CZ74199A3 - Činidlo pro zvýšení aktivity glutathionreduktasy - Google Patents

Description

Předmětný vynález se týká vynikajícího činidla pro zvýšení aktivity glutathionreduktasy, obsahujícího troglitazon nebo jeho farmakologicky přípustnou sůl.

DOSAVADNÍ STAV TECHNIKY

Glutathion lze nalézt ve všech tkáních živého těla, je to hlavní, v buňkách přítomné redukční činidlo a hraje velmi významnou úlohu v metabolicklých oxidačně-redukčních procesech. Zvláště redukovaný glutathion (GSH) hraje díky přítomnosti thiolové skupiny klíčovou roli v růzmých buněčných obranných a opravných mechanismech. Glukothionperoxidasa je enzym, který katalyzuje reakci, v níž se peroxidy (jako peroxid vodíku nebo lipoperoxid) redukují pomocí GSH a představuje tedy důležitý enzym v antioxidačním systému. Na druhé straně je glutathionreduktasa enzymem, který redukuje oxidovaný glutathion (oxidovaný typ glutathionu GSSG) na GSH v přítomnosti NADPH.

Aktioxidační systém obsahující tyto látky a enzymy chrání buňky proti škodlivým vlivům oxidačních látek (např. shora popsaných peroxidů, volných radikálů atd.). K oxidačnímu stresu dochází, je-li rovnováha mezi oxidačně působící složkou a antioxidačním mechanismem posunuta ve prospěch prvně uvedených látek [J. Appl. Physiol. Nov., 81(5), 2199-2202 (1996)]. Bylo popsáno, že oxidační stres je spojen s řadou chorob jako jsou koronární onemocnění srdce, katarakty (zákaly (oční) čočky), idiopaticka plicní fibróza, chronická selhání ledvin, poruchy nervového systému, včetně periferního nervového systému a centrálního nervového systému (např. Parkinsonova choroba, Alzheimerova choroba, epilepsie, amyotropická laterální skleróza a mozkové ischémie) a žaludeční vředy [J. Appl. Physiol. Nov., 81(5), 2199-2202 (1996); Free Radical Biology & Medicine 21(6), 845-853 (1996); Free Radical Biology & Medicine 20(7), 925-931 (1996) a Gastroenterology, 112, 855-863 (1997) ] .

• ·

• · · · • · · · · • ····· · ··

• ·

Ve W094/12527 se uvádí, že sloučeniny, které urychlují syntézu endogenního GSH jsou vhodné pro humánní terapii, zvláště pro léčbu různých chorob způsobených nedostatkem glutathionu, jako jsou patologické stavy, mající vztah k oxidačním poškozením tkání, především v případech, kdy jsou důsledkem přebytku volných radikálů. Některými příklady takových chorob jsou: vnitrobuněčné nerovnovážné oxidační stavy po požití nadměrných množství alkoholu, po vystavení se xenobiotickým činidlům, poškození, způsobovaná zářením, choroby jater, omámení drogami a chemickými činidly, otravy těžkými kovy, fyziologické stárnutí mozku (např. Parkinsonova choroba, což je degenerace mozku v důsledku snížených hladin glutahionu, způsobovaná měnícími se antioxidačními obrannými mechanismy), akutní a chronické neurodegenerativní choroby (např. akutní patologie jako: akutní ischemické stavy, především mozková ischémie, hypoglykémie a epileptické záchvaty; chronické patologie jako: amyotrofická laterální skleróza, Alzheimerova choroba, Huntingtonova chorea), choroby způsobované změněnou funkčností imunitního systému, především v důsledku nádorové imunoterapie, a neplodnosti, především mužské. Je rovněž známo, že tyto sloučeniny jsou vhodné i pro reperfusi (opětné zprostupnění) po ischemických příhodách přisuzovaných hlavně volným radikálům. V Japanese Patent Application (japonské přihlášce vynálezu) Kokai No. Sho 64-26516 je uvedeno, že sloučenina, která zvyšuje hladiny glutathionu, je užitečná pro léčbu nebo prevenci různých chorob, včetně katarakt, poruch jater a poruch ledvin.

Na základě těchto poznatků předpokládáme, že sloučenina, která zvyšuje aktivitu glutathionreduktasy a urychluje dodávku GSH bude vykazovat účinky podobné shora popsaným sloučeninám, zvyšujícím syntézu endogenního GSH nebo sloučeninám zvyšujících hladiny glutathionu a bude tedy užitečná pro prevenci nebo léčbu chorob, uváděných jako příklady v předchozím textu .

