It is more preferably a factor chosen from BDNF, GDNF, CNTF, NT3, FGFa and IGF-1.
  • the expression system of the invention allows the production of two neurotrophic factors in vivo.
  • the expression system comprises either two expression cassettes, or a single cassette allowing the simultaneous expression of two nucleic acids (bicistronic unit).
  • the system comprises two expression cassettes, these can use identical or different promoters.
  • the expression system of the invention allows the production in vivo of the following combinations of neurotrophic factors: BDNF and GDNF; BDNF and NT3; GDNF and NT3, CNTF and BDNF, CNTF and NT3, CNTF and GDNF.
  • the Applicant has indeed shown that the administration of 2 systems for the expression of neurotrophic factors results in an important therapeutic effect.
  • promoters of identical or similar strength are generally used, and an identical or sinuous copy number of nucleic acids.
  • the respective amount of the two factors produced in vivo is fairly close.
  • the expression cassette (s) advantageously form part of a vector. It may in particular be a viral or plasmid vector. In the case of an expression system comprising several expression cassettes, the cassettes can be carried by separate vectors, or by the same vector.
  • the vector used can be a standard plasmid vector, comprising, in addition to the expression cassette (s) according to the invention, an origin of replication and a marker gene.
  • an origin of replication and a marker gene.
  • Different types of improved vectors have also been described, lacking a marker gene and an origin of replication (PCT / FR96 / 00274) or having, for example, an origin of conditional replication (FR95 10825). These vectors can be used advantageously in the context of the present invention.
  • the vector used can also be a viral vector.
  • Different vectors have been constructed from viruses, with remarkable gene transfer properties. Mention may more particularly be made of adenoviruses, retroviruses, AAV and the herpes virus.
  • the genome of these viruses is modified so as to render them incapable of autonomous replication in a cell. These viruses are said to be defective for replication.
  • the genome is modified by substitution of the essential regions in trans for viral replication by the expression cassette (s).
  • Adenoviruses are linear double-stranded DNA viruses around 36 (kilobases) kb in size. Their genome includes in particular a repeated inverted sequence (ITR) at each end, an encapsidation sequence (Psi), early genes and late genes.
  • ITR inverted sequence
  • Psi encapsidation sequence
  • the main early genes are contained in the regions E l, E2, E3 and E4. Among these, the genes contained in the region E l in particular are necessary for viral propagation.
  • the main late genes are contained in regions L1 to L5.
  • the genome of the Ad5 adenovirus has been fully sequenced and is accessible on the database (see in particular Genebank M73260). Likewise, parts or even all of other adenoviral genomes (Ad2, Ad7, Ad 12, etc.) have also been sequenced.
  • adenovirus constructs derived from adenoviruses have been prepared, incorporating different therapeutic genes. More particularly, the constructions described in the prior art are deleted adenoviruses from the E1 region, essential for viral replication, at the level of which heterologous DNA sequences are inserted (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195 ; Gosh-Choudhury et al., Gene 50 (1986) 161). Furthermore, to improve the properties of the vector, it has been proposed to create other deletions or modifications in the genome of the adenovirus.
  • a heat-sensitive point mutation was introduced into the mutant tsl 25, making it possible to inactivate the DNA binding protein of 72kDa (DBP) (Van der Vliet et al., 1975).
  • DBP 72kDa
  • Other vectors include a deletion of another region essential for viral replication and / or spread, the E4 region.
  • the E4 region is indeed involved in the regulation of the expression of late genes, in the stability of nuclear RNA late, in the extinction of the expression of host cell proteins and in the efficiency of viral DNA replication.
  • Adenoviral vectors in which the E1 and E4 regions are deleted therefore have a background of transcription and an expression of very reduced viral genes.
  • adenoviruses described in the literature are produced from different serotypes of adenovirus II indeed exist different serotypes of adenovirus. whose structure and properties vary somewhat, but which have a comparable genetic organization More particularly, the recombinant adenoviruses can be of human or animal origin. As regards adenoviruses of human origin, mention may preferably be made of those classes in group C, in particular adenoviruses of type 2 (Ad2), 5 (Ad5), 7 (Ad7) or 12 (Ad 12).
  • adenoviruses of animal origin mention may preferably be made of adenoviruses of canine origin, and in particular all the strains of the adenoviruses CAY2 [Manhattan strain or A26 / 61 (ATCC VR-800) for example].
  • Other adenoviruses of animal origin are cited in particular in application WO94 / 26914 incorporated herein by reference
  • the recombinant adenovirus is a human adenovirus of group C More preferably. it is an Ad2 or Ad5 adenovirus.
  • Recombinant adenoviruses are produced in an packaging line. That is to say a cell line capable of complementing in trans one or more of the deficient functions in the recombinant adenoviral genome.
  • a cell line capable of complementing in trans one or more of the deficient functions in the recombinant adenoviral genome.
  • One of these lines is for example the line 293 in which a part of the adenovirus genome has been integrated. More specifically, line 293 is a human embryonic kidney cell line containing the left end (approximately 1 1 -12%) of the genome of the adenovirus serotype 5 (Ad5), comprising the left ITR, the region packaging.
  • This line is capable of trans-complementing recombinant adenoviruses defective for the region E l, it is that is to say devoid of all or part of the El region, and of producing viral stocks having high titers
  • This line is also capable of producing, at permissive temperature (32 ° C.), stocks of virus further comprising the mutation E2 thermosensitive
  • Other cell lines capable of complementing the E l region have been described, based in particular on human lung carcinoma cells A549 (W094 / 28152) or on human retinoblasts (Hum Gen Ther (1996) 215) , lines capable of trans-complementing several functions of the adenovirus have also been described.
  • the cassette for expression of the therapeutic gene (s) can be inserted at different sites in the genome of the recombinant adenovirus, according to the techniques described in the prior art. It can first of all be inserted at the level of the El deletion. It can also be inserted at the E3 region, in addition to or in substitution for sequences It can also be located at the deleted E4 region For the construction of vectors carrying two expression cassettes, one can be inserted at the region El, the other at the level of region E3 or E4 The two cassettes can also be introduced at the level of the same region As indicated above, in the case of expression systems comprising several expression cassettes, the cassettes can be carried by separate vectors, or by the same vector.
  • the present invention relates more specifically to the development of vectors which are particularly effective for delivering in vivo and in a localized manner, therapeutically active amounts of GDNF, BDNF, NT3 and CNTF. More precisely, the present invention relates to the injection by the systemic route of an expression system comprising two gene transfer vectors each carrying a gene coding for a neurotrophic factor. The invention also relates to the injection by the systemic route of an expression system comprising a bicistronic vector allowing the coexpression of the two genes.
  • the present invention relates to the injection by the systemic route, of an expression system comprising two vectors, one carrying the gene coding for CNTF and the other the gene coding for NT3, or one the gene coding for CNTF and the other coding for BDNF, or one coding for GDNF and the other coding for NT3.
  • the transfer vectors used are adenoviral vectors.
  • the Applicant has indeed shown the effectiveness of the use of adenoviruses encoding neurotrophic factors injected by the z ' .v route. when treating different animal models of ALS.
  • the results presented in the examples show, for the first time on an animal model of a familial form of ALS, FALS GWA mice, a significant increase in lifespan, accompanied by better electromyographic performance.
  • the only treatment currently offered to patients with ALS is riluzole
  • pmn mice Another model of ALS is pmn mice, characterized by earlier and faster degeneration of motor neurons and an average lifespan of approximately 40 days.
  • the results presented in the examples show that the therapeutic approach according to the invention makes it possible to extend the average lifespan of pmn mice from 40 to 53 days, which constitutes a significant improvement of more than 30%. This prolongation of the treated pmn mice is also accompanied by a significant reduction in their motor neuron degeneration.
  • the in vivo production of trophic factors is obtained by systemic administration.
  • Systemic administration is preferably an intravenous or intra arterial injection. Intravenous injection is particularly preferred. This injection method is also advantageous in terms of tolerance and ease of access. It also makes it possible to inject larger volumes than intramuscular injection, and repeatedly.
  • the present invention also relates to any pharmaceutical composition comprising a system for the expression of two neurotrophic factors.
  • the pharmaceutical compositions of the invention advantageously contain pharmaceutically acceptable vehicles for an injectable formulation.
  • saline solutions monosodium phosphate, disodium phosphate, sodium chloride, potassium, calcium or magnesium, etc., or mixtures of such salts
  • sterile, isotonic, or dry compositions in particular lyophilized which, by addition according to the case of stenhsee water or physiological saline, allow the constitution of injectable solutes
  • Other excipients can be used such as for example stabilizing proteins (human serum albumin in particular FR96 03074) or a hydrogel
  • This hydrogel can be prepared from any biocompatible and non-cytotoxic (homo or hetero) polymer.
  • Such polymers have, for example, been described in application WO93 / 08845. Some of them, in particular those obtained from ethylene oxide and / or propylene, are Furthermore, when the expression system is composed of plasmid vectors. it may be advantageous, in the pharmaceutical compositions of the invention, to add chemical or biochemical agents promoting the transfer of genes In this regard, mention may more particularly be made of cationic polymers of polylysine type, (LKLK) n, (LKKL) n as described in application W095 21931. immine polyethylene (WO96 / 02655) and DEAF dextran or even canonical lipids or lipofectants. They have the property of condensing DNA and promoting its association with the cell membrane.
  • the doses of expression system administered depend on several factors, and in particular the vector used, the neurotrophic factor (s) involved, the type of promoter used, the stage of the pathology or even the duration of the treatment sought.
  • the expression system is administered in the form of doses comprising from 0.1 to 500 mg of DNA per kilogram preferably from 1 to 100 mg of DNA per kilogram. Doses of approximately 10 mg DNA / kg are generally used.
  • recombinant adenoviruses they are advantageously formulated and administered in the form of doses of between 10 ⁇ and 4 pf U ⁇ e t and preferably 10 ° at l ⁇ '0 pfu.
  • pfu plaque forming unit
  • plaque forming unit corresponds to the infectious power of an adenovirus solution. and is determined by infection of an appropriate cell culture, and measures, generally after 15 days, the number of plaques of infected cells. The techniques for determining the pfu titer of a viral solution are well uu umcntées in the literature.
