CZ377299A3 - Způsob inhibice růstu nádorů pomocí ÁLdenovirového vektoru, který obsahuje antagonistů angiogeneze - Google Patents

Abstract

Genová terapie vhodná k léčení nádorů, tj. vnesení genu kódujícího anti-angiogenní faktor do buněk nádoru, např. pomocí defektniho adenovirového vektoru, kteiý inhibuje růst nádoru nebo metastázy nádoru nebo obojí. Ve specifickém provedení sejedná o podání defektniho adenoviru, který exprimuje aminokoncový fregment urokinázy (ATF),jež inhibovalo růst a metastázy nádoru Tyto účinky korelují s významnou inhibicí neovaskularizace vmístě injekce a vjeho bezprostřednímokolí. Podání defektniho adenovirového vektoru, který exprimuje smyčky 1 až 3 angiostatinu inhibovalo růst nádoru a tumorigenicitu a indukovalo apoptózu nádorových buněk Dálejsou poskytnuty virové vektoiy pro použití k inhibici růstu nádorů.

Description

Způsob inhibice růstu nádorů pomocí adenovirového vektoru, který obsahuje antagonistu angiogeneze

Oblast' techniky

Předkládaný vynález, se týká genové terapie pro léčení nádorů. Konkrétně ^!se vynález týká vnesení .genu kódujícího

anti-angiogenní	faktor	do	buněk nádoru,	např.	pomocí
adenovirového	vektoru/	.aby	inhiboval·' růst	nádoru	nebo

metastázy nebo obojí.

Dosavadní stav-techniky

Migrace buněk je- koordinovaný proces, který spojuje .buněčnou .aktivaci a adhezi, kdy je narušena rovnováha mezi pericelulární proteolýzou a její inhibici .(např. spouštěnou inhibitory aktivátoru piazminogenu a tkáňovými inhibitory metaloproteináz (1-3). Urokinázový aktivátor piazminogenu (u?A) má klíčovou roli v tomto procesu, protože iniciuje proteolytickou kaskádu na povrchu migrujících buněk tím, že se naváže· na svůj receptor na buněčném povrchu (uPAR) (4,5). Navázání ' uPA na svůj receptor značně zesiluje konverzi plásminogen/plasmin ·. na buněčném povrchu'

Plasmin je může -.přímo . j e např.

široce specifická, degradovat složky serinová proteázá, která mez.ibuněčné hmoty jaké fibronektin, vitronektin nebo laminin. Plasmin také nepřímo podporuje lokalizovanou degradaci, s.tromatů tím., že přeměňuje inaktivní zymogen na aktivní metaloproteinázy (7). Selektivní distribuce uPRA na ' vedoucím konci migrujících buněk (invadopody) zjevně koncentruje uPA vylučovaný jimi samotnými nebo sousedními buňkami stromatu . (.8) . Receptory uPAR se také přímo účastní buněčné- adheze k mezibuněčné hmotě, jak je ilustrováno např. jejich vazbou k vitronektinu závislou na uPA (9), a také proto, že uPAR 'moduluje vazebné vlastnosti, některých molekul integrinů (10) . A nakonec uPA a· plasmin se podílejí nějakým způsobem i na. buněčné morfogenezi tím, že. aktivují nebo indukují uvolňování mor-fogenních faktorů jako je např. vaskulární endotelový růstový faktor (VEGF), růstový, faktor hepatocytů (HGF), růstové faktory fibroblastů (FGF) ' a transformující, růstový faktor β (TGFp) (11,12).

Všechna tato' pozorování 'Ukazují· .na .-to, .že systém uPA/uPAR řídí' buněčnou, migraci, tím, že koordinuje . buněčnou aktivaci, adhezi a . motilitu. Toto tvrzení podporují i klinické' . poznatky,.', které koreluji s..přítomností.. zvýšené • aktivity uPA na invazivní straně nádorů (13, 14). Zjištění, že melanom indukovaný DMBA nebo krotonovým olejem.nepokračuje do maligního stadia ujmyší deficitních na uPA také podporuje to, že uPA hraje'roli -při vzniku a progresi nádorů . (15) . ' uPA.se váže na uPAR fragmentem lehkého řetězce·, který je také znám jako fragment, aminokonce,· aminoterminálňí fragment' (ATF, aminokyseliny .1 až 135) ' Tato- interakce je · druhově specifická·· ,(16), a účastní se ji doména' ATF podobná EGF '· (aminokyselinové zbytky '1 až 46), ve které' jsou kritické aminokyseliny. 19. až' 32, které nepatří ke úsekům při srovnání myši a_; -.člověka (17, .18).

komplexu uPA/uPAR zprostředkované AT.F inhibuje - a invazi buněk in vitro (19) , yIritraperitoneální bolusová injekce.chimérického humánního antagonisty. založeného na'ATF byla užita k inhibici plicních metastáz lidských nádorových buněk ‘ implantovaných myším bez thýmusu, . aniž by došlo k významnému ovlivněni růstu primárního nádoru (20) . Jiná konzervativním Narušení migraci studie popisovala, že intráperitoneální injekce syntetických peptidu odvozených od-myšího ATF byla účinná v inhibici jak růstu primárního, nádoru tak i plicních metastáz (21) . Tyto výsledky jsou konzistentní s úlohou komplexu . uPA/u.PAR při kontrole motilitv nádorových i endotelových buněk. Fakt, že chimérický antagonisťa založeriý na myším ATF může inhibovat růst cév. v mezibuněčné hmotě uměle .obohacené bFGF (23) dále podporuje podíl uPA/uPAR- v kontrole angiogeneze in vi vo. .

Vytváření cév neboli angiogeneze - je výsledkem '-růstu .kapilár· z již existujících cév.. Angiogeneze. je nezbytná pro řadu. fyziologických procesů jako .je vývoj embrya, hojení ran a regenerace tkání a orgánů· .K'abnormálnímu růstu nových cév dochází v patologických podmínkách jako je např. diabetická retinopatie, růst nádoru-nebo- d-iseminace nádoru · ná vzdálená .místa (38, ' 24j . .Jak experimentální tak klinické výzkumy ukázaly,, že,, primární _λnádory i- metastázy zůstávají dormantní díky rovnováze v buněčně proliferaci a apoptóže,·. dokud není Spuštěn proces angiogeneze (39).

. Růst endotelových buněk, je- přísně regulovaný proces, a to· jak pozitivními tak i negativními ' faktory. Počátek . nádorové . angiogeneze může být nastartován ·'buďto aktivací 'angiogennícn faktorů uvolňovaných· nádorem, jako je např. vaskulární endotelový růstový faktor (VEGF) a'kyselý a/nebo bazický růstový faktor fibroblastů (bFGF) , a nebo utlumením angiostatických faktorů jako jsou trombospondin a angiostatin (39). Takže-· obě cesty, jak- rekonstituce 7 angiostatických' faktorů' a nebo odstránění -angiogenezi stimulujících faktorů, představují vhodné klinické strategie k' potlačení nádorové:, angiogeneze (4Ó, 41) . .Terapie- založená na angiostatiku by byla vhodná také pro všechny.typy solidních nádorů, protože endotelové buňky se neliší mezi nádory, což ještě více.

zdůrazňuje klinickou relevanci takového protinádorového

·· ··	• · ·	• ·	• ·
• ·	• · ·	•	• · ·
• · ·	• · · ·	• ·	• · · ·
• ·	• · ·		* 9
···· ····	··· ··	*·	'9 >

<5 <?

postupu. Takže terapie- zacílená na angiogenezi je vysoce ' . <

relevantní pro. klinickou praxi._____ -________ . Mnohé fyziologické .angiostatické faktory vznikají proteolytickým štěpením cirkulujících proteinů. To -je případ angiostatinů (32), enaostatinu (.42) , fragmentu prolaktinu velikosti’ 16 kD (43) nebo faktoru 4 destiček (44). Angiostatin byl původně izolován, z myši s Lewisovým plicním nádorem (LLC); a byl identifikován jako vnitřní fragment velikosti .38 kD z plasminogenu (Plg)(aminokyseliny 98 až 440), který obsahuje první čtyři smyčky molekuly (32, WO 95/29242, US 5 639. 72.5) . Bylo ukázáno, že, angiostatin se t.voří po hydrolýze Plg ' metaloelastážou z makrofágů stimulovaných ' - GM-CSF -infiltrujících nádor (45),

In.traperi tdneální-·. ’ bolusová .injekce pur-ifikovaného angiostatinů se ' ukázala být . velice účinná- .v potlačení, růstu primárního nádoru, u šesti různých modelů nádorů/ a to bez zjevné , toxicity (46). . Suprese. ..nádorové angiogeneze zprostředkovaná angiostatinem zjevně způsobila vyšší rychlost apoptózy nádorových, buněk/ .-což vyrovnalo jejich proliferační rychlost. V této studii se růst nádoru zpravidla obnovil po odstranění molekul·, angiostatinů, .' což vede ke zdůraznění důležitosti dlouhodobého, podávání pro dosažení klinicky' prospěšného výsledku (46). Studie, in vitro. s rekombinantríími. proteiny ukazují,; že angiostatická aktivita angiostatinů je zprostředkována - především . smyčkami i^; až 3 . a·.- smyčka '4 má minimální angioštatickou aktivitu -(-47)-. - Jako .- u', většiny' angios.tatických 'faktorů ' také u angiostatinů j e' ' známo -velmi málo o tom, jakým způsobem účinkuje.

Angiostatická terapie vyžaduje dlouhodobé udržování dostatečné hladiny léčiva in vivo, avšak kontinuální podávání rekombinantního proteinu'je.drahé a nepohodlné. Přímé in vivo podávání odpovídajících genů· pomocí virových vektorů ·· • β • · · » « »· · • ' *

I « · představuje atraktivní řešení tohoto problému. Jelikož většina protinádorových genových terapii současnosti^; spočívá v destruktivní strategii ...namířené na nádorové buňky (4 8.) , virem zprostředkovaný přenos angiostatického faktoru tak představuje? koncepčně zcela odlišný, a snad synergistický, přístup k boji proti rakovině. -/ . I přes tyto výsledky, stále přetrvává potřeba vyvíjet nové účinné způsoby k léčení, nádorů, zvláště , nádorů'odolných & k dosavadní chemoterapii. ' ._

Předkládaný vynález 'vyhovuje této potřebě a poskytuje účinný, prostředek k léčení, nádorů. .

V textu' přihlášky je 'citována (zkráceně ‘čísly) řada publikací, které '.jsou shrnuty v .seznamu .na . konci textu. V žádné z těchto publikací není popsán ani navržen vynález , předložený v této přihlášce...

Podstata vynálezu <5, - g, . : Předkládaný ’ vynález · výhodně, poskytuje- vysoce účinnou . pro.tinádorovu ...-genovou . terapii. Ve ' specifickém provedení předkládaného .. vynálezu .ATF . (aminokoncový fragment) .· myší

- urokin.ázy exprimovaný v lidských nádorových buňkách u modelu . ·· bezthymovýčh*. myší- překvapivě, účinně inhibovál tumorigeňní·' působení, V . jiném provedení anglosta.ťln-- exprimovaný € J v nádorových buňkách u myšíhomodelu kromě toho, 'že blokoval 'angiogenezi, inhibovál růst⁷ nádorů a.'tumorigeneziúa indukoval , apoptózu nádorových buněk.

Předkládaný vynález z širšího hlediska poskytuje způsob . inhibice rů.s.tu nádorů nebo metastáz nádorů, nebo obojího, kterýžto způsob spočívá ve vnesení vektoru obsahujícího gen, který- kóduje, anti-angiogenní faktor operativně spojený, se sekvencí řídící expresi, která vede k expresi antiangiogenního faktoru v buňce/buňkách · nádoru. JVýhodně_ _ je vektor virový vektor, výhodněji je to adenovirový vektor. Ve .specifickém provedení vynálezu popsaném dále je adenovirovým vektorem defektní adenovirový vektor.

Způsoby podle předkládaného vynálezu jsou. vhodné k léčení mnoha nádorů, jak,bude dále podrobněji popsáno.. Ták např: ve specifickém provedení vynálezu' se jedné- o' plicní karcinom nebo karcinom prsu.

Předkládaný vynález poprvé ukazuje výhodu exprese antiangiogenního faktoru .transdukovanými nádorovými buňkami. Tudíž je možné podle vynálezu, podávat gen kódující jakýkoliv anti-angiogenní faktor, jako je třeba rozpustný receptor angiogenního proteinu, nebo antagonista angiogenze. Ve specifickém provedení . vynálezu anti-angiogenní' -faktor obsahuje sekvence amino-koncového fragmentu urokinázv mající doménu podobnou EGF, přičemž‘faktor není urokináza. Tak nápř.· anti-angiogenní faktor může být chimérický protein obsahující ATF-imun-c globu! in nebo ATF-lidský sérový albumin. Ve výhodném provedení vynálezu uvedeném dále v příkladech anti-angiogenní faktor je - aminokoncový ' -fragment urokinázy mající aminokyselinovu sekvenci urokinázy od aminokyselinového zbytku 1 až ke zbytku 135. Specifickým příkladem urokinázy je myší uirokináza. Ve výhodném, provedení je urokináza lidská urokináza. ' <' ,

V alternativním- provedení ‘ ;j-e anti-angiogenní faktor angios tatiň,- zvláště smyčky 1 až. 3 angiostatinů. Ve zvláště výhodném provedení vynálezu je anti-angiogenní .faktor aminokoncový fragment plasminogenu (Plg) -mající; aminokyselinovou sekvenci . plasminogenu zahrnující aminokyselinové zbytky 1 až 333., V jiném výhodném provedení • · • · » · · <

· · · · <

···· ···· ··· ·· fragment anti-angiógenní faktor je amino-koncový (angiostatin) lidského plasminogenu. .·____________

Dalším předmětem předkládaného vynálezu je použiti vektoru obsahujícího gen kódující anti-angiogenní faktor, operativně 'spojený sé . sekvencí řídící expresi, která poskytuje expresi anti-angiogenního' faktoru,,', pro výrobu léku k inhibici růstu nádoru nebo metastáz nádoru nebo. obojího. Konkrétně vynález., poskytuje použití virového vektoru podle předkládaného vynálezu, jaký je- např. popsán dále, pro výrobu léku ' k inhibici ' „růstu nádoru . nebo metastáz nádoru nebo oboj ího.

Přirozeně kromě způsobů a použití . uvedených v .předchozích odstavcích poskytuje vynález také. nový virový, vektor, .který obsahuje gen kódující anti-angiogenní faktor operativně, spojený se sekvencí řídicí expresi.· Ve výhodném provedení vynálezu je vektor virový, vektor. Ve výhodnějším provedení je to d.efektní. adenovirový. vektor. Virový .vektor podle předkládaného vynálezu poskytuje· gen. kódující .antiangiogenní· faktor,' ják · byl již definován· výše. Antiangiogenní faktor např. obsahuje sekvence aminokoncového fragmentu urokinázy- mající doménu podobnou EGF, ' přičemž' faktor ' není urokináz'a. Ve. výhodném provedení . vynálezu uvedeném^- dále . v ·.příkladech anti-angiogenní faktor je aminokoncový fragment urokinázy mající aminokyselinovu sekvenci urokinázy od .aminokyselinového zbytku 1 až ke zbytku 135. V tomtoprovedení vynálezů jě urokinazou myší urokináza'nebo výhodněj i'.lidská· urokináza . ' ''

Předkládaný vynález ' dále poskytuje farmaceutický přípravek, který obsahuje jakýkoliv, virový vektor, podle vynálezu a farmaceuticky přijatelný nosič.

• Cílem vynálezu je poskytnout genovou^- terapii k léčení nádorů založenou na.dodání anti-angiogenního faktoru. ..

• · • 9 • 9' 9 ' 9 ♦ · · 9 -9 · · . · · · 9 9 9 9 9 9 « » 9 9 9 9 '9·· «99

9 - · - 9 9 9 9

9 99999 9 9 9-99' 9« 9 9

Dalším cílem vynálezu je poskytnout virový vektor pro podávání anti-angiogenního faktoru. · _ __

A: dalším cílem vynálezu je poskytnout genovou terapií amino koncový fragment urokinázy .(ATF) k léčení nádorů.

Dalším cílem vynálezu 'je poskytnout' genovou terapií angiostatin k léčení nádorů.

Ještě dalším ^:cíle.m vynálezu je poskytnout genovou terapií -angiostatin, zvláště pak smyčky angiostatinu 1 až 3, k léčení nádorů.' Tyto předměty vynálezu jsou dále ještě- podrobněji popsány'a vysvětleny pomocí- příkladů a doprovodných obrázků.

Popis obrázků

Obr. 1. Molekulární' charakterizace - -viru AdmATF. Panel A: struktura AdmATF .'a AdCOl. Chromosom Ad5. je 36 kb· dlouhý a ohraničený invertovanými terminálním repeticemi. Y,/označuje' enképsidační signál. Obva viry jsou deřéktní v, -růstu, neboť postrádají-, geny A.d5 El. Obsahují také- delecí 1,9 kb Xbal v úseku E3. Pod Ad5. chromosomem je uvedena (není -v měřítku)' schematicky, mATF expresní' kazeta' . viru' AdmATF.. Přehled adenovirových. vektoru viz/ (38). Panel 3: analýza exprese mATF. Buňky MDÁ-MB-231 byly infikovány po 24 hodin AdCOl (dráha 2) a '.AdmATF (dráha 3), nebo. slepě, infikovány jako kontrola (dráha 1) a celková póly-(A+) RNA byla pak analyzována northernovým přenosem. RNA kódující ATF (0,5 kb) je označena šipkou.- Byla- .také, detekována molekula velikosti 1,7; kb (označena hvězdičkou), což. je velikost, která, je v souladu s velikostí užitého polyadenylačního signálu, z genu pIX adenoviru. Panel C: Analýza sekrece ATF infikovanými buňkami 393. Kultivační médium ze slepě infikovaných, kontrolních • · · · ♦ '· * ·' · · · · • 9 9 9 9 '9 9 9 9 · · ' »- * · · · ··· ' «·· 9- 9 9 9 9 9 9

..· ..

, buněk (dráha 1). nebo buněk infikovaných AdCOl (dráha .2) nebo ______. - . AdmATF____(dráha 3.)-byly_____analýzo vány ...westernovým přenosem . s polyklonální anti-myší u-PA protilátkou.

Obr. 2. Funkční charakterizace viru AdmATF. Panel A: ..'Kultivační médium buněk infikovaných AdmATF inhibuje konverzi ^e plasminu na povrchu buněk kLLC (viz metody v příkladech). 293 označuje neinfikované buňky-í Panel ' B: ..Infekce . buněk : LLC ' ' AdmATF (pravý; panel) specificky inhibuje invazivnost buněk ve srovnání s buňkami -LLC ' infikovanými .AdCOl (levý . panel) . Viditelné jsou 1,mm póry membrány... , . Obr. 3. Intratumorová injekce AdmATF inhibuje růst' nádoru LLC . u- svngenních myší.- Nádorové buňky (2 x 10^s buněk).· -byly . . i-njikovány subkutánně do myší C57BL/6 . /. Po 6 dnech- zvířata dostala intratumorovou ' injekci PBS- nebo 10^s pfu AdCOl. nebo AdmATF a' pak byl' monitorován .růst nádoru. Jsou uvedeny _e. průměrné hodnoty sě. směrodatnou., odchylkou (n=10)'.. Statistické hodnocení bylo provedeno Studentovým testem.

Obr. 4. Intratumorová injekce AdmATF -inhibuje vaskularizací nádorů LLC . Panel A: Reprezentativní nádor extrahovaný . 10' dní po injekci u .skupiny. léčené AdCOl (vlevo) a AdmATF (vpravo). Reprezentativní nádoo extrahovaný 20.den po injekci je ukázán na panelu B*. (injekce AdCOl) a panelu C. (injekce AdmATF) .

g' > „. ^x ' ¹ ’ ’ ' -Všechny fotografie byly provedeny při stejném zvětšení.

Povšimněte si, že,nádory, po injekci AdmATF jsou mnohem menší 'než kontroly po.· injekci AdCOl, zvláště ' vě' druhém odběrovém, čase (srovnej panely B a C).