Jak uvedeno shora, katarakty patří rovněž k stavům, při nichž dochází k oxidačním stresům. Bylo popsáno, že u pacientů, trpících kataraktou lze pozorovat dramatické snížení obsahu GSH v čočce a že thiolové skupiny proteinů byly velkou rychlostí oxidovány u stařeckých pacientů, u pacientů, postiže3 • · · · ných kataraktami, způsobovanými paprsky X a u pacientů, postižených kataraktami způsobovanými jadernými vlivy [V. K. Reddy, Exp. Eye Res. 50, 771-778 (1990)]. Lze tedy předpokládat, že těmto kataraktám, způsobovaným především oxidačními stressy, je možno preventivně zabránit nebo je léčit zvýšením aktivity glutathionreduktasy.

Diabetické katarakty jsou katarakty, způsobované cukrovkou a jsou jednou z diabetických komplikací. U pacientů, trpících cukrovkou, je polyolový metabolický systém stenózní a o tomto jevu se předpokládá, že je příčinou různých diabetických komplikací, včetně diabetické katarakty. V tomto polyolovém metabolickém systému je přítomnost NADPH rychlost určujícím krokem, takže produkce sorbitolu se zvyšuje v důsledku stenózy polyolového metabolického systému [Satish K, Srivastava et al., Proč. Nati. Acad. Sci. 82, 7222-7226 (1995)]. Sorbitol se hromadí v buňkách v důsledku nízkého prostupu přes biomembránu. Hromadění sorbitolu v čočce je pokládáno za příčinu růstu osmotického tlaku, botnání čočky [Kinoshita et al., Metabolism 28-4 sup-1, 462-469 (1995)], způsobuje edémy a denaturaci buněk, což vede ke vzniku katarakty. Je známa řada studií o inhibitorech AR a o jejich vývoji na základě předpokladu, že kataraktě je možno zabránit nebo ji léčit inhibicí AR, tedy sledováním vnitrobuněčného hromadění sorbitolu.

Na druhé straně je známo, že vycházeje ze zjištění, že pokud vedle sebe existují jak glutathionreduktasa, tak i AR, se jako první z těchto látek přednostně spotřebovává NADPH, takže zvýšení aktivity glutathionreduktasy umožňuje potlačit funkci AR, což se v konečné fázi projeví inhibici hromadění polyolu [Yokoyama et al., Exp. Eye Res. 58, 207-218 (1994)].

Zkráceně řečeno: Je možno předpokládat, že diabetické kataraktě.....lze preventivně zabránit nebo ji léčit také sloučeninou, která je schopna zvyšovat aktivitu glutathionu.

Troglitazon je komerčně dostupný jako na inzulínu nezávislé antidiabetické činidlo a je o něm známo, že je užitečný pro léčbu nebo prevenci různých jiných chorob, včetně s cukrovkou souvisejících komplikací. Není ovšem známo, že troglitazon je schopen zvyšovat aktivitu glutathionreduktasy.

» · · 4 • · · · · 4 • 4 ·· ··

PODSTATA VYNALEZU

Shora uvedení vynálezci provedli rozsáhlý výzkum o použitelnosti troglitazonu jako léčiva. Jako výsledek bylo zjištěno, že troglitazon má vynikající účinky co do zvýšení aktivity glutathionreduktasy.

Předmětný vynález poskytuje:

(1) činidlo pro zvýšení aktivity glutathionreduktasy, které obsahuje troglitazon nebo jeho farmakologicky přípustnou sůl. Preferovaným hlediskem předmětného vynálezu je, že rovněž poskytuj e:

(2) činidlo pro zvýšení aktivity glutathionreduktasy, jak popsáno shora v (1), pro prevenci nebo léčbu chorob, vyplývajících z nedostatku redukovaného glutathionu.

Preferovanějším hlediskem předmětného vynálezu je, že rovněž poskytuje:

(3) činidlo pro zvýšení aktivity glutathionreduktasy, jak popsáno shora v (1), pro prevenci nebo léčbu chorob, způsobovaných oxidačními stresy,

Ještě preferovanějším hlediskem předmětného vynálezu je, že rovněž poskytuje:

zvýšení aktivity glutathionreduktasy, jak (1), pro prevenci nebo léčbu koronárních (4) činidlo pro popsáno shora v srdečních chorob, (5) činidlo pro popsáno shora v plicní fibrózy, (6) činidlo pro zvýšení aktivity glutathionreduktasy, jak (1), pro prevenci nebo léčbu idiopatické zvýšení aktivity glutathionreduktasy, jak popsáno shora v (1), pro prevenci nebo léčbu chronického selhání ledvin, (7) činidlo pro zvýšení aktivity glutathionreduktasy, jak popsáno shora v (1), pro prevenci nebo léčbu poruch nervového systému, způsobovaných oxidačními stresy, (8) činidlo pro zvýšení aktivity glutathionreduktasy, jak popsáno shora v (1), pro prevenci nebo léčbu žaludečních vředů , (9) činidlo pro zvýšení aktivity glutathionreduktasy, jak popsáno shora v (1), pro prevenci nebo léčbu katarakt.