  • the injection can be carried out using different devices, in particular syringes or by infusion. Injection using syringes is preferred. Furthermore, repeated injections can be given to further increase the therapeutic effect.
  • this treatment can also be applied in combination with riluzole.
  • the invention thus relates to a pharmaceutical composition comprising an expression system according to the invention and a pharmacologically effective amount of riluzole, for simultaneous or spaced-apart administration over time.
  • Figure 1 Comparison of electromyographic performance of FALS G ⁇ mice with or without administration of an expression system of a CNTF-GDNF combination.
  • Figure 2 Comparison of electromyographic performance of FALS mice ( ⁇ ,tician ⁇ with or without administration of an NT3 expression system.
  • transgenic mice expressing mutated forms of SOD responsible for familial forms of ALS have been constructed in an attempt to obtain a mouse model of the pathology.
  • Transgenic mice overexpressing mutated human SOD carrying a substitution of glycine 93 for aianin exhibit progressive motor neuron degeneration resulting in paralysis of the limbs, and die at the age of 4-6 months (Gumey et al., 1994).
  • the first clinical signs consist of a tremor of the limbs at around 90 days, then a reduction in the length of steps to 125 days (Chiu et al., 1995).
  • vacuoles of mitochondrial origin are observable in motor neurons from around 37 days, and motor neuron loss can be observed from 90 days (Chiu et al., 1995).
  • Myelinated axon damage is observed mainly in the ventral marrow and little in the dorsal region.
  • Compensatory collateral reinervation phenomena are observed at the level of the motor plates (Chiu et al., 1995).
  • mice ⁇ 1 ⁇ .
  • Mice FALS G9 Constitute a very good animal model for the study of pathophysiological mechanisms of SL ⁇ and for the development of therapeutic strategies. They share in common with familial forms of ALS a common pathophysiological origin (SOD mutation), a large number of histopathological and electromyographic characteristics. Thus, we have characterized in the laboratory the electromyographic performance of FALS mice (! 91 ⁇ .
  • mice FALS c ⁇ meet the Lambert criteria for ALS (Kennel et al., 1996): (1) reduction in the number of motor units with concomitant collateral reinervation; (2) presence of spontaneous denervation activity (fibrillations) and fasciculation in the hind and anterior limbs; (3) modification of the motor conduction speed correlated with a decrease of the evoked motor response; (4) no sensory impairment. Furthermore, we have shown that facial nerve damage is rare, even in elderly FALS 09 , A mice, which is also the case in patients.
  • the FALSG93A mice come from Transgenic Alliance (L'Arbresle,
  • Pregnant females are delivered every week. They give birth in the laboratory pet store. Heterozygous mice developing the disease are identified by PCR after removing a piece of tail and extracting DNA. There are other animal models presenting motor neuron degenerations (Stllevis-Smitt & De Jong, 1989; Pnce et al., 1994), either following an acute neurotoxic lesion (treatment with IDPN, with excitotoxins) or due to a genetic defect (wobbler mouse, pmn, Mnd, HCSMA dog).
  • pmn mice are particularly well characterized clinically, histologically (Schmalbruch 1991) and electromyographically (Kennel, 1996) The pmn mutation is transmitted in the autosomal recessive mode and has been localized on chromosome 13. Les.
  • pmn homozygous mice develop muscle atrophy and paralysis that manifests in the hind limbs from two to three weeks of age and then become generalized All untreated pmn mice die before six to seven weeks of age Degeneration of their motor neurons begins at the nerve endings and leads to a massive loss of myelinated fibers in the motor nerves and in particular in the phrenic nerve which ensures the innervation of the diaphragm (Schmalbruch 1991) Unlike the FALSc mouse, 93A ' this muscular uptake is very fast and is hardly accompanied by signs of re-reservation by collateral regrowth Axonal On the electromyographic level, the process of muscle denervation is characterized by the appearance of fibrillations and by a significant reduction in the amplitude of the muscular response evoked after supramaximal electrical stimulation of the nerve (Kennel et al 1996)
  • mice A line of Xt / pmn transgenic mice was also used as another mu ⁇ n model of ALS. These mice were obtained by a first cross between C57 / B156 or DBA2 female mice and Xtpmn / Xt pmn male mice (strain 129), followed by a second between Xt p nu l / Xt pmn 'heterozygous females (NI) with initial males.
  • NI heterozygous females
  • mice (N2)
  • the double heterozygotes Xt p mn / Xt pmn (called “mouse Xt pmn") carrying an Xt allele (demonstrated by the Extra-finger phenotype) and a pmn allele (determined by PCR) have been chosen for future crosses
  • plasmid vectors allowing the expression of one or two neurotrophic factors can be used. Mention may be made, for example, of the plasmids pCRII-BDNF and pSh-Ad-BDNF, which comprise a cassette for expression and secretion of BDNF (WO95 / 25804).
  • plasmids p-LTR-IX-GDNF containing a nucleic acid coding for GDNF under the control of the LTR promoter (WO95 / 26408) as well as the plasmid p-LTR-IX- preNGF / CNTF containing the sequence of the CNTF gene behind the signal sequence of betaNGF as well as the inverted repeat sequences (ITR) of the adenoviral genome, the LTR sequences of the Rous Sarcoma virus promoter (RSV). packaging sequences as well as adenoviral sequences necessary for homologous recombination.
  • any plasmid comprising an origin of replication and a marker gene can be used to construct an expression system according to the invention, by insertion of one or more cassettes of expression of a neurotrophic factor.
  • the plasmids can be preparations in a eukaryotic or prokaryotic cell host.
  • the viral vectors and in particular the adenoviruses, constitute a particularly preferred embodiment of the invention
  • the recombinant adenoviruses used below were obtained by homologous recombination according to the techniques described in the prior art. In short, they are constructed in 293 cells, by recombination between a linearized viral genome fragment (dl324) and a plasmid containing the left ITR, the packaging sequences, the transgene as well as its promoter and viral sequences allowing the recombination.
  • the viruses are amplified on 293 cells. They are regularly repurified in the P3 of our laboratory.
  • the viral genomes can also be prepared in a prokaryotic cell according to the technique described in application WO96 / 25506.
  • - Ad-CNTF Recombinant adenovirus of serotype Ad5 comprising, inserted into its genome in place of the deleted region E1, a cassette for expression of the CNTF gene composed of the cDNA coding for CNTF under the control of a transcriptional promoter (in particular the RSV LTR). Details of the construction are given in application WO94 / 08026. Alternative constructs include an additional deletion in the E4 region, as described in application WO96 / 22378 or in the E3 region.
  • Ad-GDNF Recombinant adenovirus of serotype Ad5 comprising, inserted into its genome in place of the deleted region E1, a GDNF expression cassette composed of the cDNA coding for GDNF under the control of a transcriptional promoter (in particular the RSV LTR). Details of the construction are given in application WO95 / 26408). An alternative construction comprises an additional deletion in the E4 region, as described in application WO96 / 22378.
  • Ad-NT3 Recombinant adenovirus of serotype Ad5 comprising, inserted into its genome in place of the deleted region E1, an expression cassette for the NT.3 gene composed of the cDNA coding for NT3 under the control of a transcriptional promoter (in particular the RSV LTR).
  • An alternative construction includes an additional deletion in the E4 region. as described in application W096 / 22378.
  • Ad-BDNF Recombinant adenovirus of serotype Ad5 comprising, inserted into its genome in place of the deleted region E1, a BDNF expression cassette composed of the cDNA coding for BDNF under the control of a transcriptional promoter (in particular the RSV LTR). Details of the construction are given in application WO95 / 25804). An alternative construction comprises an additional deletion in the E4 region, as described in application WO96 / 22378.
  • Ad-FGFa Recombinant adenovirus of serotype Ad5 comprising, inserted into its genome in place of the deleted region E1, an FGFa expression cassette composed of cDNA coding for FGFa under the control of a transcriptional promoter (in particular the LTR of RSV)
  • a transcriptional promoter in particular the LTR of RSV
  • An alternative construction comprises an additional deletion in the E4 region, such as described in application W096 / 22378
  • the functionality of the constructed viruses is verified by infection of fibroblasts in culture.
  • the presence of the corresponding neurotrophic factor is analyzed in the culture supernatant by ELISA and / or by highlighting the trophic properties of this supernatant on primary neuronal cultures.
  • mice 10 9 pfu of each of the adenoviruses (final volume 200 ⁇ l) are thus injected into the caudal vein using 1 a Ham ⁇ lton-type microsyringe ( ⁇ In newborn pmn mice (age 2-3 days), identified by 1 absence of a supernumerary finger, 2 ⁇ 10 9 pfu (final volume 20 ⁇ l) of the adenoviral suspension are injected into the retinal vein a 1 using an insulin-type microsyringe fitted with a 30 G needle. Newborn animals are slightly anaesthetized with 1 ether and in a hypothermic state.
  • the animals are anesthetized by intrapentoneal injection of a mixture of diazepam (Vahum®, Roche. France) and ketamine hydrochloride (Ketalar®, France) at a rate of 2 ⁇ g / g and 60 ⁇ g / g of body weight respectively
  • the electromyograph used is a latest generation device (Keypo ⁇ nt ( B) with all the software necessary for the acquisition and processing of electromyographic signals. This equipment is rented from the company Dantec (Les Uhs, France) Electromyography of stimulus detection response evoked motor fREM)
  • the muscles innervated by this nerve are the seat of an electrical response This occurs after a certain time (distal latency) which corresponds to the time from conduction of stimulation to the synapses , to which is added the signal transmission time in the synapse
  • the amplitude of the response is proportional to the quantity of innervated muscle fibers
  • the animals are killed by an overdose of chloroform and perfused intracardiac with a glutaraldehydc solution.
  • the phrenic nerves are isolated, sampled, postfixed. by tetroxide osmium and included in the epoxy.
  • the phrenic nerves are cut close to the diaphragm, sections with a 3 .mu.m thickness are stained with paraphenyldiamine and analyzed by light microscopy.
  • mice 2 to 3 days old, identified by the absence of a supernumerary finger were used for the injection of adenoviral vector.
  • AdlacZ coding in E. coli for ⁇ -galactosidase (Stratford-Perncaudet. 1992), was used as an adcnoviral control vector.