Obr. 5.. Intratumorová injekce AdmATF Inhibuje růst nádoru

MDA-MB-2312 u .nahé myši. Nádory bylý implantovány • · • · • · • ·

subkutánní injekcí 3 x 10⁶ buněk MDA-MB-231. 11.den po implantaci myši dostaly intratumorovou injekci PBS nebo IQ⁹ pfu AdmATF nebo AdCOl a pak byl monitorován růst nádoru. Jsou uvedeny průměrné hodnoty se směrodatnou odchylkou. ·

Obr. 6. 'Intratumorová injekce AdmATF inhibuje intratumorovou a peritumorovou angiogenezi. Panely A' a B: Imunobarvení pomocí vWF. Řezy nádorů MDA-MB-2-31 zalitých do parafinu připravené ze skupin zvířat léčených AdCOl' (A) a AdmATF (B) byly vyhodnocovány pomocí séra vVF .52.den' po . injekci. Panely Č a D: makroskopické hodnocení peritumořové vaskularizace v kůži tumoru 20. den po injekci AdCOl (C) nebo AdmATF (D) .

Obr. 7. (A) Rekombinantní adenoviry. -Genom Ad5' je 3 6 kb dlouhý chromosům. Viry AdK3 a .AdCOl byly odvozeny· pomocí letální delece genů El (nukleotidy 382. až .3446),. nesou také·'· neletální deleci 1,9 kb Xba I v úseku E3 (pro přehled viz (37)). Expresní kazeta pro .angiostatin je ukázána· pod 'chromosomem'-· ' Ád5. Plasminogenový sekreční · signál . je představován černým úsekem, +1 označuje transkripční počátek řízený CMV. promotorem,. AATAAA označuje .pozdní polyadenylační· signál z SV40. .(B). Analýza sekrece' angiostatinu infikovanými buňkami·. Westernová analýza byla provedena se 100 ng lidského' 'Plg (dráha 1) , kultivačním' médiem - z buněk' HMEC infikovaných AdK3 (dráha 2) nebo AdCOl (dráha 3), buněk C6 infikovaných AdK3 (dráha 4) nebo AdCOl (dráha 5) a .buněk MDA-MB-231 infikovaných AdK3 . (dráha 6) .nebo AdCOl·.' (dráha·. 7). (C) Imunodetek.ee angiostatinu. v extraktech, ž nádorů- Č6.' Nádory byly navozeny u nahých myší injekcí 10⁹ pfu . AdCOl (dráha 1) nebo AdK3 (dráha 2) a 10. den po injekci, byla provedena westernová analýza. Signál odpovídající • ·

<·, fc.

'<8_ν angiostatinu. (38 až 38 k'D) a Plg (92 kD) jsou označeny šipkou a hvězdičkou (v_ uvedeném pořadí) ._________j _ (_·____;__

Obr. 8. (A) Inhibice proliřerace endotelových buněk. C6 (panel 1) , MDA-MD-231 (panel 2) . a · HMEC-1 (panel 3) byly injikovány AdK3 .(♦) nebo AdCOl '(□) . Buňky HMEC-1 (panel 4) byly kultivovány se supernatantem z AdK3 (♦) nebo AdCOl (□) infikovaných C6 gliomových buněk. (B) . detekce MPM-2 fosfoepitopu v buňkách HMEC-1. Kontrolní slepě infikované buňky (dráha 1), buňky infikované' A.dCOl (dráha 2) a buňky infikované ,A.dK3 (dráha 3). ' (C) , MPM-2 epitop byl detekován v buňkách .HMEC-1 infikovaných AdCOl' (panel·· 1) a buňkách infikovaných- AdK3 '(panel 2) nepřímým imunobarvením a obsah DNA barvením- pomocí propidiumjodidu,, a kvantifikován průtokovou cytometrií (-viz metody.) ., Pro. statistickou analýzu byl; užit Studentův t-test. ..

Obr. 9. ,A.dK3 inhibuje' růst nádoru.. Gliomové' buňky C6 (panel

Z

A) a. karcinomové buňky MDA-M3-231 (panel 3) byly implantovány, subkutánně ' do bezthymóvých myší - (viz ' metody).Když nádor dosáhl, objemu 20 mm³ (den, 0), dostaly myši'· intratumorovouinjekci' PBS ·(□) nebo 10^s pfu Adk3 . (·) nebo AdCOl' (♦) . Jsou uvedeny průměrné hodnoty se směrodatnou odchylkou.

Obr. 10. AdK3 inhibuje růst, nádoru C6 a angiogenézi. Nádory' ze skupiny léčené AdCO.l· (panel A) a AdK3 ;(panel . B) jsou ukázány 10 dnů po injekci. Rozsah vaskulařizace v periferii reprezentativního nádoru je ukázán 5. den -po injekci pro. skupinu léčenou AdCOl (panel C) a A-dK3 (panel D) . Parafinové řezy z C6 léčených AdCOl; (panel E)a AdK3 (panel F) byly 10 dní po injekci podrobeny imunobarveňí ,vWF. Podíl apoptic.kých. buněk byl detekován metodou. TUNEL na řezech z nádorů • ·' injikovaných AdCOl (panel G) a AdK3 (panel H) . Pro všechna n

- _____srovnán i AdCOl a AdK3 bylo použito stejné _zv ě t š en i .______________

Obr. 11. Účinek AdK3 závislý na dávce. Buňky, C6 byly infikovány in vitro 24 hodin AdCOl (panel A) a AdK3 (panel B) a smíchány v poměru 1:1 (□), 1:2 (♦) a '1:4 (·) _r ·.· \ s neinfikovánými C6 buňkami·' předtím než byly implantovány do . bezthymových myší. V průběhu 20 dnů byl měřen objem nádoru. h . Jsou uvedeny průměrné hodnoty se směrodatnou · odchylkou. , a angiosrarin.

na příslušný

*. .Podrobný popis vynálezu . . .

, Jak bylo již. zmíněno výše, vynález se týká' způsobů a vektorů pro genovou terapii nádorů. Způsoby a vektory podle předkládaného' vynálezu inhibují růst nádorů· nebo-· metastázv nebo obojí. Způsoby a.vektory podle vynálezu působí tak, že .neočekávaně silně inhibují angiogenezi v nádoru.

Vynález vychází z pokusů, kdy se v rámci genové terapie podával áminókóncový ' fragment'urókinázy .(ATF .. ATF ' je . antagonista. vazby - urókinázy - (uPA receptor’ (uPAR) a. inhibitor, migrace .endotelových. buněk. Pro hodnocení, významu interakce uPA/uPA-R , pro . růst a di.semi.náci . nádoru byl zkonstruován defektní adénovirus exprimující 'myší ATF z promotoru CMV (AdmATF). Jediná intratumorová injekce AdmATF inhibovala růst předem vyvolaných nádorů u dvou odlišných myších 'modelů a zpomalila diseminaci nádorů . .· Tyto .‘ účinky , korelovaly s pozoruhodnou .inhibici neovaskularizace přímo v místě injekce a. jeho blízkém, okolí·. Rozsah, tohoto ' ' účinku byl zvláště, pozoruhodný ve schopnosti mycího ATF inhibovat angiogenezi nádorů lidského původu. Ve specifickém vynálezu byl zkonstruován defektní exprimující N-koncový fragment příkladu provedení adénovirus (AdK3j • ·

(aminokyseliny . 1 až 333) lidského Pig, zahrnující _________preaktivační peptid a smyčky 1 _ až 3__(47)., a byla___testoyána_ jeho účinnost ' in vitro a in vivo na různých myších modelech nádorů. Vektor AdK3 inhiboval růst., nádoru, nádorovou . angiogenezi a tumorigenezi a indukoval apoptózu nádorových buněk. ^; · ·’ _σ Intratumorové podání antagonisty zprostředkované adenovirovým vektorem vykazuje silné protinádorové·· účinky £ .· - tím, že působí na angiogenezi'.· '· · .

. Definice' ' ..·

V textu přihlášky se užívají termíny,. které jsou . definovány v následuj,ících'' odstavcích, , což pomůže k ₍lepší,mu '.porozumění, a případně provedení, předkládaného vynálezu..

Termíny /asi.'· a .přibližně” používané ve 'specifických ' * provedeních' vynálezu znamenají·, hodnoty; v rozmezí 20 výhodně. 10 %.a· výhodněji 5 % uvedené hodnoty.

' Termín anti-angiogenní faktor”· označuje molekulu, která.

.inhibuje angiogenezi, zvláště tím, že blokuje migraci endotelových buněk.’ K takovým faktorům ‘patří fragmenty, · .angiogenních' proteinů, · které mají inhibiční- účinek- (jako je ATF nebo urokináza), faktory .inhibující· angiogenezi· (jako jsou angiostatin a-- endostatin) a rozpustné- receptory' _é ' angiogenních faktorů jako je např. receptor urokinázy nebo

FGF/VEGF receptor.. Termín ' ..angiostatin . se týká u ' ; . ' - .

· aminokonc.ového fragmentu' plasminogenu, ' který zahrnuje antiangiogenní fragment · ángiostatihu obsahující smyčky 1 - až 3. Obecně · je anti-angiogenní -.faktor - pro' použití ..podle předkládaného vynálezu protein nebo polypeptid kódovaný genem, který je transfekován do nádoru pomocí vektorů, podle vynálezu. '· 14' «·' ·· ·· • · 9 9 9 9 '· · · · · · « 9 9 ·9 9 ··* « · · · .·· ·· 99

Varianta polypeptidů nebo proteinu znamená analog, fragment, derivát nebo mutantu, které jsou odvozeny od původního polypeptidů nebo proteinu , a které si uchovávají alespoň jednu biologickou vlastnost původního polypeptidů nebo proteinu. V přírodě mohou existovat různé varianty polypeptidů nebo proteinů. Tyto varianty mohou· být alelicke varianty, které jsou charakteristické rozdíly v nukleotidová sekvenci strukturního genu kódujícího protein, nebo mohou, obsahovat rozdíly, díky. ' odlišnému. sestřihu RNA. nebo posttranslačním modifikacím, odborník je -schopen připravit varianty, které obsahují, substituce,, delece, adice nebo přemístění jedné nebo· několika aminokyselin. Kromě, .jinéhopatří k variantám: a) varianty, kde jeden nebo .několik aminokyselinových zbytků je nahrazeno konzervativní nebo nekónzervativní aminokyselinou·, b). varianty,· kde j-e ..přidána, k polyp.eptidu. nebo .proteinu' j edna nebo několik , aminokyselin, c) varianty, kde jedna nebo -několik aminokyselin, obsahuje substituované- Skupiny a vd). varianty, kde polypeptid. nebo protein je fúzován, s jiným polypepti-dem jako je např.- sérový albumin.. Způsoby získání takových' variant, včetně genetických (suprese·, 'delece, mutace atd.)', . chemických a enzymatických způsobů - jsou odborníkovi .dostatečně známy.

Takže jestliže alelické,' varianty, ahalogy, fragmenty,.

a .modifikace, ·. včetně alt.erantivních nebo alternativních .pošttranslačních k derivátům polypeptidů, . které si uchovávají některou .biologickou vlastnost polypeptidů, jsou také předmětem předkládaného vynále-zu. .

deriváty, mutanty sestřihových forem modifikací, vedou

Obecná molekulární biologie

V předkládaném 'vynálezu se užívají konvenční techniky:

molekulární biologie, mikrobiologie a.rekombinantní DNA známé r

průměrnému, odborníkovi. Tyto techniky jsou podrobně popsány

A . '. - i v odborné literatuře např. viz. Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A 'Laboratory Manual, -Second Edition, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 'New York (dále jen /'Sambrook et al., .1989); DNA Cloning:

A Practical Approach, Volumes. I and II (D.N. Glo.ver ed. 1985); Óligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed. 1984); Nucleic A-cid Hybridization 15 [B.D. Hames & S.J. Higgins·eds.

_Λ . (1985)]; Transcription- And’ Translation [B.D.’ Hames' & S. J.

Higgins, eds. (1984)]; Animal Cell'. Culture [R.I. Freshney, ed. (1986)]; Immobilized Cells And Enzymes .[ IRL Press, . (.1986)]; Bl 'Perbal, A Practical Guide.· To. Molecular- Cloning (1984); F.M. Ausubel et. al.. .(.eds,), Current. Protocols' in. Moleculdař Biology, John Wiley .& Sons,' Inc. (1994) .. ^; . - - Dále ''jsou' vysvětleny .. ještě. další..'relevantní termíny užívané v textu přihlášky..' t Vektor je jakýkoliv prostředek pro'· přenos' nukleové . \ ....

. . kyseliny podle předkládaného vynálezu do hostitelské buňky.· ' Termín vektor zahrnuje jak virové tak i nevirové prostředky pro·'.vnesení nukleové kyseliny do'.'buňky in vitro, ex. vivo nebo , in vivo. Κ,nevirovým . vektorům patří plazmidy,' liposomy, nabité- lipidy ' (tzv. cytof ektin.y) , komplexy.·' protein-DNA a biopolymery K virovým' vektorům patří recrcviry, adenoasociované viry, t- . . . ·

Herpes simplex & vektory, které kyseliny podle několik regulačních ús.e.ků a/nebo. selekčních markérů vhodných pro . selekci,·· -'kvantifikaci a monitorování výsledků přenosu nukleové kyseliny (do .které tkáně, trvání exprese atd;)

Regulační úsek . znamená sekvenci nukleové kyseliny, .která reguluje expresi druhé sekvence nukleové kyseliny.' virus neštovic,' .bákuloviřus·, virus vakcínie,· virus., virus Epsteina-Barrové a adenovirové jsou podrobně popsány dále. Kromě nukleové vynálezu může- vektor obsahovat .jeden nebo

• · · · ·· '♦· i*

Regulační úsek může obsahovat sekvence, které jsou přirozeně zodpovědné, za expresi dané nukleové kyseliny (homologní úsek) nebo obsahuje sekvence odlišného původu (zodpovědné za 'expresi jiných proteinů nebo dokonce syntetických proteinů). Konkrétně to. mohou být sekvence eukaryotických nebo virových genů nebo z nich. odvozené sekvence, které stimulují nebo potlačují’ transkripci, genu specifickým .nebo nespecifickým způsobem a buďto indukovatelným nebo neindukovatelným způsobem. Regulační 'úseky obsahují počátek, replikace, RNA sestřihové místo, zesilovače (enháneery), terminátory transkripce, signální ' sekvence cílící. polypeptid ' do .s.ekretorické dráhy cílové buňky,' a promotory.

-Regulační úsek z. heterologního zdroje je regulační -úsek, který není přirozeně spojen s exprimovanou nukleovou kyselinou. K heterologním regulačním úsekům patří- regulačníúseky z jiného biologického druhu, regulační úseky z jiného genu, hybridní regulační sekvence a regulační sekvence, které se nevyskytují v přírodě,· ale které jsou připraveny průměrným odborníkem.

Kazeta označuje segment DNA, který můž,e být vl.ožen' do i “ vektoru .ve specifických restrikčních místech. .Segment DNA kóčlující . požadovaný polypeptid, kazeta a restrikční místa jsou navržena tak, aby byla zajištěna inzerce kazety ve' správném čtecím rámci pro transkripci a translaci.Buňka je transfekována exogenní' nebo heterologní DNA, když tato DNA byla vnésena do buňky. Buňka je transformovaná nebo; transdukovaná exogenní nebo heterologní DNA ,- když. transfekované DNA způsobuje fenotypové změny.

Heterologní' DNA se týká DNA, , která se.· přirozeně nevyskytuje v buňce nebo v-chromosomovém místě buňky. Výhodně k heterologní DNA patří geny. cizorodé-pro buňku.·

• «

·· ·· .

• · «

Nukleová kyselina je,· polymerní sloučenina obsahující kovalentně svázané podjednotky zvané nukleotidy. K nukleovým kyselinám patří polyribonukleová kyselina (RNA.) a polydeoxyribonukleová kyselina (DNA),. které obě mohou být ve dvouřetězcové nebo jednořetězcové formě. K DNA. patří cDNA, genomová DNA, syntetická DNA a ,semisyntetická DNA. Sekvence nukleotidů nebo nůkleové kyseliny, která kóduje protein, se nazývá sense sekvence. Rekombinantní molekula DNA je molekula DNA., která byla podrobena molekulárně biologickým úpravám. · . ‘ . '/· · i

Kódující sekvence DNA je dvouřetězcové' sekvence DNA,·· která se přepisuje (transkripce) a překládá (translace) db polypeptidu v buňce in-'vi tro ' nebo- invivo, pokud je řízena vhodnou regulační sekvencíHranice . kódující .sekvence jsou vymezeny, start-kodonem na 5'-konci (aminovém konci) a. stopkodonem na 3'-konci .(karbpxýlovém konci). Pdlyadenylační signál·., a 'terminátor transkripce jsou obvykle umístěny na 3'-konci kódující sekvence,. ·'

Transkripční a trans lační kontrolní 'sekvence' .'jsou regulační sekvence DNA. jako' např. .. promotory, enhancery, terminátory apod., které umožňují expresi kódující sekvence v hostitelské buňce.. V eukaryotické .buňce polyadenylační •signály jsou kontrolní sekvence. ' .Promotorové sekvence je úsek regulační sekvence DNA schopnývázat, RNA polymerázu v buňce a . iniciovat transkripci downštream (tj . ve směru k 3') ležící kódující sekvence. Pro definici předkládaného vynálezu je· promotorové sekvence navázána svým 3'-koncem a zahrnuje úsek upstream k ” místu iniciace ' transkripce (směrem k 5'-konci) obsahující minimální počet' baží nebo elementů .nezbytných k iniciaci transkripce v míře detekovatelné nad .úrovní pozadí. Uvnitř promotorové 'sekvence se nalézá místo iniciace transkripce «IL

(pohodlně definované např. pomocí mapováni nukleázou SI) a také vazebné domény proteinů (konvenční sekvence) zodpovědné ža vazbu RNA polymerázy.

Kódující sekvence je kontrolována nebo. řízena transkpipční a translační kontrolní/řídicí sekvencí v buňce, když RNA polymerázá transkribuje kódující sekvenci do mRNA, která je pak· případně sestřižena (splicing). a translatována do ' proteinu kódovaného sekvencí . ;

Signální- sekvence, je 'Vložena na začátku kódující sekvence proteinu,· který má být exprimován na povrchu buňky. Tato sekvence kóduje signální peptid, a sice ná N-konci 'maturovaného (zralého) polypeptidů, -, která - vede 'hostitelskou buňku k translokaci polypeptidů. K označení tohoto typů signální sekvence se užívá také termín trans lokační signální sekvence.. Translokační signální ·. sekvenci je možné najít asociovanou s řadou proteinů eukaryot i prokaryót a často jsou' funkční v obou'typech-organismů. .

Termín.' odpovídající se, zde užívá, k označení podobných nebo -homologních sekvencí,- ať je přesná pozice identická nebo odlišná ve; srovnání- s molekulou ke které se podobnost nebo homologie vztahují.' ' Srovnání. , (alignment) ' sekvencí nukleových kyselin- nebo aminokyselin může obsahovat' mezery,, termín odpovídající se. .tedy .týká skutečné'.podobnosti sekvence, ’ nikoliv číslování' aminokyselinových zbytků nebo nukleotidových baží.

V následujících kapitolách budou podrobněji vysvětleny některé aspekty předkládaného vynálezu, 'týkající se genové terapie, vektorů, a promotorů, anti-angio.genních proteinů a terapeutických strategií. Text je takto' členěn pro usnadnění porozumění popisu vynálezu a v žádném případě vynález nijak neomezuje.

·« ·· • · · « . · I ·· ·· *· • · · a · a • · · · a · zaměřovaní retrovirové

Vektory pro genovou terapii ;

. . Jak již bylo diskutováno dříve, vektor je jakýkoliv prostředek, k přenosu nukleové kyseliny podle' vynálezu do hostitelské buňky. Výhodné vektory jsou virové vektory jako retroviry, adenoviry a adeno-asociované vir.y (AAV) , Takže gen nebo nukleová kyselina kódující anti-angiogenní protein.nebo pólypeptidový fragment kódující jeho. doménu- ..je vnesen do buňky _:in vivo, in vitro' nebo' ex vivo buďto pomocí, virového vektoru nebo přímými přenosem DNA. Exprese v cílové- tkáni je· ovlivněna zaměřením tránsgenního vektoru na specifické buňky, což je mo.žné např. pomocí 'virového- vektoru nébo receptorového ligandu, nebo použitím tkáňově specifického. -promotoru nebo obojím. ’ - Virové vektory obecně'užívané in vivo nebo ex vivo pro a. ''.genovou ' terapii , jsou DNA vektory ' nebo vektory. Způsoby konstrukce .a .použití, virových vektorů jsou odborníkovi známy (viz· např. Miller a .Rosman, BioTechniques 7.: 980-990, 1992). 'Výhodně, virové vektory jsou' replikačně defektní, . tj . nej sou. .schopny autonomní' reoplikace v cílové buňce. Obecně platí,, že genorn -replikačně defektních virových vektorů, ' které, jsou- vhodné podle .předkládaného' vynálezu, postrádá .alespoň jeden-· úsek, ' který je nezbytný ppo replikaci viru v'infikované buňce., Takové úseky mohou být buďto eliminovány (celé nebo částečně), nebo . jakoukoliv technikou odborníkovi známou ^: změněny na nefunkční, úseky. K těmto technikám patří úplné odstranění, substituce (jinou sekvencí, zejména vloženou požadovanou nukleovou kyselinou), částečná delece nebo adice jedné nebo několika baží v úseku nezbytném- pro replikaci. Takové techniky se mohou provádět in vitro (na izolované DNA) nebo in sítu pomocí způsobů genových manipulací nebo - působením mutagenních činidel.

