CZ35846U1 - Mikrofluidní komora pro efektivní detekci genotypů - Google Patents

Description

Mikrofluidní komora pro efektivní detekci genotypů

Oblast techniky

Technické řešení se týká efektivního genotypování DNA markérů pro jejich využití při racionalizaci farmakoterapií a životního stylu, konkrétně k vhodné volbě a úpravě dávkování léčiv, a pro nutriční a sportovní poradenství.

Dosavadní stav techniky

V současné době významně roste poptávka po rychlých a neinvazivních metodách, které mohou poskytnout rychlou informaci jak o okamžitém, tak dlouhodobém klinickém stavu lidského organismu, a zároveň návod pro dlouhodobé nastavení potřebných účinných farmakoterapií i celkového životního stylu. Jedním z cílů těchto prostředků je umožnit větší dostupnost individuální genomické informace, která se v průběhu života mění pouze v omezené míře, přičemž již při současném stavu poznání funkcí genů poskytuje cennou informaci. Jedním z využití individuální genomické informace je možnost u řady léčiv upravit volbu a dávku léčiva dle individuálních znalostí farmakogenů a dosáhnout tak účinnější léčby s významným omezením nežádoucích účinků, kritických stavů a nákladů zdravotních pojišťoven. Tomuto trendu předcházel technologický pokrok v oblasti molekulární biologie, expanze znalostí o funkcích genů i rostoucí poptávka veřejnosti po širším využití genetických znalostí. Nemalým příspěvkem byly rovněž ekonomické tlaky na účinné terapie, jako např. u COVID-19. Pozornost se zaměřila i na mnohá další onemocnění, která zůstávají méně monitorována, ať již v klinických laboratořích, nebo v domácím prostředí.

Péče o zdraví, ať již prostřednictvím zdravotnických zařízení nebo v domácím prostředí, tak čelí výzvě rychlého a účinného testování prognostických a terapeuticky významných nástrojů. Jedná se zejména o detekci biomarkerů rakovinových, kardiovaskulárních a imunitních onemocnění, diabetů, jakož i alergologických a mnoha dalších onemocnění. Zároveň roste poptávka u uživatelů; veřejnost má zájem o zužitkování individuální genetické informace k úpravě životního stylu, např. při poskytování nutričního, sportovního nebo i reprodukčního poradenství. Z výše uvedených důvodů se jeví jako žádoucí technické provedení potřebných nástrojů na multiplexní bázi, které nebudou za běžných laboratorních podmínek zatíženy pracností, relativně vysokými náklady a časem.

Ke genotypování se v současné době využívají následující metody: A) identifikace polymorfismu délky restrikčních fragmentů (RFLP - restriction fragment length polymorphism) genomové DNA, B) náhodná amplifikace polymorfní DNA (RAPD - Random Amplification of Polymorphic DNA) genomové DNA, C) detekce polymorfismu délky amplifikovaného fragmentu (AFLPD), D) polymerázová řetězová reakce (PCR), E) sekvenování DNA, využití sond pro alelově specifický oligonukleotid (ASO) a F) hybridizace na DNA čipu či magnetických kuličkách (magnetic beads).

K hybridizaci DNA fragmentů se využívají následující instrumentální zařízení: 1) automatické hybridizační přístroje s mikrofluidní podporou nebo chaotickým mícháním, 2) hybridizační pece spojené s rotačním zařízením a hybridizačními komorami, 3) původní vodní lázně s hybridizační komorou a temperovanou teplotou.

K přípravě samotné reakční komory existuje několik přístupů. U těch jednoduchých je vzorek zakápnut přímo na sklo s reakčním pufrem, přikryt krycím sklíčkem a zataven po obvodu. Je to jeden z původních postupů využívaných i v klasické mikroskopii, nicméně je pracný a značně chybový. Navíc je pod krycím sklíčkem výrazně zpomalena difúze, kteráje důležitým parametrem pro účinnou hybridizaci. Další platformou jsou hybridizační kazety, v nichž se též využívá krycího sklíčka; zde ale není nutno vzorek zatavovat.