• · • 0 00 00 0 • · · 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 · 0 0 0 0 · · *

0 0 0 0 0 0000 0 000 ···

00·0·0 0 ·

000000 ·· · 00 00 Zvláště preferovaným hlediskem předmětného vynálezu, jak popsáno shora v (9) je, že rovněž poskytuje:

(10) činidlo pro zvýšení aktivity glutathionreduktasy, jak popsáno shora v (9), kde zmíněné katarakty jsou způsobovány hromaděním polyolu v čočce, hromaděním proteinu o vysoké molekulové hmotnosti v čočce něho hromaděním peroxidu v čočce. Speciálně preferovanýmm hlediskem předmětného vynálezu je, že rovněž poskytuje:

(11) činidlo pro zvýšení aktivity glutathionreduktasy, jak popsáno shora v (9), kde zmíněné katarakty jsou způsobovány hromaděním proteinu o vysoké molekulové hmotnosti v čočce nebo hromaděním peroxidu v čočce.

Ještě preferovanějším hlediskem předmětného vynálezu je, že rovněž poskytuje:

(12) činidlo pro zvýšení aktivity glutathionreduktasy, jak popsáno shora v (9), kde zmíněné katarakty jsou katarakty stařeckých pacientů.

Nejpreferovanějším hlediskem předmětného vynálezu je, že rovněž poskytuje:

(13) činidlo pro zvýšení aktivity glutathionreduktasy, jak popsáno shora v (9), kde zmíněné katarakty nejsou diabetické katarakty, ale katarakty stařeckých pacientů

V předmětném vynálezu znamená termín choroby vyplývající z nedostatku redukovaného glutathionu choroby jako vnitrobuněčné nerovnovážné oxidační stavy po požití nadměrných množství alkoholu, po vystavení se xenobiotickým činidlům, poškození, způsobovaná zářením, choroby jater, omámení drogami a chemickými činidly, otravy těžký„3 . = mi kovy, poruchy nervového systému-jako degenerativní onemocnění mozku a nervového systému (např. mozková ischémie, mozková mrtvice, hypoglykémie, epilepsie, amyotrofická laterální skleróza, Parkinsonova choroba a Huntingtonova chorea); choroby, způsobované změněnou funkčností imunitního systému, především v důsledku nádorové imunoterapie; neplodnosti, především mužské; koronární srdeční choroby; katarakty; idiopatická plicní fibróza; chronická selhání jater a žaludeční vředy.

·· ·« » A A

AAAA < A A ♦ A A A » · · A » · A A

AAA AAA

Zde používaný termín choroby vyplývajíc** oxidačního. s’tréssu znamená ve shora nervového systému, uvedených příkladech zmiňované poruchy koronární srdeční choroby, katarakty, idiopatickou plicní fibrózu, chronické selhání jater a žaludeční vředy, a zde používaný termín choroby nervového systému vyplývající z oxidačního stresu znamená shora popsané poruchy nervového systému.

Zde používaný termín polyol znamená alkoholické cukry, vzniklé redukcí cukru pomocí aldosoreduktasy (AR); příklady takových alkoholických cukrů jsou sorbitol a galaktitol.

Zde používaný termín katarakta způsobovaná hromaděním polyolu v čočce znamená především diabetické katarakty, cukry způsobovyné katarakty a galaktosové katarakty.

Zde používaný termín protein o vysoké molekulové hmotnosti znamená protein, získaný vytvořením disulfidické vazby v molekule nebo mezi molekulami peptidického prekursoru nebo proteinu, který má v jedné takové molekule nejméně jednu thiolovou skupinu, a to pomocí této thiolové skupiny. Zde používaný termín peptid nebo protein, který má v jedné takové molekule nejméně jednu thiolovou skupinu zahrnuje v sobě proteiny buněčných membrán, obsahujících thiolovou skupinu, která má vztah ke kapacitě přenosu kationtů a k propustnosti membrány. Příklady katarakt způsobovaných hromaděním proteinu o vysoké molekulové hmotnosti v čočce jsou především katarakty stařeckých pacientů, katarakty způsobované paprsky X a katarakty způsobované jadernými vlivy.

Příklady peroxidů jsou oxidačně působící volné radikály, jako hyperoxid (O2'), hydroxyradikál (-0H), singletový kyslík (O2) a peroxyradikál nebo nějaký alkoxyradikál; patří sem i sloučeniny, které jsou schopné uvolňovat oxidačně působící volné radikály, jako peroxid vodíku (H2O2) a 1ipoperoxidy.

Co se týká katarakt způsobovaných hromaděním peroxidů v čočce, lze zmínit především katarakty stařeckých pacientů. Katarakty, které jsou nediabetické, ale stařecké se týkají katarakt, které se vyskytují jako důsledek stárnutí, ale nejsou způsobovány cukrovkou, což znamená, že se jedná o katarakty, vyskytující se u stařeckých pacientů, kteří netrpí cukrovko (diabetes mellitus).