·· ·· tento výčet není které úplně nebo

Výhodně si replikačně ' defektní virus ponechává sekvence nezbytné , pro .enkapsidac.i virových částic.

K DNA virovým vektorům patří atenuované (oslabené) nebo defektní viry jako jsou např. virus Herpes simplex (HSV) , papilloíná virus, - virus Epsteina-Barrové (EBV) , adehovirus, adeno-asociovaný . virus- apod. (přičemž omezující). Výhodné jsou defektní. viry, téměř úplně- .postrádají virové geny.' Defektní virus, není infekční' * po vnesení do buňky. Použití defektních virových vektorů umožňuje ' podávání do buněk ve specifické, lokalizovaní oblasti, a .to bez obav, že. by virus mohl infikovat i jiné buňky. Může být tedy zaměřena specifická tkáň. ~K příkladům patří- -vektor obsahující -defektní herpes virus 1 (HSV1, Kaplitt et al., Mol ec. Cell. Ne-urosci. 2: 320330, 1991), defektní... Herpes virus·- postrádá j ící -geri pro glykoprotein L (patentový publikovaný dokument RD371005. A) , nebo další vektory založené na defektním Herpes viru ^Mezinárodní .patentová publikace .WO 94/21807, 'publikovaná 29.. září 1994; Mezinárodní patentová' publikace , WO . 92/05263, publikovaná -2. ’ dubna’ 1994), vektor obsahující , atenuovaný jako je např. ' vektor, , který ' publikovali adenovirUs,

Stratford-Perricaudet et al.

(J. Clln. ' ' Invěst.' 90:626-630,

1992'}·; viz také La. Salle et al., Science 259:988-990, 1993), a 'vektory založené na defektních adeno-associovaných virech (Samulski -et ál., J. virol... 61:3096-3101, 1987, Samulski et al.' J.- Virol. 63 : 3822-3828,. 1989, Lebkowski et^: al., Mol.

Cell. Biol. 8:3988-3996, 1988)..

Výhodně' se při . in vivo - podávání užívá vhodná imunosupresivní - léčba - společně s virovým' vektorem, . např. adenovirovým vektorem,-’ aby se- .zabránilo imunologické deaktivaci virového vektoru a transfekovaných buněk. Tak např. se mohou podávat imúnosupre-sivní cytokiny, jako je

ΦΦ 99 9 ' ΦΦ ·· ··

Φ · φ Φ ΦΦΦΦ 4 9 9 »

9 ·······

Φ φ φ ' Φ φ Φ Φ ΦΦΦ ΦΦΦ

Φ Φ Φφ· Φ Φ

ΦΦΦΦ ΦΦΦΦ ΦΦΦ ΦΦ ΦΦ ΦΦ interleukin-12 (IL-12), interferon-y(IFN-y) nebo' protilátka anti-CD4, aby se zablokovala -humorální. nebo buněčná imunitní odpověď na virový vektor (viz např. Wilson, Nátuře Medi-cine, 1995) . Kromě toho je výhodné, užít virový vektor, který je připraven tak, aby exprimoval co nejmenší počet antigenů.

Adenovirové vektory. ,

Ve výhodném provedení .předkládaného vynálezu je vektorem adenovirový vektor. , Jak je -demonstrováno v příkladech, defektní -adenoviry se ukázaly být výjimečně' účinnými 'pro přenos'· inhibitorů angiogeneze A.TF a angiostatinu, jak -.dokazuje neočekávaný účinek -na inhibici -růstu nádorů a tumorigenezi. Adenoviry jsou· eukaryotické. DNA viry, které mohou 'být -modifikovány tak, '.aby účinně přenášely nukleovou kyselinu podle předkládaného vynálezu do buněk ..různých, typů. Existují různé sérotypy adenovipů.- Z těchto sérotypů jsou pro použití podle předkládaného vynálezu výhodné lidské adenoviry typu 2 ^;a 5. (A.ď 2 nebo Ad -5) a adenoviry zvířecího původu (viz WO 94/26914). K adenovirům zvířecího původu, které mohou být užity. podle předkládaného .vynálezu, patří ' viry psího, hovězího, myšího (např. Mávl, Beard et al., Virology' 75, 1990, 81), ovčího, prasečího, ptačího a, opičího původu (např.. SAV) _; Výhodně , je adenovirus zvířecího původu .psí adenovirus, výhodněji adenovirus CAV2 .(např.. kmen Manhattan nebo A.26/6Í, ATCC VR-800). · ' . ' ' Replikačně .defektní adenóvirově vektory podle, předkládaného vynálézu. výhodně obsahují úseky · ’ITR, enkapsidační sekvenci a -požadovanou nukleovou kyselinu.. Ještě výhodněji je . alespoň _: úsek' El adenovirového vektoru nefunkční.. Delece v úseku El zasahuje zpravidla od'nukleotidu 455 do 3329 v sekvenci adenoviru A5 (PvuII-BglII fragment) nebo 382 až 3446 (HinfII-Sau3A fragment) . I Jiné, úseky mohou

---UJU.?

. ·· te· • ·· · • · · · • ··· ··· • · ·· ··

El a E4 (Ad3.0) . jsou - popsány jejichž obsah

Příklady adenovirů v dokumentech-. JWO95/02697 se odkazujeme. V dalším má adenovirový vektor deleci v úseku El, j akýmkoliv 101 (1991)

Konkrétně adenovirem • te ·· · rte • · · · ·· · · • te · · · ··»··· ··-···

·.··· ···· ··· ·· .

7 být modifikovány, úsek E3 (W095/02 697):, usek'E2 (W094/28938), ^Γ·_Λ . ¹ úsek É4 (W094/28152, W094/12649 a W095/02697) , nebo úseky kteréhokoliv z pozdních genů LI až L5. v ' Ve výhodném provedení vynálezu má adenovirový. vektor’ deleci v úseku El (Ad 1.0) . Příklady adenovirů s delecí v El jsou uvedeny v dokumentu EP ' 185573, na který se tímto odkazujeme,. V dalším.výhodném provedení má adenovirový vektor deleci v úsecích é s delecemi E1/E4 á WO96/22378, - na výhodném provedení . .do kterého , byl vložen úsek E4 a požadovaná sekvence nukleové . kyseliny (viz FR9:4/13355, ' na . jejíž obsah. se . tímto ' ' · ^; 'odkazujeme) .

’ Replikačně . defektní-, rekombinantní adenoviry - podle předkládaného vynálezu/ mohou být připravený· způsobem odborníkovi známým (Levrero et al., Gene 195, E? 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984)· 2917)

7' Λ . · .

' mohou být přioraveny homologní řekómbinacímezi

-a plazmidem, který nese,· kromě .jiného, požadovanou' sekvenci/ DNA. ’ K.homologní rekombinaci dojde v. důsledku kotransfekce uvedeného .adenovirů .a plazmidu do', vhodné buněčné' linie. Vhodná7 buněčná linie, .která se .může použít,, výhodně musí _ř i) být transformovaťelná Uvedenými prvky a ii) obsahovatSekvence, ^;které jsou schopny .komplementovat část .genomu t replikačně defektního adenovirů, výhodně v integrované- formě, • ' aby se zabránilo riziku rekombinacé..,. Pří kladem buněčné linie, která se může užít, je,linie lidských buněk 293 zembryonální, ledviny (Graham et al., J. Gen. Virol. 36, 19.77, 59), která, obsahuje levou část genomu adenovirů Ad5 (12%) integrovanou • do svého genomu, /a buněčné, linie, které jsou schopny' kompieme.ntovat řúnkce El a E.4, jak byly popsány v dokumentech

WO94726914 a WO95/02697. Rekombinantní adenoviry se izolují •a purifikují standardními způsoby, které jsou odborníkovi známy.

Adeno-asociované viry ' (AAV) jsou DNA viry relativně malé velikosti, které se. mohou integrovat, a sice stabilním a místně-specifickým způsobem,· do genomu buněk, ' které infikují. Jsou schopny: irífikovat široké . spektrum buněk, .aniž

by působily na	buněčný	růst, . morfologii nebo	diferenciaci
buněk, a má se .	za to,	že	se nepodílejí na	žádné lidské
nemoci ./ ‘ ' Genom-	η τ\ τ τ HHV	byl.	již klonován, -	sekvencován
a charakterizován. Je tvořen	přibližně. 4700 bázemi a obsahuje

na každém konci-invertovanou terminální repetici (převrácené koncové opakované sekvenční úseky) , ITR,· tj. úsek dlouhý 145 baží, který slouží jako virový replikační počátek. 7 Zbytek genomu tvoří dva esenciální úseky, které nesou enkapsidační 'funkce:.levá část genomu obsahujřcí gen rep se účastní virové replikace a exprese virových genů, a pravá, část genomu,. obsahující gen cap, kóduje virový kapsidový-protein. Použití- vektorů odvozených - z AAV pro přenos genů in vitro a' in vivo bylo .již popsáno 7WO91/1:8088, WÓ93/09239,

US ,4,797, 368, US 5,139, 941 a EP 488528) popisují různé konstrukty 'derivátů' - AAV, a/nebo gen cap deletovánv a nahrazeny a použití těchto -konstruktů k přenosu -nebo' rekombinantní AAV podle připraveny kótransfěkcí obsahujícím požadovanou sekvenci nukleové 'kyseliny obklopenou dvěma úseky invertované terminální repetice (ITR.) 'z AAV, a plazmidem nesoucím enkapsidační geny (rep a cap) AAV, . a to buněčné linie, která je infikována lidským ‘pomocným (helper) virem (např:

Uvedené publikace, kde- -jsou gen rep požadovaným . genem, požadovaného - .genu in vivo -(-přímo do in vitro (do⁷ buněk, v kulturách)' ’ organismu).; Replikapně defektní předkládaného vynálezu ' mohou být (současnou transfekci) plazmidem

adenovirem) ·' Takto připravené rekombinantní AAV se purifikují standardním způsobem. v '.

. Předkládaný vynalez se také týká rekombinantních virů odvozených z AAV, jejichž genom obsahuje sekvence kódující nukleové kyseliny kódující anti-angiogenní faktor obklopený na obou stranách ITR z AAV. Vynález se dále týká plazmidu, který obsahuje sekvence, kódující nukleové kyseliny kódující anti-angiogenní faktor obklopený na obou stranách ITR'z AAV. Takový plazmid se může, tak, jak . je,, užít pro přenos sekvence nukleové' kyseliny, a .nebo, ' pokud je to vhodné,· může být vložen do liposomového vektoru (vytvoří se tzv. pseudovirus)..

Re.trovi-rové .vektory ’ ' ^:

V· jiném, provedení předkládaného vynálezu byl gen vnesen do buňky pomocí' retrovirového. vektoru. Retrovirové vektory popsali napr. Anderson'· et al.., U.S. Patent No. .5, 399, 34 6; Marin et' al., 1983, Cell 3.3: ' 153; Temiri et al.,.' U.S.' Patent Nó . 4, 650, 764 ; Temin- et al., U. S . Patent No .· 4,93 0,2 8 9;

Markowitz 'et al·'., 19-88,- J. Virol, 62:1 -120; ' Temin et, al.,,

U.S.'- Patent-No. 5, 124,2-63; EP 453242-, EP 173220; Bernstein et alt Genet. En.g. 7 '(-1985) .235; . McCormick, BioTechnology 3 .(1985) ;689;, Dougherty et al., WO' 5/07358, publ. 16. března. 1995; a' Kuo et al., 1993, . Blood 82:845. Retroviry jsou .integrující viry, které, infikují dělící se buňky. Retrovirový .genom. obsahuje, dva úseky LTR, enkapsidační.. sekvenci a tři kódující úseky . (gag, V pol env

V rekombinantních· ret.rovirových vektorech jsou obecně geny gag, pol a. env odstraněny, buďto celé nebo. částečně, a nahrazeny požadovanou sekvencí nukleové kyseliny. - Takové vektory se mohou konstruovat z různých typů' retrovirů jako je .např. HIV, MoMuLV (Murine Moloney léukaemia virus), MSV (Murine Moloney sarcoma virus ) ., HaSV (Harvey sarcoma virus); SNV

5 . (Spleen ,-necrošis virus); .RSV (Rous sarcoma virus) a Friendů-v virus. Defektní retrovirové vektory byly popsány _w v dokumentu WO'95/02697 .·

Obecně řečeno, pro, konstrukci rekombinantního retroviru obsahujícího sekvenci nukleové kyseliny se připraví plazmid, který obsahuje oba LTR, enkapsidační sekvenci a kódující ' sekvenci. . Tento . konstrukt se pak použije . k transfekci sbalovací (pakážovací) buněčné linie, která .'je schopná f· nahradit v trans retrovirové funkce chybějící v plazmidů.

Sbalovací linie jsou tedy obecně schopny exprimovat geny gag, pol a env. Takové pakážovací -linie byly již ve stavu techniky popsány, např. buněčná, linie PA317 (US 4,861,719), PsiCRP (W090/-02806) a-, GP+envAm-12 (W089/07150.) . Kromě- tohorekombinantní retrovirové vektory'mohou obsahovat modifikace uvnitř, úseků LTR potlačující transkripční aktivitu a také rozsáhlé enkapsidační sekvence, které- mohou- -obsahovat část genu gag ‘ (Bender et al., J. Virol. 61, 1987, 1639).

Rekombinantní -retrovirové vektory se purifikují standardními způsoby, které jsou odborníkovi, z-námy. ,

Retrovirové vektory ^vse vytvářejí tak, - aby účinkovaly jako infekční částice -.nebo- aby prodělaly ' jeden- cyklus transfekce. V prvním-případě je virus modifikován tak, aby si, uchoval všechny s.vé geny kromě- těch, které'-j sou ' zodpovědné za onkogenní transformaci,- a aby' exprimoval hetěrologní gen.

- Néinfekční virové' vektory se připravují tak, - že se zruší F virový sbalovací signál, ale přitom' se uchovají strukturní geny nutné ke sbalení , současně vneseného viru, -.který je upraven tak,, že obsahuje heterologní gen a sbalovací signál. Takže, vzniklé virové částice - nej sou . schopny - vytvářet další virus. y '

Cílený přenos genů je popsán v patentovém dokumentu WO 95/28494 publikovaném v říjnu 1995.

• · *« např. lipofectin. užívaly. liposomy kyselin in vitro.

Nevirové vektory

Alternativně se může do buňky vnést vektor in vivo jako nukleová kyselina bez transfekčních excipientů nebo s činidly usnadňujícími transfekci, jako ' je

V uplynulém destiletí se stále / více k enkapsulaci a transfekci nukleových

Syntetické kationtové lipidy navržené ke . zmírnění potížía nebezpečí při transfekci zprostředkované liposomy se mohou použít k přípravě liposomů pro transfekci in vitro markerového genu (Felgner,; et. al.,. Proč. 'Nati.- Acad. Sci. U.S.A. 84:7413-7417, 1987, · Mackey, et al., Proč. Nati. Acad..

Sci. 'U.S.A. 85:8027-8031, 1988, Ulmer et. al., Science'

259:1745-1748, 1993).. Použití kationtových lipidů podporuje enkapsulaci negativně, nabitých, nukleových kyselin a také'

V ' podporuje fúzi . s negativně nabitou buněčnou membránou (Felgner and Ringold, Science 337:387-388,. 1989). Zvláště· výhodné'lipídové sloučeniny a 'přípravky pro přenos ' nukleových- kyselin jsou popsány' v patentových dokumentech' W095/.18'863. a W096/17823, a také v patentu USA' č. 5, 459, 127. Použití lipofec.tinu k vnesení ěxogeního genu do specifického' orgánu ' in vivo má jisté praktické výhody. Jednu výhodnou oblast představuje' molekulární cílení liposomů do specifických buněk.. Je jasné, že cílení, trahsfekce' do konkrétního, typu buněk je zvláště výhodné ve tkáni se. značnou' heteř.ogenitou . buněk; jako- je např. pankreas, játra, ledviny nebo mozek. Lipidy mohou být chemicky navázaný na j'iné typy molekul pro účely cílení (viz výše Mackey et al.). Zaměřovači peptidy, např. hormony . nebo neurotransmitery, a proteiny jako jsou protilátky, nebo molekuly jiné než peptidové povahy, se mohou chemicky navázat na liposomy.

• ·

_; · .

Jiné molekuly mohou' být také užitečné, pro usnadnění transfekce nukleových kyselin in vivo, jako jsou např. kationtové oligopeptidý (viz mezinárodní patentový dokument WO95/21931), peptidy odvozené z DNA vazebných proteinů (viz WO96/25508) nebo i kationtové polymery (např.

WO95/21931) ·. .

Je také možné vnést vektor, in vivo jako nahý DNA plazmid. Vektor tvořený nahou. ĎNA pro’ genovou terapii se vnese do požadované hostitelské buňky způsoby, odborníkovi .známými, ' jako je 'např. trasnfekcě,· elektroporace,' mikroinjkece, transdukce, . buněčná fúze, precipitace za přítomnosti' DEAE-dextranu nebo kalciumfosfátu, genovým dělem nebo DNA .přenašečem . (viz např. Wu' et al., J. Biol. Chem; 267: 963-967, 1992-,· Wu a. Wu, J. Biol.. Chem. .263:1462114624, . 1988, /.Hartmut et al.,· Kanadská patentová přihláška č. 2, 012,31-1, podaná 15. března 1990; Williams eť al. , Proč. Nati.· Acad. 'Sci. USA 88:27.26-2730, 1991). Je- možné také užít přenos zprostředkovaný receptorsm (Curiel. et al.; Hum. Gene Thěr. 3:147-154, 1992, Wu ' and Wu, J. Biol. Chem. 262:44294432,_:1987). .

Nukleová kyselina se také může podávat jako nahá. DNA. Způsoby formulace, a podávání nahé’' DNA-do svalové tkáně savců byly, popsány, v patentech USA 5, 580, 859 a 5, 589, 466,/ na jejichž plné znění se tímto odkazujeme. .

Regulační úseky ’ / Exprese . anti-angiogenního faktoru .z vektoru podle předkládaného .vynálezu je řízena/kontrolována jakýmkoliv regulačním· úsekem, např.. prvky, · 'které obsahují, promotor/enhancer a jsou Odborníkovi, známy,.· přičemž tyto regulační prvky musí být fuňkční. v cílových nádorových buňkách hostitele vybraných pro expresi.:

·· *· ·«

I · · · · • · · · · · · ♦ · · • · · · · • · · · · ·· · *

Regulační úse.ky mohou obsahovat promotorovy, úsek pró funkční . transkripci v nádoru, a také úsek lokalizovaný -na '3'-konci požadovaného genu, který specifikuje signál pro terminaci ,(ukončení)' transkripce a polyadenylační místo. Všechny tyto prvky vytvářejí expresní kazetu.

K promotorům, které mohou být užity v předkládaném vynálezu,.patří jak konstitutivní promotory tak i regulované (indukovatelné) promotory. Promotorem může být promotor, který je . přirozeně zodpovědný za expresi dané nukleové kyseliny: Může to .být'také promotor z heterologního zdroje. Zejména se může.jednat o promotorovou sekvenci .eukaryotických nebo virových genů.-. Tak např. to ' může' být promotorové sekvence odvozená, z genomu buňky, která má.být infikována. .Podobně ' co může _<býť promotorové- sekvence ' z genomu viru, včetně užitého adenoviru., .V této souvislosti je- možné . uvést např.promotory genů E1A,, MLP, . CMV a RSV apod.

Kromě toho je možné modifikovat promotor tak, že se k němu přidají aktivační nebo regulační ' sekvence’ nebo sekvence umožňující -tkáňově, specifickou· nebo . převládající, expresi (promotor enolázy nebo' GFAP' apod.') . Pokud nukleová kyselina neobsahuje, promotorovou' sekvenci, může být· vložená do virového genomu downstream'' (po -směru od 5' ke 3'·) od takové promotorové sekvence.

