CZ33390U1

CZ33390U1 - Genový konstrukt pro produkci lipoproteinů a bakteriální display v E. coli, a jeho produkt

Info

Publication number: CZ33390U1
Application number: CZ201936729U
Authority: CZ
Inventors: Adam Norek; Lubomír Janda
Original assignee: Vu Veterinarniho Lekarstvi V V I
Priority date: 2019-10-09
Filing date: 2019-10-09
Publication date: 2019-11-19

Description

Předkládané technické řešení se týká genového konstruktu pro expresi proteinů s N-terminálním cysteinem modifikovaným mastnou kyselinou nebo kyselinami, a bakteriální display v Escherichia coli (E. coli), a aminokyselinového produktu tohoto genového konstruktu.

Dosavadní stav techniky

Lipoproteiny představují minoritní skupinu proteinů, které však díky schopnosti ukotvení v plasmatické membráně hrají velmi významnou roli v interakci buněk s okolním prostředím. Tato třída proteinů je tedy velmi zajímavá nejen z hlediska fyziologického, ale také z pohledu technologického. Lipidizace uděluje molekulám proteinů unikátní vlastnosti. Příkladem může být zvýšená imunogenicita způsobená připojením mastných kyselin z bakteriální cytoplazmatické membrány, která nachází uplatnění v přípravě vakcín. Lipidickou komponentu lze využít také při imobilizaci proteinů na hydrofobních částicích (např. lipozomy). Navíc, ve spojení s mechanismy zodpovídajícími za vystavení exprimovaných proteinů přímo na povrchu hostitelské bakterie lze expresní systém využít i pro vysokokapacitní screening knihoven proteinových mutantů.

Příprava lipoproteinů v množstvích uplatnitelných v biotechnologických aplikacích je ovšem náročný proces, a to díky rozsáhlé kaskádě podílející se na jejich syntéze. Ačkoliv existuje několik řešení samotné lipidizace (T. Jones a V. Tyron, Gene, 1995, 165(1), 145-146; Leiáo et al., Archives of Virology, 2000, 145(8), 1639-1657; Cullen at al., Plasmid, 2003, 49(1), 18-29), následná lokalizace na vnější membráně gram-negativních bakterií apřesmyk lipoproteinů na povrchu bakterie, je v současných produkčních systémech nedořešena. Jednotlivé kroky syntézy, procesování a transportu lipoproteinů jsou ovlivněny nejen signální sekvencí molekuly prelipoproteinu (Babu et al., Journal of Bacteriology, 2006, 188(8), 2761-2773), ale také zastoupením aminokyselin za modifikovaným cysteinem (retenční signál), které rozhodují o zadržení lipoproteinů ve vnitřní membráně nebo jeho transportu na membránu vnější. Významnou úlohu hraje i afinita prelipoproteinu k jedné ze tří kaskád zodpovědných za jeho přenesení z cytoplazmy na vnitřní membránu. Tyto transportní mechanismy zároveň určují, zda bude protein transportován ve sbaleném (aktivním stavu), či jako rozvolněný polypeptidový řetězec k jehož sbalení dochází až v průběhu lipidizace a průchodu přes periplazmu (Pathania et al., Nature Chemical Biology, 2009, 5(11), 849-856).

Z našich předcházejících experimentů vyplývá, že o výsledné lokalizaci lipoproteinů rozhoduje nejen signální sekvence a retenční signál, ale také povaha proteinové partikule jako takové (sekvenční i strukturní). Na těchto zjištěních je založeno i předkládané technické řešení, jehož lze využít pro produkci lipoproteinů na fuzním proteinovém nosiči a jejich vystavení na vnější plazmatické membráně E. coli.

Podstata technického řešení

Předkládané technické řešení se týká genového konstruktu pro expresi proteinů s N-terminálním cysteinem modifikovaným mastnou kyselinou nebo kyselinami. Vznikající modifikované proteiny, lipoproteiny, jsou následně transportovány z cytoplazmy expresních buněk E. coli na vnější plazmatickou membránu, kde jsou ukotveny pomocí mastných kyselin a vystaveny do vnějšího prostředí.

- 1 CZ 33390 U1

Předmětem technického řešení je genový konstrukt mající sekvenci

TCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGAAAGCGACCAAA CTGGTGCTGGGCGCGGTGATTCTGGGCAGCACCCTGCTGGCGGGCTGCGATGATAGC GGCAAAGATGGCAACGTCGACACCCTGACCGGTAAAACCATCACCCTGGAAGTTGA ACCGTCTGACACCATCGAAAACGTTAAAGCGAAAATCCAGGACAAAGAAGGTATCC CGCCGGACCAGCAGGAACTGATCTTCGCGGGTAAACAGCTGGAAGACGGTCGTACC CTGTCTGACTACAACATCCAGAAAGAATCTACCCTGCACCTGGTTCTGCATCTTGAGT CTGCCCACCACCACCACTCTGGTCACCACCACACCGGTCACCACCACCACTCTGGTT CTCACCACCACTCTGGTGCCGAAAACCTGTACTTCCAGTCTGGTTCTGGTGTCGACAC CATGGTTAGCGGTGGATCCGAGCTCAAGCTTCTCGAGTCTGCCCACCACCACCACTC TGGTCACCACCACACCGGTCACCACCACCACTCTGGTTCTCACCACCACTAATAGCT CGAGTAATAGGCGGCCGC (SEQ ID NO. 1) nebo sekvence obsahující synonymní mutace kódující stejné aminokyseliny.

Předmětem technického řešení je dále aminokyselinová sekvence kódovaná genovým konstruktem podle technického řešení:

SRNNFV*L*EGDIHMKATKLVLGAVILGSTLLAGCDDSGKDGNVDTLTGKTITLEVEPSD TIENVKAKIQDKEGIPPDQQELIFAGKQLEDGRTLSDYNIQKESTLHLVLHLESAHHHHSG HHHTGHHHHSGSHHHSGAENLYFQSGSGVDTMVSGGSELKLLESAHHHHSGHHHTGH HHHSGSHHH**LE**AA (SEQ ID NO. 2), kde hvězdičky značí stop-kodon.