  • treatment of pmn mice with AdCNTF induces a reduction of 20% in the loss of myelinated fibers (Fig. 4).
  • results show that all the animals in the treated group died at an age greater than or equal to the age of the oldest living animal in the control group. These results also show an increase in the lifespan in the animals treated with 30 days on average, compared to control animals. These results are particularly unexpected and, compared to the 13 days obtained with Rilutek®, demonstrate the therapeutic potential of the method of the invention.
  • Ad-NT3 Ad-NT3
  • Ad-BDNF adenovirus 10 9 pfu of Ad-BDNF adenovirus were injected (tail vein) using a microsyringe in a final volume of 200 ⁇ l to 4 animals aged 99 days. Over time, the electromyographic performances of the animals are monitored and compared to a control group. The average life is also recorded.

Abstract

La présente demande concerne une nouvelle méthode pour le traitement de maladies motoneurales et en particulier de la sclérose latérale amyotrophique. Elle repose plus particulièrement sur l'administration systémique de systèmes d'expression de facteurs neurotrophiques.

Description

METHODE DE TRAITEMENT DE LA SCLEROSE LATERALE AMYOTROPHIOUE
La présente invention concerne une nouvelle méthode pour le traitement de maladies motoneurales et en particulier de la sclérose latérale amyotrophique. Elle concerne également des vecteurs et des compositions pharmaceutiques permettant l'expression prolongée de facteurs thérapeutiques, utilisables pour le traitement de la SLA. Plus précisément, la présente invention concerne ie traitement de la SLA par administration systémique de gènes thérapeutiques.
La sclérose latérale amyotrophique (SLA), aussi connue sous le nom de maladie de Charcot et maladie de Lou Gehrig a été décrite pour la première fois par Charcot en 1865. La SLA est une maladie mortelle résultant de la dégénérescence des motoneurones et des voies corticospinales. Avec une incidence actuellement de 2,5/100 000 et en constante augmentation, une prévalance de 6-10/100 000, la SLA affecte 90 000 personnes dans les pays développés, pour la plupart des adultes encore jeunes (entre 50 et 60 ans). La maladie s'accompagne d'une paralysie progressive, conduisant à la perte totale des fonctions motrices et respiratoires puis à la mort dans un délai de deux à huit ans après l'apparition des premiers symptômes (trois ans en moyenne).
5 % des cas de SLA sont d'origine familiale et 95 % des cas sont sporadiques. L'origine physiopathologique des formes sporadiques de SLA demeure inconnue. Plusieurs hypothèses ont été proposées. La dégénérescence motoneuronale pourrait résulter d'une altération du métabolisme du glutamate conduisant à une augmentation des concentrations de cet acide aminé excitateur dans le cortex moteur et la moelle épinière (hypothèse "excitotoxique", revue dans Rothstein, 1995). La possibilité d'une composante autoimmune a également été invoquée sur la base de la présence d'auto-anticorps contre les canaux calciques sensibles au voltage chez certains patients (revue dans Appel et coll., 1995). L'implication de facteurs environnementaux tels l'exposition à certains virus (revue dans Gastaut, 1995), ou à l'aluminium (Yase, 1984) est également possible. Les études portant sur les formes héréditaires de SLA ont permis de montrer que des mutations ponctuelles dans le gène de la superoxyde dismutase à cuivre et zinc, localisée sur le chromosome 21q22- l , sont responsables de la pathologie dans 20 % des formes familiales (Rosen et coll., 1993, revue dans Rowland. 1995). Ces mutations ne provoquent pas de diminution de l'activité dismutase de la SOD (revue dans Rowland, 1995). Les enzymes mutées produisent des radicaux hydroxyl potentiellement cytotoxiques qui ne sont pas produits par la SOD sauvage (Yim et coll., 1996). L'étude approfondie de l'effet fonctionnel des mutations sur l'activité enzymatique de la SOD et sur la viabilité cellulaire devrait permettre à terme de comprendre la physiopathologie des formes familiales de SLA, et par extension d'éclairer la physiopathologie de l'ensemble des formes de SLA.
Des travaux portant sur les facteurs susceptibles d'influencer la survie des motoneurones ont permis de mettre en évidence un rôle neuroprotecteur potentiel de plusieurs facteurs neurotrophiques (revue dans Windebank, 1995; Henderson. 1995). Ainsi, des effets de protection motoneuronale in vitro ont été observés avec notamment le BDNF (Oppenheim et coll., 1 92, Yan et coll., 1992, Scndtner et coll., 1992, Henderson et coll., 1993, Vejsada ct coll., 1995), le NT-3 (Henderson et coll., 1993), le GDNF (Henderson et coll., 1994, Oppenheim et coll.. 1995), trois cytokines, le CNTF, le LIF (revue dans Henderson, 1995) et la cardiotrophine-I (Pennica et coll., 1996), avec l'IGF-l (Lewis et coll., 1993) et des membres de la famille des FGFs (Hughes et coll., 1993). L'ensemble de ces données suggère que les facteurs neurotrophiques cités renforcent la survie des motoneurones dans diverses conditions expérimentales. Toutefois l'utilisation de facteurs neurotrophiques dans des modèles animaux de SLA ou en clinique humaine n'a pas donné jusqu'à présent de résultats probant. Cette utilisation n'a jamais démontré d'effet thérapeutique et s'est toujours accompagnée d'effets secondaires indésirables tels que perte de poids, inflammation, fièvre, etc, qui limitent l'intérêt des facteurs trophiques dans le traitement de la SLA et ont conduit à l'interruption prématurée des premiers essais cliniques SLA-CNTF par Regeneron (administration systémique) (Barinaga et al., 1994). Il n'a donc pas été possible jusqu'à présent ni de confirmer l'intérêt des facteurs neurotrophiques pour le traitement de la SLA. ni d'exploiter leurs propriétés pour une éventuelle approche thérapeutique.
De ce fait, il n'existe à l'heure actuelle aucun moyen permettant de guérir la SLA et très peu de médicaments ayant un effet thérapeutique. Le Rilutek^ constitue le seul traitement disponible aujourd'hui. L'administration de riluzole Rilutek®) permet de ralentir la progression de la maladie, mais il n'a pas été démontré d'effet thérapeutique sur la fonction moteur. Par ailleurs, des essais cliniques basés sur l'administration de CNTF ont été interrompus prématurément, faute de résultats (Barinaga et al. 1994). Il existe donc aujourd'hui un besoin réel et important de disposer d'une méthode permettant de traiter les troubles des motoneurones. et en paπiculier la SLA.
La présente invention a notamment pour objectif de proposer une approche nouvelle pour le traitement des pathologies des motoneurones. telles que la SLA. basée sur la thérapie génique. Plus particulièrement, la présente invention décrit des systèmes vecteurs permettant de promouvoir directement la survie des neurones moteurs impliqués dans ces pathologies, par l'expression efficace et prolongée de certains facteurs trophiques.
Un premier aspect de l'invention concerne une méthode de traitement de la SLA comprenant l'administration systémique d'un acide nucléique codant pour un facteur neurotrophique. Un autre aspect de l'invention concerne l'utilisation d'un acide nucléique codant pour un facteur neurotrophique pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement de la SLA. Un autre aspect de l'invention réside dans la construction de vecteurs particuliers, permettant l'expression de quantités thérapeutiquement effectives vis-à-vis de la SLA de facteurs trophiques. Un autre aspect de l'invention concerne l'administration de systèmes d'expression permettant la production d'un ou plusieurs facteurs trophiques. ainsi que des compositions pharmaceutiques comprenant lesdits systèmes d'expression. Elle concerne également la création de nouveaux vecteurs permettant la co-expression de facteuis trophiques in vivo
La présente invention concerne donc plus précisément une nouvelle méthode de traitement de la SLA basée sur l'expression continue in vivo de facteurs trophiques
La présente invention montre maintenant qu'il est possible d'obtenir in vivo un effet thérapeutique particulièrement piononce par production in vivo de facteurs neurotrophiques La demanderesse a notamment montre que l'injection in vivo de systèmes d'expression de facteurs neurotrophiques, par la voie systémique, permettait d'obtenir une production continue de facteur thérapeutique et que cette production était suffisante pour obtenir un bénéfice thérapeutique dans les pathologies motoneuronales, en particulier la SLA Ainsi la demanderesse a montre que l'adminiaStration systémique de ces systèmes d'expression conduisait a une augmentation très significative de la durée de vie, accompagnée d'une amélioration de la réponse évoquée motrice telle que déterminée par electromyographie Les résultats décrits démontrent que cette voie d'administration permet d'obtenir une biodisponibilite appropriée des facteurs neurotrophiques, sans effet de toxicité Cette approche thérapeutique permet donc de produire des quantités therapeutiquement actives de molécules, tout en restant en deçà du seuil de toxicité de ces molécules Ainsi, alors qu'une protéine de la taille d'un facteur neurotrophique, administrée de manière systémique, ne pénètre le système nerveux qu'avec une faible efficacité en raison de l'existence de la barrière hemato-encephalique, la méthode de l'invention permet d'obtenir, de façon inattendue, un effet thérapeutique important Par ailleurs, la méthode de l'invention permet d'utiliser des doses de facteurs thérapeutiques qui sont en deçà du seuil de toxicité, et n'induisent pas d'effets secondaires
Un premier objet de l'invention réside donc dans un procède de traitement de la SLA comprenant l'administration, par voie systémique, d'un système d'expression d'un facteur neurotrophique. Un autre objet de l'invention réside également dans l'utilisation d'un système d'expression d'un facteur neurotrophique pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement de la SLA, par administration par voie systémique L'invention concerne également une méthode pour prolonger la durée de vie de mammifères atteints de la SLA comprenant l'administration, par voie systémique, d'un système d'expression d'un facteur neuiotrophique