K promotorům vhodným .pro provedeni vynálezu patří obecně aktivní promotory vimentin, aktin, tubulin), promotory intermediálních filament (např.. desminu, neurof ilamnt, keratínu, -GFAP), ‘promotory terapeutických, genů (např. typu MDR, CFTR, faktoru VIII), tkáňově specifické promotory (např. promotor-aktinu v buňkách hladkého. svalstva), ' promotory aktivované přednostně v dělících se buňkách, promotory odpovídající na podnět (např. receptor steroidních hormonů, receptor kyseliny předkládaného (např. HPRT, ·*· » · ·

9 & časný promotorový úsek SV40 (Benoist

O 1 Λ . -Ί -1 ----- _ J_ - -li— — — X ~ -r-r Ό ^z zau :ju4-jiu, , pruiiiucuj. uusazeay. vc ·_, viru Rousova sarkomu '(Yamamoto, et retinové), tetracyklinem regulované transkripční modulátory, promotor bezprostředně časných genů cytomegaloviru, retrovirového LTR, metalothionenin.u, SV40, Ela a MLP, Tetracyklinem regulované transkripční modulátory a promotor CMV jsou popsány v dokumentech. WO '96/01313, US 5, 168,062 a US 5,385,839, na jejichž plné znění se odkazujeme.

Takže k promotorům., které se mohou užít, patří (ale tento výčet není ome.zující) promotor cytomegaloviru (CMV), a Chambon, 1981, Nátuře, 'dlouhé koncové repetici al., 1980, Cell 22:787797), promotor thymidinkinázv .z Herpes.·, viru''.(Wagner et al.., 19.81, Proč. Nati'. Acad. Sci. U.S·.A. . 78: 1-441-1445)., a dále. regulační' sekvence metalothioneinového genu (Bri.nster et al.., 1982, Nátuře 296:39-42), přokaryotických expresních vektorů .jako např; promotor β-laktamázy. (Villa^:-Kamar.ořf' et al;, · 1978, Proč. Nati. Acad.. Sci. U. S .A; 753727-3731) , nebo promotor tac (DeBoer, e.t al., 1983,- Proč. Nati'. Acad. Sci.

U.S.A.· 80:21-25; viz také Useful proteins .from rečombinant bačteria'. in Scientiřic' American, ' 1980, 242:,.74-94) , promotorové elementy z kvasinek nebo j íných hub jako např.· promotor Gal 4, promotor·ADC (alkoholdehydrogenáza), promotor PGK - (fosfoglycerolkinážá), promotor ., alkalické fos.fatázy, a dále také kontrolní transkripční- úseky ..ze zvířat,' které vykazují tkáňovou- specificitu a byly použity ú transgenních zvířat: kontrolní . úsek genu elastázy I, který je aktivní , v pankreatických buňkách (Swift et al . , . 1984,. Cell 33: 639646; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor ' Symp . · Quant...

Biol. 50:399-409; MacDonald, 198.7, Hepatology 7:42,5-515); kontrolní úsek .genu pro insulin, který je aktivní buňkách pankreatu (Hanahan, 1985, Nátuře 315: .1, kontrolní úsek imunoglobulinového genu,který je v, oeta15-122)., aktivní « ·

v lymfoidních buňkách (Grosschedl et al., 1984, Cell 38:647-,

658; Adames et al., 1985, Nátuře 318:533-538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7:1436- 1444), kontrolní úsek viru prsního nádoru myši, který, je aktivní v buňkách prsu a varlete, v lymfoidních buňkách a mastocytech (Leder et al., 1986, Cell 45:485-495),, kontrolní úsek albuminového. genu,· který je aktivní v játrech (Pinkert et al., 1987< Genes and

Devel. .1:26.8-276), kontrolní úsek genu pro al f a-f etoprotei.n; který je aktivní v játrech (Krumlauf et al/, 1985, ,Mol. Cell·.. Biol. 5:1639-1648; Hammer.' et al., 1987,, Science 235:53-58) , .kontrolní úsek genu pro alf a 1-anti’trypsin,·.·'který· je aktivní v játrech (Ke.lšey et'al.,' 1987, Genes ' and ...Devel.- 1:161-171.) , kontrolní úsek ' beta-globinového genu, který je aktivní v myeloidních buňkách (Mogram et al., 1935, Nátuře . 315:338340; Kollias .et al.,, 1986, Cell 46:8.9-94) , kontrolní .. úsekgenu 'pro základní myelinový protein, který je aktivní v-oligodendrocytech mozku (Readheadet al. 1987, Cell 48: 703-712), /kontrolní úsek genu pro lehký řetězec 2 myosinu, který je-aktivní v kosterním svalstvu (Sani 1985, Naturé 314: 283-286) a. kontrolní úsek genu pro hormon . uvolňující gonadotropin, který je aktivní v hypothalamu (Mason eť al., 193c, Science 234:1372-1378). , '

Geny kódující 'anti-angiogenní’ proteiny '

- Vektory podle předkládaného vynálezu 7 se mohou· užít k přenosu genu kódujícího anti-angiogenní protein do nádoru.' Ve výhodném' provedení vynálezu, je ..anti-angiogenní faktor aminokoncóvý fragment (ATF)' urokiňázy, který obsahuje EGFpodobnou 'doménu. Takový fragment odpovídá aminokyselinovým zbytkům 1 až 135 v ATF.

V jiném provedení vynález je ATF ve fořmě fúzního proteinu, např..' „s imuno glóbu línem- nebo lidským sérovým

» 9· • · · • · · > · ' · · · albuminem (viz dokument WO .93/15199 na jehož plný text se tímto odkazujeme). '.

\

Účinný .ATF pro použití podle předkládaného vynálezu lze odvodit'z jakékoliv urokinázy, např. myší urokinázy, ale výhodná je lidská urokináza. Ale v rámci vynálezu .se uvažuje i o podávání urokinázy jiné než jen humánního původu, která -je modifikována substitucí . specifických aminokyselin odpovídajícími aminokyselinovými zbytky z. humánní urokinázy. Myší urokináza může být modifikována jednou nebo několika,, výhodně všemy,. ' záměnami 'z následujících: tyrosin 23' na •asparagin, arginin 28 na asparagin/ arginin 30 na histidin á arginin 31 na tryptofan. Urokinázový ATF jakéhokoliv původu může být takto humanizován. To se provede snadno modifikací kódující sekvence odborníkovi v molekulární biologii známými 'technikami.

Ve vynálezu je také možné, užít jiné ..geny pro anti-. angiogenní proteiny.' K takovým genům např: patří (přičemž omezuj ící)

Cell.. 79:

US 5,639,725), včetně angiostatinu obsahující smyčky 1 až. 3, tkáňový · Inhibitor metaloproteináz (Johnson et· al/,. J/ Cell ’Physiol.-160:194-202, 1994/ .inhibitory FGF nebo-VEGF, ataké endostatin (WO97/15666). Ve výhodném provedení' vynálezu.anti.angiogenní fa-ktor.' j.e angiostatin, zvláště smyčky 1 -až 3 angiostatinu. Ve zvláště .výhodném provedení vynálezu je anti-’ angiogenním faktorem aminokoncový fragment , ' plasminogenu (Plg), -který má aminokyselinovou sekvenci, plasminogenu od aminokyselinového 1 zbytku' 1' 'do provedení vynálezu je j plasminogenu/angiostatinu lidský plasminogen (angiostatin).

Jiné provedení vynálezu, se týká podávání genů kódujících rozpustné formy receptorů angiogenních faktorů, jako např.

tento výčet není (O'Reillv et . al., geny kódujíc- angiostatin 315-328, 1994, WO95/29242,

3.33. V dalším výhodném aminokoncový fragment ·· · ··· • · · ·· '·· rozpustné receptory VGF/VEGF a rozpustné receptory urokinázy (Wilhelm' et- al., FEBS Letterš 337:131-134, 1994), přičemž tento výčet není omezující.

* · ’ . *

Obecně se vé. vektorech pro genovou terapii a způsobech .podle předkládaného vynálezu může užít jakýkoliv gen kódující protein, který je antagonistou. aktivace 'a migrace ehdotelových buněk, které se podílejí, .na angiogenezi . Nicméně je třeba zvláště, zmínit genovou terapii', pomocí' ATF nebo angiostatinů, které jsou zvláště účinné, jak bylo již výše zdůvodněno a bude dále ukázáno v příkladech.

Geny i kódující anti-angiogenní 'faktor, .ať už jako·.;genomovou DNA., nebo cDNA, jeůmožné izolovat - z jakéhokoliv zdroje, . zvláště z humánní genomové.nebo cDNAknihovny. Metody k -získání takových genů jsou odborníkovi známy 'a byly již zmíněny výše (viz- také 'Sambrook .et .al., výše) . ' , - .

Vzhledem k degeneraci genetického kódu se mohou, užít při -provádění vynálezu také jiné sekvence nukleových kyseliny kódující v-podstatě stejnou aminokyselinovou sekvenci -jako uvedené .anti-angiogenní faktory . a· spadají -do rámce předkládaného vynálezu. ' K těmto sekvencím' ..patří,' přičemž .tento výčet není. omezující, alelické geny, homologní geny z jiných 'druhů á-- nukleotidové ^: sekvence- obsahující celé nebo. části gěnů anťi-angiógenních faktorů, které jsou v různých kodonech změněny Substitucí tak,. že.· kódují stejnou'.aminokyselinu, čili se- jedná o umlčenou záměnu. Podobně'' k -derivátům, anti-angiogenních - faktorů patří, i když -tento výčet' není omezující, takové, - které obsahují- v· primární aminokyselinové sekvenci celou nebo - část aminokyselinové sekvence anti-angiogenního proteinů, který .obsahuje změněné sekvence, kde zbytky aminokyselin byly . nahrazeny funkčně ekvivalentními . aminokyselinovým zbytky, čili došlo ke konzervativní substituci ^aminokyselin. Tak např. jeden nebo

• <*ί několik aminokyselinových zbytků může být nahrazen jinou aminokyselinou/áminokyselinami s podobnou polaritou, která působí jako funkční ekvivalent, což vede k umlčené změně. .Substituenty aminokyselin se vybírají z členů stejné třídy, k nepolárním' .(hydrofobním) leucin, isoleucin-, . valin, kam aminokyselina patří... např, aminokyselinám patří alanin, · prolin,' fénylalani.,. tryptofan a methionin. Aminokyseliny obsahující aromatickou kruhovou strukturu jsou. fenylalanin, tryptofan a tyrosin. K.polárním neutrálním aminokyselinám patří glycin, serin, threonin,.' cystein, tyrosin, asparagin a .glutamin. Pozitivně nabité (bazické)' aminokyseliny- jsou arginin, lys-in- a histidin. K negativně..· nabitým ' (kysélým)· aminokyselinám -patří · kyselina asparagová a. 'kyselina glutamová. Má se za .to, 'že'· takové změny neovlivní - zjevnou molekulovou hmotnost . stanovenou pomocí · elektroforézy. na.' polyakrylamidového gelu nebo isoleketrický' bod. Zvláště výhodné záměny jsou: .

- . Lys za Arg a naopak, takže jé uchován pozitivní náboj,' ? - Glu.za Asp a naopak, takže je uchován negativní náboj, . - Ser za Thr, takže je‘ uchována volná skupina -OH, a ' . Gin za Asn, takže j e uchováija'volná skupina NH? /

Geny kódující deriváty .-a analogy- anti-angiogenních faktorů podle- -předkládaného.'vynálezu lze -připravit různými způsoby' odborní kovi 'známými... Manipulace vedoucí k./produkci těchto látek, jsou buďto na genové nebo proteinové úrovni. Např. klonovaná 'sekvence, anti-ángíogenní faktoru může být modifikována . řadou strategií v. oboru známých (viz Sambrook et. al.). Sekvence se na vhodných místech může štěpit, restrikčními endonukleázami, poté. dle, přání dále enzymaticky modifikovat,, izolovat' a ligovat in vitro. Při přípravě'genu kódujícího derivát nebo .analog anti-angiogenního faktoru podle vynálezu „je· třeba pečlivě zajistit, aby modifikovaný

I ·· ·♦ • · · gen zůstal ve stejném translačním. čtecím rámci jako původní gen anti-angiogenního faktoru, abv nebyl přerušen stopsignály translace á aby genový úsek skutečně kódoval ¹ .

požadovanou aktivitu. . , . '

Navíc sekvence kódující anti-angiogenní faktor může být mutována in vitro .nebo in vivo tak, aby se vytvořila nebo naopak porušila iniciační a/nebo' terminační. sekvence translace, nebo aby se vytvořily variace v kódujícím úseku a/nebo se vytvořila nová místa pro restrikční' endonukleázy nebo zrušila' místa již existující,'' což. by usnadnilo další in vitro modifikace, jako např. vytvoření chimérického genu. Výhodně takové mutace 'zvyšují funkční účinnost mutovaného produktu genu- anti-angiogenního faktoru. .Je možné .' užít jakoukoliv .mutační' techniku, v oboru známou,' včetně (výčet není omezující) místně. Cílené mutageneze in vitro popsané .např. ' 'v. Hutchinson, 'C., ' et

197Í

Chem.

al (J. Bioí

253:6551), Zoller and. Smith, .1984 (DNA 3:479-488), Oliphant et al., 1986 '(.Gene 44:177), Hutchinson . et alt , 1986 (Proč.

Nati. Acad. Sci. U..S.A. 83:710) nebo použití linkerů TAB® (.Pharmacia) apod. Zvláště výhodné je použití PCR pro místně cílenou mutagenezi· (viz Higúchi;, 1989, Using PCR to Engineer DNA, in' PCR Technology.· Principles ' and - Applications for DNA 'Amplifřcation, ~H. Erlich, ed.„ Stocktón,Press, 'Chapter 6, pp. 61-70) ..

Terapeutické cíle a strategie ' .

Předkládaný vynález umožňuje' léčit nádorová' Onemocnění.

Podle předkládaného vynálezu je nyní možné uvážlivým výběrem injekcí,' infúzí, . přímé aplikace apod. infikovat specificky a jednostranně velký počet nádorových buněk. ' • ·'

Výhodně se schválených

Farmaceutické přípravky'.

Pro .použití podle předkládaného vynálezu se vektory, buďto jako virové vektory, nebo sloučeniny lipidu a nukleové kyseliny nebo v podobě, nahé DNA, výhodně kombinují s jedním nebo několika farmaceuticky. přijatelnými nosiči pro injikovatelný přípravek. Termín' farmaceuticky' přijatelný znamená takové látky a přípravky, které jsou fyziologicky' tolerovány a typicky nevedou ke vzniku alergické odpovědi nebo podobné nežádoucí reakci, jako> je např. podráždění žaludku nebo nevolnost, pokud .se podají .'člověku.

termín farmaceuticky přijatelný týká látek federální nebo státní 'kontrolní agenturou nebo úřadem, nebo látek·, jejichž seznam je uveden v Lékopisu USA nebo v jinýchobecně uznávaných lékopisech . pro použití- ve 'veterinární' a zejména humánní medicíně. ' Termín nosič označuje 'rozpouštědlo,, 'adjuvans, éxcipiěnt nebo - vehikulum se kterým se sloučenina podle vynálezu podává.· K takovým farmaceutickým nosičům, patří sterilní kapaliny jako '.je voda nebo oleje, např. také petrolej, oleje rostlinného, -živočišného nebo syntetického původu jako např. arašídový olej, sojový olej, sesamový olej, minerální olej a pod. ' Výhodně se jako nosič užije voda nebo vodné roztoky solí.nebo vodný roztok.dextrózy nebo glycerolu, . zvláště pro injikovatelné, roztoky. Vhodné farmaceutické ' nosiče , j sou . popsány v publikaci ' E. W. Martina' Remington's Pharmaceutical Sciněces Mohou to 'být zvláště isotonické, sterilní roztoky solí (hydrogenfosforečnan nebo .dihydrogenfosforečnan sodný, chlorid sodný, draselný,. vápenatý-nebo hořečnatý. nebo směsi těchto soli, anebo suché přípravky, zejména lyof ilizované přípravky,. které,, v závislosti na druhu, po přidání sterilní vody nebo fyziologického; roztoku, vytvoří injikovatelný přípravek., • · • ft » ftft ·· • ftft·· • · · · · • · ··· ··· • ftft » ftft ftft

Výhodné sterilní injikovatelné přípravky jsou roztoky nebo . suspenze v netoxických parenterálně' -přijatelných rozpouštědlech nebo ředidlech. K příkladům farmaceuticky patří roztoky soli, pufrované nebo soli (hydr.ogenfosforečnan . nebo přijatelných nosičů isoťonické roztoky dihydrogenfosforečnan sodný, chlorid sodný, draselný, vápenatý nebo hořečnatý nebo směsi těchto solí), Ringerův roztok, dextróza, voda, sterilní voda, glycerol, etanol a jejich kombinace. 1,3-butanediol a sterilní stálé oleje .se mohou výhodně užít' .jako rozpouštědla nebo suspendační média. Jakýkoliv nedráždivý stálý olej se může použít včetně syntetických mono- nebo' diglyceridů.. Mastné' kyseliny jako např. kyselina olejová se ^:také -užívají pro přípravu injekčních 'přípravků.

Termín terapeuticky účinné množství znamená takové množství, které je' dostatečné ke snížení alespoň o 15 ' %, výhodně' o 50 % a nej výhodněji alespoň o 90 % : a' ještě výhodněji k zabránění klinicky ' významného- -nedostatku' aktivity, . - funkce a odpovědi 'terapeuticky účinné množství je způsobilo klinicky významné zlepšení klinického -stavu _: hostitele. Dávky viru.použité podle' předkládaného'vynálezu se upraví' 'v závislosti' na mnoha parametrech/ zvláště v závislosti- na uvažovaném -místě podávání (nádoru), počtu.injekcí, typu nádoru, který je .léčen a 'alternativně na požadované délce léčení. Obecně rekombinantní adenoviry podle předkládaného- ' vynálezů jsou formulovány pro' ' podávání v dávkách 10⁴ až 10¹⁴ pfu, a výhodně IC' až 10¹.¹ pfu.', Termín pfu (plaque forming unit) odpovídá infekčnosti roztoku viru,- jak se. stanoví infikováním vhodné buněčné kultury aměřením.počtu, obecně po. 15 dnech, počtu plaků infikovaných hostitele. Alternativně dostatečné k tomu, aby ·· ·· • · · « ft · 9 • · • · »·· ····

99 » · · « » · · 1

99.9 999 '9 « ·· 99 buněk. Způsoby stanovení titru pfu virového roztoku jsou v odborné literatuře dostatečně popsány.

, Ve, výhodném ^provedení vynálezu přípravek obsahuje adenovirus .obsahující gen anti-angiógenního faktoru, např. gen -AT.G (ÁdATF)'· nebo' angiostatinu (AdK3) v koncentraci přibližně 1 x,10^s pfu/100 ml.

Přípravky podle předkládaného vynálezu jsou zvláště vhodné pro. podávání do nádorů.

.Předkládaný vynález se týká léčení', nádorů, zvláště, sblidních-· (tuhých’) nádorů. K příkladům takových solidních nádorů, které mohou být léčeny podle -vynálezu, patří sarkomy karcinomy jako (výčet - není. omezující’ fibrosarkom, myxosarkom, liposar.kom, .chondrosarkom, osteogenní sarkom,' chprdom, ' angiosarkom, lyrnf angioendotelios.arkom, endotelicsarkom,.' 1ymfangiosarkom,s-ynoviom, ' mesotheliom, Ewigův. tumor, - . leiomyosarkom,' rhabdomyosarkom, karcinom tlustého střeva,. rakovina pankreatu,' rakovina ' prsu,' rakovina .vaječníků,’’ rakovina prostaty, ' spinaliom, bazaliom, adenokarcinom,· karcinom potních žláz, karcinom mazových žláz, papilokarcino.m., papiloadenokarčinomy, cystadenokarcinom,' míšní' karcinom, bronchogenní ' karcinom, karcinom ledvin, hepatom, -'karcinom žlučovodů, :-choriokarcinom, s-emihóm, embryonální karcinom, Wilmsův nádor,, -rakovina čípku,' nádor varlat, pl.icní karcinom, malobuněčný karcinom plic, karcinom močového- měchýře, epiteliál-ní .karcinom, gliom/ astrocytom, meduloblastom, kraniofaryngiom;. ependymom, piněalom, hemarigioblastom, neurinom akustiku, oLigodendrogliom, meningiom, melanom, neuroblas.tom a retihoblastom. .