- 1 CZ 35846 UI

Na druhé straně spektra jsou relativně precizní automatické systémy typu hybridizačních stanic s automatickým promýváním a mícháním s různými možnostmi nastavení reakčních podmínek. Tyto systémy, využívané zejména na klinických a výzkumných pracovištích s požadavkem na zpracování většího počtu vzorků, jsou zatíženy vysokou pořizovací cenou, která je až o dva řády vyšší, než je předpokládaná prodejní hodnota dále popsaného předmětu technického řešení.

3D tiskové technologie zaznamenaly zejména v poslední dekádě technologický posun v přesnosti a rozlišení a získávají tak na popularitě, jak v akademické, tak v podnikatelské sféře s mezioborovým využitím. Uplatňují se u jednoduchých výrobků až po sofistikované 3D modely nacházející využití ve strojírenství, medicíně i mikrofluidních systémech.

Užitný vzor si klade za úkol navrhnout mikrofluidní komoru pro efektivní detekci genotypů, která vytvoří příležitost pro provozování autonomních reakčních podmínek hybridizace za konkurenceschopných podmínek při významné úspoře financí a materiálu, nejméně při zachování požadavků na reakční podmínky. Navrhované řešení umožňuje přípravu zakázkových konkurenceschopných a soběstačných hybridizačních komor a zároveň vzhledem k využití technologie 3D tisku nabízí bezprecedentní flexibilitu při úpravách.

Podstata technického řešení

Mikrofluidní komora pro efektivní detekci genotypů se skládá ze dvou částí: jednak z ploché podložky, která má na horní straně plochou prohlubeň pro uložení mikropole tvořeného skleněným nebo plastovým substrátem s ukotvenými DNA sondami pro hledané DNA markéry, a která je opatřena čtveřicí otvorů pro průchod šroubů, a jednak z průhledného víka, na kterém jsou vytvořeny otvory pro vložení hadiček přivádějících resp. odvádějících kapalinu s analyty a reakčními pufiry a pro vložení teplotních senzorů, a které je opatřeno otvory souosými s otvory na podložce, přičemž na mikropoli jsou alokovány nejméně DNA sondy pro následující geny: CACNA1S, CFTR, CYP2B6, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, DPYD, RYR1.

Ve výhodném provedení komory je po obvodu podložky vytvořen žlábek k jejímu utěsnění proti víku.

Hadičky se mohou na koncích nad mikropolem větvit.

Podstatou technického řešení je tedy mikrofluidní reakční komora obsahující multimarkerové mikropole s ukotvenými molekulárními senzory kompatibilními k hybridizaci s analyty. Panel DNA sond ukotvený na mikropoli je navržen na základě termodynamických vlastností jednotlivých markérů jednonukleotidových polymorfismů (SNP), představující signifikantní genetické variace v populaci, v nukleotidech adeninu (A), thyminu 20 (T), cytosinu (C) nebo guaninu (G). Vzhledem k polymemímu charakteru markérů (úseky DNA), senzory či bio senzory organizované v mikropolích představují vhodnou platformu k jejich účinné detekci. Ve srovnání se současnými technologiemi, zatíženými zejména vysokou pořizovací hodnotou na instrumentaci, technické řešení přináší účinnou a ekonomickou aplikaci, kde hybridizace DNA fragmentů probíhá v popsané reakční komoře za pomoci vybraných detekčních systémů.