Genový konstrukt podle předkládaného technického řešení lze začlenit do některého expresního vektoru s indukovatelným promotorem a selekčním genem (např. rezistenci na antibiotikum) a do něj vložit insert kódující libovolný protein, jehož nukleotidová sekvence je ve stejném čtecím rámci jako nukleotidová sekvence genového konstruktu. Takto exprimovaný protein ukotvený na vnější membráně lze využít při aktivitních nebo afinitních studiích, stejně tak lze protein izolovat pro další použití. Mezi vhodné expresní vektory umožňující vložení genového konstruktu patří například vektory z rodiny pET a pUbEx a od těchto odvozené. K usnadnění inkorporace genového konstruktu do expresního vektoru je konstrukt vybaven počátečním a koncovým místem rozpoznávaným restrikčními endonukleázami Xbal a Notl.

Genový konstrukt podle předkládaného technického řešení je tvořen kombinací nukleotidevých sekvencí kódujících aminokyselinovou sekvenci, v níž je fúzováno pět funkčních oblastí zajišťujících, v postupných krocích, tvorbu cílového proteinu modifikovaného mastnými kyselinami. Jednotlivé signální a funkční aminokyselinové sekvence zajišťují v následujících krocích 1.) hydrolýzu signální aminokyselinové sekvence; 2.) post translační modifikaci N-terminálního cysteinu diacylglycerolem na atomu síry a acylem na volné NH-skupině, přičemž acylové skupiny představují saturované mastné kyseliny sumárního vzorce CxIbxO?; 3.) transport modifikovaného proteinu k vnější plazmatické membráně; 4.) ukotvení modifikovaného proteinu do vnější plazmatické membrány a 5.) umožnění dostatečné konformační volnosti k zajištění přirozeného sbalení proteinu, přístupnosti z vnějšího prostředí a možnosti tvorby vyšších organizačních struktur (dimery, oligomery). Genový konstrukt je doplněn o histidinovou kotvu pro usnadnění izolace cílového proteinu. Konstrukt dále obsahuje aminokyselinovou sekvenci rozpoznávanou a hydro lyžovanou TEV proteázou, jež může být využita ke specifickému štěpení modifikovaného proteinu na povrchu E. coli a tím kjeho uvolněn do vnějšího prostředí. Genový konstrukt je upraven tak, aby do něj bylo možno vložit gen kódující protein, jež spolu s popisovaným konstruktem prochází po indukci stejnými kroky post translační modifikace

N-koncového cysteinu a následně je transportován a ukotven na vnější plazmatickou membránu E. coli.

-2cz 33390 U1

1. Signální sekvence

Signální sekvence je krátký peptid na N-koncové části translate váného genového konstruktu, díky které je při expresi udělena produkovanému proteinu afinita k Sec translokáze, jež tento protein přenáší z cytoplazmy gramnegativní bakterie E. coli přes vnitřní cytoplazmatickou membránu. Na vnější straně plazmatické membrány je tato sekvence rozpoznána kaskádou enzymů zajišťující její hydrolýzu doprovázenou acylací cysteinu následujícího za signální sekvencí (signální peptidáza, Lgt, Lsp, Lnt). Odštěpením signální sekvence zajišťuje signální peptidáza II.

> DNA kódující Signální sekvenci ATGAAAGCGACCAAACTGGTGCTGGGCGCGGTGATTCTGGGCAGCACCCTGCTGGC GGGC >Aminokyselinová sekvence Signální sekvence

MKATKLVLGAVILGSTLLAG

2. Retenční signál

Retenční signál je skupina tří aminokyselin, v translate váném genovém konstruktu, následujících za signální sekvencí, z nichž na první pozici je cystein, jež je v průběhu odštěpení signální sekvence modifikován diacylglycerolem a acylem za účasti lipoproteinové kaskády využívající enzymy (Lgt, Lsp, Lnt) přes meziprodukty apolipoprotein (diacyl lipoprotein) a hololipoprotein (triacyl lipoprotein). Následující dvě kladně nabité aminokyseliny zajišťují rozpoznání hololipoproteinu Lol kaskádou a její transport přes periplasmatický prostor.

> DNA kódující Retenční signál

TGCGATGAT >Aminokyselinová sekvence Retenčního signálu

CDD

3. Fúzní komponenty pro bakteriální display

Retenční signál je následován krátkou aminokyselinovou sekvencí odvozenou z přirozeného lipoproteinu (dále jen lipoproteinová aminokyselinová sekvence) spojenou s fúzním kulovitým proteinem, ubikvitinem. Lipoproteinová aminokyselinová sekvence uděluje translatovánému konstruktu hydrofilní povahu na N-terminálním konci a spolu s acylací N-koncového cysteinu umožňuje ukotvení exprimováného proteinu do vnější plazmatické membrány. Mimo ukotvení proteinu do vnější plazmatické membrány poskytuje dostatečnou míru konformační volnosti umožňující jednak oddálení vloženého proteinu od plazmatické membrány, čímž je zajištěna přístupnost z vnějšího prostředí a za druhé poskytuje dostatek flexibility umožňující exprimovanému proteinu zaujmout přirozenou konformaci, a to i v případě tvorby dimemích či oligomemích formací.

Fúzní ubikvitin zařazený za lipoproteinovou sekvenci slouží k odstínění hydrofobního prostředí na vnější plazmatické membráně a tím usnadňuje vystavení hydrofilních proteinů na povrchu E. coli. Zároveň je ubikvitin fúzován s histidinovou kotvou pro usnadnění purifikace.