V jiném provedení vynálezů se provádí prevence nebo se léčí . dysproliferativní změny (jako jsou metaplázie ř ' ·· ·· • · · · · • · · · · • · ♦·· ··· • . · * ·· ·· ·>· ·· z příkladů lze· .uvést, předchází v rakovinu buněk. tkáni.

metaplastický -epitel

K atypickým a dvsplázie) v epiteliální tkáni jako např. v hrdle děložním, v jícnu a v plicích. Takže předkládaný vynález .se týká léčení stavů, které jsou známy tím nebo podezřívány z -toho, že se vyvíjejí v. neoplázie nebo rakovinu, zejména pokud se vyskytuje růst , jiných než neoplaštických buněk vytvářející hyperplázie, metaplázie nebo zejména dysplázie (pro přehled stavů s abnormálním růstem viz Robbins a· .Angell,' 1976, Basig Pathology, 2d Ed., W.B. Saunders Co., Philadelphiá, pp. .6879). Hyperplázie je .forma kontrolované proliferace buněk zahrnující zvýšeni počtu buněk v tkáni něbo orgánu, aniž. by došlo k významné změně struktury nebo funkce. Jako- jeden že hyperplázie endometria. často':· endometria. Metaplázie je . forma kontrolovaného' buněčného růstu, .kdy jeden typ. dospělých'nebo' plně diferencovaných buněk nahrazuje .jiný typ dospělých, Metaplázie se objevuje· v epitelu nebo v pojivové metapláziím patří neuspořádaně. Displázie je častým předchůdcem 'rakoviny, a vyskytuje ' Se · nej častěji v epitelu, je to nejvíce neuspořádaná forma růstu buněk, -která nepatří k neopláziím, a· zahrnuje ztrátu /' uniformity a stavební orientace. jednotlivých buněk. Dysplastické buňky mají často abnormálně velké, silně' zbarvené - jádro a vykazují pleiomorf ismus, Dvsplázie se· typicky .objevuje'' tam,', kde - existuje chronické dráždění nebo zánět, a často se vyskytuje v hrdle děložním, dýchacích cestách,., dutině ústní a žlučníku. Pro přehled těchto nemocí'viz např·. Fishman et al'.,. -1985, Medicína, ,2d Ed.', J. B. Lippincott Co., Philadélphia. ' ¹

Předkládaný vynález se také týká léčení, nemaligních nádorů a jiných nemocí zahrnujících nesprávný růst buněk nebo tkání doprovázený, angiogenezi, a to tím, že ,sé podává terapeuticky účinné, množství vektoru podle . vynálezu do- tkáně, <

» ·9 ·4 • · · · « • « · · · • · »·· ·»· • · · » ·· ·.· kde dochází k nežádoucímu. růstu. Např. .vynález je užitečný pro léčení ařteriovenózních (AV) malformací, zejména v intrakraniální oblasti. ' Vynález lze- využít také při léčení psoriázv, dermatologické' nemoci,· která je charakteristická záněty a. vaskulární proliferací, a také benigní hypertofie prostaty, která je spojena, se zánětem a také možnou vaskulární proliferací. Lze také předpokládat využití při léčení jiných hyperprolif e.rativních nemocí. .

Způsoby podávání

Výhodným způsobem podávání podle vynálezu injekce' do nádoru. Nádor, může být zobrazen dostupnou technikou známou v oboru, jako' je např pomocí magnetické rezonance nebo' .počítačové .a přípravekjse pak podá stereotaktickou injekcí.

Alternativně, pokud ]s_L cílový·' nádor charakterizován výskytem zvláštního antigenu, vektor podle předkládaného vynálezů může být cílen na tento, antigen, jak· bylo již dříve popsáno,', a'· podáván pak systémově nebo - subsystémově .podle, potřeby/ napřu intravenózně, intraarteriálně, intráperitoneálně, intraventrikulárně apod-.

Kombinované terapie .

Ačkoliv- jsou způsoby podle.vynálezu účinné pro inhibici nádorového růstu- a- metastáz, .'vektory a způsoby: podle předkládaného : vynálezu se - výhodně užívají ; v kombinaci' s jinými způsoby, -léčení',·· např. 'chirurgickým 1 léčením, Ozařováním, chemoterapií - . a případně- jinými genovými terapiemi. ' • Např. vektory podle vynálezu se mohou podávat v kombinaci s inhibitory oxidu dusného, které mají vasokonstrikční aktivitu a redukují průtok krve nádorem.

je· prima j ákoukoliv zobrazení ' torno ar a ř ie

V jiném provedení je vektor podle vynálezu podáván společně' s chemoterapeutiky jako jsou např. (výčet není t

omezující) taxol, taxoter nebo jiné.taxoidy (viz např. U.S. patenty č. 4, 857, 653; 4, 814, 470; 4/924,011,. 5, 290, 957;

5,292,921; 5, 438,072; 5,587,.493,- Evropský patent č.. 015 253

738; a mezinárodní patentové publikace č. W091/17976,

W0.93/00928, W093/00929, a W09601815) nebo - s jinými chemoterapeutiky jako jsou · např. cis-platina (a jiné iriterkalující sloučeniny platiny), etoposid a etoposidfosfát, bleomycin,. mitomycin C, CGNU, doxorubicin, daunorubicin, idar.ubicin, i.fosfamid apod.

' V - ještě jiném . provedení vynálezu je vektor podlevynálezu podáván s jiným prostředkem protinádorové genově terapie, jako je p53 - nebo jeho analogy, např. CTS-1 (W097/04092), thymidinkinázá (TK) , jednořetězcová protilátky anti-ras,- interřeron-α nebo interferon-γ apod.' Jakýkoliv vektor .pro genovou’ terapii se může užít ve -spojení s předkládaným vynálezem, např. virový vektor nebo i nahá DNA. Ve. .výhodném provedení vynálezu se užije jediný vektor (virus nebo DNA.) k přenosu genů kódujících jak antiangiogenní faktor tak i další terapeutický protinádorový'gen.

Jiný aspekt předkládaného vynálezu poskytuje regulovanou expresi genu anti-angiogenního, faktoru v souladu s exp-resí proteinů vhodných- v kontextu s léčením -proliferativních poruch, jako jsou- nádory . a rakoviny, -kdy ’ heteřologní gen kóduje markér- .nebo. -imunomodulační cytok.in, .který zesiluje cílení ' nádorových buněk hostitelovým . imunitním systémem. K příkladům takových heterol-ogních genů pro imun-omodulaci (imunoefektorů) patří (výčet není omezující) 'interferon-a, interferon-β, interferon-γ, . interferon-ω, interferon-τ, nádorový nekrotidký faktor-α, nádorový nekrotický faktor-β; -interleukin-2, interleukin-7, interleukin-12,. interléukin41

15, ' kostimulující . molekula B7-1 T-buněk, kostimulující molekula B7-2 T-buněk, adhezní molekula imunitních buněk (ICAM)-l kostimulující T -buňky, faktor stimulující kolonie granulocytů, faktor stimulující kolonie granulocytů-makrofágů a jejich kombinace.

Předkládaný vynález je pro se .lepší porozumění dále vysvětlen.pomocí.následujicích příkladů, které však vynález nijak neomezují.

Příklady provedení vynálezu . Příklad 1 *

Genová, terapie'.-s-ATF inhibuje růst nádorů a metastázy

Příklad 1 dokazuje, ..že exprese uPA/.uPAR antagonisty-ATF (amino’koncový fragment¹ urókinázy) inhibuje -růst nádorů' a metastázy. Byl konstruován defektní adénovirus exprimující myší' - ATF z promotorů CMV (A.dmATF) . . Jedna ' inťrátumorální injekce . AdmATF. inhibovala .růst předem vytvořených nádorů ve dvou různých myších modelech a oddálila, nádorovou· diseminaci. Tyto účinky korelovaly s nápadnou -inhibici neovaskularizace v místě injekce a. v bezprostředním . okolí.' Tento -účinek byl zcela mimořádného .významu zejména pro schopnost myšího ATF inhibovat'angiogenezi nádoru lidského původu.

Metody ; ' Rekombinantní adenoviry »

AdmATF je El-defektní rekombinantní adénovirus, .který exprimuje mýší ATF gen z promotoru CMV. Aby, se vnesl stop42 · · ·

I · · . € ♦ · · • · « · · • · · » · · · · kodon po. zbytku' 135 maturovaného uPA, byl jako počáteční materiál použit plazmid pDB151916. Stručně, byly izolovány sekvence kódující uPA (včetně jeho signálního peptidu), naštěpeny Nsil, a zbytky 128 až 135 následované stop-kodonem byly opětně vloženy jako syntetický fragment. Otevřený čtecí rámec ATF byl poté vložen . mezi promotor ' CMV a sekvenci pozdního polyadenylačního signálu SV40, za vzniku plazmidu pEM8-mATF. Tento plazmid také nese prvních ‘6,3.kb genomu Ad5 až na to, žeexpresní kazeta ATF byla vložena mezi pozice 382 a 3.446, na místo genů ’El (obr. 1A) . 'AdmATF byl’ konstruován v buňkách , 293 homologní,' rekombinaci mezi pEM8-mATF a AdRSVbGal DNA (25) naštěpenouClal. Jednotlivé, virové plaky'se. izolovaly z jednoduchých vrstev buněk 293 pěstovaných na měkkém-· agaru, amplifikovaly v čerstvých. , buňkách 293 a extrahovala se virová DNA (.26) . Restrikční analýzy' s EcoRI,· EcoRV a AvrlI+NdeT' potvrdíly' totožňosť' a klonálitu 'rekombinantního adenoviru.

A.dCOl je defektní . kontrolní adenovirus, který je . totožný s. AdmATF až na to, že· nenesě žádnou transgenní -expresní kazetu na místě El. . Oba viry se množily ‘v buňkách 293, buněčné líni,i lidských embryonálních ledvin, -která konstitutivně exprimuje geny El z Ad5. (27) . Byly připraveny virové kmeny a. ťitrovány> jak ' je popsáno, (25). Není-li uvedeno jinak, - buňky MDA.-MB-231 a- buňky Lewisova plicního. karcinomu (LLC)- byly .infikovány v mnohonásobku- infekce (MOI) .300 pfu/buňku. Již dříve bylo prokázáno, že tyto infekční podmínky, při ; použiti viru AdRSVbGal (25) vedly k expresi β-galaktosidázy u 80' a 65 % buněk.

Analýza northernovým přenosem 'v

Téměř konfluentní b.uněčné kultury MDA-MB-231 : byly infikovány.s.AdmATF.nebo AdCOl, a 24 hodin po infekci (p.i.) β ·

se extrahovala totální RNA postupem s^;RNAZOLEM (Biogentex, lne) , a .purifikovala se polyadenylovaná RNA. Vzorky byly analyzovány na 1% agarózovém gelu s formaldehydem a přeneseny •na membrány Hybohd N (Amersham)..Membrány se prehybridizovaly s denaturovařiou sonikovanou DNA lososího spermatu (100 gg/ml) hodinu při.42°G v 10 ml 50% deionizovaného . formamidu, 0,2% SDS, 5x:Denhardtově roztoku, a inkubovaly přes noc· s náhodně. (³²P)-značeným fragmentem Xbal-HindlII -o velikosti .1.2 kb, z myší uPA cDNA (16) , Membrány se promyly dvakrát v , 2x

SSC/0.1%' SDS -1 hodinu při 50°C, jec v 0. Ix SSC 30 minut a exponovaly na filmy Kodak XAR-5 -po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti .

Analýza westernovým-přenosem , . ' . Supernatanty z buněk infikovaných virem' se sbíraly a předtím, , než ' byly přeneseny'' ' na membránu (Schleicher ·, & Schue.ll) , bylý 12.5%. SDS-polyakrylamidovém gelu (400 gg . Po inkubaci 1 hodinu v. blokovacím, pufru,

24·-hodin p.i., nit.rocelulózovou analyzovány' na proteinu_: v dráže se membrány. inkubovaly ' 1- hodinu s polyklonálním-.sérem vypěstovaným proti myšímu uPA (Pr. ,R Líjnen, Leuýen, Belgie), a pak další hodinu s kozím proti-křáličím šerem konjugovaným s křenovou peroxidázou (Dako). Membrány se třikrát promyly v puf.ru PBS-Tween a inkubovaly' s 3-amino-9-eťyl-kařbazólem (ABC) 5 minut... ,

Inhibice proteolýzy sdružené, s buňkami

Nativní uPA byl poprvé., disociován od svého receptorů buněčného povrchu - vystavením jednoduchých vrstev buněk LLC 3 minutové acidifikaci . v glycinu-HCl (pH 3), následovaném inkubací v pufru 0,5 M HEPES.. Buňky se 'pak inkubovaly 20 minut, při 37°G se supěrnatantem z buněk 293 infikovaných « · .

AdCOl- a AdmATF. Po třech promytíeh v PBS/0.1% BSA se buňky inkubovaly při 37°C- 20 minut s 1 nM myšího uPA (Pr. R.

Lijnen, Leuven, Belgie). Nenavázaný- uPA byl poté· odstraněn promytím v PBS, a u-PA sdružený s buňkami se kvantifikoval přidáním 0,4 . μΜ lidského plasminogenu ,a substrátu plazminu S-2251 (Kabi Vitrum, Švédsko).

Test invaze in vitro - .

.Dvacet čtyři hodin p.i. byly buňky LLC odděleny pomocí 1 mM EDTA, pr,omyty v PBS, a resušpendovány v médiu MDEM bez” FCS doplněném 0.1 .% BSA. Testy invaze se prováděly na přístroji ’ Transwell, jak- je popsáno. (19). ' Stručně, polykarbonátové filtry o velikosti pórů 1,2 μπι ((Transwell, Costar)' byly povlečeny se 160. pg Matrigelu (Becton Dickinson) a.usušeny. Spodní komůrky.přístrojů Transwell · byly. naplněny médiem upraveným pro lidské' fibroblasty obsahujícím 10' ng/ml .. EGF, 'a do horních komůrek bylo vyseto. 3xl0⁵ 'infikovaných buněk. Po 24 hodinách inkubace- při. 37°C se určoval počet buněk, které dosáhly - spodní ' komůrku, ' pod . 'světelným mikroskopem po Giemsově barvení.

Syngenní nádorový model,

Lewisovy plicní karcinomy se - postupně. .pasážovaly na . C57BL/6 syngenní myši. Stručně, myši C57BL/6 se subkutánně ' implantovaným. LLC nádorem byly usmrceny-,., když nádor dosáhl objem 600-1200 mm³. Nádorové··'buňky byly resuspéndovény v 0,9% solném roztoku po filtraci přes bavlněné· sítko,. a; 2 χ 10⁶ buněk (0,5 ml) bylo subkutánně implantováno t na ' hřbet 6-7 týdnů starých samic, myš i C57BL/6/ Po 5 dnech, nádory dosáhly . velikosti přibližně 20- mm³ .a bylo do nich injikováno 0,2 ml . PBS (n=8) nebo 10⁹ PFU (0,2 ml) AdCOl (n=10). nebo AdmATF (n=10) .., Velikost primárního'nádoru se měřila v den 5, 10 a. 15' f t · · 4 .·

449 · · · • · · · · · · « • · · · »·· · · · · ·

p.i. V den 16 p.i'.' se, určoval počet plicních metastáz

3'h'odiny po intraperitoneální inj ekci. 65 mg BrdU. Plicní tkáň se vyoperovala, fixovala se přes noc ve formaIdehydu s kyselinou octovou (AFA), a parafinové řezy se inkubovaly 15 minut v 4 N HCl, neutralizovaly 'a saturovaly dvoj ínr promytím 15 minut v PBS/0.5% BSA/0.1% Tween .20 před inkubací s myší . anti-BrdU monoklonální .protilátkou , značenou peroxidážou (Boehringer) po 45 minut při 37°C,. a AEC. Ložiska pozitivní, na BrdU se kvantifikovala pomocí světelného. mikroskopu při zvětšeni 25.

Model myší bez thymu · · ·- .

Pěstované buňky MDA-MB-231 (ATCC ' HTB 2 6) se- sebraly, ptomyly, resuspendo.valy - v PBS v množství 1,5 x 10⁷/ml -a 3 x 10⁶ buněk se,subkutáhně injikovalo -do hřbetů .6-7 týdnů starých· nahých (bežthymovýčh.) myší . Když . nádory dosáhly . ' objemu 15-20 mm³, (tj - po 11 dnech), ' dostala 'zvířata •intratumořální inj ekci 10³ PFU AdmATF (n=5) nebo AdCOl '(n=5)., nebo PBS (n'=5)., a'velikost nádorů se sledovala až do dne 52 p.i.,: po kterém byla zvířata usmrcena a stanoval se rozsah · inťratumorální váskúlarizace, jak je popsáno (28). Stručně, nádorové tkáně- se přes noc fixovaly v AFA, přenesly do 100% etanolu, zalily do parafinu a připravily se 5 μίη silné řezy. . Po ošetření toluenem' a rehydratací, se řezy permeabilizovaly' μσ/ml proteinázy K 15. minut ve 37°C. Endogenní peroxidázová a-ktiv.ita se vyvíjela 0,3% H₂O₂· 15 minut. Řezy se promyly PBS, inkubovaly 15 minut v 7,5% PSA,, a inkubovaly še 30 minut' . s králičím polyklonálním sérem, vypěstovaným proti lidskému ~ vWF. (Dako) . Po dvou -pr.omytích . v PBS ' se řezy 30 minut inkubovaly s biotinylovanou kozí próti-králičí . IgG protilátkou, promyly a inkubovaly 15 minut se streptavidinpeřoxidázou před přidáním AEC.. Ložiska neovaskularižace se )

• ·· nejdříve identifikovala při malém zvětšení a kvantifikovaly se kapiláry pozitivní' na vWF. Pro kontrastní barvení byl použit Meyerův hematoxylin, jak je popsáno v (28). '

Aby se vyhodnotil vliv infekce AdmATF na vytvoření nádoru, byly konfluentní buňky MDA-MB-231 nejdříve infikovány s,AdmATF nebo AdCOl v MOI 50 PFU/buňku. Buňky byly promyty 24 hodin p.i., resuspendovaly se ve 120 .μΐ PBS, smísily s 80. μΐ 'ledově chladného Matrigelu· a 1,3. x 10^s buněk se subkutánně implantovalo do. hřbetů nahých· myší.. Vytvoření nádoru a růst se sledoval,do dne. 51 po implantaci.

Výsledky ' . Molekulární a'funkční charakterizace-AdmATF

AdmATF je défektní rekombinantní. adenovirus, který exprimuje myší' ATF z promotoru · CMV, zatímco ÁdCOl je „prázdný· kontrolní adenovirus · (obr. LA) . ' Aby , se charakterizovál AdmATF vzhledem ke schopnosti exprimovat' po' inrekci funkčního· antagonistu .uPA:, · nejdříve 'se prováděly . studie¹ in vitro. Exprese genu ATF se prokazovala northernovou analýzou poly(A+) RNA ' extrahované z buněk MDA-MB-231 infikovaných 24 hodin AdmATF, ale ne AdCOl (obř.lB). Sekrece ATF buňkami'.infikovanými AdmATF se v buňkách 293, LLC a MDA-. MB-23L dokazovala analýzou westernových blotů. Například ATF specifický' polypeptid s molekulovou hmotností odpovídající i?· hmotnosti maturovaného peptidu (15,3 kD) byl detekován jedině

-- .v médiu z -buněk 293 infikovaných -24 hodin- p.i.· AdmATF (obr. IC). · ' ,

ATF je účinný antagonista uPA vázající' -se na. jeho buněčný povrchový receptor (uPAR) a je známo, . že rozpad • . tohoto komplexu značně inhibuje konverzi inaktivního \ plazminogenů .na plazmin. Pro ohodnocení funkčnosti. ATF

• ř

'4 7 secernovaného buňkami infikovanými AdmATF, se -tedy měřila konverze plazminu buňkami LLC. Jako bezpodmínečně nutné jsme ověřovali, zda buňky LLC projevují.' významnou úroveň aktivity uPA.spojenou s buňkami, z čehož vyplývalo, že secernují uPA a exprimují uPAR. Když byl nejdříve ’endogenní uPA odstraněn z buněčného povrchu ošetřením; slabou kyselinou před inkubací se supernatan-tem z buněk 293 infikovaných AdmATF ,a přidáním lnM 'myšího uPA (obr. 2A) , byla konverze/aktivita plazminu významně snížena. Komplex uPA/uPAR je také velmi důležitý pro buněčnou motilitu. Pro potvrzení funkčnosti AdmATF byl použit těst buněčné' invaze in vitro. Buňky LLC se infikovaly s AdmATF nebo AdCOÍ a .. počet buněk, které migrovaly přes membránu potaženou matrix, se určoval po ' 24 hodinách (obr 2B) . Kvantifikací dat bylo. dokázáno, že infekce AdmATF inhibovala agresivnost LLC o .65 % (n=5) ve srovnání ’s kontrolní infekcí·'AdCOÍ. ' .