·· ·· ·· * »· 4« »99 »99 9 9 9 9 • ··· 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9999 9 »99 999

9 9 9 9 9 € 9

9999 99 99 9 99 99

Z některých chorob vyplývajících z nedostatku redukovaného glutathionu nelze pacienty, trpící takovými chorobami, vyléčit úplně až do normálního stavu a v takovém případě znamená termín léčba prevenci nebo zpomalení postupu patologických stavů.

Trogli tazone cem (I) je sloučenina reprezentovaná následujícím vzor-

Jelikož je troglitazon možno získat ve formě soli, znamená zde používaný termín farmakologický přípustná sůl některou takovou sůl. Preferovanými příklady takové soli jsou soli alkalických kovů, jako sodná sůl, draselná sůl nebo lithná sůl a soli alkalických zemin, jako vápenatá sůl.

Troglitazon má ve své molekule dva asymetrické uhlíky, takže existují čtyři jeho isomery. V předmětném vynálezu jsou jednotlivé isomery a jejich směsi označovány vždy pouze jediným vzorcem, a to vzorcem (I). Předmětný vynález tedy v sobě zahrnuje všechny tyto isomery a jejich směsi

Jsou-li troglitazon nebo jeho farmakologický přípustné soli ponechány volně na vzduchu nebo jsou-li rekrystalizovány, pak absorbují vodu nebo dochází k vazbě absorbované vody na tyto substance a vznikají oddpovídající hydráty. Takové hydráty jsou rovněž zahrnuty do předmětného vynálezu.

Činidlo pro zvýšení aktivity glutathionreduktasy podle předmětného vynálezu zahrnuje v sobě troglitazon nebo jeho farmakologicky přípustnou sůl. Troglitazon je možno vyrobit postupem popsaným v Japanese Patent Application (japonské přhlášce vynálezu) Kokai No. Sho 64-51189.

• · ·

Příklady způsobů aplikace troglitazonu nebo jeho farmokologicky přípustné soli v sobě zahrnují podávání ve formě tablet, kapslí, granulí, prášků, syrupů a pod. a parenterální aplikaci formou injekcí, čípků a pod. Takové přípravky se vyrábějí známými postupy- za použití přísad jako masťových základů, maziv, pojiv, deintegračních činidel, stabilizátorů a chuť zlepšujících přísad.

Příklady mastových základů zahrnují v sobě organické masťové základy (tzv. vehikula), např. deriváty cukrů jako laktosy, sacharosy, glukosy, mannitolu nebo sorbitolu, deriváty škrobu, jako kukuřičný škrob, bramborový škrob, tzv. alfa-škrob, dextrin nebo karboxymethylovaný škrob, deriváty celuloay jako krystalinickou celulosu, arabskou gumu, dextran nebo Pullulan, anorganické mastové základy zahrnující silikátové deriváty jako lehký anhydrid kyseliny křemičité, syntetický alumosilikát nebo metasilikát hořečnato-hlinitý, fosforečnany jako fosforečnan vápenatý, uhličitany jako uhličitan vápenatý a sírany jako síran vápenatý.

Příklady maziv zahrnují v sobě kyselinu stearovou, stearáty kovů jako stearát vápenatý, stearát hořečnatý, mastek, koloidní siliku, vosky jako včelí vosk nebo vorvaninu; kyselinu boritou; kyselinu adipovou; sírany jako síran sodný; glykol; kyselinu fumarovou; benzoát sodný; DL-leucin: laurylsulfáty jako laurylsulfát sodný nebo laurylsulfát hořečnatý; křemičitany jako anhydrid kyseliny (ortho-)křemiči té nebo hydrát kyseliny (ortho-)křemičité a již dříve uvedené deriváty škrobu. Příklady pojiv v sobě zahrnují hydroxypropylcelulosu, hydroxypropylmethylcelulosu, polyvinylpyrrolidon, Macrogol a sloučeniny podobné příkladům uvedeným shora jako masťové základy. Příklady des integrační ch č inid.e,i„ zahrnu j í . der i váty celulosy jako nízkosubstituovanou hydroxypropylcelulosu, karmelosu, vápenatou karmelosu, vnitřně zesítěnou sodnou karmelosu a chemicky modifikované škroby/celulosy, jako sodík obsahující karboxymethylovaný škrob, nebo příčně zesítěný polyvinylpyrroli don

Příklady stabilizátorů zahrnují v sobě paraoxybenzoanové estery jako methylparaben, propylparaben, alkoholy jako chlorbutanol, benzylalkohol nebo ίenylethylalkohol; benza1koni um9 ·· ·· ··· · · · · • · ··· · · · · • · · · · ··· · · · · • · · · · · ···· · ··· ··· ······ · · ······ ·· · · · ·· chlorid; fenoly jako fenol nebo kresol; thimerosal; kyselinu dehydroxyoctovou a kyselinu sorbovou.