Objasnění výkresů

Technické řešení bude dále objasněno pomocí výkresů. Na obr. 1 až 4 jsou vyobrazeny obě části mikrofluidní komory pro efektivní detekci genotypů ve výhodném provedení, a to na obr. 1 je v axonometrickém promítání podložka pro uložení mikropole, na obr. 2 bokorys podložky podle obr. 1, na obr. 3 víko komory a na obr. 4 čelní pohled na víko podle obr. 3. Obr. 5 ukazuje počáteční řádky souboru DNA sond ve formátu GAU (GenePix Array List), charakterizující jejich umístění

-2 CZ 35846 UI na mikropoli. Obr. 6 představuje vizualizaci z tiskového SW (5 podpolí o 8 blocích) a na obr. 7 je ukázka náhledu skenu mikročipu po exportu do formátu jpg.

Příklady uskutečnění technického řešení

Mikrofluidní komora pro efektivní detekci genotypů se skládá ze dvou částí, které v pracovní poloze na sebe doléhají a jsou k sobě fixovány prostřednictvím šroubů. Jednak je to plochá podložka 1, která má na horní straně plochou prohlubeň 2 pro uložení mikropole 3 s ukotvenými DNA sondami na substrátu. Podložka 1 je opatřena čtveřicí otvorů 4 pro průchod šroubů. Druhou součástí komory je průhledné víko 5, na kterém jsou vytvořeny otvory 6, 7 pro vložení hadiček přivádějících, resp. odvádějících kapalinu s analyty a reakčními pufiry. Otvory 6, 7 mohou sloužit i ke vložení teplotních senzorů. Rovněž víko 5 je opatřeno otvory 8 pro průchod šroubů souosých s otvory 4 na podložce L Přitom na mikropoli 3 jsou alokovány molekulární senzory nejméně pro tyto geny: CACNA1S, CFTR, CYP2B6, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, DPYD, RYR1. Po obvodu podložky 1 je vytvořen žlábek k utěsnění podložky 1 proti víku 5. Hadičky přivádějící a odvádějící kapalinu s analyty a reakčními pufiry se na svých koncích nad mikropolem 3 větví 9.

Mikrofluidní komora byla vytvořena pomocí 3D tisku. Je určena k zapojení do mikrofluidního systému, přičemž je v ní integrováno mikropole o rozměrech 25 x 75 mm s ukotvenými sondami pro detekci biomarkerů, dále s kontrolními (pozitivními a negativními) a kalibračními funkcemi.

Komora funguje na jednoduchém principu uzavřené cirkulace. Cirkulace kapaliny se vzorkem napomáhá mobilitě analytů ke komplementárním sondám a v porovnání se systémy spoléhajícími pouze na difúzi, několikrát zvyšuje míru hybridizace, tedy výsledného detekčního signálu. Jako hnací sílu lze použit několik druhů pohonu, od jednoduché injekční stříkačky, po automatické pumpy, které postupně tlačí píst, nebo, při nízkých průsvitech hadiček, peristaltické pumpy. Technické provedení lze upravit dle konkrétních reakčních podmínek a způsobu využití mikrofluidní komory. Sestava je konstruována tak, aby reakční směs pufrů a analytů byla pod tlakem hnána přes komoru, která umožní účinný pohyb a hybridizaci nad senzorickou částí. V komoře tak dochází k vazbě jednotlivých analytů a komplementárních senzorů s následnou signalizací této vazby v závislosti na zvoleném detekčním systému. Zbylé nenavázané reagencie a rozpouštědla (pufry) odtékají druhým otvorem 6, resp. 7 a buďto jsou odvedeny mimo reakční systém do odpadu, nebo do opětovné cirkulace v závislosti na požadavcích senzorického systému. Senzorickou část je v současné době možné dimenzovat dle kapacity a přesnosti současných a budoucích robotických zařízení určených k depozici senzorů na substrát, při zachování fúnkčnosti celého systému.