Intratumorová- .injekce- AdmATF inhibovala ' růst nádoru a diseminaci . ' . Nejdříve jsme použili· syngénní model Lewisova plicního karcinomu-C.57Bl/6 pro vyhodnocení., protinádorových. účinků spojených s jedním inťratumorálním podáním AdmATF. Pět dnů po subkutánníimplantaci -se; do nádorů irij.ikovalo -10⁹ PFU AdmATF, 10⁹ PFU AdCOÍ nebo PBS' a růst nádoru se sledoval do dne 15 p.i. · Jak. je ukázáno na ' obr. 3, celková inhibice byla. specificky- pozorována ve skupině ošetřené AdmATF. Zvířata byla poté- v den 16' p.i.. · usmrcena a' vyhodnotily .se pl-icní 'metastázy -spočítáním' ložisek pozitivních na BrdU. Zatímdo metastázy byly zjevné u-všech zvířat, kterým se injikoval PBS (n=8), 7' z 9 a pouze' 3 z '9 byly pozitivní ve skupinách ošetřených AdCOÍ a AdmATF, v uvedeném pořadí .. -Průměrný počet BrdU-pozitivních ložisek na . jeden.plicní řez byl ve skupině ošetřené AdmATF také snížen (2,7) ve srovnání, se skupinami ošetřenými Ac}COl (6,3) a PBS (6,6). Jedno intratumorální podání AdmATF , tedy významně inhibo.valo růst nádoru a plicní diseminaci v tomto vysoce agresivním modelu. V samostatném pokuse- byl.a zvířata s nádory infikována AdCOl nebo AdmATF a nádory' byly v den 10 a 20 p.i. vyňaty pro makroskopické prozkoumání. Zatímco LLC nádory- injikované A.dCOl projevily v obou časových bodech silnou vaskularizaci, nádory u. skupiny ošetřené , AdmATF vykazovaly pouze omezenou vaskularizaci (obr.. 4) .

Protinádorové účinky . AdmATF se uplatňují- na.- úrovni angiogeneze .--,

Aby se spec-ifičky ' vyhodnotila. výhradně inhibice angiogeneze 'na . růst - nádoru, . studovali jsem adenovirem'. zprostředkované podáni- myšího uPA./uPAJP antagonisty v modelu ' karcinomu prsu - lidského - původu MDA-MB-231 implantovaného myším bez thymu.-Přímý účinek myšího.AT.F na .nádorové buňky-by měl být v tomto modelu minimální, . protože myší uPA^ váže lidský uPAR 200 x méně účinně než myší' uPAR. Jedenáct ,dnů. po subkutánní- ino kulaci nádorových buněk zvířata, dostala jednu intratumorální injekci 10⁹ PFU AdmATF, 10⁹ PFU .AdCOl nébo PBS, í

a růst nádoru- se sledoval do ,,dne 52 p.i. I. když do dne 32 p.i.. n.ebyl znáť žádný významný účinek, pó.té bylo patrné . zastavení růstu .nádoru ve skupině infikované / AdmATF, 'ale ne ve' skupině, infikované AdCOl · (obr/.- 5.) . .Myši byly. usmrceny v den '52- p.i., a- -určila se intratumorální . angiogeneze vlzualizací cév, . které ’'byl.y -im.unoreaktivní .na 'von Willebrandův faktor (vW'F) . , V řezech z nádorů ošetřených. AdmATF se průměrně detekovalo 4 až 6 cév ve srovnání s 18 až 20 cévami v řezech, z nádorů, do kterých se injikoval AdCOl. Nádory injikované AdmATF - také projevovaly malou- periferní ·« • «'

neovasku.larizaci ve srovnání se svými protějšky ošetřenými AdCOl. (obr. 6B) . Když byly buňky MDA-MB-231 poprvé infikovány in vitro před subkutánrií inokulací v přítomnosti MatrigeljJ, nádory byly patrné ve skupině ošetřené AdCOl již '7 dnů po implantaci. Nádor omezené velikosti byl patrný pouze u jednoho zvířete ze skupiny ošetřené AdmATF, (n=5), v ostrém kontrastu k větším nádorům přítomným u - 4 z 5- zvířat ze skupiny infikované AdCOl. Opět, -nádor, který se vyvinul po inokulací nádorových buněk infikovaných A.dmATF byl méně vaskularizován než nádory, které se vyvinuly po' inokulací. buněk, infikovaných AdCOl (data nejsou ukázána) ...

Diskuse buněk .(22,. .23). Podávání intratumorálním, podáváním exprimuje secérnovatelnou z promotoru CMV (AdmA.TF) .

Studovali jsme protinádorové účinky spojené s lokálním podáváním amino-koncového nekataiytického'fragmentu.urokinázy (ATF)., silného antagonisty' urokinázy, vázajícího, se na její receptor (uPAR)' na povrchu nádorů· (19,' 20)- a endo telových ATF in '- vivo·' bylo. provedeno' defektniho adenoviru, který molekulu „ ATF myšího původu .Aby se vyloučily nespecifické cytotoxické účinky V důsledku virově infekce (29), byl jako^ -kontrolní, virus. v. průběhu studie použit „prázdný, ale jinak izogenní adenovirus (AdCOl). To, je důležitá kontrola., také ..proto¹, že, rekombinantní adenoviry mohou pro infekci použít '' integrin aVb3 (30).,· buněčný ¹ povrchový, receptor, který- je nějakým .způsobem''-zapojéný do růstu nádoru-a .angiogeneze, (31) .

Jedna intratumorální 'injekce AdmATF účinně redukovala růst' nádoru (obr. 3) a oddálila diseminaci do plic u agresivního- syngenního myšíhomodelu,LLC-CS7BL/6. Myší ATF zřejmě tento účinek částečně vykonává inhibicí agrešívnosti

-· · malou vaskularizaci ve infikovanými AdCOl (obr.

nádorových buněk samotných (obr. 2B), což je výsledek, který je konzistentní s inhibici proteolýzy spojené s buňkami po 'infekci AdmATF (obr. 2A) . Antagonisté založené .ná ATF jsou také silnými inhibitory ' motility e.ndotelových buněk (22, 23), což svědčí pro to, že inhibice nádorové angiogeneze může také přispět k účinkům pozorovaným, u tohoto modelu. Nádory LLC, kterým .byl injikován AdmATF, opravdu projevovaly velmi srovnání ' s kontrolními, nádory 4). Tato 'inhibice' růstu nádoru specifická pro AdmATF byla zřetelná až později po podání, ale to, že- nebyla pozorována v časném stádiu,, je pravděpodobně důsledkem menších nároků, malých nádorů na. neovaskularizaci pro zajištění živin pro růst, (pro přehled viz 24) .

Inhibice. diseminace ·. buněk LLC do plic . byla . pouze přechodná, protože . čas přežití skupiny ošetřené AdmATF. byl' j ' I ' j enom -š.láb.ě prodloužen- (méně než -3 0 'dnů ?po implantaci “nádoru') ve srovnání s časem skupiny ošetřené AdCOl (méně než 25 dnů). Vliv in-jekc-e AdmATF na disemina.ci nádorových buněk může- být' vysvětlen buď'tím, že nádorové buňky byly zmraženy po. infekci AdmATF, ' a/nebo tím, - že' pro vstup do cévního zásobení bylo k dispozici pouze málo cév. Diseminace, která ' nakonec nastane,' svědčí pro to, že některé- nádorové, buňky jíž mohly dosáhnout v čase injekce AdmATF cévní zásobení. Alternativně infekci adenoviry s odstraněnou El . je také typicky spojena s rychlou- clearencí infikovaných buněk .u myší'CS7BL/6, které jsou imunologicky tolerantní pro transgenní produkt (29), a ATF je malá molekula, která biologický poločas in vivo.

Preklinická data naznačují, rozhodujícím způsobem zapojen do kontroly buněčné migrace, ¹ včetně migrace endotéloyých. buněk. Například bylo ukázáno, že fúzní protein. ATF-IgG s prodlouženým biologickým' poločasem projevuje,· velmi krátký že komplex uPA/uPAR je in. vivo inhibuje_sangiogenezi a nádorový růst v myším modelu obohaceném bFGF Matrigelem (23). Předkládaná studie poskytuje důkaz, že protinádorové účinky aritagonistů uPA/uPAR jsou v podstatě vykonávané kontrplou intratumorální. a periferní angiogeneze, zatímco protinádorové. účinky ^podání genu zprostředkované .AdmATF mohou být multifaktoriální, protože jak ' nádorové, tak endotelové buňky · jsou . možnými cíly v syngenním nádorovém modelu, ale to' není případ modelu MDAMB-231/myší ,bez thymu/ protože.. mATF je' -slabý antagonista tvorby komplexu uPA/uPAR -na povrchu lidských buněk., včetně . MDA-MB-2,31- (32) . Pozoruhodný rys, který se. vyskytl, u modelu· MDA-MB-231, byla účinnost AdmATF v prevenci růstu nádoru (obr. 5) a neovaskularizace v nádoru a jeho, okolí (obr,. 6) . Na ro.zdíl od toho, nádory infikované kontrolním adenovirem byly stále schopné „přitažení sousedních cév·. Protinádorové ‘vlastnosti 'AdmATF jsou v tomto modelu dále ilustrovány'·, sníženou účinností’ vytvoření nádoru po infekci. Maligní .nádory .ohrožují '.život,· protože poškozují a-'narušuj i . funkci vitálních orgánů na vzdálených místech, což zdůrazňuje důležitost, zaměření, 'na - angiogenezi v'boj i proti· rakovině (33, .viz také 34). Za prvé, růst primárních nádorů závisí na ..neovaskulariza.ci pro zajišťování požadovaných živin. . Za /druhé, bylo publikováno, že metastázy trpí v nepřítomnosti neovaskularizace. apoptózou (35). Kromě toho rostoucí· kapiláry v nádoru. j sou „děravé, maj i fragme-ntovánou ^: bazální membránu (36),.. což je nezbytný předpoklad· účinné penetrace.nádorových buněk 'do cévního zásobení (37). Celkové výsledky .'této studie dokazují, · že významného protinádo.rového účinku může být dosaženo po jednom- intratumorálním podání rekombinantního adenoviru exprimujícího silného antagonistu funkce uPA/uPAR na buněčném povrchu, a že tyto účinky většinou plynou z. inhibice angiogeneze. Aplikace tohoto ·· ·· • · · · • · · · ··· ···

přístupu na invazivní pevné, nádory je pro genovou terapii rakoviny jistě přitažlivá pro pleio.tropní klinické účinky očekávané po inhibicí nádorové angiogeneze.

Příklad 2 ' .

> ' Genová terapie ángiostaťinem inhibuje nádory .in. viyo ' ti . Příklad 1 dokazuje, že exprese aminokoncového fragmentu lidského plazminogenu (angiostatin K3.) inhibuje ..růst nádorů in vivo blokováním proliferace endotelových buněk spojené se zastavením mitózy. Protinádorové účinky, které jsou. způsobeny lokálním podáním N-koncového' fragmentu lidského''plazminogenu (angiostatin· K3), byly studovány ve dvou myších modelech ' ·'· · <s-.xenoimplantáty,. · Podávání angiostatinu .se ••'•dosáhlo:'de-fektním *

adenovirem, který' exprimuje , secernovatelnou- molekulu '·,.' angiostatinuK3 -z- promotoru ČMV (AdK3). Ve .studiích in vitro, U ; AdK3 selektivně’. . inhiboval ·. proliferaci. .endotelových buněk a přerušil- přechod G2/M indukovaný faktory podporujícími. . .M fázi. Endotelové buňky infikované AdK3 vykazovaly, zřetelnou zástavu mitózy, což korelovalo .. s utlumením.'fosfoproteinů

M fáze-./ Jedna intratumorální- injekce AdK3 do předem stanoveného krysího gliomu C6 nebo karcinomu prsu.,lidského původu MDA-MB-23T pěstovaných, na myších bez thymu způsobila významné .zastavení ' růstu '· nádoru,· . které bylo- doprovázeno potlačením ,'neovaskularizace v nádorech.' -a jejich okolí. Terapie AdK3 · také vyvolala - lOnásobné zvýšení počtu apoptotických nádorových buněk' ve , srovnání s kontrolním adenovirem. Data podporují představu, že cílená antiangiogeneze, . za .použití přenosu v genů zprostředkovaného adenoviry, představující slibnou .strategii pro podávání anti-

• ♦ neboť podávání ^;anti-angiogenních injekce stále představuje nevyřešený *ί.

*ζ angiogenních proteinů.j ako farmakologický faktorů, bolusové problém.

Metody

.. Konstrukce AdK3 ' .

AdK3 je- El-defektní, rekombinantní adenovirus, který >· exprimuje N-koncový fragment lidského plazminogenu (až. do zbytku 333) z přorfto toru CMV. Lidská Pig cDNA. byla získána z plazmidu PG5NM119. Fragment kódující 18 aminokyselinový signální peptid z Pig, následovaný prvními 326' .zbytky maturovaného Pig-, byl nejdříve subklonován mezi místa BamHI a Seal plazmidu - pXL2675. Poté . byl přidán syntetický oligodeoxynukleotid kódující 'zbytky 327 až 333 .následované stop-kodonem, ' ' před ' vložením mezi . promotor · CMV a. pozdní polyadeňylační signál SV40'. Tato. expresní kazeta ' byla, poté vložena mezi místa. EcoRV a BamHI plazmidu pCO5 za vzniku plazmidu . pCO5-K3. AdK3 byl konstruován v buňkách 293 homologní. rekombinaci mezi , p'CO5-K3 a . AdRSVíPgal DNA naštěpenou- Clal (25) . Jednotlivé plaky se · .izolovaly z jednoduchých .vrstev buněk 293, . amplifikovaly v čerstvých buňkách 293 a virové kmeny se připravily, jak je popsáno

v. (25) . AdCOl je kontrolní virus, který je totožný,S: AdK3 až ' ·- na to, že nenese žádnou expresní kazetu... ·..

Udržování buněčných^ linií a infekce

Buňky gliómu CS (ATCC 'CCL-107) a buňky MDA-MB 231.(ATCC

HTB- 26). se pěstovaly v DMEM s 10% fetálním telecím sérem (FCS). Virová infekce se prováděla s 5% FCS. Endotelové buňky ' · lidských, kapilár (Human Micročapillary Endothelial Cells HMEC-1) (49) se. pěstovaly v MCDB 131 doplněném .o 20% FCS,

iriM -L-glutamin, 1 pg/ml hydrokortizonu, 10 ng/ml epitelového růstového faktoru .a' infekce se prováděla ve stejném médiu, , ale. s 10% FCS a- 3 ng/ml rekombinantního lidského b-FGF (R&D ísystem). Násobek infekce (MOI) se vybral tak, aby se získalo % až 100 % infikovaných buněk při hodnocení značením X-GAL po infekci virem AdRSVPGal. · 'f · * ·

Analýza.westernovým přenosem , * , .Subkonf luentní buňky byly infikovány s AdK3 nebo AdCOl v MOI. 300 jednotek, tvořících piaky (PFU)/buňku.' Supěrnatanty buněčných -kultur se sbíraly 4 8 až 9 6 hodin po infekci (p.i.) . Pro imunologickou analýzu molekuly angiostatinu,K3 in vivo se nádory 'odebíraly v den 10 p.i., mrazily v tekutém dusíku, . rozdrtily,' extrahovaly·Ivzovacím.pufrem . (lOmM· NEM, .1% triton X100, lmM PMSF, Ο,ΙΜ.ΝΗ-ΟΗ) a stočily ve 12'000 rpm·-ve 4 °Cí . Vzorky 'obsahující 300' pg proteinu byly'· analyzovány. ' na ÍO% SDS-polyakrylamidovém gelu před tím, ; 'než byly přeneseny na nitrocelulózovou ’ membránu (Sc-hleicher & ' Schuell)-. 100 ng lidského Plg (Stago) se pustilo jako kontrola,' Po 2 hodinách inkubace v blokovacím pufru . (TBS-5% mléko-0>05% Tween' 20) se .- membrány inkubovaly A .hodinu s proti-lidskou Plg MAb A1D12.(50), 1- hodinu s ' kozím ' proti-myším’ sérem ‘konjugovaným s křenovou ' percxidázou (Biosys),.’ Po promytí se membrány .» ’ detekovaly s pomocí soupravy ECL biolumihescerice, kit (Amersham, UK)., Aby se .detekoval MPM-2 fosfoepitop,· byly » , z buněk HMEC-1 připraveny extrakty 96 hodin p.; i. a testovány, se specifickou'mitotickou MPM-2 MAb' (DAKO.) .

.. - .. Test proliferace · í Nádor nebo buňky HMEC-1.’ byly infikovány s Ad'K3 nebo

AdCOl v naznačené MOI 12 hodin. Buňky sé sbíraly s 1 mM EDTA, dvakrát promyly s PBS . a resuspendóvaly. Pak se vysely na • ··

96jamkové kultivační destičky (5000 buněk/jamku) a pěstovaly 72 hodin.' Kromě toho se buňky .HMEC-1 pěstovaly v médiu MCDB ' 131 obsahujícím 40, 20 -nebo 10% supernatant z gliomových buněk C6 transdukovaných AdK3 nebo AdCOl. Supernatanty z,virem infikovaných- buněk C6 se. sbíraly 96 hodin' p.i,, zahřály, se 30' minut, v .56 °C,. abv .se .virus inaktivoval, koncentrovaly se 10.. x a dialyzovaly proti PBS. Buňky se kvantifikovaly pomocí .testovací'' soupravy na -buněčnou proliferací za použiti MTS tetrazoliové sloučeniny (Promega).

Vytvoření kapilární trubičky v modelu fibrinové matrix

Tento model byl navržen podle metody Peppera et'al. (51) s použitím, endotelových buněk telecí pulmonální arterie (CPAE) .(ATCC CCL 209) infikovaných 12 hodin s Ad-K3 nebo AdCOl v MOI 600 .

Test lýze úplné krve. ·'.· '

Lýze koagula úplně krve se prováděla smísením 80 U/ml tkáňového aktivátoru - plazminogenu, 250 μί' . ' tkáňového supernatantu získaného .'4 dny píi. s AdK3 nebo AdCOl a 500. μί plné- krve antikoagulačně ošetřené citrátem odebrané zdravým dárcům. Koagulace se spouštěla přidáním 1 U/ml trombinu a 12 mM Ca++. Rozsah lýze koagula se' určoval časem, lýze a sledováním kinétiký rozpustných D-dimerů, jak je popsáno v (52) . í , ^:Průtoková_; imuno-cýtometrie . , .

HMEC-1 byly 96 hodin infikovány s AdK3 nebo AdCOl' v MOI

300 PFU/buňku. Buňky se sesbíraly,, permeabilizovaly tritonem X100, inkubovaly se s propidiumjodidem (20 pg/ml) a ribonukleázou A (100 pg/ml) 30 minut při teplotě místnosti, aby se označila DNA, před inkubací s mitotickou protilátkou ···

MPM-2,' jak je popsáno v (53). Proti-myší IgG protilátky konjugované s FITC byly použity pro detekci, MPM-2 fosfoepitopu. Pokus se prováděl v průtokovém cytometru Coulter .EPICS Profile II a data se analyzovala programem Multic.ycle (Phoenix Flow Systems, San Diego, CA) .

Vbuď AdK3 (n-β) nebo AdCOl (n=6) nebo - PBS (n=6) . nádorů se sledovala, až do dne 10 p.i. pro. model a dne 42 p.i. pro model MDA-MB-231.

Aby se’ vyhodnotil vliv infekce ' AdK3 na a progresi ' nádoru, byly buňky- MDA-MB-231 a C6 24· hodin v MOI 50 a .100 PrU/buňku, před subkutánní

Model'myší bez thvm.u

Pěstované gliomové buňky C6 a buňky MDA-MB-231 se .sebraly, promyly, resušpendovaly v PBS v množství 1,5 x IO⁷ a 0, 25 x 10⁷/mi a objem; 200· μ,i se subkutánně, injikoval do hřbetů 6-7 týdnů starých nahých myší. Když nádory dosáhly objemu 20 mm³, dostala zvířata intratumorální, injekci 10⁹ PFU , Velikost gliomu C6

.. <· , vytvoření' infikovány inokulaci do hřbetů'nahých-myší (n=6) . Infikované buňky MDA-MB--231 jsou méně schopné vyvolat nádor než infikované buňky - C6, takže před subkutánní· implantací (10^s buněk MDA-MB-231 nebo

0,25 x10⁶ buněk C6) muselo .být -ke. 120 μΐ PBS přidáno 80 -μ1 ledově chladného . Matrigelu. (Becton. Dickinson) . Vytvoření nádoru a růst .se -sledovaly do dne 25 .(MDA-MB-231) nebo 22 (C6) p.i. Pro statistickou analýzu , byl . použit Studentův t-test,. Imunohi-stochemie .