Příklady chuť zlepšujících přísad zahrnují v sobě sladidla, ocet nebo voňavé látky tak, jak se běžně používají.

Činidlo pro zvýšení aktivity glutathionreduktasy podle předmětného vynálezu obsahující troglitazon je možno místně aplikovat i do očí. Příklady přípravků vhodných pro místní aplikaci do očí zahrnují pevné vsazovací formy, které zůstanou ve skoro perfektntím stavu i po aplikaci a desintegrace schopné vsazovací formy, které se rozpustí ve slzné kapalině nebo se desintegrují jiným způsobem. Příklady zahrnují v sobě kapaliny, suspenze, gely, oční masti a pevné (tuhé) vsazovací formy .

Přípravky používané jako oční přípravky mohou obsahovat troglitazon nebo jeho farmakologicky přípustnou sůl v množstvích od 0,01 % (spíše 0,1 %) jako spodní mez do 10 % (spíše 5 %) jako horní mez.

Oční přípravky mohou obsahovat netoxický oční anorganický nebo organický nosič. Typické příklady nosičů pro oční přípravky zahrnují vodu; směsi vody a s vodou misitelného rozpouštědla jako nižšího alkanolu nebo aralkanolu; rostlinný olej; póly(alkylenglykol); želé, používající ropu jako základový materiál; ethylcelulosu; ethyloleát; karboxymethy1celulosu;. polyvinylpyrrolidon. myristan 1sopropylnatý a jiné přípustné nosiče, které je možno běžně používat. Oční přípravky mohou rovněž obsahovat netoxické pomocné látky jako emulsifikátory, konzervační přípravky, smáčedla a masťové základy, např. polyethylenglykol 200,300, 400 a 500, Carbowax 1000, 1500, 4000, 6000 a 10000, estery kyseliny p-hvdroxvbenzoové. jako methylester kyseliny p-hydroxybenzoové nebo propylester kyseliny p-hydroxynbenzoové, kvartérní amonné sloučeniny (např. benzethoniumchlorid nebo benzalkoniumchlorid), o nichž je známo, že mají za nízkých teplot fungicidní vlastnosti a že jsou při použití netoxické, fungicidní činidla jako soli fenylrtuti, jako pufry působící látky jako thimerosal, (pethyl- a propylparaben, benzylalkohol , fenylethanol, chlorid sodný, boritan sodný a octan sodný, pufry na bázi kyseliny • · • · ······ * · · · · · · glukonové a monolaurátu kyseliny sorbové, triethanolamin, monopalmitan kyseliny polyoxyethylsorbitové, dioktylsulfojantaran sodný, thiosorbitol a kyselina ethylendiaminotetraoctová.

Dále může oční přípravek podle předmětného vynálezy obsahovat vhodný oční masťový základ jako běžná pufrová vehikula na bázi kyseliny fosforečné (např. pufr na bázi fosforečnanu sodného nebo pufr na bázi forforečnanu draselného), isotonické mastové základy na bázi kyseliny borité, vehikula na bázi chloridu sodného a isotonické mastové základy na bázi boritanu sodného.

V předmětném vynálezu se bude množství (dávka) troglitazonu nebo jeho farmakologicky přípustnou soli měnit v závislosti na stavu a věku pacienta, na způsobu aplikace a pod. V případě orální aplikace je např. u dospělého lidského pacienta žádoucí podávat denně od 0,1 mg (spíše 1 mg) jako spodní mez do 1000 mg (spíše 500 mg) jako horní mez. V případě nitrožilní aplikace je žádoucí podávat denně od 0,01 mg (spíše 0,1 mg) jako spodní mez do 500 mg (spíše 200 mg) jako horní mez. Přípravek se podává v jediné nebo několika dělených dávkách denně v závislosti na stavu pacienta.

Přípravek obsahující troglitazon nebo jeho farmakologicky přípustnou sůl je možno připravit např. některým z v dalším popsaných postupů.

Příklad 1 Prášky

V mísiči se smísí 5 g troglitazonu, 895 g laktosy a 100 g kukuřičného škrobu, čímž je možno získat prášek.

Příklad 2 Granule

Po smísení 5 g troglitazonu, 895 g laktosy a 100 g nízkosubstituované hydroxypropylcelulosy se přidá 300 mg lOSsního vodného roztoku hydroxypropylcelulosy. Vzniklá směs se poté hněte. Prohnětená hmota se granuluje na protlačovacím granulátoru, čímž je možno získat granule.

······ · · ······ ·* · ·· · ·

Příklad 3 Kapsle g troglitazonu, 115 g laktosy, 58 g kukuřičného škrobu a 2 g stearátu hořečnatého se smísí v mísiči tvaru V. 180 mg vzniklé směsi se poté zpracuje na kapsli č. 3, čímž se získá přípravek v požadované (kapslové) formě.