Au sens de l'invention, le terme "système d'expression" désigne toute construction permettant l'expression in vivo d'un acide nucléique codant pour un facteur neurotrophique Avantageusement, le système d'expression comprend un acide nucléique codant pour un facteur neurotrophique sous le contrôle d'un piomoteur transcnptionnel (cassette d'expression) Cet acide nucléique peut être un ADN ou un ARN S'agissant d'un ADN, on peut utiliser un ADNc, un ADNg ou un ADN hybride, c'est-a-dire un ADN contenant un ou plusieurs introns de l'ADNg, mais pas tous L'ADN peut également être un synthétique ou semi-synthetique, et en particulier un ADN synthétise artificiellement pour optimiser les codons ou créer des fonnes réduites
Le promoteur transcnptionnel peut être tout promoteur fonctionnel dans une cellule mammifère, de préférence humaine II peut s'agir de la région promotrice naturellement responsable de l'expression du facteur neurotrophique considère lorsque celle-ci est susceptible de fonctionner dans la cellule ou l'organisme concernes II peut également s'agir de régions d'origine différente (lesponsables de l'expression d'autres protéines, ou même synthétiques) Notamment, il peut s'agir de régions promotrices de gènes eucaryotes ou viraux Par exemple, il peut s'agir de régions promotrices issues du génome de la cellule cible Parmi les promoteurs eucaryotes, on peut utiliser tout promoteur ou séquence dérivée stimulant ou réprimant la transcription d'un gène de façon spécifique ou non, mductible ou non, forte ou faible II peut s'agir en particulier de promoteurs ubiquitaires (promoteur des gènes HPRT, PGK, α-actine, tubuline, etc), de promoteurs des filaments intermédiaires (promoteur des gènes GFAP, desmine, vimentine, neurofilaments, kératine, etc), de promoteurs de gènes thérapeutiques (par exemple le promoteur des gènes MDR. CFTR, Facteur VIII, ApoAl, etc), de promoteurs spécifiques de tissus (promoteur du gène pyruvate kinasc, villine, protéine intestinale de liaison des acides gras, α-actine du muscle lisse, etc) ou encore de promoteurs repondant a un stimulus (récepteur des hormones steroides, récepteur de l'acide retinoique, etc) De même, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome d'un virus, tel que par exemple les promoteurs des gènes E l A et MLP d'adenovirus, le promoteur précoce du CMV, ou encore le promoteur du LTR du RSV, etc En outre, ces régions promotrices peuvent être modifiées pai addition de séquences d'activation, de régulation, ou permettant une expression tissu-specifique ou majoritaire
On utilise avantageusement dans le cadre de l'invention un promoteui constitutif eucaryote ou viral II s'agit plus particulièrement d'un promoteui choisi parmi le promoteur des gencs HPR1 , PGK, α-actine, tubuline ou le promoteur des gènes El A et MLP d'adenovirus, le promoteur précoce du CMV, ou encore le promoteur du LTR du RSV
Par ailleurs, la cassette d'expression comporte avantageusement une séquence signal dirigeant le produit synthétise dans les voies de sécrétion de la cellule cible Cette séquence signal peut être la séquence signal naturelle du produit synthétise, mais il peut également s'agir de toute autre séquence signal fonctionnelle, ou d'une séquence signal artificielle
Enfin, la cassette d'expression comprend généralement une région située en 3', qui spécifie un signal de fin transcπptionnelle et un site de polyadenylation
Les facteurs trophiques utilisables dans le cadre de l'invention se classent essentiellement dans trois familles la famille des neurotrophines, la famille des neurokines, et la famille du TGF beta (pour revue, voir Henderson Adv Neurol 68 ( 1995) 235)
Plus préferentiellement, dans la famille des neurotrophines, on préfère utiliser dans le cadre de l'invention le BDNF, le NT-3 ou le NT-4/5 Le facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF), décrit par Thoenen (Trends in NeuroSci. 14 ( 1991 ) 165), est une protéine de 1 18 acides aminés et de poids moléculaire 13,5 kD. In vitro, le BDNF .stimule la formation de neurites et la survie en culture des neurones ganglionaires de la rétine, des neurones cholinergiques du septum ainsi que des neurones dopaminergiques du mesencephale (revue par Lindsay in Neurotrophic Factors, Ed, (1993) 257, Académie Press). La séquence d'ADN codant pour le BDNF humain et pour le BDNF de rat a été clonée et séquencée (Maisonpierre et al., Genomics 10 ( 1991 ) 558), ainsi que notamment la .séquence codant pour le BDNF de porc (Leibrock et al., Nature 341 ( 1989) 149). Bien que ses propriétés soient potentiellement intéressantes, l'application thérapeutique du BDNF se heurte à différents obstacles. En particulier, l'absence de biodisponibilité du BDNF limite toute utilisation thérapeutique. Le facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF) produit dans le cadre de la présente invention peut être le BDNF humain ou un BDNF animal.
La neurotrophine 3 (NT3) est une protéine sécrétée de 1 19 aa qui pennet la survie in vitro de neurones même à des concentrations très faibles. (Henderson et al. Nature 363,266-270 (1993)). La séquence du cDNA codant pour la NT3 humaine a été décrite (Hohn et al., Nature 344 (1990) 339).
La famille du TGF-B comprend notamment le facteur neurotrophique dérivé des cellules gliales. Le facteur neurotrophique dérivé des cellules gliales, GDNF (L.- F. Lin et al., Science, 260, 1 130-1 132 (1993)) est une protéine de 134 acides aminés et de poids moléculaire de 16 kD. Il a la capacité essentielle de promouvoir in vitro la survie des neurones dopaminergiques et des motoneurones (revue dans Henderson. 1995). Le facteur neurotrophique dérivé des cellules gliales (GDNF) produit dans le cadre de la présente invention peut être le GDNF humain ou un GDNF animal. Les séquences d'ADNc codant pour le GDNF humain et le GDNF du rat ont été clouées et séquencées ( L.-F. Lin, D. Doherty. J. Lile, S. Besktesh, F. Collins. Science, 260. 1 130-1 132 ( 1993)). Un autre facteur neurotrophique utilisable dans le cadre de la présente invention est notamment le CNTF ("Ciliary NeuroTrophic Factor"). Le CNTF est une neurokine susceptible d'empêcher la mort des neurones. Comme indiqué précédemment, des es.sais cliniques ont été interrompus prématurément faute de résultats. L'invention permet maintenant la production prolongée et continue in vivo de CNTF, seul ou en combinaison avec d'autres facteurs trophiques, pour le traitement de la SLA. Le cDNA et le gène du CNTF humain et murin ont été clones et séquences (EP385 060; W091/04316.
D'nntres facteurs neurotrophiques utilisables dans le cadre de la présente invention sont par exemple l'IGF-l (Lewis et al., 1993) et les Facteurs de Croissance des Fibroblastes (FGFa, FGFb). En particulier, l'IGF-I et le FGFa sont des candidats très intéressants. La séquence du gène du FGFa a été décrite dans la littérature, ainsi que des vecteurs permettant son expression in vivo (WO95/25803).
Les gènes codant pour le BDNF, le GDNF, le CNTF et la NT3 sont tout particulièrement intéressants pour la mise en oeuvre de la présente invention.
Selon un premier mode de réaliaSation, le système d'expression de l'invention permet la production d'un seul facteur neurotrophique in vivo. Dans ce cas, le système d'expression ne comporte qu'une cassette d'expression. Préférentiellement, le système d'expression de l'invention permet la production in vivo d'un facteur neurotrophique choisi parmi les neurotrophines, les neurokines et les TGF. Il s'agit plus préférentiellement d'un facteur choisi parmi le BDNF, le GDNF, le CNTF, la NT3, le FGFa et l'IGF-l.
Selon un autre mode de réalisation, le système d'expression de l'invention permet la production de deux facteurs neurotrophiques in vivo. Dans ce mode de réalisation, le système d'expression comporte soit deux cassettes d'expression, soit une seule cassette permettant l'expression simultanée de deux acides nucléiques (unité bicistronique). Lorsque le système comprend deux cassettes d'expression, celles-ci peuvent utiliser des promoteurs identiques ou différents. Préférentiellement, le système d'expression de l'invention permet la production in vivo des combinaisons de facteurs neurotrophiques suivantes : BDNF et GDNF ; BDNF et NT3 ; GDNF et NT3, CNTF et BDNF, CNTF et NT3, CNTF et GDNF.
De manière avantageuse, la demanderesse a en effet montré que l'administration de 2 systèmes d'expression de facteurs neurotrophiques se traduisait par un effet thérapeutique important. Dans les systèmes d'expression de 2 facteurs neurotrophiques, on utilise généralement des promoteurs de force identique ou similaire, et un nombre de copie d'acides nucléiques identique ou sinviaire. De façon générale, la quantité respective des deux facteurs produits in vivo est assez proche. Il peut cependant être préférable dans certaines situations de produire des quantités différentes de chaque facteur. Dans ce cas, on peut utiliser soit des promoteurs de force différente, soit un système dans lequel sont présents des nombres de copies de gènes différents, soit varier les doses administrées.
Dans les systèmes d'expression de l'invention, la ou les cassettes d'expression font avantageusement partie d'un vecteur. Il peut s'agir en particulier d'un vecteur viral ou plasmidique. Dans le cas d'un système d'expression comportant plusieurs cassettes d'expression, les cassettes peuvent être portées par des vecteurs séparés, ou par le même vecteur.
Le vecteur utilisé peut être un vecteur plasmidique standard, comportant, en plus de la ou des cassettes d'expression selon l'invention, une origine de réplication et un gène marqueur. Différents types de vecteurs améliorés ont par ailleurs été décrits, dépourvus de gène marqueur et d'origine de réplication (PCT/FR96/00274) ou possédant par exemple une origine de réplication conditionnelle (FR95 10825). Ces vecteurs sont utilisables avantageusement dans le cadre de la présente invention.
Le vecteur utilisé peut également être un vecteur viral. Différents vecteurs ont été construits à partir de virus, ayant des propriétés de transfert de gènes remarquables. On peut citer plus particulièrement les adénovirus, les rétrovirus, les AAV et le virus de l'herpès. Pour leur utilisation comme vecteurs de transfert de gènes, le génome de ces virus est modifié de manière à les rendre incapable de réplication autonome dans une cellule. Ces virus .sont dits défectifs pour la réplication. Généralement, le génome est modifié par substitution des régions essentielles en trans à la réplication virale par la ou les cassettes d'expre-ssion.