Na mikropoli jsou navrženy komplementární sondy pro hledané DNA markéry a jejich ukotvení na substrát při využití vhodného detekčního systému (fluorescence, kolorimetrie ad.). Principem je interakce krátkých vybraných úseků DNA, které jsou imobilizovány na aktivované matrici, s jejich komplementárními např. fluorescenčně značenými DNA fragmenty z biologického vzorku charakterizující vybrané jednonukleotidové polymorfismy. Mikropole je tvořeno skleněným nebo plastovým podkladem, který je chemicky modifikován pro imobilizaci vybraných syntetických krátkých úseků sekvencí genů (komplementárních k vybraným loci genomu a kontrolních sekvencí).

Předpokládaná současná kapacita je několik set až desítek tisíc markérů. Dotčený senzorový podklad byl v daném případě vytvořen kontaktní microarray technologií použitím tiskového robota NanoPrint™ (Arrayit, USA) s použitím tiskové hlavy a pinů SMP3 (Telechem, USA). Parametry mikročipu a dále informace k identifikaci pozic jednotlivých sond na substrátu jsou obsaženy v tzv. GAU souboru.

Mikropole bylo vytvořeno nátiskovém robotu NanoPrint™ (Arrayit, USA) s užitím tiskové hlavy a pinů SMP3 (Telechem, USA). Geometrie rozmístění spotů na substrátu může být značně rozdílná

-3CZ 35846 UI v závislosti na počtu zvolených cílových sekvencí a vzorků. Pro výtisk DNA sond bylo použito rozmístění do 5 sub-polí 600 pm od sebe vzdálených po 8 blocích, přičemž v každém bloku jsou spoty 10 x 12 s mezerou 420 x 420 pm. Každý locus a kontroly jsou vytištěny v 5 opakováních v podobě spotu o průměru přibližně 100 pm (u velikosti spotu je možná variabilita). Výše zmíněné parametry mikropole a dále informace k identifikaci pozic jednotlivých sond na substrátu jsou obsaženy vtzv. GAL souboru - viz obr. 5 a 6. Popsaný profil umožňuje úpravy počtu sond a kontrol.

Po přípravě je mikropole podrobeno mikroskopické kontrole kvality a následně integrováno do reakční komory a podrobeno hybridizaci za optimalizovaných reakčních podmínek s cílenými analyty označenými fluorofory získanými úpravou biologického vzorku (2 až 2,5 pl/cm²). Vyhodnocení bylo provedeno na fluorescenčním skeneru GenePix® 4000B (Molecular Devices, USA) pouze v zeleném detekčním kanálu (λ = 532 nm).

DNA sondy pro výtisk byly zakoupeny u komerčních subjektů v modifikaci a v kvalitě nezbytné pro výtisk a jejich výsledná koncentrace byla upravena na 25 pM. Generovaná data je vhodné podrobit bioinformatickému vyhodnocení, zejména eliminaci nevyhovujících výsledků s použitím standardních kritérií SNR > 3 (z angl. Signal to Noise Ratio), kde parametr udává zda signál ve spotu je dostatečně silný oproti pozadí atzv. “flagů” (funkce sloužící k filtraci a třídění dle kvality spotů, např.: dobrý, špatný, chybný, nevyhovující).

Popsaná mikrofluidní komora v kombinaci s mikropolem s DNA sondami je využitelná pro genotypování a následnou racionalizaci farmakoterapií dle vybraných DNA markérů, tzv. farmakogenů, a diagnostice onemocnění. Při nálezu vybraných farmakogenů je žádoucí informovat lékaře, případně genetika a další odborníky, a konzultovat úpravu terapeutické dávky, případně změnu léčiva. K výběru genů a jejich variant byla použita databáze PHARMGKB [1] s následujícími parametry významu a průkaznosti funkce genů dle stávajících popsaných klinických nálezů:

> Úroveň průkaznosti (Level of Evidence) < 1A > Skóre min. 100 > Modifikátory úrovně (Level Modifiers) Tier 1 VIPs

Tab. 1. Ukázka aplikace pro farmakogenetiku zahrnující geny s vysokou klinickou signifikancí pro metabolismus léčiv