Příklad 4 Tablety g troglitazonu, 90 g laktosy, 34 g kukuřičného škrobu, 20 g krystalinické celulosy a 1 g stearátu hořečnatého se smísí v mísiči. Směs se poté peletizuje pomocí tabletovacího stroje, aby se získaly tablety.

Příklad 5 Oční kapky

Troglitazon 2,0 g

Fosforečnan dvojsodný 0,716 g

Dihydrofosforečnan sodný 0,728 g

Chlorid sodný 0,400 g p-hydroxybenzoan methylnatý 0,026 g

Hydrobenzoan propylnatý 0,014 g

Sterilizovaná a čištěná voda q.s.

Louh sodný q.s.

Celkem 100 ml pH směsi směsi se upraví na hodnotu 7,0 a oční kapky se připraví běžným způsobem.

[Nejlepší způsoby, jak provádět vynález]

Břejimětný vynález bude v dalším podrobněji popsána pomocí příkladů. Příklady však nebyly konstruovány jako případy omezující rozsah vynálezu.

···· · ··· · ·· · • · · · · · ···· · ··· ··· ······ · · «····· ·· · « · ··

PŘÍKLADY PROVEDENÍ VYNÁLEZU

Příklad 1: Efekt zvýšení aktivity reduktasy (1) Kultura čočkové tkáně až 8 týdnů staré SD samčí krysy (Japan SLC) byly usmrceny udušením v důsledku vdechování kysličníku uhličitého. Každému z pokusných zvířat byly vyříznuty oční bulvy. Na zadní straně očních bulev byl proveden řez do bělimy, poté bylo odstraněno sklivcové a duhovkové (ciliární) těleso a následovalo vyjmutí čočky.

Každá tímto způsobem získaná čočky byla kultivována ponořením do 3 ml v dalším popsaného kultivačního roztoku v šestijímkové destičce pro kultivaci tkání (FALCON).

Kultivace byla prováděna po dobu 48 hodin v C02 kultivátoru, udržovaném na 37 °C při 100%ní vlhkosti v přítomnosti 5 % CO2 (ve vzduchu).

Jako kultivační roztok pro negativní kontrolu byl použit přípravek Medium 199 (GIBCO), obsahující penicilín (20 jednotek/ml) a streptomycin (20 pg/ml).

Jako kultivační roztok pro pozitivní kontrolu byl použit roztok obsahující galaktosu (D-galaktosu) o koncentraci 30 mM. Tento roztok byl přípraven rozpuštěním galaktosy ve směsném roztoku (85:15) shora popsaného kultivačního roztoku pro negativní kontrolu a čištěné vody.

Kultivační roztok pro testy byl připraven rozpuštěním nebo suspendací troglitazonu v 10%ním vodném acetonu, který byl následně přidán ke shora popsanému kultivačnímu roztoku pro pozitivní kontrolu v množství 1 %, vztaženo na výsledný roztok nebo výslednou suspenzi. Pro testy byl přípraven a používán kultivační roztok, obsahující troglitazon v koncentracích 0,2 μΜ, 2 μΜ a 20 μΜ.

Po inkubaci byly čočky skladovány ve zmrazeném stavu.

Čočky inkubované v kultivačním roztoku pro negativní kontrolu odpovídají čočkám v normálním stavu, čočky inkubované v kultivačním roztoku pro pozitivní kontrolu odpovídají čočkám pod galaktosovou zátěží a čočky inkubované v kultivačním roztoku pro testy čočkám vystaveným působení troglitazonu.

(2) Měření aktivity glutathionreduktasy

Vodný roztok glutathionreduktasy byl připraven za použití čoček, inkubovaných podle bodu (1), načež v něm byla změřena aktivita reduktasy.

Podrobnější popis; Zmrazené krysí oční čočky byly homogenizovány v 2 ml destilované vody, načež následovalo rozdělení odstředěním (při 10 000 g po dobu 20 minut). Získaný supernatant byl použit jako vzorek enzymu.

400 μί vzorku enzymu bylo přidáno k 0,6 ml fosfátového pufru, obsahujícího 1 mM oxidovaného glutathionu (GSSG) a 100 μΜ NADPH. Poté, co směs při 25 °C reagovala po dobu 6 minut, byla změřena absorbance nezreagovaného, ve směsi zbylého NADPH (340 nm, 0D340nm). Rozdíl (60D340nm) mezi hodnotou 0D340nm před reakcí a hodnotou OD340nm po proběhnutí reakce byl použit jako indikátor spotřebovaného podílu NADPH a rovněž jako index aktivity glutathionreduktasy.

Výsledky (50D340nm/min/čočku) jsou uvedeny v tabulce 1.