>DNA kódující Lipoproteinovou aminokyselinovou sekvenci AGCGGCAAAGATGGCAACGTCGAC >Aminokyselinová sekvence Lipoproteinové aminokyselinové sekvence

SGKDGNVD cz 33390 U1 >DNA kódující Ubikvitin s histidinovou kotvou ACCCTGACCGGTAAAACCATCACCCTGGAAGTTGAACCGTCTGACACCATCGAAAAC GTTAAAGCGAAAATCCAGGACAAAGAAGGTATCCCGCCGGACCAGCAGGAACTGAT CTTCGCGGGTAAACAGCTGGAAGACGGTCGTACCCTGTCTGACTACAACATCCAGAA AGAATCTACCCTGCACCTGGTTCTGCATCTTGAGTCTGCCCACCACCACCACTCTGGT CACCACCACACCGGTCACCACCACCACTCTGGTTCTCACCACCACTCTGGTGCCGAA AACCTGTACTTCCAGTCTGGTTCTGGTGTCGACA >Aminokyselinová sekvence Ubikvitinu s histidinovou kotvou TLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQELIFAGKQLEDGRTLSDYNIQKESTLH LVLHLESAHHHHSGHHHTGHHHHSGSHHHSGAENLYFQSGSGVDT

4. Doplňkové funkční komponenty konstruktu

Konstrukt je koncipován tak, aby do něj bylo možno vložit libovolný úsek DNA kódující protein, jehož nukleotide vá sekvence je ohraničena restrikčními oblastmi rozpoznávanými endonukleázami Ncol, BamHI, Sací, HindlII a Xhol nebo jejich vhodnou kombinací, přičemž její čtecí rámec přímo navazuje na čtecí rámec konstruktu. Při použití Xhol v kombinaci s jinou restrikční endonukleázou dochází k odstranění C-koncové histidinové kotvy.

>DNA kódující úsek pro vložení insertu CCATGGTTAGCGGTGGATCCGAGCTCAAGCTTCTCGAG >Aminokyselinová sekvence úseku pro vložení insertu

MVSGGSELKLLE >DNA kódující C-koncovou histidinovou kotvu TCTGCCCACCACCACCACTCTGGTCACCACCACACCGGTCACCACCACCACTCTGGT TCTCACCACCACTAATAGCTCGAGTAATAGGCGGCCGC >Aminokyselinová sekvence C-koncové histidinové kotvy

SAHHHHSGHHHTGHHHHSGSHHH

Exprese lipoproteinů na vnější membráně E. coli umožňuje relativně snadný přístup k přirozeně posttranslačně modifikovaným molekulám. Navrhovaný genový konstrukt je založen na přítomnosti konzervované N-terminální části, která se skládá ze signální sekvence, krátké hydrofobní oblasti a partikule ubiquitinu. Signální sekvence zaručuje zpracování nascentního proteinu lipidizační kaskádou a na něj navazujícím transportní systém, jež je zodpovědný za přenesení molekuly přes periplasmatický prostor. Na signální sekvenci navazuje krátký hydrofobní úsek, umožňující stabilní ukotvení cílové molekuly v prostředí bivalentních molekul fosfolipidů. Poslední část konzervovaného úseku je tvořen konzervovanou kulovitou molekulou ubiquitinu, jejíž hlavní úlohou je odstínění cílového proteinu od hydrofobní oblasti vnější plazmatické membrány gram-negativní buněčné stěny. Tato kombinace uplatněná v genovém konstruktu vede k vnesení uniformních vlastností v klíčové oblasti v okolí plazmatické membrány a tím k možnosti volného zaměňování polypeptidikého řetězce na C-koncové oblasti fúzního proteinu. Díky tomu je navrhovaný systém teoreticky schopen produkovat libovolný protein v lipidizované podobě v případě, že jeho biochemické vlastnosti umožňují jeho expozici do vnějšího prostředí buňky.

Zvolená strategie exprese umožňuje produkci přirozených nebo umělých lipoproteinů na povrchu technologicky dobře zvládnutého hostitelského organismu. Expresní systém umožňuje kromě prvotního cíle, tedy exprese lipoproteinů (ať již s korpuskulámí komponentou, nebo v přirozené formě), také přípravu přirozeně nelipidizovaných proteinů s touto posttranslační modifikací a jejich exponování na povrchu E. coli. Tímto způsobem lze významně zvýšit jejich imunogenicitu ať již v podobě atenuovaných bakterií, nebo ve formě čistých izolovaných

-4CZ 33390 U1 proteinů s nízkým rizikem vzniku nových nepřirozených epitopů. V neposlední řadě lze genový konstrukt využít pro tzv. bakteriální display, tedy záměrnou expresi zkoumaných proteinů na povrchu živého pomnožujícího se hostitelského organismu (např. knihovny mutantních enzymů pro studium jejich biologické aktivity, vazebných molekul využitelných pro vysokokapacitní screening afinity k vybraným molekulám či antigenům a tak podobně).

Objasnění výkresů

Obrázek 1: SDS-PAGE buněk exprimujících GFP (vlevo), respektive OspC (uprostřed) z plasmidu pLipDis. Odpovídající proteiny jsou označeny šipkou, hmotnostní standard (MW) vpravo.

Obrázek 2: Porovnání výskytu mastných kyselin u proteinů exprimováných z pLipDis expresního vektoru určených pomocí plynové chromatografie a hmotnostní analýzy. Kontrola - proteiny bez lipoproteinové signální sekvence; Lipoproteiny - proteiny s lipoproteinovou signální sekvencí; Hydrolyzované lipoproteiny - lipoproteiny opracované lipázou.

Obrázek 3: Inverzní fotografie snímku z fluorescenčního mikroskopu. Černé body odpovídají přítomnosti fluorescenčního signálu. Vlevo negativní kontrola, vpravo buňky exprimující OspC protein z vektoru pLipDis.

Příklady uskutečnění technického řešení

1. Sestavení genového konstruktu

Genový konstrukt pro produkci lipoproteinů a bakteriální display byl sestaven in silico z jednotlivých výše popsaných funkčních celků organizovaných v podobě nukleotidevých kazet tak, aby jej bylo možno vložit do expresního vektoru dle výběru technikou restrikčního štěpení a ligace na komplementární místa. Jednotlivé funkční celky jsou odděleny dalšími restrikčními místy umožňující jejich modifikaci dle experimentálních potřeb. Navržená sekvence byla optimalizována pro expresi v E. coli (zastoupení kodonů), uměle syntetizována (jako SEQ ID NO. 1), a vložena do pomnožovacího plasmidu pUC57.