Dans le cadre de l'invention, on préfère utiliser un vecteur viral dérivé des adénovirus. Les adénovirus sont des virus à ADN double brin linéaire d'une taille de 36 (kilobases) kb environ. Leur génome comprend notamment une séquence inversée répétée (ITR) à chaque extrémité, une séquence d'encapsidation (Psi), des gènes précoces et des gènes tardifs. Les principaux gènes précoces sont contenus dans les régions E l , E2, E3 et E4. Parmi ceux-ci, les gènes contenus dans la région E l notamment sont nécessaires à la propagation virale. Les principaux gènes tardifs sont contenus dans les régions Ll à L5. Le génome de l'adénovirus Ad5 a été entièrement séquence et est accessible sur base de données (voir notamment Genebank M73260). De même des parties, voire la totalité d'autres génomes adénoviraux (Ad2, Ad7, Ad 12, etc) ont également été séquencées.
Pour leur utilisation comme vecteurs de transfert de gènes, différentes constructions dérivées des adénovirus ont été préparées, incorporant différents gènes thérapeutiques. Plus particulièrement, les constructions décrites dans l'art antérieur sont des adénovirus délétés de la région El , essentielle à la réplication virale, au niveau de laquelle sont insérées les séquences d'ADN hétérologuc (Levrero et al., Gène 101 ( 1991 ) 195 ; Gosh-Choudhury et al., Gène 50 (1986) 161 ). Par ailleurs, pour améliorer les propriétés du vecteur, il a été proposé de créer d'autres délétions ou modifications dans le génome de l'adénovirus. Ainsi, une mutation ponctuelle thermosensible a été introduite dans le mutant tsl 25, permettant d'inactiver la protéine de 72kDa de liaison à l'ADN (DBP) (Van der Vliet et al., 1975). D'autres vecteurs comprennent une deletion d'une autre région essentielle à la réplication et/ou à la propagation virale, la région E4. La région E4 est en effet impliquée dans la régulation de l'expression des gènes tardifs, dans la stabilité des ARN nucléaires tardifs, dans l'extinction de l'expression des protéines de la cellule hôte ct dans l'efficacité de la réplication de l'ADN viral. Des vecteurs adenoviraux dans lesquels les régions El et E4 sont délétées possèdent donc un bruit de fond de transcription ct une expression de gènes viraux très réduits. De tels vecteurs ont été décrits pas exemple dans les demandes WO94/28152, WO95/02697, W096/22378. En outre, des vecteurs portant une modification au niveau du gène IVa2 ont également ete décrits (W096/10088).
Les adénovirus recombinants décrits dans la littérature sont produits a partir de différents serotypes d'adenovirus II existe en effet différents serotypes d'adenovirus. dont la structure et les propriétés varient quelque peu, mais qui présentent une organisation génétique comparable Plus particulièrement, les adénovirus recombinants peuvent être d'origine humaine ou animale. Concernant les adénovirus d'origine humaine, on peut citer préférentiellement ceux classes dans le groupe C, en particulier les adénovirus de type 2 (Ad2), 5 (Ad5), 7 (Ad7) ou 12 (Ad 12). Parmi les différents adénovirus d'origine animale, on peut citer préférentiellement les adénovirus d'origine canine, et notamment toutes les souches des adénovirus CAY2 [souche manhattan ou A26/61 (ATCC VR-800) par exemple]. D'autres adénovirus d'origine animale sont cites notamment dans la demande W094/26914 incorporée à la présente par référence
Dans un mode préféré de mise en oeuvre de l'invention, l'adénovirus recombinant est un adénovirus humain du groupe C De manière plus préférentielle. il s'agit d'un adénovirus Ad2 ou Ad5.
Les adénovirus recombinants sont produits dans une lignée d'encapsidation. c'est-à-dire une lignée de cellules capables de complémenter en trans une ou plusieurs des fonctions déficientes dans le génome adénoviral recombinant. L'une de ces lignées est par exemple la lignée 293 dans laquelle une partie du génome de l'adénovirus a été intégrée. Plus précisément, la lignée 293 est une lignée de cellules embryonnaires humaines de rein contenant l'extrémité gauche (environ 1 1 -12 %) du génome de l'adénovirus sérotype 5 (Ad5), comprenant l'ITR gauche, la région d'encapsidation. la région El , incluant E la ct El b, la région codant pour la protéine pIX et une partie de la région codant pour la protéine plVa2 Cette lignée est capable de trans-complementer des adénovirus recombinants defectifs pour la région E l , c'est-a-dire dépourvus de tout ou partie de la région El , et de produire des stocks viraux ayant des titres élevés Cette lignée est également capable de produire, a température permissive (32°C), des stocks de virus comportant en outre la mutation E2 thermosensible D'autres lignées cellulaires capables de complementer la région E l ont ete décrites, basées notamment sur des cellules de carcinome de poumon humain A549 (W094/28152) ou sur des retinoblaste humains (Hum Gen Ther ( 1996) 215) Par ailleurs, des lignées capables de trans-complementcr plusieurs fonctions de l'adénovirus ont également ete décrites En particulier, on peut citer des lignées complementant les régions El et E4 (Yeh et al , J Virol 70 ( 199b) 559 , Cancer Gen Ther 2 ( 1995) 322 , Kroughak et al , Hum Gen Ther 6 ( 1995) 1575) et des lignées complementant les régions E l et E2 (W094/28152, WO95/02697, WO95/27071 ) Les adénovirus recombinants sont habituellement produits par introduction de l'ADN viral dans la lignée d'encapsidation, suivie d'une lyse des cellules après environ 2 ou 3 jours (la cinétique du cycle adénoviral étant de 24 a 36 heures) Apres la lyse des cellules, les particules virales recombinantes sont isolées par centnfugation en gradient de chlorure de césium Des méthodes alternatives ont ete décrites dans la demande FR96 08164 incorporée a la présente par référence
La cassette d'expression du ou des gènes thérapeutiques peut être insérée en différents sites du génome de l'adénovirus recombinant, selon les techniques décrites dans l'art antérieur Elle peut tout d'abord être insérée au niveau de la deletion El Elle peut également être insérée au niveau de la région E3, en addition ou en substitution de séquences Elle peut également être localisée au niveau de la région E4 deletée Pour la construction de vecteurs portant deux cassettes d'expression, l'une peut être insérée au niveau de la région El , l'autre au niveau de la région E3 ou E4 Les deux cassettes peuvent également être introduites au niveau de la même région Comme indiqué ci-avant, dans le cas de systèmes d'expression comportant plusieurs cassettes d'expression, les cassettes peuvent être portées par des vecteurs séparés, ou par le même vecteur. La présente invention vise plus spécifiquement la mise au point de vecteurs particulièrement efficaces pour délivrer in vivo et de manière localisée, des quantités thérapeutiquement actives de GDNF, de BDNF, de NT3 et de CNTF. Plus précisément la présente invention concerne l'injection par voie systémique d'un système d'expression comprenant deux vecteurs de transferts de gènes portant chacun un gène codant pour un facteur neurotrophique. L'invention concerne également l'injection par voie systémique d'un système d'expression comprenant un vecteur bicistronique permettant la coexpression des deux gènes. Préférentiellement la présente invention concerne l'injection par voie systémique, d'un système d'expression comprenant deux vecteurs, l'un portant le gène codant pour le CNTF et l'autre le gène codant pour la NT3, ou l'un le gène codant pour la CNTF et l'autre le gène codant pour le BDNF, ou l'un le gène codant pour le GDNF et l'autre le gène codant pour la NT3.
D'une manière plus préférée, les vecteurs de transfert utilisés sont des vecteurs adénoviraux. La demanderesse à en effet montré l'efficacité de l'utilisation d'adenovirus codant pour des facteurs neurotrophiques injectés par voie z'.v. lors du traitement de différents modèles animaux de la SLA. En particulier, les résultats présentés dans les exemples montrent, pour la première fois sur un modèle animal d'une forme familiale de la SLA, les souris FALSGWA , une augmentation importante de la durée de vie, accompagnée de performances électromyographiques meilleures. Le seul traitement aujourd'hui proposé aux patients atteints de SLA est le riluzole
(Rilutek®) qui augmente de quelques mois l'espérance de survie des malades. Il a également été démontré que le riluzole administré aux souris FALSG93A pouvait augmenter de 13 jours leur durée de vie moyenne (Gurney et coll., 1996). On peut donc prédire que tout traitement augmentant de plus de 13 jours la durée de vie des souris FALSGI>, ^ est susceptible d'apporter aux patients un bénéfice thérapeutique supérieur à celui du riluzole. Les résultats présentés dans les exemples montrent que l'approche thérapeutique selon l'invention permet d'augmenter la durée de vie moyenne de souris FALSra,A jusqu'à 30 jours environ. Ceci constitue une amélioration très significative de la durée de vie, et représente la mise en évidence d'un bénéfice thérapeutique important sur des modèles de la SLA.
Les souris pmn constituent un autre modèle de la SLA, caractérisé par une dégénérescence plus précoce et plus rapide des motoneurones et par une durée de vie moyenne de 40 jours environ. Les résultats présentés dans les exemples montrent que l'approche thérapeutique selon l'invention permet de prolonger la durée de vie moyenne des souris pmn de 40 à 53 jours, ce qui constitue une amélioration significative de plus de 30 %. Cette prolongation des souris pmn traitées s'accompagne également d'une réduction significative de leur dégénérescence motoneuronale.
L'ensemble des résultats obtenus par cette nouvelle approche thérapeutique démontre pour la première fois une amélioration importante de différents paramètres cliniques, électromyographiques et histologiques, dans deux modèles différents de la SLA.
Selon l'invention, la production in vivo de facteurs trophiques est obtenue par administration systémique. Les résultats présentés dans les exemples montrent que ce mode d'administration permet d'obtenir une production régulière et continue d'un facteur trophique par l'organisme du patient lui même, et que cette production est suffisante pour générer un effet thérapeutique significatif. L'administration systémique est préférentiellement une injection intraveineuse ou intra artérielle. L'injection intra veineuse est particulièrement préférée. Ce mode d'injection est également avantageux en terme de tolérance et de facilité d'accès. Il permet en outre d'injecter de plus grands volumes que l'injection intramusculaire, et de façon répétée.