Tabulka 1

Kontrolní skupina	Skupina s přídavkem troglitazonu
Negativní kontrola (- galaktosa)	Pozitivní kontrola (+ galaktosa)	2 μΜ	2 0 μΜ
0,027 + 0,001	0,026 + 0,001	0,031 + 0,000	0,031 + 0,00

Jak je zřejmé z tabulky 1, je hodnota 60D340nm u skupiny s přídavkem troglitazonu větší, což znamená, že spotřebovaný podíl NADPH je větší než stejná hodnota u negativních a positivních testů, což naznačuje, že přídavek troglitazonu zvýšil aktivitu glutathionreduktasy.

Příklad 2: Inhibiční účinek na aldosoreduktasu (AR)

Aktivita aldosoreduktasy AR byla měřena podobnou metodou jako je ta, kterou popsali Hayman a Kinoshita et al. (J. Biol. Chem 240, 877-882 (1965)) a která používala jako zdroj enzymu čočky kultivované podle Příkladu 1(1).

• ·

Podrobnější popis: Oční čočka kultivovaná podle Příkladu 1(1) byla promyta fysiologickým (solným) roztokem a homogenizována v 0,05 mM roztoku EDTA. Homogenizát byl podroben rozdělení v odstředivce (při 10 000 g po dobu 15 minut) a vzniklý supernatant byl použit jako vzorek enzymu. Vzniklý vzorek enzymu byl přidán k roztoku 0,5 mM DL-glyceraldehydu, 0,4 M síranu lithného, 0,05 mM NADPH, 67 mM monohydrogenfosforečnanu dvojsodného a 1 mM EDTA v destilované vodě, aby se nastartovala enzymatická reakce. Po 7 minutách reakce při pokojové teplotě byla změřena absorbance (340 nm) nezreagovaného, v reakční směsi zbylého NADPH. Rozdíl mezi absorbancí před reakcí a její hodnotou po proběhnutí reakce vyjádřený spotřebovaným podílem NADPH byl použit jako index aktivity AR Troglitazon nevykazoval při koncentrací 0,2 μΜ nebo 2 μΜ na AR žádné inhibiční účinky.

Příklad 3: Inhibiční účinek na hromadění polyolu v čočce

V čočkách byl měřen podíl galaktitolu, což je polyol, vznikající redukcí galaktosy působením AR.

Podrobnější popis: Oční čočka kultivovaná a zmrazená podle Příkladu 1(1) byla homogenizována v 1 ml 0,6 mM roztoku dimethylmerkaptoglukosy (vnitřní standard) v destilované vodě.

K homogenizátu bylo přidáno 2,4 ml ledem chlazeného ethanolu a vzniklá směs byla ponechána stát po dobu 5 minut. Reakční směs byla podrobena rozdělení v odstředivce (při 10 000 g po dobu 5 minut) a 25 μΐ vzniklého supernatantu bylo vloženo do lahvičky se šroubovacím uzávěrem k následné lyofilizaci. Po přidání 70 a 20 μΐ feny1 isokyanátu k produktu lyofilizace byla vzniklá směs inkubována po dobu 5 minut při 55 °C. Poté bylo přidáno 20 μΐ methanolu a vzniklá směs byla inkubována po dobu 1 hodiny při 55 °C. K inkubované směsi bylo za účelem přípravy vzorku přidáno 90 μΐ pyridinu. Vzorek byl nastříknut do vysokovýkonného chromatografického přístroje (eluent: směs acetonitril : ethanol : voda v poměru 5:2 : 3, průtok: 1 ml/min). Jeho absorbance (při 240 nm) byla změřena spektrofotometrem a by1 vypočten podíl galaktitolu, obsažený v každé z čoček. V tabulce 2 je uveden podíl galaktitolu ve skupině • · · · ·· ·· · s přídavkem troglitazonu, když podílu galaktitolu kontrolní skupině byla přiřazena hodnota 100.

v positivní

Tabulka 2

Koncentrace přidaného trogli tazonu	0 μΜ (positivní kontrola)	2 μΜ	20 μΜ
Podíl galaktitolu	100	65 + 8	47 + 6

Jak je zřejmé z tabulky 2, troglitazon inhibuje v závislosti na koncentraci hromadění galaktitolu v čočce.

Příklad 4: Účinek co do snižování lipoperoxidu

Byl měřen podíl lipoperoxidu v čočce krys kultivované podle Příkladu 1(1).

Podrobnější popis: Po určení mokré hmotnosti čočky byla čočka homogenizována v 0,5 ml 50 mM trishydrochloridového pufru (pH 7,6), obsahujícího 1 mM EDTA. Homogenizát byl podroben rozdělení v odstředivce (při 2 500 g po dobu 30 minut) a lipoperoxid, obsažený v supernatantu byl určen pomocí soupravy pro měření lipoperoxidu (LPO-586, BIOXYTECH S.A.). Kolorimetrie lipoperoxidu byla provedena malonaldehydem a hydroxyalkenalem a vedla k indexu lipoperoxidu. Výsledky (podíl lipoperoxidu v 1 g čočky: v nmol/g) jsou uvedeny v tabulce 3.