2. Vložení genového konstruktu do expresního vektoru pUbEx20

2.1 Příprava genového konstruktu pro vložení do expresního vektoru pUbEx20

Genový konstrukt obsažený v pomnožovacím plasmidu pUC57 byl izolován za pomocí štěpení restrikčními endonukleázami Xbal a Notl. 1 pg pomnožovacího plasmidu byl inkubován s 10 jednotkami každého enzymu po dobu 60 minut při teplotě 37 °C v prostředí pufiru CutSmart (NEB). Štěpená směs plazmidu a genového konstruktu byla separována na DNA gelové elektroforéze a fragment migrující do oblasti odpovídající velikosti genového konstruktu byl vyříznut z gelu a izolován pomocí izolační soupravy NucleoSpin Gel and PCR Clean up (Macherey-N agel).

2.2 Příprava expresního vektoru pUbEx20 pro vložení genového konstruktu

Expresní vektor pUbEx20 s indukovatelným promotorem a genem pro rezistenci ke kanamycinu byl linearizován pomocí štěpení restrikčními endonukleázami tak, aby byly vytvořeny kompatibilní kohézní konce umožňující vložení štěpeného genového konstruktu. Vektor byl opracován restrikčními endonukleázami Xbal aNotl. 1 pg expresního vektoru byl inkubován s 10 jednotkami každého enzymu po dobu 60 minut při teplotě 37 °C v prostředí pufiru CutSmart (NEB). Štěpená směs plazmidu byla separována na DNA gelové elektroforéze a fragment

-5 CZ 33390 U1 migrující do oblasti odpovídající velikosti linearizovaného vektoru (přibližně 5 000 bp) byl vyříznut z gelu a izolován pomocí izolační soupravy NucleoSpin Gel and PCR Clean up (Macherey-N agel).

2.3 Ligace a transformace

Izolované produkty restrikčního štěpení, vektor pUbEx20 a genový konstrukt byly ligovány pomocí T4 DNA ligázy v prostředí T4 ligačního pufru. Ke 100 ng plasmidové DNA bylo přidáno 10 ng izolovaného genového konstruktu a 10 jednotek T4 DNA ligázy. Ligační reakce probíhala při 16 °C 16 hodin. Následně byl produkt ligační reakce použit k transformaci chemokompetentních pomnožovacích buněk E. coli DH10B pomocí teplotního šoku (42 °C 60 sec) v prostředí KCM. K transformaci bylo použito 10 ng ligovaného plasmidu.

Transformované buňky byly vysety na ztužený LB agar s přídavkem 1% glukózy. Jako selekční marker bylo využito antibiotikum kanamycin. Pět náhodně vybraných kolonií bylo odebráno z každé transformace, buňky byly kultivovány a byla izolována plasmidová DNA (Plasmid isolation kit, Machery-Nagel). Přítomnost genového konstruktu, jeho správná orientace a intaktnost byly ověřeny pomocí sekvenování. Ověřený konstrukt byl anotován jako pLipDis.

Funkčnost technického řešení byla ověřena na dvou experimentálních příkladech. V prvním případě se jednalo o protein OspC (Outer Surface Protein C), jenž se v nativní formě exprimuje jako dimemí lipoprotein na povrchu bakterie Borreliella a jeho biochemické vlastnosti umožňují expozici do vnějšího prostředí. Ve druhém případě se jednalo o zelený fluorescenční protein (GFP), jenž je běžně exprimován v cytoplazmě jako intracelulámí protein bez posttranslačních modifikací.

3. Úprava genů kódujících OspC a GFP

3.1 Úprava OspC genu

Gen pro OspC byl modifikován tak, aby vyhovoval experimentálnímu ověření funkčnosti genového konstruktu inkorporovaného do expresního vektoru pLipDis. Úpravy zahrnovaly odstranění přirozené schopnosti procházet lipidizační kaskádou (OspC signální sekvence pro signální peptidázu II, N-koncového cysteinu, retenčního signálu včetně prvních 19 aminokyselin zralého nativního OspC). Takto modifikovaný gen byl doplněn o nukleotidové sekvence odpovídající restrikčním místům pro Ncol a BamHI, kompatibilními s úsekem pro vložení insertu.

>DNA kódující sekvence modifikovaného OspC

CCATGGAGGCATCTACTAATCCTGATGAGTCTGCGAAAGGACCTAATCTTACAGAAA TAAGCAAAAAAATTACAGATTCCAATGCAGTTGTACTAGCTGTGAAAGAAGTTGAG GCTTTGCTTTCATCTATAGATGAACTTGCTAAAACTATTGGTAAAAAAATAGAGGCA AATGGTTTGGGTAACGAAGCGGATAAAAACGGATCATTATTAGCAGGAGCCTATGC AATATCAACCCTAATAAAACAAAAATTAGATGGATTGAAAGGTCTAGA AGGATTAAATAAAGAAATTGCGGAGGCCAAGAAATGTTCCGAAGCATTTACTAAAA AGCTACAAGATAGTAACGCAGATCTTGGAAAACGTAATGCTACTGATGCTGATTCAA AAGAAGCAATTTTGAAAACAAATGGGACTAAAACTAAGGGTGCTAAAGAACTTGAA GAGTTGTTTAAATCAGTAGAAAGCTTGTCAAAAGCAGCTAAAGAAGCATTAAGTAAT TCAGTTAAAGAGCTTACAAGCCCTGTTGTAGCAGAAAGTCCAAAAAAACCTTAAGG ATCC (SEQ ID NO. 3) >Aminokyselinová sekvence modifikovaného OspC

MEASTNPDESAKGPNLTEISKKITDSNAVVLAVKEVEALLSSIDELAKTIGKKIEANGLGN EADKNGSLLAGAYAISTLIKQKLDGLKGLEGLNKEIAEAKKCSEAFTKKLQDSNADLGK

-6cz 33390 U1

RNATDADSKEAILKTNGTKTKGAKELEELFKSVESLSKAAKEALSNSVKELTSPVVAESP KKP (SEQ ID NO. 4)

3.2 Úprava genu kódujícího GFP

Pro účely ověření funkčnosti pLipDis expresního vektoru byl gen pro zelený fluorescenční protein ponechán v nezměněném stavu, pouze 3‘- a5‘- konce kódující DNA byly doplněny o kompatibilní restrikční místa Ncol a BamHI umožňující začlenění do úseku pro vložení insertu genového konstruktu.