La présente invention concerne également toute composition pharmaceutique comprenant un système d'expression de deux facteurs neurotrophiques. Les compositions pharmaceutiques de l'invention contiennent avantageusement des véhicules pharmaceutiquement acceptables pour une formulation injectable. Il peut s'agir en particulier de solutions salines (phosphate monosodique, disodique. chlorure de sodium, potassium, calcium ou magnésium, etc, ou des mélanges de tels sels) stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées qui, par addition selon le cas d'eau stenhsee ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables D'autres excipients peuvent être utilises tels que par exemple des protéines stabilisatrices (serum-albumine humaine notamment FR96 03074) ou un hydrogel Cet hydrogel peut être prépare a partir de tout polymère (homo ou hetero) bio-compatible et non cytotoxique De tels polymères ont par exemple ete décrits dans la demande WO93/08845 Certains d'entre eux comme notamment ceux obtenus a partir d'oxyde d'ethylene et/ou de propvlene sont commerciaux Par ailleurs, lorsque le système d'expression est compose de \ ecteurs plasmidiques. il peut être avantageux, dans les compositions pharmaceutiques de l'invention, d'ajouter des agents chimiques ou biochimiques favorisant le transfert de gènes A cet égard on peut citer plus particulièrement les polymères cationiques de type polylysine, (LKLK)n, (LKKL)n tels que décrits dans la demande W095 21931. polyethylene immine (WO96/02655) et DEAF dextran ou encore les lipides canoniques ou lipofectants Ils possèdent la propriété de condenser l'ADN ct de promouvoir son association avec la membrane cellulaire Parmi ces derniers on peut citer les popolyamines (hoofectamine, transfectam, tels que décrits dans la demande W095/18863 ou W096/1 7823) différents lipides canoniques ou neutres (DOTMA DOGS, DOPE, etc) ainsi que des peptides d'origine nucleane (W096 25508) éventuellement fonctionnalises pour cibler certains tissus La préparation d'un composition selon l'invention utilisant un tel vecteur chimique est réalisée selon toute technique connue de l'homme du métier, généralement par simple mise en contact des différents composants.
Les doses de système d'expression administrées dépendent de plusieurs facteurs, et notamment du vecteur utilise, du ou des facteurs neurotrophiques impliques, du type de promoteur utilise, du stade de la pathologie ou encore de la durée du traitement recherche D'une manière générale, le système d'expression est administre sous forme de doses comprenant de 0,1 a 500 mg d'ADN par kilogramme de préférence de 1 à 100 mg d'ADN par kilogramme. On utilise généralement des doses de 10 mg d'ADN /kg environ.
S'agissant d'adenovirus recombinants, ils .sont avantageusement formulés et administrés sous forme de doses comprises entre 10^ et l ' 4 pfUι et de préférence 10° à l θ'0 pfu. Le terme pfu ("plaque forming unit") correspond au pouvoir infectieux d'une solution d'adenovirus. et est déterminé par infection d'une culture cellulaire appropriée, et mesure, généralement après 15 jours, du nombre de plages de cellules infectées. Les techniques de détermination du titre pfu d'une solution virale sont bien uu umcntées dans la littérature.
L'injection peut être réalisée au moyen de différents dispositifs, et en particulier de seringues ou par perfusion. L'injection au moyen de seringues est préférée. Par ailleurs, des injections répétées peuvent être pratiquées pour acroitre encore l'effet thérapeutique.
Selon une variante de l'invention, ce traitement peut également être appliqué en combinaison avec du riluzole. L'invention concerne ainsi une composition pharmaceutique comprenant un système d'expression selon l'invention et une quantité pharmacologiquement effective de riluzole, en vue d'une administration simultanée ou espacée dans le temps.
Les résultats présentés ci-après illustrent la présente invention sans pour autant limiter sa portée. Us démontrent les propriétés particulièrement avantageuses de la méthode de l'invention qui constitue, à notre connaissance, la première mise en évidence, sur un modèle animal, d'un tel bénéfice thérapeutique pour la SLA.
LEGENDE DES FIGURES
Figure 1 : Comparaison des performances électromyographiques de souris FALSG< avec ou sans administration d'un système d'expression d'une combinaison CNTF- GDNF. Figure 2 : Comparaison des performances électromyographiques de souris FALS(ι,„Λ avec ou sans administration d'un système d'expression de NT3.
Figure 3 : Comparaison de la survie de souris pmn avec ou sans administration d'un système d'expression de CNTF. La survie des souris pmn (en jours) est exprimée en pourcentage des animaux analysés. Souris pmn traitées par administration d'un système d'expression de CNTF : 100 %, n=7 (courbe en gras) ; Souris pmn non traitées 100 %, n= 14 (courbe trait normal).
Figure 4 : Comparaison de la dégénérescence motoneuronale chez la souris pmn avec ou sans administration d'un système d'expression de CNTF. le nombre de fibres myélinisées dans le nerf phrénique de souris est examiné à 25 jours d'âge. Résultats : souris pmn avec système d'expression CNTF ( 145, n=10) ; souris pmn sans système d'expression CNTF "non traitées" (122, n=8) ; souris pmn traitées par AdlacZ ( 1 1 1 , n=8) ; souris Xt "normal" (263, n=4). Les barres verticales représentent l'erreur standard des moyennes (SEM).
EXEMPLES
1. Matériel et Méthodes
L'ensemble des expériences décrites ci dessous (construction d'adenovirus, injection aux souris, mesures fonctionnelles) ont été effectuées en laboratoire de confinement L3.
1 -Animaux.
Plusieurs lignées de souris transgéniques exprimant des formes mutées de SOD responsables des formes familiales de SLA ont été construites pour tenter d'obtenir un modèle murin de la pathologie. Des souris transgéniques surexprimant la SOD humaine mutée portant une substitution de la glycine 93 en aianine (souris FALSM,A) présentent une dégénérescence motoneuronale progressive se traduisant par une paralysie des membres, et meurent à l'âge de 4-6 mois (Gumey et coll., 1994). Les premiers signes cliniques consistent en un tremblement des membres à environ 90 jours, puis à une réduction de la longueur des pas à 125 jours (Chiu et coll., 1995). Au plan histologique des vacuoles d'origine mitochondrialc sont observables dans les motoneurones à partir d'environ 37 jours, et une perte motoneuronale peut être observée à partir de 90 jours (Chiu et coll., 1995). Des atteintes des axones myélinisés sont observées principalement dans la moelle ventrale et peu dans la région dorsale. Des phénomènes de réinervation collatérale compensatoire sont observés au niveau des plaques motrices (Chiu et coll., 1995).
Pour les exemples 2 à 10 nous avons choisi d'utiliser les souris FALS(Λ1Λ. Les souris FALSG9... constituent un très bon modèle animal pour l'étude des mécanismes physiopathologiques de la SLΛ ainsi que pour le développement de stratégies thérapeutiques. Elle partagent en effet avec les formes familiales de SLA une origine physiopathologique commune (mutation SOD), un grand nombre de caractéristiques histopathologiques et électromyographiques. Ainsi, nous avons caractérisé au laboratoire les performances électromyographiques des souris FALS(!91Λ.et montré que les souris FALSc< remplissent les critères de Lambert pour la SLA (Kennel et coll., 1996): ( 1 ) réduction du nombre d'unités motrices avec une réinervation collatérale concomitante; (2) présence d'activité .spontanée de dénervation (fibrillations) et de fasciculation dans les membres postérieurs et antérieurs; (3) modification de la vitesse de conduction motrice corrélée avec une diminution de la réponse évoquée motrice; (4) pas d'atteinte sensorielle. De plus nous avons montré que les atteintes des nerfs faciaux étaient rares, mêmes chez les souris FALS09,A âgées, ce qui est aussi le cas chez les patients. Les souris FALSG93A proviennent de Transgenic Alliance (L'Arbresle,
France). Des femelles gestantes sont livrées chaque semaines. Elles mettent bas dans l'animalerie du laboratoire. Les souriceaux hétérozygotes développant la maladie sont identifiés par PCR après prélèvement d'un morceau de queue et extraction d'ADN. Il existe d'autres modèles animaux présentant des dégénérescences motoneuronalcs (Stllevis-Smitt & De Jong, 1989; Pnce et coll., 1994), soit suite a une lésion neurotoxique aiguë (traitement a l'IDPN, aux excitotoxines) soit dues a un défaut génétique (souris wobbler, pmn, Mnd, Chien HCSMA). Parmi les modèles génétiques, les souris pmn sont particulièrement bien caractérisées sur le plan clinique, histologique (Schmalbruch 1991 ) et electromyographique (Kennel, 1996) La mutation pmn est transmise sur le mode autosomique récessif et a été localisée sur le chromosome 13. Les .souris pmn homozygotes développent une atrophie et paralysie musculaires qui se manifestent aux membres postérieurs des l'âge de deux a trois semaines et qui ensuite se généralisent Toutes les souris pmn non-traitees meurent avant six à sept semaines d'âge La dégénérescence de leurs motoneurones débute au niveau des terminaisons nerveuses et aboutit a une perte massive de fibres myélinisées dans les nerfs moteurs et notamment dans le nerf phrénique qui assure I'inervation du diaphragme (Schmalbruch 1991 ) Contrairement a la souris FALSc,93A' cette dencrvation musculaire est très rapide et ne s'accompagne pratiquement pas de signes de réinervation par repousse de collatérales axonales Sui le plan électromyograhique, le processus de denervation musculaire est caractérise par l'apparition de fibrillations et par une réduction importante de l'amplitude de la réponse musculaire évoquée après stimulation électrique supramaximale du nerf (Kennel et al 1996)
Une ligne de souris transgéniques Xt/pmn a ete également utilisée comme autre modèle muπn de la SLA. Ces souris ont été obtenues par un premier croisement entre des souris femelles C57/B156 ou DBA2 et de souris mâles Xtpmn /Xt pmn (souche 129), suivi d'un second entre des femelles hétérozygotes Xt p nu l'/Xt pmn' descendantes (N I ) avec des mâles initiaux. Parmi les souris descendantes (N2), les double- hétérozygotes Xt p mn / Xt pmn (dénomme "souris Xt pmn ") portant un allele Xt (mis en évidence par le phenotype Extra-doigt) et un allele pmn (détermine par PCR ) ont été choisi pour les croisements futurs
2. Systèmes d'expression 2 1 Vecteurs plasmidiques
Différents vecteurs plasmidiques permettant l'expression de un ou deux facteurs neurotrophiques peuvent être utilises. On peut citer par exemple les plasmides pCRII-BDNF et pSh-Ad-BDNF, qui comportent une cassette d'expression et de sécrétion du BDNF (WO95/25804). On peut également mentionner les plasmides p-LTR-IX-GDNF contenant un acide nucléique codant pour le GDNF sous contrôle du promoteur LTR (WO95/26408) ainsi que le plasmide p-LTR-IX- preNGF/CNTF contenant la séquence du gène CNTF derrière la séquence signal du betaNGF ainsi que les séquences inversées répétées (ITR) du génome adénoviral, les séquences LTR du promoteur du virus du Sarcome de Rous (RSV). des séquences d'encapsidation ainsi que des séquences adenovirales nécessaires a la recombinaison homologue. Il est entendu que tout plasmide comportant une origine de réplication et un gène marqueur peut être utilisé pour construire un système d'expression selon l'invention, par insertion d'une ou plusieurs cassettes d'expression d'un facteur neurotrophique Les plasmides peuvent être prépares chez un hôte cellulaire eucaryote ou procaryote.