Nádorové tkáně se fixovaly v kyselině octové s alkoholem a formalínem, zalily do parafínu a připravily se řezy silné 5 pm. ,Po ošetření toluenem a rehydratací byly řezy předběžně zpracovány třikrát 5 minut v mikrovlnné troubě v lOmM

• 9 ·· 9 9· ·· ·· ·'· · · · 9 · · · 99' '9 · 9 9 999

9.99 9 9 · 9 999 99 • ' 9 9 9 · ·

999 99*9 999 ·· 99 99 citrátovéni pufru (pH 6,0), endogenní peroxidázová aktivita se vyvíjela -3% H₂O2- 5 minut, řezy se promyly PBS, a poté se inkubovaly 60 . minut s králičím polyklonálním sérem vypěstovaným proti lidskému von Willebrandovu faktoru (vWF,

Dako, ředění -1:200). ‘Po třech promvtích se řezy inkubovaly 30 minut s biotinyl.ovanou kozí proti-králičí-IgGprotilátkou, promyly a inkubovaly 3Ό minut - se streptavidin-peroxidázou před. přidáním 3-amino-9-etyl-ká-rbazolu.. - Pro kontrastní, barvení byl použit Meyerův -hematcxylin. Apoptotické buňky v řezech se detekovaly pomocí soupravy metodou značení zlomů dUTP-biotinem zprostředkovaného terminální -deoxynukleotidyltransferázou (terminál deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick-end labeling method' - TUNEL, Boehringer Mannheim). Pro značení jaderného antigenu:proiřferující buňky (PCNA) postup zahrnoval biotinylovano-u ..myší- protilátku antiPCNA CPhármingen, - ředění 1:100), pak -nášledovalo' zvidi'tein,ěnístreptavidin-peroxidázou a., substrátem.

'-Výsledky ,

Molekulární charakterizace A.dK3 . Rekombinantní AdK3 nese Ν-koncový fragment Lidského Plg řízený . CMV,. který zahrnuje první tři smyčkové domény angio.statinově móle-kuly (47), zatímco AdCOl je „izogenní kontrolní adenovirus., . který.nekóduje žádnou expresní kazetu (obr. 7A) . Sekrece molekuly K3 do kultivačního média, '2-3 dnv po . Infekce s AdK3 byla dokázána -pro' buňky HMEC-T/ -C6 a MDA--. MB-231 'pomocí imunologického přenosu, povinen s M-ab A1D12, přičemž po-infekci'š AdCOl nebyl detekován žádný signál (obr. . 7Bj . Secernovaný imunoreaktivní peptid se jevil' jako dimer s molekulovou hmotností 36 . a , 38 kD, s největší φ 9 • 9 • ΦΦ φφ φφ φφ φ φφφ φ φ · · • ΦΦ φφφ φ φ • Φ 9 9 pravděpodobností odrážející různý rozsah -N-glykósylace. v Asn^2SS, jak. popsáno pro Plg (54,55) . · ’

Funkční charakterizace AdK3

Transdukce buněk HMEC-1 AdK3 měla za následek inhibici proliferace stimulované bFGF v závislosti na. dávce,· v den 3 p.i.: 30% při’ MOI 50,. 7.4% při MOI 150, a 97% při MOI 300, v ostrém kontrastu k buňkám infikovaným s AdCOl (P<0,005). AdK3 neovlivnil proliferaci buněk MDA-MB-231 a. C6 (obr. 8A). Aby se vyhodnotil parakrinní potenciál molekuly K3 působit tyto účinky, přidaly se .k buňkám HMEC-1. kultivační, -média zbavená viru z gliomových buněk C6 infikovaných virem.. Jak je ilustrováno na obr. 8A, pozorovali jsme inhibici závislou na dávce proliferace buněk HMEC-1 angiostatinem secernovaným. buňkami·C6. (p<0.001). Přidání AdK3 také významně inhibovalo tvorbu''.'kapilár ‘buněk·-CPAE. ve ' f ibrino.vém· gelu s. průměrnou redukcí 55 %· (neukázáno) . Kromě toho,, lýze koagula plné krve indukovaná' tPA 'nebyla .inhibována- přidáním supernatantů z buněčných kultur z 'buněk C.6 · infikovaných A.dK3 a· vznik D-dimerů - byl , v podstatě, nezměněn během· prvních tří hodin, (1200 ng/ml proti. 1150 ng/ml) . ;'.·'·.·

AdK3 inhibuje mitózu endotelových buněk '

Aby se určilo, zda je angiostatin schopný, blokovat mitózu HMEC-1, .provedla, se analýza průtokovou imunocytometrií s buňkami značenými s MAb, MPM-2,' .. která' se váže·, k fosforylovaným proteinům specificky přítomným během M-fáze, ' spolu se souběžným značením DNA. Výsledky ukázaly, že. mitóza -^;-buněk HMEC-1 infikovaných AdK3 byla snížena o.· 82 % relativně k infekci AdCOl: pouze 5 .% buněk HMEC-1 ve fázi G2/M',bylo· pozitivních na MPM-2 po infekci s AdK3 ve srovnání s 27 % po kontrolní infekci s AdCOl (obr 8C) . Aby se .detekovaly MPM-2 . ·· ··

9 9 9

9 9 9 .· ··· 999 • ·

99 ·**· ·· «» :

• · · · • 9, • · i

• · • · • · ·· pozitivní proteiny, byla z extraktů HMEC-1 provedena analýza westernovým přenosem, neboť obvykle je MPM-2 odhaleno alespoň 16 mitotických fosfoproteinů se zjevnou molekulovou hmotností v rozmezí od 40 do více než 200 kD. Ve srovnání s kontrolními, extrakty z buněk HMEC-1 buď neinfikovaných nebo infikovaných AdCOl projevovaly extrakty z buněk infikovaných AdK3 -výrazně redukovanou hladinu .MPM-2 reaktivních ·. fosfoproteinů (obr. 83) .

AdK3 inhibuje růst nádoru

Aby se .indukovala: lokální sekrece angiostatinu, injikovala .se. jedna' dávka. 10.9 PFU AdK3 do· předem vytvořených nádorů o . velikosti 20 mm^J lidského karcinomu prsu MDA-MB-23'1 a . krysího· .gliomu ’C6, rostoucích na myších bez thymu, a sledoval se růst. nádoru. . Jak j e ukázáno na · obr. 9A, nádory Co ' ze 'skupiny' injikované AdK3 byly' významně menší, '~ než''nádory z kontrolních . skupin AdCOl nebo PBS: -v den 10 p.ř. dosáhly nádory . injikované AdK3 průměrný' objem 278 ± 14 mm' proti 1403 i 142 mm³, nebo 1533 ± 259mm³ pro nádory injikované AdCOl a PBS (p<0,05). Tato 80% inhibice -korelovala š .detekcí materiálu imunoreaktivního na ·, angiostatin (obr. 7'C) . Jak je ukázáno ňa obr. 9B, ' růst nádoru- byl inhibovárí podobně , (85 %) v nádorovém modelu MDA-MB-231 v den. 42 p.i.: -80 ± 4 mm³ pro nádory ošetřené AdK3. proti 563 ± 137 mm³ pro - nádory •V'·,· ·' · injikované AdCOl a 530 ± 69 mm³ pro nádory injikované PBS (p<0, 05) . . . ; ' ' . · .

AdK3 inhibuje angiogenezi a indukuje- 'apoptózu - nádorových buněk in vivo

Nádory C6 infikované AdCOl projevovaly mnohem větší vaskul.arizaci, než jejich protějšky, infikované AdK3 (obr. 1,0, panely A-B). Intratumorální angiogenez.e byla tak vyhodnocena

imunologickým značením na vWF nádorových řezů, jak je popsáno v (28). vWF pozitivní ložiska byla nejdříve lokalizována při malém zvětšení,., a pak byly vWF pozitivní cévy'.počítány ve zvětšení 200 x (obr. 10, panely. E-F) . Výsledky vyjadřovaly výraznou redukci inťr^tumorální vaskularizace v nádorech injikovaných . AdK3 (5 ± 2 ..vWF poztivních cév v poli) ve srovnání s kontrolami injikovanými AdCOl (14 ± . 4, n=5,· p<0.005). .Nádory, ve skupině.injikované PBS projevovaly stejný počet, cév (-14 ± .3), což .naznačuje, že použité podmínky .nfekc-e neinterferovaly .. s nádorovou

Na makroskopické úrovni nádory.C6;injikované.s. AdK3 projevovaly malou .periferní. neovaskularizaci ve srovnání s jejich protějšky ošetřenými A.dCOl (obr. 10, panely C-D) . Podobné výsledky byly získányu řezů z nádorů MDA-MB-231 (4,8 ±. 1,2 vWF immunoreaktivních cév/pole pro AdK3 proti- 15, 6 ± -3 AdCOl, ρ=ΰ, 02) . ’

Apoptóza- nádorových buněk byla poté kvantifikována in sítu se vzorky nádorů. C6 metodou TUNEL (viz Metody).' Výsledky vyjadřovaly výrazný nárůst apoptotických buněk' v nádorech.C6 injikovaných AdK3 10 dnů ·ρ·. i. (20 ± 9 proti·. 1-2''apoptotickým buňkám na .pole .pro kontrolní . nádory, ' ρ<0.ΌΌ1) (obr. 10, panely, G-H) .· Na .. rozdíl od toho .rychlost proliferace' nádorových buněk nebyla odlišná mezi’třemiskupinami -zvířat, jak určeno imunologickým, značením PCNA (neukázáno). Terapie Ad-angiostatinem , vyvolala lOnásobný nárůst . apoptotických nádorových.buněk bez ovlivnění proliferace těchto buněk, což j,e podobné publikovaným výsledkům' získaným. denními injekcemi purifikovaného angiostatinu.

AdK3 inhibuje vznik nádoru .

Aby se. určilo, zda inhibice nádorové angiogeneze oslabilá vznikání: nádoru, byly buňky MDA-MB-231 a C6 nejdříve infikovány 24 hodin před injekcí do hřbetů nahých myší. Po 5 dnech se u všech myší ze skupiny infikované AdCOl vyvinuly hypervaskularizované nádory. C6 průměrně velikosti.

27, 4 . ± 3,41 mm³, zatímco 20 zvířat. . ze skupiny infikované (obr.

11)

A.dK3 zůstávalo po 12 dnech bez nádoru U zbývajících zvířat se. projevily velmi malé nádory (průměrná velikost 0,42 ± 0,05 . mní), které. byly skoro bez vaskuíarizace,. Po 22 dnech byly nádory, které byly pozorovány ve skupině AdK3, alespoň 5x menší, než nádory ‘ ze skupiny AdCOl· (n=5, p<0,005, obr. 11). Podobná pozorování byla učiněna v'modelu nádoru MDÁ-MB-231 (neuvedeno) . ·'

Diskuse

Bylo' ukázáno, - že angiostatin je ' fyziopatologický angiogenéze secernovaný primárními, nádory, uvádějící metastázy do spícího, stádia. Bylo proto lákavé vyhodnotit terapeutický potenciál angiostatinu na·' primární nádory.' Ale ' /systémové '.. a _; iri.traperitoneální bolusové injekce lidského angiostatinu zdůraznily -obtížné - farmakologické problémy,. -protože angiostatin je rychle . odstraňovánž cirkulace (46). Pro udržení cytostatických intratumorálních koncentrací angiostatinu bylo vskutku vyžadováno' dlouhotrvající -působení purifikovaného angiostatinu ve vysokých, dávkách (46). Nebylo předem jasné, zda přímá transdukce nádorové a okolní tkáně rekombinaritním virem' kódujícím cDNA angiostatinu- p.ředs tavovu je účinnější metodu dosažení ' 'konstantních - . intratumorálních' koncentrací angiostatinu. V takové strategii jsou vhodnými vektory adenoviry, protože mohou účinně ' exprimovat svůj transgen. v terapeutických hladinách jak' v próliferujících, tak v neproliferujících buňkách (přehled viz . 37),, což umožňuje • · • · •f 'ř

S'

-v řs

zacílit širokou oblast pro tvorbu angiosta.tinu. Tak byl konstruován defektní adenovirus, který exprimuje N-koncový fragment (aminokyseliny la.ž 333) z lidského Plg, včetně jeho preaktivačního peptidu a smyček 1 až 3 (AdK3),.

Použití . Mab A1D12, která je specifická pro lidský Plg (50), poprvé ; prokázalo účinnou sekreci, angiostatinu, do kultivačních médií buněk infikovaných s. AdK3. Zahrnutí N-koncovéhó preaktivačního peptidu. do molekuly angiostatinu neovlivnilo, jeho anti-angiogenní aktivitu, protože endotelově. buňky infikované AdK3', ale ne infikované AdCOl, vykazovaly výraznou, na dávce závislou, zástavu proliferace in vitro (obr. 8A) . Kromě toho proliferace nádorových buněk MDA-MB-231 nebo C6 nebyla infekcí AdK3 ovlivněna,· což dokazuje omezené /

působení angiostatinu na endotelové buňky.' Supernatanty bez viru z tkáňové kultury nádoru infikované.AdK3 také inhibovaly proliferaci 'endotelovýcn buněk, což ukazuje parakrinní. \účinek angiostatinu secernovaneho transdukovanými nádorovými buňkami.

Protože smyčkové domény j sou důležité pro. vazbu Plg' na' fibrin a degradaci fibrinu, bylo podstatné'· analyzovat účinek této, terapie na tnombolýzu, ' fyziologickou ochranu proti trombóze in vivo. Angiostatin secernovaný. do kultivačního média selhal při inhibici lýze koagula plné krve in vitro. indukovanou tPA. Ačkoliv tento pokus ' nevyloučil škodlivou. kompetici mezi angiostatiném a Plg ve vazbě na fibrin během trombolýzy in vivo, naznačuje, že angiostatický účinek může . být dosažen v koncentraci daleko pod koncentrací požadovanou pro; poručení trombolýzy závislé na plazminogenu in .vivo. To. může také svědčit pro to, že endotelové buňky mají receptor, který rozpoznává angiostatin a ne intaktní Plg.

Analýza endotelových buněk infikovaných AdK3 průtokovou . cytometrií prokázala kompletní vymizení mitotické populace • ·

pozitivní, 'na MPM-2 MAb (56). Analýza imunopřenosem odhalila, že fosfóproteiny M-fáze reaktivní na MPM-2 MAb byly opravdu v endotelových buňkách ošetřených, angiostatinem utlumeny, což je v ostrém kontrastu s kontrolními ..eňdotelovými buňkami. Toto pozorování by mohlo být nápomocné - při., definici mechanismu, kterým angiostatin ruší proliferaci endotelových buněk. Také jsme ukázali, že angiostatin narušil-. přechodné stádium G2/M indukované podporujícím faktorem M. fáze (MPF), složeného z cdc2 a jeho přidružené regulační podjednotky, cyklmu B .(57) . MPF zosforylovane proteiny, reaktivnr s- MPM—2 MAb, jsou zapojeny do hlavních změn buněčných struktur aaktivit pro účinný přechod do mitózy. Důvod, proč aktivní MPF chyběl v endotelových buňkách· transdukovaných· AdK3, musí být dále zkoumán. ·.,-.·...

, Ukázalo se, že jedna intratumoráiní injekce A.dK3,, ale ne AdCOl,· dramaticky inhibuje růst primárního nádoru ve dvou předem vytvořených xenoimplantátových myších modelech. Tento inhibiční. účinek na. růst nádoru těsně: koreloval s výrazně sníženou vaskularizací v nádorech , a. jejich okolí .(obr.· 10) , spolu s detekcí materiálu imunologicky 'reaktivního· na angiostatin v. nádorových extraktech (obr. 7C).'. Gliom C6 je vysoce vaskularizovaný nádor díky své nadměrné· expresi VEGF' (58.) . Je zajímavé, že v-gliomu C6 transdukovaném AdK3 zjevně nenastalo vytvoření vaskulární .sítě v nádorové hmotě pro podporu - rychlého a extenzivního růstu ‘(obr. 10) a toto, selhání mělo' za následek více než 80% inhibici růstu nádoru. Imunologické značení na vWF nádorových · řezů také odhalilo významnou redukci n.eoangiog.eneze v. nádorech ošetřených AdK3: dobře vytvořené cévy s vyzrálým lumen byly často pozorované u kontrolních nádorů G6, ale ne u gliomu C6 ošetřeného AdK3 (obr. 10). Tento pokles hustoty cév byl sdružen s 10 násobným nárůstem apoptózy- nádorových buněk a žádnou znatelnou změnou proliferačního . indexu nádorových buněk, pravděpodobně kvůli i) nedostatku endotelových parakrinnich faktorů, ii) redukci dodávky živin,' a iii) hypoxii spouštěné ap.optózóu nádorových buněk závislé na p53 (59, 60). V modelu karcinomu- prsu MDA-MB-231 jedna intratumorální injekce AdK3 podobně indukovala nápadnou inhibici nádorové angiogeneze a.růstu.

V průběhu této studie buňky C6 a MDA-MB-231 projevovaly· menší potenciál pro vznik nádorů, což- vyjadřovalo prodloužené, zpoždění buněk, infikovaných AdK3 do vyvinutí, viditelných r\ á v? r ? i ίττιτλΊ sn ť o p i liuuxv x u bs v·/ J-alLs*' x_ Cí x x Ur -x. · ' za použití . při j atelná

Bylo. ukázáno, že angiostatická terapierekombinantních adenovirů je experimentálně '-a/účinná. Možnost podávání, více než jednoho angiostetického faktoru by také mohla věst.k synergickému- účinku na zastavení růstu nádoru. Dá se také předpovídat, že ve spojení š' ' přístupem .'k · léčení pomočí cyčoťóxičkýčh. .látek. může.' být nový. přístup zejména účinný pro zlepšení.klinického výsledku u maligních nemocí.

, Předkládaný vynález není omezen na jednotlivá provedení uvedená . v· příkladech. Odborníkovi jsou na základě uvedeného popisu a obrázků zjevné, mnohé modifikace vynálezu.' ..T-yto modifikace' jsou’- také předmětem předkládaného' .vynálezu vymezeného následujícími patentovými, nároky.

Je třeba také uvést,, že všechny údaje týkající' se počtu baží nebo aminokyselin a molekulové hmotnosti nukleových . kyselin a polypetidů jsou přibližné a . jsou uváděny z popisných důvodů. .

Púčlikace, na které se odkazovalo vpředchozím, textu přihlášky jen čísly, jsou plně uvedeny'v následujícím seznamu publikací.

• · · · · · · · · · ···· • · - · · · ··· · ' -Seznam citované literatury ·’ ·’ i i Ϊ ’ “í

1) E. Bacharach, A. Itin and E. Késhet. In vivo pattems_;of expression of urokinase and its inhibitor PAI1 suggest a concerted role in regulating physiological angiogenesis. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89, 10686-10690 (1992).

2) P. R. M. Mignatti and Ď. B. Rifkin. Biology and biochemistry of proteinases in tumor invasion. Physiol. Rev. 73, 161-195. (1993).

3) S. Imren, D. B. Kohn, H. Shimada, L. Blavier and X. DeClerck. Overexpression of tissue inhibitor of metalloproteinases-2 by retroviral-mediated gene transfer in vivo inhibits tumor growth and invasion. Cancer Res. 56, 2891-2895 (1996).

4) M. Ploug, E. Ronne, N. Behrendt, A. L. Jensen and F. Blasi. Cellular receptor for urokinase plasminogen activator: carbo.xyl-terminal processing and membrane anchoring by glycosylphosphatidylinositol. J. Biol. Chem. 266, 1926-1933 (1991).

5) A. L. Roldan, Μ. V. Cubellis, Μ. T. Masucci, N. Behrendt, L. R. Lund, K..Dano, E: Appella and F. Blasi. Cloning and expression of the receptor for human urokinase plasminogen activator, a centrál ''molěculeiň cell surface/plásmin dependent proteoiysis. EMBO J. 9, 467-474 (1990). ........... ~

6) V. Ellis, N. Behrendt and K. Dano. Plasminogen activation by receptor-bound urokinase, a kinetic , study with cell-ašsociated and isolated receptor. J. Biol. Chem. 266, '12752-12758 (1991).