Tabulka 3

Kontrolní skupina	Skupina
		s přídavkem troglitazonu
Megat ivná	Pozitivní	. 2 ,μΜ	2 0 μΜ
kontrola	kontrola
(- galaktosa)	( + galaktosa)
0,68 + 0,28	5,17 + 0,1,09	4,52 + 0,19	1,25 + 0,92

Jak je zřejmé z tabulky 3, koncentrace lipoperoxidu v čočce se v důsledku uplatnění zátěže galaktosou zvyšovala, ovšem míra zvýšení se snižovala přidáním troglitazomu v závislosti na koncentraci troglitazonu.

• · [Možnost průmyslového využití]

Jelikož troglitazon vykazuje - jak ukázáno v Příkladu 1 účinek na zvýšení aktivity glutathionreduktasy a je schopen zvýšit podíl GSH, dodávaného do živého těla, je vhodný pro prevenci nebo léčbu chorob, vznikajících z nedostatku redukovaného glutathionu. Navíc - jak ukázáno v Příkladu 4 - je troglitazon schopen snižovat podíl 1ipoperoxidu, takže je vhodný pro prevenci nebo léčbu chorob, vznikajících z oxidačních stresů (zvláště katarakt, které jsou stavy, vyplývajícími z oxidačních stresů v čočce).

Z výsledků Příkladů 2 a 3 je dále zřejmé, že troglitazon vykazoval účinek co do zvýšení aktivity glutathionreduktasy a inhibiční aktivitu proti hromadění polyolu i za koncentrace, (2 μΜ), při které nevykazuje inhibičné účinky vůči AR. Troglitazon totiž inhiboval polyolový metabolický systém zvýšením aktivity glutathionreduktasy, potlačujíc tím hromadění polyolu. Činidlo pro zvýšení aktivity glutathionreduktasy obsahujcí troglitazon lze tedy využít pro prevenci nebo léčbu chorob, vznikajících v důsledku vnitrobuněčného hromadění polyolu, jako diabetických očních kataraktů.

Claims (13)

1. Činidlo pro zvýšení aktivity glutathionreduktasy obsahující troglitazon nebo jeho farmakologicky přípustnou sůl.

2. Činidlo pro zvýšení aktivity glutathionreduktasy, popsané v patentovém nároku 1, pro prevenci nebo léčbu chorob, vyplý vajících z nedostatku redukovaného glutathionu.

3. Činidlo pro zvýšení aktivity glutathionreduktasy, popsané v patentovém nároku 1, pro prevenci nebo léčbu chorob, vyplývajících z oxidačních stresů.

4. Činidlo pro zvýšení aktivity glutathionreduktasyjí, popsané v patentovém nároku 1, pro prevenci nebo léčbu koronárních srdečních chorob.

5. Činidlo pro zvýšení aktivity glutathionreduktasy, popsané v patentovém nároku 1, pro prevenci nebo léčbu idiopatické plicní fibrózy.

6. Činidlo pro zvýšení aktivity glutathionreduktasy, popsané v patentovém nároku 1, pro prevenci nebo léčbu chronického selhání ledvin.

7. Činidlo pro zvýšení aktivity glutathionreduktasy, popsané v patentovém nároku 1, pro prevenci nebo léčbu poruch nervového systému, způsobovaných oxidačními stresy.

8. Činidlo pro zvýšení aktivity„g.lutathionreduktasy., popsané v patentovaném nároku 1, pro prevenci nebo léčbu žaludečních vředů.

9. Činidlo pro zvýšení aktivity glutathionreduktasy, popsané v patentovém nároku 1, pro prevenci nebo léčbu katarakt.

10. Činidlo pro zvýšení aktivity glutathionreduktasy, popsané v patentovém nároku 9, kde zmíněné katarakty jsou způsobovány hromaděním polyolu v čočce, hromaděním proteinu o vysoké molekulové hmotnosti v čočce nebo hromaděním peroxidu v čočce.

11. Činidlo pro zvýšení aktivity glutathionreduktasy, popsané v patentovém nároku 9, kde zmíněné katarakty jsou způsobovány hromaděním proteinu o vysoké molekulové hmotnosti v čočce nebo hromaděním peroxidu v čočce.

12. Činidlo pro zvýšení v patentovém nároku 9, stařeckých pacientů.

aktivity glutathionreduktasy, popsané kde zmíněné katarakty jsou katarakty

13. Činidlo pro zvýšení aktivity glutathionreduktasy, popsané v patentovém nároku 9, kde zmíněné katarakty nejsou diabetické katarakty, ale katarakty stařeckých pacientů.