2.2 -Adénovirus
Comme indique précédemment, les vecteurs viraux, et notamment les adénovirus, constituent un mode de réalisation particulièrement préfère de l'invention
Les adénovirus recombinants utilises ci-apres ont été obtenus par recombinaison homologue selon les techniques décrites dans l'art antérieur. En bref, il sont construits dans les cellules 293, par recombinaison entre un fragment de génome viral linéarise (dl324) et un plasmide contenant l'ITR gauche, les séquences d'encapsidation, le transgène ainsi que son promoteur et des séquences virales permettant la recombinaison. Les virus sont amplifiés sur cellules 293 II sont régulièrement repurifies dans le P3 de notre laboratoire. Les génomes viraux peuvent également être préparés dans une cellule procaryote selon la technique décrite dans la demande WO96/25506. Les virus suivants ont été plus particulièrement utilisés: - Ad-CNTF : Adénovirus recombinant de sérotype Ad5 comprenant, inséré dans son génome à la place de la région El délétée, une cassette d'expression du gène CNTF composée du cDNA codant pour le CNTF sous contrôle d'un promoteur transcriptionnel (en particulier le LTR du RSV). Les détails de la construction sont données dans la demande WO94/08026. Des constructions alternatives comprennent une délétion supplémentaire dans la région E4, telle que décrite dans la demande W096/22378 ou dans la région E3.
- Ad-GDNF : Adénovirus recombinant de sérotype Ad5 comprenant, inséré dans son génome à la place de la région El délétée, une cassette d'expression du GDNF composée du cDNA codant pour le GDNF sous contrôle d'un promoteur transcriptionnel (en particulier le LTR du RSV). Les détails de la construction sont données dans la demande WO95/26408). Une construction alternative comprend une délétion supplémentaire dans la région E4, telle que décrite dans la demande W096/22378. - Ad-NT3 : Adénovirus recombinant de sérotype Ad5 comprenant, inséré dans son génome à la place de la région El délétée, une cassette d'expression du gène NT.3 composée du cDNA codant pour le NT3 sous contrôle d'un promoteur transcriptionnel (en particulier le LTR du RSV). Une construction alternative comprend une délétion supplémentaire dans la région E4. telle que décrite dans la demande W096/22378.
- Ad-BDNF : Adénovirus recombinant de sérotype Ad5 comprenant, inséré dans son génome à la place de la région El délétée, une cassette d'expression du BDNF composée du cDNA codant pour le BDNF sous contrôle d'un promoteur transcriptionnel (en particulier le LTR du RSV). Les détails de la construction sont données dans la demande WO95/25804). Une construction alternative comprend une délétion supplémentaire dans la région E4, telle que décrite dans la demande W096/22378.
- Ad-FGFa : Adénovirus recombinant de sérotype Ad5 comprenant, inséré dans son génome à la place de la région El délétée, une cassette d'expression du FGFa composée du cDNA codant pour le FGFa sous contrôle d'un promoteur transcnptionnel (en particulier le LTR du RSV) Les détails de la construction sont données dans la demande WO95/25803) Une construction alternative comprend une deletion supplémentaire dans la région E4, telle que décrite dans la demande W096/22378
La fonctionnalité des virus construits est vérifiée par infection de fibroblastes en culture La présence du facteur neurotrophique correspondant est analysée dans le surnageant de culture par ELISA et/ou en mettant en évidence les propriétés trophiques de ce surnageant sur des cultures primaires neuronales 3-Administration d'adenovirus recombinants.
Les adénovirus codant pour les facteurs neurotrophiques sont administres par voie intraveineuse chez des animaux adultes ou nouveau-nes Chez les souris F LSG93A adultes 109 pfu de chacun des adénovirus (volume final 200 ul) sont ainsi injectes dans la veine caudale a 1 aide d une microseringue de type Hamιlton(ϋ Chez les souris pmn nouveau-nees (âge 2-3jours), identifiées par 1 absence d un doigt surnuméraire, 2xl09 pfu (volume final 20 μl) de la suspension adenovirale sont injectes dans la veine rétinienne a 1 aide d une microseringue de type insuline équipée d une aiguille 30 G Les animaux nouveau-nes sont légèrement anaesthesies avec de 1 ether et en état d hypothermie
4-Techniques diverses.
E 1 ectro y o graphie
Tant que leur état physique le permet, les animaux sont anesthesies par injection intrapentoneale d'un mélange de diazepam (Vahum®, Roche. France) et de chlorhydrate de ketamine (Ketalar®,
Figure imgf000024_0001
France) a raison de 2 μg/g et 60 μg/g de poids corporel respectivement L'electromyographe utilise est un appareil de dernière génération (Keypoιnt(B ) possédant l'ensemble des logiciels nécessaires a l'acquisition et au traitement des signaux électromyographiques Ce matériel est loue a la société Dantec (Les Uhs, France) Electromyographie de stimulo-detection réponse évoquée motrice fREM)
Lorsqu'un choc électrique est applique sur un nerf, les muscles innerves par ce nerf sont le siège d'une réponse électrique Celle-ci survient après un certain temps (latence distalc) qui correspond au temps de conduction de la stimulation jusqu'aux synapses, auquel s'ajoute le temps de transmission du signal dans la synapse L 'amplitude de la réponse est proportionnelles a la quantité de fibres musculaires innervées
Pour des raisons purement pratiques, nous avons choisi de stimuler le nerf sciatique en recueillant la repon.se évoquée motrice au niveau du muscle gastrocnemien du mollet Cinq électrodes aiguilles (Dantec) sont directement implantées et reliées a l'electromyographe selon le schéma suivant (a) 2 électrodes de stimulation sont placées, l'une (électrode active) sui le trajet du nerf sciatique l'autre (électrode de référence) a la racine de la queue , (b) 2 électrodes de détection sont implantées, l'une dans le muscle gastrocnemien (électrode
Figure imgf000025_0001
l'autre sur le tendon correspondant (électrode de référence) , (c) enfin une électrode est reliée a la terre -.i est implantée entre les 2 électrodes actives, dans la cuisse de l'animal On mesure l'amplitude et la latence de la REM du muscle a une stimulation de son nerf moteur Celle-ci dure 200 ms a une intensité dite supramaximale qui correspond a 150 % de l'intensité permettant d'obtenir le potentiel d'action maximum Chez la souris adulte, si le muscle et le nerf étudies sont sains, et dans les conditions décrites ci-dessus, l'amplitude de la réponse évoquée est supérieure ou égale a 80 mV, et le temps de latence est en gênerai égal a 0,6 ms
analyse histologique
I es animaux sont tues par overdose de chloroforme et perfuse en intracardiaque avec une solution de glutaraldehydc Les nerfs phreniques sont isoles, prélevés, postfixes par tetroxide d'osmium et inclus dans l'epoxy. Les nerfs phréniques sont coupés proche du diaphragme, des sections d'une épaisseur de 3 μm sont colorées à la paraphenyldiamine et analysées par microscopie optique.
5. Administration d'un système d'expression exprimant le gène CNTF
Injection de vecteur adénoviral :
Des souris homozygotes Xt' pmn/Xt" pmn (".souris pmn ") agees de 2 à 3 jours, identifiées par l'absence de doigt surnuméraire, ont ete utilisées pour l'injection de vecteur adénoviral. Une suspension de CNTF adénoviral a ete prépare par dilution du stock adénoviral dans un tampon salin-phosphate ( PBS)a 2x 10' pfu/μl et administrée selon les conditions décrites au point 3 L'AdlacZ codant chez E. coli pour la β- galactosidase (Stratford-Perncaudet. 1992), a ete utilisé comme vecteur adcnoviral contrôle.
Résultats :
Des analyse par Northern blot de fibroblastes humains infectes par l'AdCNTF démontrent la présence de deux transcripts recombinants d'une taille respective de 1.1 et 1.6 kb. Les analyses par ELISA révèlent la présence de protéines recombinanies dans les surnageants après infection de différents types de cellules. Toutes les souris pmn non traitées dans les séries expérimentales sont decédees avant l'âge de deux mois et la moyenne de leur survie a été de 40.4 ± 2.4 jours (n=14) L'administration du vecteur contrôle AdlacZ n'a pas modifié la survie des souris pmn. Par opposition, les souris pmn traitées par des injections intraveineuses de AdCNTF ont survécu jusqu'à 73 jours (Fig.3). La moyenne de la survie des souris pmn traitées par l'AdCNTF a ete significativement améliorée et représente 52.7 ± 3.9 jours (n=7. p< 0.01 1 ) (Les différences entre les résultats des souris saines Xϋpmn. des souris homozygotes non traitées et des souris pmn traitées ont ete analysées par le test de Student t. les valeurs sont données en moyenne + erreur standard des moyennes (SEM)). Afin de déterminer si la prolongation de la survie des souris pmn traitées par l'AdCNTF reflétait une augmentation du nombre de fibres des nerfs phréniques, une microscopie optique au jour 25 a été réalisée et a montré que chez les souris pmn non traitées et chez les souris pmn ayant reçu en intraveineuse l'AdlacZ . le nombre de fibres myélinisées dans les nerfs phréniques avait diminué respectivement à 122 ± 13 (n=6) et 1 1 1 ± 1 1 (n=8) comparé aux 263 ± 8 fibres myélinisées chez des souris saines (n=4). Le nombre de fibres myélinisées dans les nerfs phréniques de souris pmn auxquelles l'AdCNTF a été injecté, était significativement supérieur à celui des animaux contrôle (145 ± 1 1 , n=10, p<0,05). Ainsi, un traitement des souris pmn par l'AdCNTF induit une réduction de 20% dans la perte des fibres myélinisées (Fig.4).