>DNA kódující sekvence modifikovaného GFP CCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTTACCGGCGTGGTTCCGATTCTGGTGGAGC TGGACGGCGATGTTAATGGTCATAAGTTTAGCGTGAGCGGCGAGGGCGAAGGTGAC GCGACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAATTCATCTGCACCACCGGTAAACTGCCGGTG CCGTGGCCGACCCTGGTTACCACCCTGACCTACGGCGTTCAGTGCTTTAGCCGTTATC CGGACCACATGAAGCAACACGATTTCTTTAAAAGCGCGATGCCGGAGGGCTACGTG CAGGAACGTACCATCTTCTTTAAGGACGATGGTAACTATAAAACCCGTGCGGAAGTG AAGTTCGAAGGCGACACCCTGGTTAACCGTATCGAGCTGAAGGGTATTGACTTTAAA GAAGATGGCAACATTCTGGGTCACAAGCTGGAGTACAACTATAACAGCCACAACGT GTATATCATGGCGGATAAGCAGAAAAACGGCATTAAGGTTAACTTCAAAATCCGTCA CAACATTGAAGACGGTAGCGTGCAACTGGCGGATCACTACCAGCAAAACACCCCGA TTGGCGACGGTCCGGTTCTGCTGCCGGATAACCACTATCTGAGCACCCAAAGCGCGC TGAGCAAGGACCCGAACGAGAAACGTGATCAC

ATGGTGCTGCTGGAATTTGTTACCGCGGCGGGCATCACCCTGGGCATGGACGAAC TGTATAAGGGATCC (SEQ ID NO. 5) >Aminokyselinová sekvence modifikovaného GFP

MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWP TLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEG DTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSV QLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDE LYKGS (SEQ ID NO. 6)

4. Klonování OspC a GFP do expresního vektoru pLipDis

Expresní vektor pLipDis a modifikované geny pro proteiny OspC a GFP byly podrobeny štěpení restrikčními endonukleázami a byly separovány pomocí DNA agarózové elektroforézy. Odpovídající hydrolyzované úseky DNA byly vyříznuty z gelu a izolovány s využitím izolační soupravy NucleoSpin Gel and PGR Clean up (Macherey-Nagel). 100 ng izolovaného linearize váného vektoru pLipDis bylo smícháno s 10 ng modifikovaného OspC nebo GFP a ligovány pomocí T4 DNA ligázy 12 hodin při 16 °C.

5. Transformace pLipDis OspC a pLipDis GFP do pomnožovacích buněk

Produkty ligační reakce OspC s pLipDis a GFP s pLipDis byly použity k transformaci chemokompetentních pomnožovacích buněk E. coli DH10B pomocí teplotního šoku (42 °C, 60 sec) v prostředí KCM. K transformaci bylo použito 10 ng ligovaného plasmidu.

Transformované buňky byly vysety na ztužený LB agar s přídavkem 1% glukózy. Jako selekční marker bylo využito antibiotikum kanamycin. Pět náhodně vybraných kolonií bylo odebráno z každé transformace, buňky byly kultivovány a byla izolována plasmidová DNA (Plasmid isolation kit, Machery-Nagel). Přítomnost odpovídajících insertů OspC, respektive GFP, byla ověřena sekvenací.

>DNA kódující sekvence OspC v expresním vektoru pLipDis

-7 CZ 33390 U1

ATGAAAGCGACCAAACTGGTGCTGGGCGCGGTGATTCTGGGCAGCACCCTGCTGGC GGGCTGCGATGATAGCGGCAAAGATGGCAACGTCGACACCCTGACCGGTAAAACCA TCACCCTGGAAGTTGAACCGTCTGACACCATCGAAAACGTTAAAGCGAAAATCCAG GACAAAGAAGGTATCCCGCCGGACCAGCAGGAACTGATCTTCGCGGGT

AAACAGCTGGAAGACGGTCGTACCCTGTCTGACTACAACATCCAGAAAGAATCTACC CTGCACCTGGTTCTGCATCTTGAGTCTGCCCACCACCACCACTCTGGTCACCACCACA CCGGTCACCACCACCACTCTGGTTCTCACCACCACTCTGGTGCCGAAAACCTGTACTT CCAGTCTGGTTCTGGTGTCGACACCATGGAGGCATCTACTAATCCTGATGAGTCTGC GAAAGGACCTAATCTTACAGAAATAAGCAAAAAAATTACAGATTCCAATGCAGTTG TACTAGCTGTGAAAGAAGTTGAGGCTTTGCTTTCATCTATAGATGAACTTGCTAAAA CTATTGGTAAAAAAATAGAGGCAAATGGTTTGGGTAACGAAGCGGATAAAAACGGA TCATTATTAGCAGGAGCCTATGCAATATCAACCCTAATAAAACAAAAATTAGATGGA TTGAAAGGTCTAGAAGGATTAAATAAAGAAATTGCGGAGGCCAAGAAATGTTCCGA

AGCATTTACTAAAAAGCTACAAGATAGTAACGCAGATCTTGGAAAACGTAATGCTAC TGATGCTGATTCAAAAGAAGCAATTTTGAAAACAAATGGGACTAAAACTAAGGGTG CTAAAGAACTTGAAGAGTTGTTTAAATCAGTAGAAAGCTTGTCAAAAGCAGCTAAA GAAGCATTAAGTAATTCAGTTAAAGAGCTTACAAGCCCTGTTGTAGCAGAAAGTCCA AAAAAACCTTAAGGATCCGAGCTCAAGCTTCTCGAGTCTGCCCACCACCACCACTCT GGTCACCACCACACCGGTCACCACCACCACTCTGGTTCTCACCACCACTAATAGCTC GAG (SEQ ID NO. 7) >DNA kódující sekvence GFP v expresním vektoru pLipDis

ATGAAAGCGACCAAACTGGTGCTGGGCGCGGTGATTCTGGGCAGCACCCTGCTGGC GGGCTGCGATGATAGCGGCAAAGATGGCAACGTCGACACCCTGACCGGTAAAACCA TCACCCTGGAAGTTGAACCGTCTGACACCATCGAAAACGTTAAAGCGAAAATCCAG GACAAAGAAGGTATCCCGCCGGACCAGCAGGAACTGATCTTCGCGGGTAAACAGCT GGAAGACGGTCGTACCCTGTCTGACTACAACATCCAGAAAGAATCTACCCTGCACCT GGTTCTGCATCTTGAGTCTGCCCACCACCACCACTCTGGTCACCACCACACCGGTCA CCACCACCACTCTGGTTCTCACCACCACTCTGGTGCCGAAAACCTGTACTTCCAGTCT GGTTCTGGTGTCGACACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGT GCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCG GCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACC ACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTG CAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCC ATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTAC AAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCT GAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGG

CAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCAT GGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCG AGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGAC GGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAA GACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGG GATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGGGATCCGAGCTCAAGCTTCTCGAGTC TGCCCACCACCACCACTCTGGTCACCACCACACCGGTCACCACCACCACTCTGGTTC TCACCACCACTAATAGCTCGAG (SEQ ID NO. 8)

6. Transformace do expresních buněk

Plasmidy, u nichž byla potvrzena přítomnost genu OspC (pLipDis_OspC), respektive GFP (pLipDis_GFP), byly použity ke transformaci expresních buněk E. coli BL21 RILP. 50 ng plasmidové DNA bylo smícháno s 50 μΐ kompetentních buněk, které byly transformovány teplotním šokem (42 °C, 60 s) ve vodní lázni. Transformované buňky byly vysety na kultivační plotny se ztuženým LB agarem, doplněným o 1% glukózu a kanamycin 250 pg/ml a kultivovány 16 hodin při 37 °C. Z narostlých kolonií bylo náhodně vybráno 15, kterými bylo inokulováno 100 ml LB média s kanamycinem (250 pg/ml) a 1% glukózou v 500 ml Erlenmayerových

-8cz 33390 U1 baňkách. Inokulovaná média byla kultivována při 37 °C, 180 otáčkách za minutu. Po 12 hodinách byly narostlé kultury centrifůgovány (4 000 g/4 °C/15 min), pelety byly rozsuspendovány v 10% glycerolu a zamraženy při -80 °C v 500 μΐ alikvotech označených jako E. coli BL21 RIPL pLipDis OspC, respektive E. coli BL21 RIPL pLipDis GFP.

7. Exprese proteinů OspC a GFP

500 ml autoindukčního LB média (složení: 10 g Tryptonu; 5 g Kvasničního extraktu; 3,3 g síranu amonného; 50 mM fosfátový pufir pH6,7; 0,5 g glukózy; 2g Laktózy na 1 litr média) bylo inokulováno 500 μΐ zamražené bakteriální suspenze E. coli BL21 RIPL pLipDis OspC, respektive E. coli BL21 RIPL pLipDis GFP. Kultura byla inkubována při 22 °C/180 otáčkách za minutu po dobu 18 hodin. Úspěšná indukce byla ověřena pro oba konstrukty pomocí SDS elektroforézy na akrylamidovém gelu (Obrázek 1) a MS analýzou. OspC pozitivní identifikace se skóre 4944,12, identifikován na 38 peptidů s pokrytím sekvence 62,82 %. GFP byl potvrzen pozitivní identifikací se skóre 629,53, identifikován na 21 peptidů s pokrytím sekvence 76,89 %. Oba proteiny byly identifikovány na hladině hodnoty FDR 0,01.

8. Ověření lipidizace OspC a GFP

Lipidizace purifikovaných proteinů OspC a GFP exprimovaných z expresního vektoru pLipDis nesoucího genový konstrukt byla ověřena pomocí analýzy mastných kyselin metodou hmotnostní spektrometrie. Indukované proteiny OspC a GFP byly izolovány na Ni-NTA koloně a dočištěny s využitím gelové filtrace. K odmytí nespecificky navázaných lipidů byla použita dialýza s faktorem ředění 1:1000. Stejným postupem byl opracován kontrolní OspC protein bez lipoproteinové signální sekvence a retenčního signálu. Výsledek analýzy potvrdil významně vyšší přítomnost nesaturovaných mastných kyselin ve vzorcích exprimovaných z pLipDis expresního vektoru (Obrázek 2). Redukce zastoupení mastných kyselin po opracování lipoproteinu lipázou (hydrolýza vazby diacylglycerolu na N-koncovém cysteinu) prokázala, že detekované mastné kyseliny jsou na lipidizovaný protein vázány kovalentně.

9. Ověření povrchové lokalizace exprimovaného OspC a GFP

Lokalizace proteinů OspC exprimovaných z vektoru pLipDis obsahující genový konstrukt byla ověřena pomocí imunofluorescenční detekce a fluorescenční mikroskopie. Indukované buňky byly zafixovány na podložním skle, blokovány v 3% roztoku bovinního sérového albuminu v PBS (60 min). Blokované vzorky byly následně inkubovány s monoklonální protilátkou vázající OspC protein v roztoku 1% bovinního sérového albuminu (60 min). K detekci specifické vazby byla použita sekundární anti-myší protilátka nesoucí zelenou fluorescenční značku. Jako negativní kontrola byly použity buňky exprimující OspC protein bez lipoproteinové signální sekvence.

-9cz 33390 U1

SE-QUEKSE LISTING

-ΙΐΟ-' *'<usmv ústav veterinárnlLo Lěx.ařstvi, v. v. i.

<12í>> Gancvý koiistrukt pxo produkci lipoprcteluu a feaktariálnx display v .£. coli, a jeho produkt <138> F <!€£» 3 <17S> Psterstlu version 3-5

-e218> i tZlis· SS7 <22 2> 3V“ <213> artificial <228* <2Z3> geassý korsatruit c«S-8> 1 tctagaaata attttgttta actt-teagas gga.-gatat·2:· atatgaasgc gaecaaact.g £S gSgctgggcg cggtgettct gggcagcacc ctgctggcgg gctgcg-atga tagcggcsaa 128 gatggcaacg scgícaccct gaccggtaas accaEcaccc tggsa-gttga accgtctgac 138 aceatasaaa a-cgtt.saagc gassaeecag gacasa-gaag gtatcccgec g-g=ccsg-zag 248 gs.actgatct t-cgcg-ggtaa eesgct.gg=.a gacggtcgta. ccctgtctgs ct.aesa-as.tc 3SS cagaaagaat ctaccetgca cctggtt.ctg catcttgagt. ctgcecaeca ccac'cac-cet 3£S ggtcs.cca.cc acaccggtca ccaccaec-ac tctggttcte sccaecactc tggtgccgaa 4.ΐδ ascctgtáet tceagtctgg ttctggtgt.c gacsceatgg -ttagcgrgtgg atce-gagctc 45δ aagcttcteg agtctgecea essccsccas tctggtcacc sesaeacsgg tcaccsccac S48 cs.ctctggtt cSesccacea ctsats.gcte gagtaatagg cggccgc E-S7 <21δ> 2 <211-* lii <21Ž> 5ST <213> artificial <22δ>

<223> produkt- g-en-ovůho konstruktu <4S8> 2

Sei 1.