Gen	Léčiva - příklady	Kategorie	Fen oty p
CACNA1S	fluranová léčiva, halothane, succinylcholine	toxicita	maligní hypertermie
CFTR	ivacaftor	účinnost	cystická fíbróza
CYP2B6	efavirenz	toxicita, metabolismus, dávkování	HIV Infekce
CYP2C9	phenytoin, siponimod, flurbiprofen, ibuprofen, warfarin	toxicita, metabolismus, dávkování	epilepsie, nadměrná antikoagulace, krvácení kardiovaskulární choroby
CYP2C19	inhibitory protonové pumpy (omeprazole ad.), cyklická antidepresiva (deriváty triptilynu ad.), clopidogrel, sertraline, citalopram ad.	toxicita, metabolismus, účinnost	jícnový reflux, depresivní porucha; duševní poruchy, kardiovaskulární choroby

-4CZ 35846 UI

CYP2D6	enflurane, halothane, Isoflurane, methoxyflurane, Sevoflurane, succinylcholine, tamoxifen, tramadol ad.	toxicita, metabolismus, účinnost	ADHD, novotvary, duševní onemocnění, kardiovaskulární choroby
DPYD	fluorouracil	toxicita	novotvary
RYR1	fluranová léčiva, halothane, succinylcholine	toxicita	maligní hypertermie

Popsaná mikrofluidní komora umožňuje jednoduché a univerzální použití nejen v laboratořích s kvalifikovaným personálem, ale i běžnými uživateli. Rovněž umožňuje vlastní zhotovení např. 3D tiskem dle konkrétních požadavků reakčních a detekčních podmínek v daném místě a čase.

Průmyslová využitelnost

Mikrofluidní komora je primárně určena pro účinnou a nízkonákladovou hybridizaci biomarkerů 10 s bio senzory ukotvenými na plastovém či skleněném substrátu (DNA fragmenty, proteiny, protilátky apod.) organizovanými do mikropolí a dále účinné semi-automatické či automatické mikrofluidní promývání reakční komory. Z hlediska detekce úspěšné hybridizace lze dle požadavků konkrétního reakčního systému využít např. fluorescenční nebo kolorimetrické metody. Celý systém ovšem nabízí více variant využití, např. jako průtočný, případně vsádkový mikro15 reaktor k chemickým reakcím, kultivační mikro reaktor ke kultivaci a sledování mikroorganismů a další. Poměrně jednoduchý design umožňuje přípravu pomocí 3D tisku a úpravy designu pro specifické potřeby. V případě využití mikropole s DNA sondami je vhodným nástrojem k účinnému genotypování.

Claims (3)

1. NÁROKY NA OCHRANU

   1. Mikrofluidní komora pro efektivní detekci genotypů, vyznačující se tím, že se skládá ze dvou částí: jednak z ploché podložky (1), která má na horní straně plochou prohlubeň (2) pro uložení mikropole (3) tvořeného skleněným nebo plastovým substrátem s ukotvenými DNA sondami pro hledané DNA markéry, a která je opatřena čtveřicí otvorů (4) pro průchod šroubů, ajednak z průhledného víka (5), na kterém jsou vytvořeny otvory (6, 7) pro vložení hadiček přivádějících, resp. odvádějících, kapalinu s analyty a reakčními pufry a pro vložení teplotních senzorů, a které je opatřeno otvory (8) souosými s otvory (4) na podložce (1), přičemž na mikropoli (3) jsou alokovány nejméně DNA sondy pro následující geny: CACNA1S, CFTR, CYP2B6, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, DPYD, RYR1.
2. 2. Mikrofluidní komora podle nároku 1, vyznačující se tím, že po obvodu podložky (1) je vytvořen žlábek k jejímu utěsnění proti víku (5).
3. 3. Mikrofluidní komora podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že hadičky jsou na koncích nad mikropolem opatřeny větvením (9).