7) C. He, S. M. Wilhelm, A. P. Pentland, B. L. Marmer, G. A. Grant, A. Z. Eisen and G, I> Goldberg. Tissue cooperation in a proteolytic Cascade activating human interstitial collagenase. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86, 2632-2636 (1989).

8) A. Estreičher, J. Muhlhauser, J. L. Carpentier, L. Orci and J. D. Vassallí. The receptor for urokinase type plasminogen activator polarizes.expression of the protease to the leading edge of migráting monocytes and promotes degradatíon of enzyme inhibitor complexes. J. Cell Biol. 111; 783-792 (1990).

9) Ý. Wei, D. A. Waltz, N. Rao, R. J. Drummónd, S. Rosenberg and H. A. Chapman. Identification of the urokinase receptor-ás an adhesion receptor for vitronectin. J. Biol. Chem. 269, 32380-32388 (1994).

10) Y. Wei, M. Lukashev, D.I. Simon, S. C. Bodary, S. Rosenberg, Μ. V. Dóyle and H. A. Chapman. Regulaťion ofintegrin function by the urokinase receptor. Science 273, 1551-1555 (1996).

*

11) L. Náldini, L. Tamagnone, E. Vigna, M. Sachs, G. Hartmann, W. Birchmeier, Y. Daikuhara, H. F. B. Tsubouchi and P. M. Comoglio. Extracellular protedlytic cleavage by urokinase is required for actívation of hepatocyte growth factor/scatter factor. EMBO J. 11,4825-4833 (1992).

12) D. Rifkin, D. Moscatelli, J. Bizik, N. Quarto, F. Blei, P. Dennis, R. Flaumenhaft and P. Mignatti. . Growth factor control of extracellular proteolysis. Cell Differ. Dev, 32, 313-318 (1990).

13) M. Schmitt,F. Janicke and H. Graeff. Tumor-associated proteases. Fibrinolysis 6, 3-26 (1992).

14) C. Pyke, P. Kristensen, E. Ralfkiaer, J. Grondhal-Hansen, J. Eriksen, F.. Blasi and K. Dano. Urokinase-type plasminogen activator is expressed in stromal celíš and its receptor in cancer cells at invasive foci in human colon adenocarcinomas. Am. J. Pathol. 138, 1059-1067 (1991).

15) R. L. Shapiro, J. G. Duquette, D. F. Róses, I. Nunes, Μ. N. Harris, H. Kamino,'E. L.. Wilson and D.

B. Rifkin. Induction of pri-mary cutaneous melanocytic neoplasms in urokinase-type plasminogen , activator (uPA) deficient and wild-type mice: cellular blue Nevi invade but do not progréss to malignant •-melanoma m uPA-deficient animalš. Cancer·Res. 56,3597-3604 (1996). ·

16) D. Bělin, I. D. Vassalli, C. Combepine, F. Godeau, Y. Nagamine, E. Reich, Η. P. Kocher and R. M... Duvoisin. Cloning, nucleotide sequencing and expression of.cDNAs encoding mouše urokinase-type plasminogen activator. Eur. J. Biochem. 148, 225-232, (1985).

17) E: Appella, E. A. Robinson, S. J. Ullrich, Μ. P. Stoppelli, A. Corti, G. Cassani and F. Blasi. The receptor binding sequence of urokinase: a biological function for the growth factor module of proteases.

J. Biol. Chem. 262, 4437-4440 (1987); .. ’

18) V. Magdolen, P. Rettenberger, M. Koppitz, L. Goretski, H. Kessler, U.H.-Weidle, B. Konig, H. Graeff, M. Schmitt and O. Wilhelm. Systemic mutational analysis of the receptor-binding region of the human urokinase-type plasminogen activator. Eur. J. Biochem. 237, 743-751 (1996).

19) H. Lu, P. Yeh, J. D. Guilton, C. Mábilat, F. Desanlis, I. Maury, Y. Legrand, J. Soria and C. Soria. Blockage of the urokinase receptor on the cell surface: construction and characterization of a hybrid protein consisting of the N-terminal fragment of human urokinase and human albumin. FEBS Lett. 356, 56-59(1994).

• * ·· ·· · ·· ·· • · · · · · · · · · · • · ···«·» • · · *······ • · · · · ·

........... ** ·*

20) C. W. Crowley, R. L. Cohen, Β. K. Lucas, G. Liu, M, A. Shuman and A. D.

Levinson. Prevention of metastasis by inhibition of the urokinase receptor. Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 90,5021-5025 (1993).

21) H. Kobayashi, J. Gotoh, M. Fujie, H. Shinohara, N. Moniwa and T. Terao. Inhibition-of metastasis of Lewis lung carcinoma by a synthetic peptide within the growth factor-like domain of urokinase in an experimental and spontaneous metastasis modelInt.J. Cancer 57, 727-733 (1994).

22) H. Lu, C. Mabilat, P. Yeh, J. D. Guitton, H. Li, M. Pouchelet, D. Shoevaert,Y. Legrand, J. Soria and C. Soria. Blockage of urokinase receptor reduces in vitro the motility and deformability of endothelial cells. FEBS Lett. 380,21-24(1996). , .

. /

23) Η. Y. Min, L. V. Doyle, C. R. Vitt, C. L. Zandonella, J. R. Stratton-Tomas, M. A. Shuman and S. Rosenberg. Urokinase receptor antagonists inhibit angiogenesis and primary tumor growth in synaenic mice. Cancer.Res. 56, 2428-2433 (1996).

24) J. Foikman. Angiogenesis iri cancer, vascular, rheumatoid and other disease.Nature Medicine 1,2731. (1995). . <

25) L. D. Stratford-Perrieaudet, I. Makeh, M. Perricaudet and P. Briand. Widespread long-term gene transfer to mouše skeletal muscles and heart via an adenovirus vector. J. Clin. Invest. 90, 626-630 (1992).

26) B. Hirt. Selective extraction of polyoma DNA from infected mouše cells cultures. J. Mol. Biol. 26,

365-369 (1967). ' ..

27) F. L. Graham, J. Smiley, W. C. Russel and R. Naim. CharacteristicS of a human cell line transformed by DNA from human adenovirus type 5J. Gen. Virol. 36, 59-72 (1977).

28) N. Weidner, J. P. Semple and W. R. Welch. Tumor angiogenesis and metastasis-correlation in invasive breast carcinoma. N. Engl. J. Med. 324, 1-8 (1931).

• ·

29) J.-F. Dedieu,Έ. Viene, C. Torrent, C. Jullien, I. Mahfouz, J.-M. Caillaud, N.Aubailly, C. Orsini, J.M. Guillaume, P. Opolon, P. Delaěre, M. Perricaudet and P. Yeh.Long-term gene delivery intathe liver of immunocompetent mice with El/E4-defective adenoviruses. J. Virol. (1997).

30) T. J. Wickham, P. Mathias, D. A. Cheresh and G. R. Nemerow. Integrins-avb3 and avb5 promote intemalízation but not virus attachment. Cell 73, 309-319 (1993).

31) P. C. Brooks, A. Μ. P. Montgomery, M. Rosenfeíd, R. A. Reisfeld, T.-Hu, G. Klier and D. A. Cheresh. Integrin aVb3 antagonists promote tumor regression byinducing apoptosis of angiogenic blood vessels.Cell 79, 1157-1164 (1994).

32) M. 0'Reilly, L. Holmgren, Y. Shing, C. Chen, R. Rosenthal, M. Moses, W. Lané, Y. Cao, E. Sage and J. Folkman. Angiostatin: a novel angiogenesis inhibitor that mediates the suppression of meíastases by a Lewis lung carcinoma. Cell 79, 315-328 (1994).

33) T. P. D. Fan, R. Jaggarand R. Bicknelí. Controlling the vasculature: angiogenesis, anti-angiogenesis ' and vascular targeting of gene therapy. TIPS

16, 57-66 (1995).

34) L. Holmgren, M. S. 0'Reilly and J. Folkman. Dormancy of micrometastasis: balanced proliferation and .apoptosis in the presence of angiogenesis suppression. Nátuře Med. 1, 149-153 (1995).

35) H. F. Dvorak, J. A. Nagy, J. T. Dvorak and A. M, Dvorak. Identification and characterization of the blood vessels of solid tumors that are leaky to.circulating macromolecules. Am. J. Pathol. 133,.95-109 (1988). ' '

36) L. Liotta, J. Kléinerman and G. Saidel. Quantitative relationships of intravascular tumor cells, tumor vessels and pulmonary metastases following tumor implantaťion. Cancer Res. 34, 997-1004 (1974).

37) P. Yeh and M. Perricaudet, Advances in adenoviral vectors: from genetic , - engineering to their biology. FASEB J. 11:615-623 (i 997). 38) J. Folkman. What is the evidence that tumors are angiogenesis dependent. J. Nati. Cancer Inst. 82,

4-6(1990). -.' ··· • ·

39) D. Hanahan & J. Folkman, Pattems and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis. Cell 86, 353-364 (1996). <

40) A. Hoři. Suppression of solid tumor growth by immunoneutralizing monoclonal antibody against human basic fibroblast grouth factor. Cancer Res. 51,6180-6184 (1991).

41) K.J. Kim. Inhibition of vascular endothelial growth factor-induced artgiogenesis suppresses tumour growth in vivo. Nátuře 362, 841-844 (1993). .

42) M.O. 0'Reilly, T. Boehm, Y. Shing, N. Fukai, G. Vasios, W.S. Lané, E. Flynn, J,R. Birkhead, B.R., —Olsen, & J. Folkman. Endostatin: An Endogenous Inhibitor of Angiogenesis and tumor Growth.

Cell 88,277-285 (1997). ' , ^λ

43) C. Clapp, J.A. Martial, R.C. Guzman, F. Rentier-Delrue, & R.I. Weiner. The 16 kDa N-terminal fragment of human prolactin is a potent inhibitor of angi.ogenesis. Endočrinol. 133, 1292-1299 x (1993).

44) S.K. Gupta, T. Hassel, & J.P. Singh. A potent inhibitor of endothelial cell proliferation is generated by proteolytic cíeavage of the chemokine platelet factor 4. Proč. Nad. Acad. Sci. USA. 92, 77997803 (1995). . . . . . '

45) Z. Dong, R. Kumar, X. Yang, & I. Fidler. Macrophage-děrived metalloelastase iš řésponsiblé for the generation of angiostatin in Lewis Lung Carcinoma. Ce// 88, 801-810 (1997).

46) M. 0'Reilly, L. Holmgren, C. Chen, & J. Folkman. Angiostatin induces and sustains dormancy of human.primary tumors in míče: Nátuře Med. 2, 689-692 (1996).

47) Y. Cao, R.W. Ji, D. Davidson, J. Schaller, D. Marti, S. Sóhndel, S.G. McCance, M.S. 0'Reilly, M.

Llinas, & J. Folkman. Kringle domains of human angiostatin. J. Biol. Chem. 271,29461-29467 (1996). . 2 . . .

48) J.A. Roth & R.J. Chrisliano. Gene therapy for cancer: what háve we doně and where are we going. J. Nad. Cancer Inst. 88, 21-29(1991).

49) V. Trochon, C. Mabilat, P. Bertrand, Y. Legrand, F. Smadja-Joffe, C. Soria, B. Delpech & H. Lu. Evidence of involvement of CD44 in endothelial cell proliferation, migration and angiogenesis in vitro. Int. J. Cancer 66, 664-668 (1996).

»· ·· • ' ·· · • 9 9 · •99 999 ··· ··

50) M. Mirshahi, J. Soria, H.R. Lijnen, V. Fleury, O. Bertrand, LY. Drouet, J. Caen & C. Soria. A monoclonal antibody directed against an epitope in the NH2-terminal region ofnative human plasminogen iňduces a modification of its functional pmperňes. fíbrinolysis and Coagulation, in press (1997).

51) M.S. Pepper, R. Montesano, J.D. Vassalli & L. Orli. Chondrocytes inhibits endothelial sprout formation in vitro: evidence for involvement of a transforming growth factor β. J. cell. Physiol: 146, 170-179 (1991).

‘ 52) M. Mirshahi, J.C.S. Soria, R. Faivre, H. Lu, M. Courtney, C. Roitsch, D. Tripier & J.P. Caen. --Evaluation of the inhibition.by heparin and hirudin of coagulation activation by r-tPA induceď thrombolysis. 74, 1025-1030 (1989). - '

53) A. Skladanowski & A.K. Larsen. Expressíon of Wild-type p53 etoposide cytotoxicity in Μ1 myeloid leukemia cells by facilitated G2 to M transition: Impličations for gene therapy. Cancer Res. 57, S1S-S23 (1997).

54) B.K. Lee Sim, M.S. 0’Reilly, H. Liang, A.H. Fortier, W: He, J.W. Madsen, R. Lapcevich & C.A. Nacy. A recombinant. human angiostatin protein inhibits experimental primary and metastatic cancer. Cancer Res. 57, .1329-1334 (1997).

55) M.L. Hayes & F.J. Castellino. Carbohydrate of the. human plasminogen variant II. Structure of the asparagine-linked oligosaccharide unit. J. Biol. Chem. 254, 8772-8776 (1979).

: 56) F.M.Davis, T.Y. Tsao, S.K. Fowler & P.N. Rao. Monoclonal antibodies to mitotic cells. Proč. Nati. Acad. Sci. 80,2926-2930 (1983).

57) R.W. King, P.K. Jackson & M.W. Kirschner. Mitosis in transition. Cell 18, 563-571 (1994).

58) K.H. Plate, G. Breier, HA. Weich & W. Risau. Vascular endothelial growth factor is a potential tumor angiogenesis factor in humari gliomas in vivo. M?/ure. 359, 845-848 (1992).

59) J. Hamada, P.G. Cavanaugh, O. Lótan & G.L. Nicolson. Separate growth and migration factors for large-cell lymphoma cells secreted by microvascular endothelial ceiis derived irum target organs for metastasis. Br. J. Cancer 66, 349-354 (1992).

60) G.G. Graeber. Hypoxia-mediated selection of cells. with diminished apoptotic potential in solid tumors. Nátuře 379, 88-91 (1996).

Claims (20)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1,. Způsob inhibice růstu nádoru vyznačuj. ící se t i m, že'obsahuje” krok., kdy .se do nádoru zavede defektní adenovirový vektor,. který obsahuje gen kódující anti-angiogehní faktor operativně spojený se . sekvencí řídící expresi, které poskytuje expresi anti-angiogenního faktoru v buňkách nádoru.
2. 2. Způsob · podle nároku 1 v y z n á č u, j i c í s e t í m, že nádor- je plicní karcinom nebo karcinom prsu.
3. 3. Způsob podle nároku 1 vyznačuj ící s., e tím, že· anti-angiógenní faktor, obsahuje sekvenci aminokoncového fragmentu urókinázy mající doménu-podobnouEGF, a tp s výhradou, že faktor 'není urokináza.
4. 4. Způsob' podle nároku · 3- v y z n a č u-j í c í' se t . i m, že ant i - angio.genní faktor j.e - áminókóncový fragment urókinázy mající 'aminokyselinovou sekvenci urókinázy od .aminokyselinového zbytku . 1 · do aminokyselinového zbytku

   135. - ,·

   Způsob podle nároku 4 v y z n a č. u j í c í s e že urokináza je myší Urokináza. ~ t i m,

   Způsob podle-:nároku 4 v y.z na č ů j i c i' že urokináza je lidská urokináza.

   s e.

   c- i m,
5. 7. Způsob podle nároku l. v y z n a č u j i c i s e t i m, že anti-angiogenní· faktor je angiostatin.

   • · · · ·.

   • · · · · · « »· ·
6. 8. Způsob podle nároku 7 vyznačuj ící se tím, že angiostatin obsahuje smyčky 1 až 3.
7. 9. Způsob podle nároku 7 v y z n a č u j i c i se tím/ že angiostatin je aminokoncový fragment plasminogenu •(Pig) mající aminokyselinovou sekvenci plasminogenu od aminokyselinového zbytku - 1 do . aminokyselinového zbytku . 333. ' ·.··.·'
8. 10.. Způsob podle nároku 9 v y z n, a č u j i c i se že plasminogen je lidský.plasminogen.

   tím, li. Způsob inhibice růstu nádoru, nebo metastáz nádoru nebo vnese vektor, který·oo ť í.m, že obsahuje Ό S ahujé. gen obojího, v y. z n a č u. j i c i se krok, kdy se do nádoru kódující aminokoncový -fragment -urokiňázy' mající doménu podobnou EGF, a to s výhradou, že.gen nekóduje -urokinázu, přičemž gen je. -.operativně spojený se sekvencí řídící expresi,- která poskytuje expresi genu v buňkách nádoru. ..
9. 12.-Způsob podle nároku 11 v y ž n a č u j i c i' s e t i m, že aminokoncový fragment urokiňázy má aminokyselinovou sekvenci. urokiňázy od aminokyselinového aminokyselinového zbytku 135·. ' zbytku. 1 do
10. 13. Způsob podle nároku 12 vyznačující- se t i m, že urokináza je myší’ urokináza. '
11. 14. Způsob podle nároku 12 v y z n a č u j- i c i se tím, že urokináza je lidská urokináza.

    »· ·· • · · · · • · · • · · · · · ·' · · · · · · · · • · · ·
12. 15. Defektní adenovirový vektor,- který obsahuje gen kódující anti-angiogenní faktor operativně spojený se sekvencí řídící expresi.
13. 16. Virový vektor podle nároku 15, kde .anti-angiogenní faktor obsahuje .sekvenci nukleové kyseliny . aminokoncového fragmentu urokinázy mající doménu podobnou EGF, ' a to s výhradou, že faktor není. urokináza.
14. 17. Defektní -adenovirový vektor, který obsahuje gen kódující . aminokoncový .fragment urokinázy ..'mající '.doménu podobnou / EGF, a to s výhradou, že gen nekóduje urckinázu.

    .
15. 18. Virový vektor podle ňáro.ku 17, kde aminokoncový fragment .urokinázy má aminokyselinovou -sekvenci . urokinázy od aminokyselinového zbytku 1 do aminokyselinového zbytku 135. ( .
16. 19. Virový vektor' podle .nároku' 18, 'kde-' urokináza je - myší 'urokináza.
17. 20-, Virový vektor podle nároku '18, kde urokináza je' lidská urokináza. . ,
18. 21. Virový vektor podle nároku 15, kde anti-angiogenní faktor je angiostatin. ' . .
19. 22. Virový vektor podle, nároku .21, kde - angiostatin·· obsahuje . smyčky 1 až 3. · -
20. 23. Virový vektor podle nároku 21, kde angiostatin obsahuje, sekvenci nukleové .kyseliny aminokoncového fragmentu ·· ·· · ·· ·· ··

    9 9 9·· 99 9 9 · · · · • · · · · «··· • · 9-99 99 999 999

    9 9 9 9 9 9 ' 9

    9999 9999 '9 9 9 99 99 99 ' ' V'.

    ? '26.

    27.

    Z '28.

    29.

    <·»

    30.

    plasminogenu majícího aminokyselinovou- sekvenci plasminogenu - od aminokyselinového zbytku 1 do aminokyselinového zbytku.333. ' Virový vektor podle nároku 23, .kde plasminogen¹ je lidský plasminogen.

    Farmaceutický . přípravek 'vyznačující se t i m, že obsahuje .virový vektor podle .kteréhokoliv z nároků 15 až- 24 a farfliaceuticky-.přijatelný nosič.'

    Použití virového vektoru podle kteréhokoliv z nároků 15 až'24'pro výrobu léku inhibujícího. růst nádoru.

    Použití virového vektoru .podle kteréhokoliv z 'nároků 16 až' .20- pro ' výrobu léku- inhibujícího růst nádoru .nebo metastázy nádoru nebo obojí.

    Použití virového vektoru podle kteréhokoliv z nároků 21 až 24- . pro .výrobu - léku inhibujícího růst nádoru a indukujícího- apoptózu.

    Použití vektoru,' který obsahuje gen kódující aminokoncový fragment urokinázy mající doménu podobnou EGF, a to s výhradou, že gen nekóduje urokinázu, operativně spojenýse sekvencí řídící- expresi, která -poskytuje expresi anti-angiOgenního, faktoru, . pro výrobu léku, -inhibujícího růst nádoru nebo metastázy- nádoru nebo obojí.

    Použití podle nároku 26. až 29, kdy nádor je plicní karcinom nebo- karcinom prsu.