Arg

Ast:

1st

2h-e 5

Val

Leu

Glu

Sly

Lap 18

lie

His

Het

LV£

Ais 15

Thr

Lya

Leu

Vsi

Les 28

Giy

Ala

Val

Lie

Leu 25

Gly

Ser

Tfcr

Leu

Leu SĎ

Ale

Cys

žsp

Asp 35

Ser

Siy

Lys

Ssp

Gly 48

Lat.

Val

.Asp

Tři-

Leu 45

Thr

GLy

Lya:

Thr

lie 5-3

T.hr

Les

\r-L Lj

Val

:2-14 5S

Fr-o

Ser

J.SB

T?s.r

lie £8

Glu

S.sn

Val

L'^2:

- 10cz 33390 U1

Ala «5

Lys

lie

Gis .P.sp

ly.a 70

Gin

Giy

Lie

Pro

Pra Asp 75

Gin

G1.K

Glii

Less 50

lie

Phe

Ala

Gly

Lys

Gin

Len

ÍjXU

Asp

Giy

Arg

Thr

Len

Ser

Asp

Tyr

85

SO

S5

Aan

lie

Glr.

Lys

GLu

Ser

Ihr

Len

His

Len.

Val

Lesí

His

Lea

Gin.

Ser

ISO

1SS

110

Ala

His

Ser

Gly

His

™hr

Gly

His

Hi s

US

125

Ser

Gly

Ser

His

Ser

Gly

Ala

G1 n

Asn

Les

Tyr

Phs

is.l·

Ser

132

135

140

Gly

Ssr

Gly

?al

Asp

Thr

Jíst

Val

Ser

Gly

Sit

Se r

Gm

Les

Lys

Len

14.5

1Ϊ0

155

150

Lea

Gin

Ser

Ala

His

Ser

Giy

His

Thr

Giy

HÍ:S

1SS

170

175

His

Hi a

His

Ser

Gly

Ser

His

Les

GL·;.

Ala

130

1SS

<211> 5SQ <212> EÍTS.

<213> artificial <22 S>

<22 S> sekvence vkládaného OspC <ΐΰ©> 3 ccatggaggc g-te » sa.aaa t tttcstctat gtascgaagc taesBoaaa ccaagaastg sscgtaatgc. cteagggtge ctasagaagc ;= as, aas. a ::

asctactaat Sacagattcc agatgaactt ggataaaaac attegs.tg.ga tt.ccgaagca tsetgatgcr taaagaaett attaagtaat ttaaggatcc cctgat-gagt satgcagttg gctaaaacta ggst.cs ttst ttgaaaggtť t-ttact-aasa gattceassg ga&g agttgt. tcsgttaasg ctgcgaaagg tactegcigt ttggtasaaa tagcaggagc tagseggattagctaeaaga aagcaatt-ct t.t as atca.gt sgcttacaag

BECSSBtOTt gaaagaagtt aatagaggca ctatgcsata, aaata.a.agaa tagtaacgca. gaa==c=aat agaaagcttg cccSgttgta.

acagsaat-aa gaggctttgc astggttt-gg tcaaccctas atrgcggagg gatcttggaa gggs.cts.aas teaaaagcag ·;: a a set:

S·

S

240

300

350

420

480:

540

SĚO <220> 4 <ΐ:11> 183 <2;12> PST <213> artificial

- 11 CZ 33390 U1

<22 3> s s kvsnce vkl s.d an-eh-s· GE?

ecat.g§-£.gsg· caa-§g^sgs-§ gag-zt.gtit’t.a ccgg^gtggx acggcgavgt t.asX-g>jt.cs.t; sag^t.^sgcg: xga^ggcgs. gřggcgaaggc gaea-cgac^t acggcss^cC ^acc-ct-gaas. ttcatctgca ecacc-crgr-as acT.gccggtg cos't-g^ccga

12cz 33390 U1 ooctygrtar ageaaoaega -ntttaagga aes ag ctgga aog-rc 'att.aa eggatoact a aetatetgag tgctgctgga gatce caocot-gacc metttasa c;: atggt a = :2:.::7=-3:¾ gsacaectst gg 11- aact t-c ecagcsasac :ϊ·:·: cs a sgc at t-Ěgtta c c ttecggcgtsc agcgcgaPge Estasssece aagggtattg sacagccacs aaaatccgtc sccecgatíg gegetgagea gcggcgggca

B-gtgcttt-ag cggagggcta gtgugga agt. actttaBaga s.cgtgtatat scaacett-ga gcgacggf-cc sggaeecgaa tcaeoOt-ggg rcgttato-tg cg&gcaggaa gaagttcgaa s^atggcaac catggcggat agacggtagc gp—t etgetg egagaaaegt cat-ggacgaa.

gaccacatgs cgtaccasct ggegacae:: aSt-ctgggtc aagcsgaaaa gt-gcaact-gg ccggstaaec gs.teseatgg ctgtat-aagg

S

3£S

42S

4SS e

SOS

Sž5

S '725 <21S> δ <211> 241 <212> PST <213> artificial <22S>

<223> sekvence vkládaného GFP <4G3> £

Sáet i

Vai Ser

L.y =

GLy 5

Siu Gli.!

Leu Phe

Tňr 1®

Sly

Va.l

Vai

Pro

Lie is

Leu

Val

Git.

Leu.