6. Administration d'un système d'expression produisant une combinaison CNTF - GDNF
109 pfu de chacun des adénovirus Ad-CNTF et Ad-GDNF ont été injectés (veine caudale) à l'aide de microseringue dans un volume final de 200 μl à 4 souris FALS(W3.. âgées de 99 jours. Au cours du temps, les performances électromyographiques des animaux ont été suivies et comparées à un groupe témoin. La durée de vie moyenne a également été enregistrée.
Electromyographie
Les résultats obtenus sont présentés sur la Figure 1. On observe une baisse de l'amplitude de la réponse évoquée motrice (REM) dans le gastrocnemien des souris FALSG93A traitées (AdCNTF+AdGDNF) ainsi que des souris FALSG9 non traitées. Cette baisse reflète le processus de dénervation progressive qui est une des caractéristiques de la SLA. Toutefois les souris traitées présentent une amplitude de REM systématiquement supérieure à celle des contrôles, démontrant un ralentissement de l'atteinte fonctionnelle suite au traitement. Longévité
La durée de vie des animaux est indiquée dans les tableaux ci-dessous.
Animaux traités
Animal n° Age de décès
1779-5 188
1779-6 170
1779-7 176
1779-8 155
Moyenne 172.2
SEM 6.86
Animaux non traités:
Animal n° âge de décès
35-5 142
35-8 135
35-9 151
35-50 125
35-60 147
35-90 155
Moyenne 142.5
SEM 4.51
Les résultats montrent que tous les animaux du groupe traites sont morts a un âge supérieur ou égal a l'âge de l'animal vivant le plus vieux dans le groupe contrôle Ces résultats montrent également une augmentation de la durée de vie chez les animaux traités de 30 jours en moyenne, par rapport aux animaux contrôle. Ces résultats sont particulièrement inattendus et, comparés aux 13 jours obtenus avec le Rilutek®, démontrent le potentiel thérapeutique de la méthode de l'invention.
7. Administration d'un système d'expression produisant de la NT3
7 (a) - Administration d'un système d'expression produisant de la NT3 (souris âgées de 99 jours)
109 pfu d'adenovirus Ad-NT3 ont été injectés (veine caudale) à l'aide de microseringue dans un volume final de 200 μl a 4 souris FALS(|1)^ agees de 99 jours Au cours du temps, les performances électromyographiques des animaux sont suivies et comparées a un groupe témoin. Les résultats obtenus sont présentes sur la Figure 2 et montrent que les souris traitées présentent une amplitude de REM supérieure a celle des contrôles, démontrant un ralentissement de l'atteinte fonctionnelle suite au traitement
7 (b) - Administration d'un système d'expression produisant de la NT3 (souris agees de 3 jours)
5 108 pfu d'adenovirtis Ad-NT3 ont ete injectes (veine temporale) a l'aide de microseringue dans un volume final de 20 μl a des souris F AL S(ι„. agees de 3 jours
La durée de vie des animaux est indiquée dans les tableaux ci-dessous
Animaux traites
Animal n° Age de deces
73- 1 161
73-2 173
73-3 178
73-4 184
73-5 186
73-6 187
73-7 187
73-8 191
73-9 196
73- 10 197
74- 1 162
74-2 177
74-3 177
74-4 179
74-5 180
74-6 183
74-7 186
37- 1 162
37-2 176
37-3 181
37-4 189
37-5 190
37-6 190
Moyenne 181.4
SEM 2.1 28
Animaux non traités:
Animal n° âge de décès
1-1 130
1-2 150
1-3 158
1-4 156
1-5 162
1-6 142
1-7 170
39-1 157
39-2 157
39-3 164
39-4 147
39-5 161
43-1 150
43-2 168
43-3 170
43-4 193
43-5 147
43-6 161
43-7 191
45-1 154
45-2 174
45-3 179
45-4 176
45-5 157
45-6 188
45-7 P8
45-8 182
59-1 150
59-2 186
59-3 171
59-4 172
34-1 172
34-2 189
34-3 170
34-4 191
34-5 195
34-6 174
34-7 147
34-8 150
34-9 151
34-10 165
34-11 165
34-12 155
34-13 148
Moyenne 165.3
SEM 2.3 29
Les résultats montrent une augmentation de 16.1 jours de la durée de vie moyenne entre les animaux ayant été traités par l'Ad-NT3 par voie intraveineuse et les animaux non-traités.
8. Administration d'un système d'expression produisant une combinaison CNTF - NT3
109 pfu de chacun des adénovirus Ad-CNTF et Ad-NT3 ont été injectés (veine caudale) à l'aide de microseringue dans un volume final de 200 μl à 4 animaux âgés de 99 jours. Au cours du temps, les performances électromyographiques des animaux sont suivies ct comparées à un groupe témoin. L-a durée de vie moyenne est également enregistrée.
9. Administration d'un système d'expression produisant une combinaison BDNF - NT3
109 pfu de chacun des adénovirus Ad-BDNF et Ad-NT3 ont été injectés (veine caudale) à l'aide de microseringue dans un volume final de 200 μl à 4 animaux âgés de 99 jours. Au cours du temps, les performances électromyographiques des animaux sont suivies et comparées à un groupe témoin, La durée de vie moyenne est également enregistrée.
10. Administration d'un système d'expression produisant le BDNF
109 pfu d'adenovirus Ad-BDNF ont été injectés (veine caudale) à l'aide de microseringue dans un volume final de 200 μl à 4 animaux âgés de 99 jours. Au cours du temps, les performances électromyographiques des animaux sont suivies et comparées à un groupe témoin. La durée de vie moyenne est également enregistrée. Bibliographie
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Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation d'un système d'expression de facteurs neurotrophiques pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement de la SLA par administration systémique.
2. Utilisation selon la revendication 1 caractérisée en ce que le système d'expression comprend une cassette d'expression composée d'un acide nucléique codant pour un facteur neurotrophique sous le contrôle d'un promoteur transcnptionnel.
3 Utilisation selon la revendication 1 caractérisée en ce que le système d'expression comprend deux cassettes d'expression composées chacune d'un acide nucléique codant chacun pour un facteur neurotrophique différent, sous le contrôle d'un promoteur transcriptionnel.
4 Utilisation selon la revendication 1 caractérisée en ce que le système d'expression comprend une cassette d'expression composée de deux acides nucléiques codant pour un facteur neurotrophique différent, sous le contrôle d'un promoteur transcnptionnel unique (unité bicistronique).
5. Utilisation selon la revendication 2 caractérisée en ce que le facteur neurotrophique est choisi parmi le GDNF, le CNTF, le BDNF et le NT3.
6. Utilisation selon la revendication 3 ou 4 caractérisée en ce que chaque acide nucléique code pour un facteur neurotrophique différent choisi parmi le GDNF, le CNTF, le BDNF et le NT3.
7 Utilisation selon la revendication 6 caractérisée en ce que le système d'expression comprend un acide nucléique codant pour le CNTF et un acide nucléique codant pour le GDNF.
8. Utilisation selon l'une des revendications 2 a 4 caractérisée en ce que les cassettes d'expression font partie d'un vecteur.
9. Utilisation selon la revendication 8 caractérisée en ce que les cassettes d'expression font partie d'un vecteur plasmidique.
10. Utilisation selon la revendication 8 caractérisée en ce que les cassettes d'expression font partie d'un vecteur viral.
1 1. Utilisation selon la revendication 10 caractérisée en ce que le vecteur viral est un vecteur adénoviral.
12. Utilisation selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce que promoteur est un promoteur constitutif eucaryote ou virai.
13. Utilisation selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce que l'administration systémique est une administration intraveineuse
14. Composition phannaceutique destinée au traitement des maladies dégénératives des motoneurones comprenant un système permettant l'expression de deux facteurs neurotrophiques.
15. Composition selon la revendication 14 caractér sée en ce que ledit système comprend deux vecteur de transfert de gène portant chacun un acide nucléique codant pour un facteur neurotrophique différent.
16. Composition selon la revendication 14 caractérisée en ce que ledit système comprend un vecteur de transfert de gène portant une cassette permettant l'expression concomittante de deux facteurs neurotrophiques différents.
17. Composition selon la revendication 15 ou 16 caractérisée en ce que les vecteurs sont des vecteurs viraux.
18. Composition selon la revendication 17 caractérisée en ce que les vecteurs sont des adénovirus.
19. Composition selon la revendication 15 ou 16 caractérisée en ce que les vecteurs sont des vecteurs plasmidiques. 20 Composition selon la revendication 14 caractérisée en ce que les facteurs neurotrophiques sont choisi parmi le GDNF le BDNF, le CNTF et la NT3
21 Composition selon la revendication 20 caractérisée en ce qu'elle contient deux adénovirus recombinants defectifs l'un portant un acide nucléique codant pour le CNTF et l'autre pour le GDNF
22 Composition selon la revendication 20 caractérisée en ce qu'elle contient deux adénovirus recombinants defectifs l'un portant un acide nucléique codant pour le GDNF et l'autre pour la NT3
23 Composition selon la revendication 20 caractérisée en ce qu'elle contient deux adénovirus recombinants defectifs l'un portant un acide nucléique codant pour le
BDNF et l'autre pour la NT3
24 Composition selon la revendication 14 caractérisée en ce qu'elle est injectée par voie intra-veineuse
25 Composition pharmaceutique comprenant un système d'expression de facteurs neurotrophiques et du riluzole, pour une administration simultanée ou espacée dans le temps
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