Asp

Giy

Asp

Vai

Asu

Sly

His

Lys

i'Le

Ser

Vai

Ser

Gly

20

25

57

•52 y

i»xu

uly

Asp

Ala

Thr

Tyr

SI y

Lys;

Leu

Thr

Leu

Lys

She

Lie

33

43

4S

€ya

Thr

Sly

Lys

Lea

Pre

Vai

Pro

Irp

Pro

Tiir

Leu

Vai

Tňr

Thr

5ϋ

55

£5

Leu

Thr

Tyr

Sly

Vai

£in

Cya

Phe

Ser

Arg

Tyr

Pro

Asp

His

Mat.

Lys

SE-

'73

75

SO

Gin

Kis

Asp.

She

Lys

Set

Ala

Ke-

Pi·._'

Glu

siy

Tyr

Vai

Sirs.

Glu

85

93

55

.Arg

Thr

lie

Phe

she

Lys

Asp

Sly

Ζ3Ώ

Tyr

Lys

Thr

Arg

Ala

>S1 u

1G3

IS*

113

Val

Lys

She

!VS

Sly

Asp

Thr

Leu

Vai

Asti

Arg

Ila

Siu

L-eu

Lys

Gly

115

123

12 5

lie

Asp

Ehs

Lys

Sin

A-P

Sly

As.-;

lie

Lea

GLy

His

Lya

Leu

Gits

Tyr

130

135

14 0

Asn

Tyr

Aas

Ser

Hie

Asn

Vai

Tyr

lie

Set,

Ala

Asp

Lye

Sis

Lys

Ass

- 13CZ 33390 U1

Γ’-ί fí>.

14cz 33390 U1

eett&agrgat	csga^sts&a	gattetegsg	tctgfeeaec	SCC&CCžCtC	tggteaeeae	i jytc'
CBcaecggte	sccsccscea	etc ^_g.g !» tc	•zaceaeeact	a-st a g e t e g· a	9*	1&7 Σ
<21δ> 8 <211> 123S <22Ž> DÍSA <213> artificial
<22δ> <22S> seJcve&CB GFP v	espreanírs vektarsi
a at-gasagcga	ccs.aactggt·	gctgggcgeg	gtgattetgg	gcageaccct	getggeggge	so
tgcgstgrsts	gcggcaaagB	t^g-caacgtc:	gstaccctga	eoggtassac	estcscectg	12S
gaagttgasE	cgtctgacac	estersasae	gttaaagega	aaateesgga	csas.ga.sggt:	2SS
at-ceegeegg·	2:=jc=;§=	ectgatcttc	gcgggtaaac	agct-CFga-s.ga	eggtegts.ee	23S
EtGtCtgSCt	BZSBCStCeB	gssagaatet	accctgcBcc	t-ggt-t etges	tettgagtet	300
	Bccaeictgrg	tcsecaccac	acc.ggtjcacc	secsccaete	tggttetcae	3€ΰ
cscesctctg·	gegccgaaaa	cct.gta.ctte	cagrctggtt	etggt:gtcga	cactstggtg	42S
sgcs.agggeg	•aggagct: gts	esecgcgggtg	gtgeccatcc	tggtegsgat	ggaeggcgac	480
gt&saeggec	Hcasgtfccrag	cgtgtcegge	g=gggegs.gg	gegatgeese	ctaeg-gea ag	548
ctgaccetga	agttcatctg	esccBccggc	aagctgcccg	t gc ee t g gee	escEctcgtg	SOO
•5.ccsccctgs	cctaeggegt	gcagtgettc	sgcegctBcc	c-c^sccá-cat	•gaagcagcac.	S58
gsettettea	agt ecgccat	geeegaagge	taegtecagg	agegeseest	ettetteaag	720
gacgacgges	actacaajac	eegc^eegag	gtgaagrtScg	sggsjag-a-es.c	ectggtgsac	7S0
cgcstcgagc	t. gasgggcrat	egactt-es.ag	g=ggaeggoa	aesteetggg*	geaeaagetg	840
gagtae&act	scascagcca	s&acgt-ctat	accaeggccg	acsageagsa	g-aacggc&tc	SOO
saggtg-act	tcsagatecg	ecacssestc	gaggaeggea	gegtgesget	cgccgaccac	550
taNtcagcaga	acacecceat.	eggegaegge	eecgEgctgc	t gee eg a-esa	ecaetaectg	1020
ageacecagt	c: ;=s	eaaagaecce	aaegagaage	gegatcaest	gg t c c t g e tg	wso
g agt t cgtg a	ccgccgccgg	gates, čtete	go -' ž t ggacg	agetgt aes.a	gggstcegag	1140
•etesagette	t-cgagSetgrc	ecaecaecae	ffactetggsc	acs&ccassc	eggtcsecac:	1200
c3.cc set e tg	gttctcscca	ccaetastag	ctcgag			1235

Claims

1. Genový konstrukt pro produkci lipoproteinů a bakteriální display v E. coli, vyznačený tím, že má sekvenci

TCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGAAAGCGACCAAA CTGGTGCTGGGCGCGGTGATTCTGGGCAGCACCCTGCTGGCGGGCTGCGATGATAGC GGCAAAGATGGCAACGTCGACACCCTGACCGGTAAAACCATCACCCTGGAAGTTGA ACCGTCTGACACCATCGAAAACGTTAAAGCGAAAATCCAGGACAAAGAAGGTATCC CGCCGGACCAGCAGGAACTGATCTTCGCGGGTAAACAGCTGGAAGACGGTCGTACC CTGTCTGACTACAACATCCAGAAAGAATCTACCCTGCACCTGGTTCTGCATCTTGAGT CTGCCCACCACCACCACTCTGGTCACCACCACACCGGTCACCACCACCACTCTGGTT CTCACCACCACTCTGGTGCCGAAAACCTGTACTTCCAGTCTGGTTCTGGTGTCGACAC CATGGTTAGCGGTGGATCCGAGCTCAAGCTTCTCGAGTCTGCCCACCACCACCACTC TGGTCACCACCACACCGGTCACCACCACCACTCTGGTTCTCACCACCACTAATAGCT CGAGTAATAGGCGGCCGC (SEQ ID NO. 1) nebo sekvenci obsahující synonymní mutace k SEQ ID NO. 1 kódující stejné aminokyseliny.

2. Aminokyselinová sekvence kódovaná genovým konstruktem podle nároku 1, vyznačená tím, že má sekvenci: