CZ310672B6 - Způsob určení aktivity enzymů přeměňujících cytosinové deriváty na uracilové deriváty v roztocích - Google Patents

Způsob určení aktivity enzymů přeměňujících cytosinové deriváty na uracilové deriváty v roztocích

Info

Publication number
CZ310672B6
CZ310672B6 CZ2024-359A CZ2024359A CZ310672B6 CZ 310672 B6 CZ310672 B6 CZ 310672B6 CZ 2024359 A CZ2024359 A CZ 2024359A CZ 310672 B6 CZ310672 B6 CZ 310672B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
bromo
deoxyuridine
antibody
anchored
sample
Prior art date
Application number
CZ2024-359A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ2024359A3 (cs
Inventor
Karel KOBERNA
CSc. Koberna Karel RNDr.
Anna Ligasová
Ligasová Anna RNDr., Ph.D.
Original Assignee
Univerzita Palackého v Olomouci
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univerzita Palackého v Olomouci filed Critical Univerzita Palackého v Olomouci
Priority to CZ2024-359A priority Critical patent/CZ310672B6/cs
Publication of CZ2024359A3 publication Critical patent/CZ2024359A3/cs
Publication of CZ310672B6 publication Critical patent/CZ310672B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Řešení poskytuje způsob stanovení aktivity enzymů přeměňujících cytosinové deriváty na uracilové deriváty ve vzorku pomocí 5-brom-2'-deoxycytidinu a/nebo jeho monofosfátu, protilátky vázající se na BrdU a ukotveného BrdU na nosičích, jako jsou například více-jamkové destičky nebo magnetické částice. Popsaná metoda umožňuje změřit aktivitu enzymů přeměňujících cytosinové deriváty na uracilové deriváty v různých vzorcích, např. krevní plazmě nebo buněčném lyzátu, a může tudíž sloužit např. pro posouzení vlivu různých faktorů, např. potenciálních inhibitorů buněčných deamináz, na tuto aktivitu.

Description

Způsob určení aktivity enzymů přeměňujících cytosinové deriváty na uracilové deriváty v roztocích
Oblast techniky
Vynález se týká způsobu stanovení aktivity enzymů přeměňujících cytosinové deriváty na uracilové deriváty v roztocích.
Dosavadní stav techniky
Deaminázy, které deaminují cytosin, se podílejí nejen na regulaci nukleosidových a nukleotidových zásob, ale současně hrají kritickou úlohu v metabolismu terapeuticky významných analogů deoxycytidinu. Příkladem jsou např. 2',2'-difluoro-2'-deoxycytidin (gemcitabin, dFdC, např. Eur J Pharmacol, 741, 8-16), 1-e-D-arabinofuranosylcytosin (cytarabin, ara-C, např. Fundam Clin Pharmacol, 25, 172-185) nebo 5-aza-2'-deoxycytidin (DAC, decitabin, 5-aza-dC, např. Semin Hematol 42 (3 Suppl 2), S9-16). Jejich deaminace může vést ke snížení jejich účinku na léčbu až k jejich inaktivaci (např. Fundam Clin Pharmacol, 25, 172-185). K deaminaci dochází zpravidla na dvou úrovních. Na úrovni nukleosidu (např. cytidin nebo deoxycytidin) pomocí enzymu cytidin deaminázy (CDA) a na úrovni deoxynukleosid monofosfátu (např. deoxycytidin monofosfát) pomocí enzymu deoxycytidinmonofosfát deaminázy (DCTD). Oba enzymy mohou hrát významnou roli ve funkci léčiv založených na analozích cytidinu a deoxycytidinu. Vedle inaktivace mohou být rovněž využity pro aktivaci farmakologicky neaktivní látky, která se jejich aktivitou mění na farmakologicky aktivní látku. Příkladem může být 5-fluoro-2'-deoxycytidin, jehož deaminaci vzniká 5-fluoro 2'-deoxyuridin. Ten následně inhibuje syntézu DNA (např. Eur J Cancer, 34, 296-306; Clin Cancer Res, 12(24), 7483-7491).
Nejčastějším přístupem pro stanovení aktivity cytosinové deaminázy v krevní plasmě je spektrofotometrická analýza amoniových iontů, které jsou uvolňovány při přeměně cytidinu na uridin (např. Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, 33(4-6), 403-41; Br J Cancer, 119, 1326-1331). Další možností je použití vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC), pomocí které se kvantifikuje produkt deaminační aktivity. V tomto případě se vzorek krevní plazmy inkubuje s cytosinovým derivátem (např. dFdC - 2',2'-difluor-2'-deoxyuridin) a následně se stanoví množství vzniklého uridinového derivátu pomocí HPLC (např. Clin Cancer Res 14(6), 1797-1803). V případé buněčných lyzátů je možné použít metodu, kde se po inkubaci buněčných lyzátu s cytidinem určí míra deaminace měřením snižování absorbance při 282 nm (Cell Struct Function, 9, 117-123). Jiným způsobem je sledování produktu deaminace 5-etynyl 2'deoxycytidinu (5-etynyl 2'-deoxyuridinu) v DNA (Sci Rep, 13, 20530).
Podstata vynálezu
Předkládaný vynález umožňuje rychlé stanovení aktivity enzymů přeměňujících cytosinové deriváty na uracilové deriváty (dále jen enzymů) ve vzorku pomocí 5-brom-2’-deoxycytidinu (BrdC, obr. 1) a/nebo 5-brom-2'-deoxycytidin monofosfátu (BrdCMP, obr. 1), specifické protilátky (BrdU-protilátka) konjugované s fluorochromem a reagující s 5-brom-2'deoxyuridinem (BrdU) nebo jeho monofosfátem (BrdUMP) a pomocí ukotveného BrdU na různých nosičích. BrdU může být ukotven přímo na nosiči nebo je ukotven prostřednictvím oligonukleotidového řetězce, jehož je součástí. V případě, že BrdU protilátka není konjugovaná s fluorochromem, je předmětem vynálezu i použití sekundární protilátky, která reaguje s BrdUprotilátkou, přičemž tato sekundární protilátka je konjugována s fluorochromem. Pro stanovení souhrnné aktivity deamináz působících jak na úrovni nukleosidu, tak jeho monofosfátu se vzorek inkubuje současně s BrdC a BrdCMP. Pro stanovení aktivity deamináz působících na úrovni
- 1 CZ 310672 B6 nukleosidu se vzorek inkubuje jen s BrdC. Pro stanovení aktivity deamináz působících na úrovni nukleosid monofosfátu se vzorek inkubuje jen s BrdCMP. V posledních dvou případech je možné poměrně přesně odhadnout množství vzniklých produktů.
Jak již bylo uvedeno, BrdU může být ukotveno přímo na nosičích nebo je součástí na nosičích ukotveného oligonukleotidu (dále jenom BrdU-oligo). Příkladem výhodných nosičů jsou vícejamkové destičky nebo magnetické částice. Pro kotvení je s výhodou použit systém založený na reakci biotinu a streptavidinu. Biotin je s výhodou kovalentně konjugován s BrdU nebo BrdUoligo a streptavidin je navázán kovalentně nebo nekovalentně na nosiče. V případě BrdU-oligo může být biotin konjugován buď na 5' nebo 3' konec. V oligonukleotidovém řetězci může být i více nukleosidů BrdU. Vyšší obsah BrdU v BrdU-oligo může zvýšit citlivost metody.
V typickém uspořádání se nejprve k testovanému roztoku přidá BrdC a/nebo BrdCMP o požadované koncentraci a roztok se inkubuje na požadované teplotě požadovaný čas. Příkladem je teplota 1 až 50 °C a délka inkubace 1 až 120 minut. Příkladem koncentrace BrdC je 0,1 až 1000 pmol.l-1, příkladem koncentrace BrdCMP je 0,1 až 1000 pmol.l-1. Pokud je v roztoku přítomen současně aktivní enzym, dojde během inkubace k přeměně BrdC na BrdU a/nebo BrdCMP na BrdUMP. Množství vytvořeného BrdU a/nebo BrdUMP závisí především na aktivitě enzymu, množství přidaného BrdC a/nebo BrdCMP a délce inkubace. Kontrolní vzorek se inkubuje bez přídavku BrdC a/nebo BrdCMP. Po inkubaci je ve druhém kroku enzym z roztoku odstraněn filtrací pomocí centrifugačního filtru neboje inaktivován zvýšením teploty nad 60 °C. Velikost póru centrifugačního filtru je nižší než je velikost enzymu. Příkladem vhodných podmínek centrifugace je čas točení 10 minut při relativní centrifugační síle (RCF) 16 000 x g. Centrifugace není nutná, zpravidla však snižuje nežádoucí interakce s použitými protilátkami. Pokud je použita teplotní inaktivace, je výhodné inkubovat vzorek na teplotě 60 °C déle než 1 minutu, následně vzorek centrifugovat a odebrat jen horní tekutou frakci. Filtrovaný nebo teplotně inaktivovaný roztok je následně přidán k BrdU nebo BrdU-oligo, které jsou ukotvené na nosiči. Poté je přidána BrdU-protilátka. BrdU-protilátka reaguje jak s molekulou BrdU nebo molekulou BrdUMP, které byly vytvořeny přeměnou BrdC respektive BrdCMP, tak s ukotveným BrdU nebo BrdU, které je součástí ukotvených oligonukleotidů. Čím více je vytvořeného BrdU z BrdC a/nebo BrdUMP z BrdCMP, tím méně se váže BrdU-protilátka na ukotvené BrdU nebo ukotvené BrdU-oligo. Příkladem délky inkubace s BrdU-protilátkou je čas 1 až 120 minut.
Po inkubaci v přítomnosti BrdU-protilátky jsou nosiče s ukotveným BrdU nebo ukotveným BrdU-oligo promyty v roztoku, který neobsahuje ani BrdU a/nebo BrdUMP ani protilátku. Tím dojde k odstranění BrdU-protilátky, která není vázána na BrdU nebo BrdU-oligo ukotvených na nosičích. Promytí výhodně sestává z jedné až pěti následných inkubací v promývacím vodném roztoku, např. fosfátovém pufru nebo fyziologickém roztoku nebo pufru obsahujícím tris(hydroxymetyl)aminometan (Tris) nebo kyselinu N'-2-hydroxyetylpiperazin-N'-2etansulfonovou (Hepes). Celková délka promývacích kroků je výhodně 1 až 30 minut.
V případě, že je BrdU-protilátka konjugována s fluorochromem, je změřen fluorescenční signál nosičů s ukotveným BrdU nebo BrdU-oligo, který je tím vyšší, čím je aktivita enzymu v testovaném roztoku nižší.
V případě, že BrdU-protilátka není konjugována s fluorochromem, jsou nosiče s ukotveným BrdU nebo ukotveným BrdU-oligo a navázanou BrdU-protilátkou po promývacím kroku inkubovány s druhou protilátkou, která se váže na BrdU-protilátku. Tato druhá protilátka je konjugována s fluorochromem. Příkladem doby inkubace s druhou protilátkou je čas 1 až 120 minut. Po inkubaci s druhou protilátkou jsou nosiče s ukotveným BrdU nebo ukotveným BrdUoligo promyty v roztoku bez druhé protilátky. Tím dojde k odstranění druhé protilátky, která není vázána na nosiče s ukotveným BrdU nebo BrdU-oligo prostřednictvím BrdU-protilátky. Promytí výhodně sestává z jedné až pěti následných inkubací v promývacím vodném roztoku, např. fosfátovém pufru nebo fyziologickém roztoku nebo pufru obsahujícím Tris nebo Hepes. Celková délka promývacích kroků je výhodně 1 až 30 minut. Následně je změřen fluorescenční signál
- 2 CZ 310672 B6 nosičů s ukotveným BrdU nebo ukotveným BrdU-oligo.
Odhad vytvořené koncentrace BrdU nebo BrdUMP v testovaném roztoku je proveden prostřednictvím odečtu z kalibrační křivky sestrojené pomocí seriálně ředěných koncentrací BrdU nebo BrdUMP. Kalibraci je možné provést pouze v případě, že byl vzorek inkubován alternativně buď s BrdC nebo BrdCMP. V případě, že byl testovaný vzorek inkubován současně s BrdC a BrdCMP není kalibrace možná. BrdU nebo BrdUMP jsou s výhodou ředěny v roztoku, který má podobné nebo stejné složení jako testovaný vzorek, např. v roztoku, který byl použit pro přípravu vzorku. Pro přesné stanovení vytvořené koncentrace BrdU nebo BrdUMP je výhodné použít pro ředění kalibračních koncentrací BrdU nebo BrdUMP část z testovaného roztoku, ve kterém neproběhla inkubace s BrdC nebo BrdCMP. V tomto případě je tato část testovaného roztoku před přidáním různých koncentrací BrdU nebo BrdUMP filtrována nebo teplotně inaktivována a to v závislosti na způsobu odstranění deaminázové aktivity v testovaném roztoku inkubovaném s BrdC nebo BrdCMP. V případě, že byla pro odstranění deaminázové aktivity v testovaném roztoku použita filtrace, je i při přípravě kalibračních vzorků použita filtrace. V případě, že byla použita teplotní inaktivace, je použita teplotní inaktivace i v případě přípravy kalibračních vzorků. Součástí kalibračních vzorků je i kontrolní vzorek, který neobsahuje žádné BrdU nebo BrdUMP. Kalibrační roztoky jsou nejprve přidány k ukotvenému BrdU nebo BrdUoligo a následně je přidána BrdU-protilátka. Délka inkubace s BrdU-proti látkou je stejná, jako v případě vzorků inkubovaných s BrdC nebo BrdCMP.
Po inkubaci v přítomnosti BrdU-protilátky jsou nosiče s ukotveným BrdU nebo ukotveným BrdU-oligo promyty v promývacím roztoku, který neobsahuje ani BrdU a/nebo BrdUMP ani protilátku. Promytí je provedeno stejně jako v případě vzorků inkubovaných s BrdC a/nebo BrdCMP. Obdobně je buď změřen signál (v případě, že BrdU-proti látka byla fluorescenčně značena), nebo následuje inkubace s druhou, fluorescenčně značenou, protilátkou a po ní promytí a měření signálu. Všechny tyto kroky jsou stejné jako v případě vzorků inkubovaných s BrdC a/nebo BrdCMP.
Hodnoty signálů ze vzorků se známými koncentracemi BrdU pak slouží pro odhad vytvořené koncentrace BrdU v testovaném vzorku. Nejčastěji jsou pro odhad použity metody založené na lineární nebo nelineární regresi.
Pro analýzu signálu produkovaného protilátkami je výhodné použít zařízení typu čteček destiček.
Vzorkem může být například vzorek kultivačního média, nebo krevní plazmy, nebo buněčného lyzátu. Tyto vzorky mohou být neředěny nebo ředěny. Pro ředění je možné použít vodné roztoky. Příkladem vhodných roztoků jsou fosfátový pufr, fyziologický roztok nebo pufry obsahující Tris nebo Hepes nebo voda.
Enzymem přeměňujícím cytosinové deriváty na uracilové deriváty může být např. cytidin deamináza (CDA) nebo dCMP deamináza (DCTD).
Jako nosiče lze použít například 6-, 12-, 24-, 48-, 96-, 384-, nebo 1536-jamkové černé destičky nebo magnetické částice.
Předmětem předkládaného vynálezu je rovněž sada pro stanovení deaminázové aktivity enzymů přeměňujících cytosinové deriváty na uracilové deriváty, která obsahuje substrát enzymu přeměňujícího cytosinové deriváty na uracilové deriváty 5-brom-2'-deoxycytidin a/nebo 5-brom2'-deoxycytidin monofosfát, 5-brom-2'-deoxyuridin a/nebo 5-brom-2'-deoxyuridin monofosfát, biotinylovaný oligonukleotid s 5-brom-2'-deoxyuridinem nebo biotinylovaný 5-brom-2'deoxyuridin, alternativně protilátku reagující s 5-brom-2'-deoxyuridinem konjugovanou nebo nekonjugovanou s fluorochromem a v případě, že tato protilátka nebyla konjugována s fluorochromem, rovněž druhou protilátku konjugovanou s fluorochromem, která reaguje s protilátkou reagující s 5-brom-2'-deoxyuridinem a více-jamkové destičky, jejichž dno je pokryto
- 3 CZ 310672 B6 streptavidinem.
Ve výhodném provedení se testovaný vzorek inkubuje se substrátem enzymu - 5-brom-2'deoxycytidinem a/nebo 5-brom-2'-deoxycytidin monofosfátem, přičemž dochází k deaminaci 5brom-2'-deoxycytidinu na 5-brom-2'-deoxyuridin a/nebo k deaminaci 5-brom-2'-deoxycytidin monofosfátu na 5-brom-2'-deoxyuridin monofosfát, následně se vzorek inkubuje na teplotě vyšší než 60 °C nebo se filtruje pomocí centrifugačního filtru, pak se vzorek inkubuje s 5-brom-2'deoxyuridinem ukotveným na povrchu nosiče v přítomnosti protilátky, která se váže na 5 -brom2'-deoxyuridin, po inkubaci vzorku a protilátky s ukotveným 5-brom-2'-deoxyuridinem je z nosiče s ukotveným 5-brom-2'-deoxyuridinem odstraněn vzorek s protilátkou, v případě, že použitá protilátka není konjugována s fluorochromem, následuje inkubace se sekundární protilátkou, která se váže na protilátku navázanou na ukotvený 5-brom-2'-deoxyuridin. přičemž tato sekundární protilátka je konjugována s fluorochromem, po této inkubaci je z nosiče s ukotveným 5-brom-2'-deoxyuridinem odstraněn roztok sekundární protilátky, přičemž signál fluorochromu poskytovaný navázanými protilátkami na ukotvený 5-brom-2'-deoxyuridin je nepřímo úměrný deaminázové aktivitě.
V jiném výhodném provedení je ukotvený 5-brom-2'-deoxyuridin součástí oligonukleotidového řetězce.
V dalším výhodném provedení obsahuje oligonukleotidový řetězec několik 5-brom-2'deoxyuridinů.
V provedení, kdy je třeba určit koncentraci vyprodukovaného 5-brom-2'-deoxyuridinu z 5-brom2'-deoxycytidinu, se pro stanovení koncentrace vzniklého 5-brom-2'-deoxyuridinu připraví vzorky vodných roztoků obsahující různé známé koncentrace 5-brom-2'-deoxyuridinu a tyto vzorky se inkubují s 5-brom-2'-deoxyuridinem ukotveným na povrchu nosiče v přítomnosti protilátky, která se váže na 5-brom-2'-deoxyuridin, po inkubaci vzorku a protilátky s ukotveným 5-brom-2'-deoxyuridinem je z nosiče s ukotveným 5-brom-2'-deoxyuridinem odstraněn vzorek s protilátkou, v případě, že použitá protilátka není konjugována s fluorochromem, následuje inkubace se sekundární protilátkou, která se váže na protilátku navázanou na ukotvený 5-brom2'-deoxyuridin, přičemž tato sekundární protilátka je konjugována s fluorochromem, po této inkubaci je z nosiče s ukotveným 5-brom-2'-deoxyuridinem odstraněn roztok sekundární protilátky, změří se signál poskytovaný navázanými protilátkami na ukotvený 5-brom-2'deoxyuridin a pomocí lineární nebo nelineární regrese je vypočtena koncentrace vzniklého 5brom-2'-deoxyuridinu v testovaném vzorku.
V provedení, kdy je třeba určit koncentraci vyprodukovaného 5-brom-2'-deoxyuridin monofosfátu z 5-brom-2'-deoxycytidin monofosfátu, se pro stanovení koncentrace vzniklého 5brom-2'-deoxyuridin monofosfátu připraví vzorky vodných roztoků obsahující různé známé koncentrace 5-brom-2'-deoxyuridin monofosfátu a tyto vzorky se inkubují s 5-brom-2'deoxyuridinem ukotveným na povrchu nosiče v přítomnosti protilátky, která se váže na 5-brom2'-deoxyuridin, po inkubaci vzorku a protilátky s ukotveným 5-brom-2'-deoxyuridinem je z nosiče s ukotveným 5-brom-2'-deoxyuridinem odstraněn vzorek s protilátkou, v případě, že použitá protilátka není konjugována s fluorochromem, následuje inkubace se sekundární protilátkou, která se váže na protilátku navázanou na ukotvený 5-brom-2'-deoxyuridin, přičemž tato sekundární protilátka je konjugována s fluorochromem, po této inkubaci je z nosiče s ukotveným 5-brom-2'-deoxyuridinem odstraněn roztok sekundární protilátky, změří se signál poskytovaný navázanými protilátkami na ukotvený 5-brom-2'-deoxyuridin a pomocí lineární nebo nelineární regrese je vypočtena koncentrace vzniklého 5-brom-2'-deoxyuridin monofosfátu v testovaném vzorku.
Výhodným nosičem je povrch více-jamkové destičky. Jiným výhodným nosičem jsou magnetické částice.
- 4 CZ 310672 B6
Výhodně je 5-brom-2'-deoxyuridin ukotven na nosič prostřednictvím vazby streptavidinu navázaného na povrchu nosiče a biotinu vázaného na BrdU nebo na 3' nebo 5' konci oligonukleotidu.
Sada pro stanovení deaminázové aktivity enzymů přeměňujících cytosinové deriváty na uracilové deriváty výhodně obsahuje substrát enzymů přeměňujících cytosinové deriváty na uracilové deriváty 5-brom-2'-deoxycytidin a/nebo 5-brom-2'-deoxycytidin monofosfát, 5-brom-2'deoxyuridin a/nebo 5-brom-2'-deoxyuridin monofosfát, a protilátku, která se váže na 5-brom-2'deoxyuridin.
Výhodně je tato protilátka konjugovaná s fluorochromem.
Rovněž výhodně sada obsahuje sekundární protilátku, která reaguje s protilátkou, vázající se na 5-brom-2'-deoxyuridin, přičemž tato sekundární protilátka je konjugována s fluorochromem.
Objasnění výkresů
Obrázek 1 Chemické struktury BrdC, BrdCMP, BrdU a BrdUMP a zjednodušené schéma deaminace. CDA = cytidin deamináza, DCTD = deoxycytidinmonofosfát deamináza.
Obrázek 2. Příklad analýzy aktivity cytidinové deaminázy v roztoku.
Obrázek znázorňuje stanovení koncentrace BrdU vzniklého deaminací v testovaných roztocích A a B pomocí odečtu signálu z kalibrační křivky sestrojené ze signálů různých koncentrací BrdU změřených pomocí čtečky destiček. Pro detekci BrdU byla použita detekce pomocí primární BrdU-protilátky a sekundární protilátky konjugované s Alexa Fluor 488. Naměřené intenzity signálů byly zpracovány v softwaru GraphPad Prism 6, pomocí kterého byla zkonstruována kalibrační křivka. Současně byla z kalibrační křivky odečtena koncentrace vzniklého BrdU.
Seznam použitých zkratek
HeLa S3 suspenzní buněčná linie lidských epiteliálních buněk
HeLa přisedlá buněčná linie lidských epiteliálních buněk
S-MEM modifikace Eaglova minimálního média pro suspenzní buňky
BSA bovinní sérový albumin
Příklady uskutečnění vynálezu
Veškeré příklady vycházejí z přeměny cytosinového derivátu na uracilový derivát a následném stanovení obsahu tohoto derivátu v DNA pomocí protilátek.
Příklad 1
Stanovení aktivity enzymů přeměňujících cytosinové deriváty na uracilové deriváty v krevní plasmě za použití BrdC
Následující postup popisuje způsob stanovení aktivity enzymů přeměňujících cytosinové deriváty na uracilové deriváty v krevní plasmě za použití BrdC. Není-li uvedeno jinak, veškeré kroky byly prováděny při teplotě místnosti, přičemž kroky následovaly po sobě bez dalších prodlev.
A) 1,1 ml krevní plasmy bylo rozděleno na 3 části. První část (500 μ^ byla inkubována při 90 °C po dobu 10 minut (alternativně při 60 °C nebo 70 °C) a následně centrifugována ve zkumavce 10 minut při 16 000 x g. Po centrifugaci byla ze zkumavky odebrána horní tekutá frakce a přenesena do nové zkumavky (vzorek V1). Druhá část (200 gl, vzorek V2) a třetí část
- 5 CZ 310672 B6 (200 μΐ, vzorek V3) krevní plasmy nebyly ovlivněny.
B) Vzorek V1 byl použit pro přípravu kalibračních roztoků. Byly připraveny tyto koncentrace kalibračních roztoků: 10, 2, 0,4, 0,08, 0,016, 0,0032, 0,00064 a 0,00128 μmol.l-1 BrdU (řada vzorků V1_k_10 až V1_k 0,00128, každý vzorek: 60 μΐ).
C) Vzorek V2 byl inkubován s 10 μmol.l-1 (alternativně s 1, 20, 100 a 1000 μmol.l-1) BrdC po dobu 20 minut (alternativně po dobu 1 minuty nebo 60 minut). Vzorek V3 byl inkubován bez BrdC po dobu 20 minut (alternativně po dobu 1 nebo 60 minut). Teplota v průběhu inkubace byla u všech vzorků 25 °C.
D) Následně byly vzorky V2 a V3 inkubovány při 90 °C (alternativně při 60 °C nebo 70 °C) po dobu 10 minut a pak centrifugovány ve zkumavkách 10 minut při 16 000 x g. Po centrifugaci byla ze zkumavek odebrána horní tekutá frakce a přenesena do nové zkumavky. Tato frakce byla použita v následných krocích.
E) Dále byly všechny vzorky přeneseny do jamek 384-jamkové destičky se dnem pokrytým streptavidinem s navázaným BrdU-oligo. Do každé jamky bylo naneseno 19 μl roztoku. Následně byl přidán 1 μl připravené primární protilátky namířené vůči BrdU (BrdU-protilátka). Konečná koncentrace BrdU-protilátky v jamce byla 1 μg.ml-1.
F) Vzorky byly inkubovány 30 minut na temperované třepačce při 300 ot./min a 25 °C.
G) Po inkubaci byl roztok odstraněn a vzorky byly promyty Tris-NaCl pufrem (složení viz Použité roztoky a chemikálie, bylo použito 100 μl pufru/jamka). Pufr byl odstraněn a do jamek byl přidán nový Tris-NaCl pufr. Tento krok byl ještě 2x opakován.
H) Pufr byl odstraněn a do jamek bylo přidáno 20 μΐ roztoku sekundární protilátky v Tris- NaCl pufru. Byla použita kozí anti myší protilátka konjugovaná s fluorochromem AlexaFluor 488. Konečná koncentrace protilátky v jamce byla 15 μg.ml1.
I) Vzorky byly inkubovány 30 minut na temperované třepačce při 300 ot./min a 25 °C.
J) Po inkubaci byl roztok odstraněn a vzorky byly promyty v Tris-NaCl pufru (složení viz Použité roztoky a chemikálie, bylo použito 100 μl pufru/jamka). Pufr byl odstraněn a do jamek byl přidán nový Tris-NaCl pufr. Tento krok byl ještě 2x opakován.
K) Signál byl detekován pomocí čtečky destiček.
L) Vyhodnocení bylo provedeno pomocí metod lineární a nelineární regrese.
Příklad 2
Stanovení aktivity enzymů přeměňujících cytosinové deriváty na uracilové deriváty v roztoku krevní plasmy za použití BrdC
Následující postup popisuje způsob stanovení aktivity enzymů přeměňujících cytosinové deriváty na uracilové deriváty v roztoku krevní plasmy za použití BrdC. Není-li uvedeno jinak, veškeré kroky byly prováděny při teplotě místnosti, přičemž kroky následovaly po sobě bez dalších prodlev.
Postup byl stejný jako v příkladu 1 s následujícími změnami:
Krevní plasma byla ještě před rozdělením na tři části ředěna fyziologickým roztokem v poměru 1:10 nebo 1:20. Alternativně byla ředěna Tris-NaCl pufrem.
- 6 CZ 310672 B6
Ostatní kroky byly stejné jako v příkladu 1.
Příklad 3
Stanovení aktivity enzymů přeměňujících cytosinové deriváty na uracilové deriváty v krevní plasmě nebo jejím roztoku za použití BrdC
Následující postup popisuje způsob stanovení aktivity enzymů přeměňujících cytosinové deriváty na uracilové deriváty v krevní plasmě nebo jejím roztoku za použití BrdC. Není-li uvedeno jinak, veškeré kroky byly prováděny při teplotě místnosti, přičemž kroky následovaly po sobě bez dalších prodlev.
Postup byl stejný jako v příkladu 1 nebo 2 s následujícími změnami:
Krok A byl proveden následovně:
1,1 ml krevní plasmy bylo rozděleno na 3 části. První část (500 pl, vzorek V1) byla nanesena do centrifugačního filtračního zařízení (Amicon® Ultra Centrifugal Filter, 3 kDa MWCO). Vzorky byly centrifugovány 10 minut při 12 400 x g, 25 °C. Pro další kroky byla použita zachycená přefiltrovaná frakce, která prošla filtrem. Druhá část (200 pl, vzorek V2) a třetí část (200 pl, vzorek V3) nebyly ovlivněny.
Krok D byl proveden následovně:
Vzorky V2 a V3 byly naneseny do centrifugačního filtračního zařízení (Amicon® Ultra Centrifugal Filter, 3 kDa MWCO). Vzorky byly centrifugovány 10 minut při 12 400 x g, 25 °C. Pro další kroky byla použita zachycená přefiltrovaná frakce, která prošla filtrem.
Ostatní kroky byly stejné jako v příkladu 1 a 2.
Příklad 4
Stanovení aktivity enzymů přeměňujících cytosinové deriváty na uracilové deriváty v buněčném lyzátu za použití BrdC
Následující postup popisuje způsob stanovení aktivity enzymů přeměňujících cytosinové deriváty na uracilové deriváty v cytoplazmatickém lyzátu HeLa buněk za použití BrdC. Není-li uvedeno jinak, veškeré kroky byly prováděny při teplotě místnosti, přičemž kroky následovaly po sobě bez dalších prodlev.
Postup byl stejný jako v příkladu 1 s následujícími změnami:
Cytoplazmatický lyzát připravený z HeLa buněk byl použit namísto krevní plasmy. Cytoplazmatický lyzát byl připraven podle publikovaného návodu (Sci Rep, 13, 20530).
Ostatní kroky byly stejné jako v příkladu 1.
Příklad 5
Stanovení aktivity enzymů přeměňujících cytosinové deriváty na uracilové deriváty v roztocích buněčného lyzátu za použití BrdC
Následující postup popisuje způsob stanovení aktivity enzymů přeměňujících cytosinové deriváty na uracilové deriváty v roztoku cytoplazmatického lyzátu HeLa buněk za použití BrdC. Není-li
- 7 CZ 310672 B6 uvedeno jinak, veškeré kroky byly prováděny při teplotě místnosti, přičemž kroky následovaly po sobě bez dalších prodlev.
Postup byl stejný jako v příkladu 2 s následujícími změnami:
Cytoplazmatický lyzát připravený z HeLa buněk byl použit namísto krevní plasmy. Cytoplazmatický lyzát byl připraven podle publikovaného návodu (Sci Rep, 13, 20530).
Ostatní kroky byly stejné jako v příkladu 2.
Příklad 6
Stanovení aktivity enzymů přeměňujících cytosinové deriváty na uracilové deriváty v buněčném lyzátu nebo jeho roztocích
Následující postup popisuje způsob stanovení aktivity enzymů přeměňujících cytosinové deriváty na uracilové deriváty v cytoplazmatickém lyzátu HeLa buněk nebo jeho roztocích za použití BrdC. Není-li uvedeno jinak, veškeré kroky byly prováděny při teplotě místnosti, přičemž kroky následovaly po sobě bez dalších prodlev.
Postup byl stejný jako v příkladu 3 s následujícími změnami:
Cytoplazmatický lyzát připravený z HeLa buněk byl použit namísto krevní plasmy. Cytoplazmatický lyzát byl připraven podle publikovaného návodu (Sci Rep, 13, 20530).
Ostatní kroky byly stejné jako v příkladu 3.
Příklad 7
Stanovení aktivity enzymů přeměňujících cytosinové deriváty na uracilové deriváty v kultivačním médiu za použití BrdC
Následující postup popisuje způsob stanovení aktivity enzymů přeměňujících cytosinové deriváty na uracilové deriváty v kultivačním médiu HeLa S3 buněk za použití BrdC. Není-li uvedeno jinak, veškeré kroky byly prováděny při teplotě místnosti, přičemž kroky následovaly po sobě bez dalších prodlev.
Postup byl stejný jako v příkladu 1 s následujícími změnami:
Namísto krevní plasmy bylo použito kultivační médium používané pro kultivaci suspenzních HeLa S3 buněk.
Lidské HeLa S3 buňky byly pěstovány v kultivačních lahvích (objem lahví byl 50 ml), které byly třepány, v růstovém médiu S-MEM (modifikace Eaglova minimálního média pro suspenzní buňky, Merck) s 3% (hmotn./obj.) L-glutaminem, 5% (obj./obj.) fetálním telecím sérem (PAA Laboratories) a 50 μg.ml1 gentamicinem v atmosféře s 5% (obj./obj.) CO2 při 37 °C. Buněčná suspenze obsahovala přibližně 5 až 8 x 105 buněk na 1 mililitr. Z kultivační láhve bylo následné přeneseno 10 ml buněčné suspenze do 15 ml zkumavky a buňky byly stočeny při 2000 x g, 10 minut, 25 °C. Bylo odebráno 1,1 ml kultivačního média.
Ostatní kroky byly stejné jako v příkladu 1. Výsledek vyhodnocení viz obrázek 2.
Příklad 8
Stanovení aktivity enzymů přeměňujících cytosinové deriváty na uracilové deriváty v roztocích
- 8 CZ 310672 B6 kultivačního média za použití BrdC
Následující postup popisuje způsob stanovení aktivity enzymu přeměňujícího cytosinové deriváty na uracilové deriváty v roztocích kultivačního média HeLa S3 buněk za použití BrdC. Není-li uvedeno jinak, veškeré kroky byly prováděny při teplotě místnosti, přičemž kroky následovaly po sobě bez dalších prodlev.
Postup byl stejný jako v příkladu 7 s následujícími změnami:
Kultivační médium bylo ještě před rozdělením na tři části ředěno fyziologickým roztokem v poměru 1:10 nebo 1:20. Alternativně bylo ředěno Tris-NaCl pufrem.
V dalších krocích bylo postupováno dle příkladu 7.
Příklad 9
Stanovení aktivity enzymů přeměňujících cytosinové deriváty na uracilové deriváty v krevní plasmě za použití BrdCMP
Následující postup popisuje způsob stanovení aktivity enzymů přeměňujících cytosinové deriváty na uracilové deriváty v krevní plasmě za použití BrdCMP. Není-li uvedeno jinak, veškeré kroky byly prováděny při teplotě místnosti, přičemž kroky následovaly po sobě bez dalších prodlev.
A) 1,1 ml krevní plasmy bylo rozděleno na 3 části. První část (500 μ^ byla inkubována při 90 °C po dobu 10 minut (alternativně při 60 °C nebo 70 °C) a následně centrifugována ve zkumavce 10 minut při 16 000 x g. Po centrifUgaci byla ze zkumavky odebrána horní tekutá frakce a přenesena do nové zkumavky (vzorek V1). Druhá část (200 pl, vzorek V2) a třetí část (200 pl, vzorek V3) nebyly ovlivněny.
B) Vzorek V1 byl použit pro přípravu kalibračních roztoků BrdUMP (500 pl). Byly připraveny tyto koncentrace kalibračních roztoků: 10, 2, 0,4, 0,08, 0,016, 0,0032, 0,00064 a 0,00128 pmol.l-1 BrdUMP (řada vzorků V1_k_10 až V1_k_0,00128, každý vzorek: 60 pl).
C) Vzorek V2 byl inkubován s 10 pmol.l-1 (alternativně s 1, 20, 100 a 1000 pmol.l-1 ) BrdCMP po dobu 20 minut (alternativně po dobu 1 a 60 minut). Vzorek V3 byl inkubován bez BrdCMP po dobu 20 minut (alternativně po dobu 1 a 60 minut). Teplota v průběhu inkubace byla u všech vzorků 25 °C.
D) Vzorky V2 a V3 byly inkubovány při 90 °C (alternativně při 60 °C nebo 70 °C) po dobu 10 minut a následně centrifugovány ve zkumavkách 10 minut při 16 000 x g. Po centrifugaci byla ze zkumavek odebrána horní tekutá frakce a přenesena do nové zkumavky. Tato frakce byla použita v následných krocích.
E) Následně byly všechny vzorky přeneseny do jamek 384-jamkové destičky se dnem pokrytým streptavidinem s navázaným BrdU-oligo. Do každé jamky bylo naneseno 19 pl roztoku. Následně byl přidán 1 pl připravené primární protilátky namířené vůči BrdU (BrdUprotilátka). Konečná koncentrace BrdU-protilátky v jamce byl 1 pg.ml-1.
F) Vzorky byly inkubovány 30 minut na temperované třepačce při 300 ot./min a 25 °C.
G) Po inkubaci byl roztok odstraněn a vzorky byly promyty v Tris-NaCl pufru (složení viz Použité roztoky a chemikálie, bylo použito 100 pl pufru/jamka). Pufr byl odstraněn a do jamek byl přidán nový Tris-NaCl pufr (složení viz Použité roztoky a chemikálie, bylo použito 100 pl pufru/jamka). Tento krok byl ještě 2x opakován.
- 9 CZ 310672 B6
H) Pufr byl odstraněn a do jamek bylo přidáno 20 μΐ roztoku sekundární protilátky v Tris-NaCl pufru. Byla použita kozí anti myší protilátka konjugovaná s fluorochromem AlexaFluor 488. Konečná koncentrace protilátky v jamce byla 15 μg.ml-1 .
I) Vzorky byly inkubovány 30 minut na temperované třepačce při 300 ot./min a 25 °C.
J) Po inkubaci byl roztok odstraněn a vzorky byly promyty v Tris-NaCl pufru (složení viz Použité roztoky a chemikálie, bylo použito 100 μl pufru/jamka). Pufr byl odstraněn a do jamek byl přidán nový Tris-NaCl pufr (složení viz Použité roztoky a chemikálie, bylo použito 100 μl pufru/jamka). Tento krok byl ještě 2x opakován.
K) Signál byl detekován pomocí čtečky destiček.
L) Vyhodnocení bylo provedeno pomocí metod lineární a nelineární regrese.
Příklad 10
Stanovení aktivity enzymů přeměňujících cytosinové deriváty na uracilové deriváty v roztoku krevní plasmy za použití BrdCMP
Následující postup popisuje způsob stanovení aktivity enzymů přeměňujících cytosinové deriváty na uracilové deriváty v roztoku krevní plasmy za použití BrdCMP. Není-li uvedeno jinak, veškeré kroky byly prováděny při teplotě místnosti, přičemž kroky následovaly po sobě bez dalších prodlev.
Postup byl stejný jako v příkladu 9 s následujícími změnami:
Krevní plasma byla ještě před rozdělením na části ředěna fyziologickým roztokem v poměru 1:10 nebo 1:20. Alternativně byla ředěna Tris-NaCl pufrem.
Ostatní kroky byly stejné jako v příkladu 9.
Příklad 11
Stanovení aktivity enzymů přeměňujících cytosinové deriváty na uracilové deriváty v krevní plazmě nebo jejím roztoku za použití BrdCMP
Následující postup popisuje způsob stanovení aktivity enzymů přeměňujících cytosinové deriváty na uracilové deriváty v krevní plasmě nebo jejím roztoku za použití BrdCMP. Není -li uvedeno jinak, veškeré kroky byly prováděny při teplotě místnosti, přičemž kroky následovaly po sobě bez dalších prodlev.
Postup byl stejný jako v příkladech 9 a 10 s následujícími změnami:
Krok A byl proveden následovně:
1,1 ml krevní plasmy bylo rozděleno na 3 části. První část (500 pl, vzorek V1) byla nanesena do centrifugačního filtračního zařízení (Amicon® Ultra Centrifugal Filter, 3 kDa MWCO). Vzorky byly centrifugovány 10 minut při 12 400 x g, 25 °C. Pro další kroky byla použita zachycená přefiltrovaná frakce, která prošla filtrem. Druhá část (200 pl, vzorek V2) a třetí část (200 pl, vzorek V3) nebyly ovlivněny.
Krok D byl proveden následovně:
Vzorky V2 a V3 byly naneseny do centrifugačního filtračního zařízení (Amicon® Ultra
- 10 CZ 310672 B6
Centrifugal Filter, 3 kDa MWCO). Vzorky byly centrifugovány 10 minut při 12 400 x g, 25 °C. Pro další kroky byla použita zachycená přefiltrovaná frakce, která prošla filtrem.
Ostatní kroky byly stejné jako v příkladech 9 a 10.
Příklad 12
Stanovení aktivity enzymů přeměňujících cytosinové deriváty na uracilové deriváty v roztocích krevní plasmy za současného použití BrdC a BrdCMP
Následující postup popisuje způsob stanovení aktivity enzymů přeměňujících cytosinové deriváty na uracilové deriváty v krevní plasmě za současného použití BrdC a BrdCMP. Není-li uvedeno jinak, veškeré kroky byly prováděny při teplotě místnosti, přičemž kroky následovaly po sobě bez dalších prodlev.
A) Krevní plazma (400 μ^ byla rozdělena na dvě frakce po 200 μl (vzorek V1 a V2).
B) Vzorek V1 byl inkubován s 10 μmol.l-1 (alternativně s 1, 20, 100 a 1000 pmol.l'1) BrdC a BrdCMP po dobu 20 minut (alternativně po dobu 1 a 60 minut). Vzorek V2 byl inkubován bez BrdC a BrdCMP po dobu 20 minut (alternativně po dobu 1 a 60 minut). Teplota v průběhu inkubace byla u všech vzorků 25 °C.
C) Oba vzorky byly následně inkubovány při 90 °C (alternativně při 60 °C nebo 70 °C) po dobu 10 minut a následně centrifugovány ve zkumavkách 10 minut při 16 000 x g. Po centrifUgaci byla ze zkumavek odebrána horní tekutá frakce a přenesena do nové zkumavky. Tato frakce byla použita v následných krocích.
D) Následně byly oba vzorky napipetovány do jamek 384-jamkové destičky se dnem pokrytým streptavidinem s navázaným BrdU-oligo. Do každé jamky bylo naneseno 19 μl roztoku. Následně byl přidán 1 μl připravené primární protilátky namířené vůči BrdU (BrdU-protilátka). Konečná koncentrace BrdU-protilátky v jamce byla 1 μg.ml-1.
E) Vzorky byly inkubovány 30 minut na temperované třepačce při 300 ot./min a 25 °C.
F) Po inkubaci byl roztok odstraněn a vzorky byly promyty v Tris-NaCl pufru (složení viz Použité roztoky a chemikálie, bylo použito 100 μl pufru/jamka). Pufr byl odstraněn a do jamek byl přidán nový Tris-NaCl pufr (složení viz Použité roztoky a chemikálie, bylo použito 100 μl pufru/jamka). Tento krok byl ještě 2x opakován.
G) Pufr byl odstraněn a do jamek bylo přidáno 20 μl roztoku sekundární protilátky v Tris-NaCl pufru. Byla použita kozí anti myší protilátka konjugovaná s fluorochromem AlexaFluor 488. Konečná koncentrace protilátky v jamce byla 15 gg.ml'1.
H) Vzorky byly inkubovány 30 minut na temperované třepačce při 300 ot./min a 25 °C.
I) Po inkubaci byl roztok odstraněn a vzorky byly promyty v Tris-NaCl pufru (složení viz Použité roztoky a chemikálie, bylo použito 100 μl pufru/jamka). Pufr byl odstraněn a do jamek byl přidán nový Tris-NaCl pufr (složení viz Použité roztoky a chemikálie, bylo použito 100 μl pufru/jamka). Tento krok byl ještě 2x opakován.
J) Signál byl detekován pomocí čtečky destiček.
Použité roztoky a chemikálie
1. Tris-NaCl pufr
- 11 CZ 310672 B6 • 25 mmol.l-1 Tris-HCl, pH~7,2 • 150 mmol.l-1 NaCl • 0,1 % (hmotn./obj.) BSA • 0,05 % (obj ./obj.) Tween-20
Uvedené složky byly smíchány v destilované vodě. Pufr byl skladován při teplotě 4 °C.
Průmyslová využitelnost
Způsob stanovení aktivity enzymů přeměňujících cytosinové deriváty na uracilové deriváty v roztocích lze využít např. (i) při posouzení deaminační aktivity v různých vzorcích, (ii) při posouzení vlivu různých faktorů na deaminační aktivitu, nebo (iii) při hledání potenciálních inhibitorů aktivity buněčných deamináz.

Claims (10)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Způsob stanovení deaminázové aktivity enzymů přeměňuj ících cytosinové deriváty na uracilové deriváty ve vzorku in vitro a/nebo při nediagnostické metodě, vyznačující se tím, že testovaný vzorek se inkubuje se substrátem enzymu - 5-brom-2'-deoxycytidinem a/nebo 5-brom-2'deoxycytidin monofosfátem za vzniku 5-brom-2'-deoxyuridinu a/nebo 5-brom-2'-deoxyuridin monofosfátu, následně se vzorek inkubuje na teplotě vyšší než 60 °C, poté se vzorek inkubuje s 5brom-2'-deoxyuridinem ukotveným na povrchu nosiče v přítomnosti protilátky, která se váže na 5brom-2'-deoxyuridin, po inkubaci vzorku a protilátky s ukotveným 5-brom-2'-deoxyuridinem je z nosiče s ukotveným 5-brom-2'-deoxyuridinem odstraněn vzorek s protilátkou, v případě, že použitá protilátka není konjugována s fluorochromem, inkubuje se alternativně nosič s ukotveným 5-brom2'-deoxyuridinem se sekundární protilátkou, která se váže na protilátku navázanou na ukotvený 5brom-2'-deoxyuridin, přičemž tato sekundární protilátka je konjugována s fluorochromem, po této inkubaci je z nosiče s ukotveným 5-brom-2'-deoxyuridinem odstraněn roztok sekundární protilátky, přičemž signál fluorochromu poskytovaný navázanými protilátkami na ukotvený 5-brom-2'deoxyuridin je nepřímo úměrný deaminázové aktivitě.
  2. 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že ukotvený 5-brom-2'-deoxyuridin je součástí oligonukleotidového řetězce.
  3. 3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že se vzorek inkubuje s 5-brom-2'deoxycytidinem a pro stanovení koncentrace vzniklého 5-brom-2'-deoxyuridinu se připraví roztoky obsahující různé známé koncentrace 5-brom-2'-deoxyuridinu a tyto roztoky se inkubují s 5-brom2'-deoxyuridinem ukotveným na povrchu nosiče v přítomnosti protilátky, která se váže na 5-brom2'-deoxyuridin, po inkubaci roztoků a protilátky s ukotveným 5-brom-2'-deoxyuridinem je z nosiče s ukotveným 5-brom-2'-deoxyuridinem odstraněn roztok s protilátkou, v případě, že použitá protilátka není konjugována s fluorochromem, inkubuje se alternativně nosič s ukotveným 5-brom2'-deoxyuridinem se sekundární protilátkou, která se váže na protilátku navázanou na ukotvený 5brom-2'-deoxyuridin, přičemž tato sekundární protilátka je konjugována s fluorochromem, po této inkubaci je z nosiče s ukotveným 5-brom-2'-deoxuridinem odstraněn roztok sekundární protilátky, změří se signál poskytovaný navázanými protilátkami na ukotvený 5-brom-2'-deoxyuridin v jednotlivých roztocích se známými koncentracemi 5-brom-2'-deoxyuridinu a pomocí lineární nebo nelineární regrese se vypočte koncentrace vzniklého 5-brom-2'-deoxyuridinu v testovaném vzorku.
  4. 4. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že se vzorek inkubuje s 5-brom-2'deoxycytidin monofosfátem a pro stanovení koncentrace vzniklého 5-brom-2'-deoxyuridin monofosfátu se připraví roztoky obsahující různé známé koncentrace 5-brom-2'-deoxyuridin monofosfátu a tyto roztoky se inkubují s 5-brom-2'-deoxyuridinem ukotveným na povrchu nosiče v přítomnosti protilátky, která se váže na 5-brom-2'-deoxyuridin, po inkubaci roztoků a protilátky s ukotveným 5-brom-2'-deoxyuridinem je z nosiče s ukotveným 5-brom-2'-deoxyuridinem odstraněn roztok s protilátkou, v případě, že použitá protilátka není konjugována s fluorochromem, inkubuje se alternativně nosič s ukotveným 5-brom-2'-deoxyuridinem se sekundární protilátkou, která se váže na protilátku navázanou na ukotvený 5-brom-2'-deoxyuridin, přičemž tato sekundární protilátka je konjugována s fluorochromem, po této inkubaci je z nosiče s ukotveným 5-brom-2'-deoxyuridinem odstraněn roztok sekundární protilátky, změří se signál poskytovaný navázanými protilátkami na ukotvený 5-brom-2'-deoxyuridin z jednotlivých roztoků se známými koncentracemi 5-brom-2'deoxyuridin monofosfátu a pomocí lineární nebo nelineární regrese se vypočte koncentrace vzniklého 5-brom-2'-deoxyuridin monofosfátu v testovaném vzorku.
  5. 5. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že nosičem je povrch vícejamkové destičky nebo povrch magnetických částic.
  6. 6. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že 5-brom-2'-deoxyuridin je ukotven na nosič prostřednictvím vazby streptavidinu navázaného na povrchu nosiče a biotinu vázaného na 3' nebo 5' konci oligonukleotidu.
    - 13 CZ 310672 B6
  7. 7. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6, vyznačující se tím, že vzorek je vybrán ze skupiny zahrnující buněčné lyzáty, kultivační média, krevní plasma.
  8. 8. Sada pro stanovení deaminázové aktivity enzymů přeměňujících cytosinové deriváty na uracilové deriváty pro provedení způsobu podle nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že obsahuje 5 substrát enzymů přeměňujících cytosinové deriváty na uracilové deriváty 5-brom-2'-deoxycytidin a/nebo 5-brom-2'-deoxycytidin monofosfát, 5-brom-2'-deoxyuridin a/nebo 5-brom-2'-deoxyuridin monofosfát, a protilátku, která se váže na 5-brom-2'-deoxyuridin.
  9. 9. Sada pro stanovení deaminázové aktivity enzymu přeměňujícího cytosinové deriváty na uracilové deriváty podle nároku 8, vyznačující se tím, že protilátka je konjugována s 10 fluorochromem.
  10. 10. Sada pro stanovení deaminázové aktivity enzymu přeměňujícího cytosinové deriváty na uracilové deriváty podle nároku 8, vyznačující se tím, že sada obsahuje sekundární protilátku, která se váže na protilátku vázající se na 5-brom-2'-deoxyuridin, přičemž tato sekundární protilátka je konjugována s fluorochromem.
CZ2024-359A 2024-09-18 2024-09-18 Způsob určení aktivity enzymů přeměňujících cytosinové deriváty na uracilové deriváty v roztocích CZ310672B6 (cs)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2024-359A CZ310672B6 (cs) 2024-09-18 2024-09-18 Způsob určení aktivity enzymů přeměňujících cytosinové deriváty na uracilové deriváty v roztocích

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2024-359A CZ310672B6 (cs) 2024-09-18 2024-09-18 Způsob určení aktivity enzymů přeměňujících cytosinové deriváty na uracilové deriváty v roztocích

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ2024359A3 CZ2024359A3 (cs) 2026-04-15
CZ310672B6 true CZ310672B6 (cs) 2026-04-15

Family

ID=99396706

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ2024-359A CZ310672B6 (cs) 2024-09-18 2024-09-18 Způsob určení aktivity enzymů přeměňujících cytosinové deriváty na uracilové deriváty v roztocích

Country Status (1)

Country Link
CZ (1) CZ310672B6 (cs)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090325897A1 (en) * 2006-11-27 2009-12-31 University Of Miami Designer therapy of pancreatic tumors
CZ2014579A3 (cs) * 2014-08-26 2016-03-09 Univerzita PalackĂ©ho v Olomouci Způsob stanovení aktivity enzymů přeměňujících cytosinové deriváty na uracilové deriváty v buňkách, tkáních a organismech
US20240043564A1 (en) * 2014-06-26 2024-02-08 Hoffmann-La Roche Inc. Anti-brdu antibodies and methods of use

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090325897A1 (en) * 2006-11-27 2009-12-31 University Of Miami Designer therapy of pancreatic tumors
US20240043564A1 (en) * 2014-06-26 2024-02-08 Hoffmann-La Roche Inc. Anti-brdu antibodies and methods of use
CZ2014579A3 (cs) * 2014-08-26 2016-03-09 Univerzita PalackĂ©ho v Olomouci Způsob stanovení aktivity enzymů přeměňujících cytosinové deriváty na uracilové deriváty v buňkách, tkáních a organismech

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LIGASOVÁ, ANNA, ET AL.: "A new technique for the analysis of metabolic pathways of cytidine analogues and cytidine deaminase activities in cells", SCIENTIFIC REPORTS, vol. 13, no. 1, pages p20530, ISSN: 2332-2675 *
TUTTLE, ALEX H., ET AL.: "Immunofluorescent detection of two thymidine analogues (CldU and IdU) in primary tissue", JOURNAL OF VISUALIZED EXPERIMENTS, no. 46, pages e2166, ISSN: 1940-087X *

Also Published As

Publication number Publication date
CZ2024359A3 (cs) 2026-04-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20250147022A1 (en) Multiplexed Analyses of Test Samples
US12540355B1 (en) Nucleic acid reporter molecules for massively parallel DNA sequencing
US6515120B1 (en) Method for sequencing and characterizing polymeric biomolecules using aptamers and a method for producing aptamers
EP1030678B1 (en) High throughput method for functionally classifying proteins identified using a genomics approach
Rajendran et al. Selecting nucleic acids for biosensor applications
EP2272975B1 (en) Method for determination of dna methylation
US20240264154A1 (en) Single molecule assays for ultrasensitive detection of analytes
EP3995575A1 (en) Aptamer selection method and immunity analysis method using aptamer
Mashiyama et al. Uracil in DNA, determined by an improved assay, is increased when deoxynucleosides are added to folate-deficient cultured human lymphocytes
DE4027616A1 (de) Verfahren zur bestimmung von polymerase-aktivitaet
EP1490682B1 (en) Detection of dna-binding proteins
Ermert et al. Phosphate-modified nucleotides for monitoring enzyme activity
EP2971278A1 (en) Methods for determining multiple interactions between nucleic acids in a cell
KR20040036676A (ko) 시그날링 압타머의 시험관내 선별 방법
WO2001046693A2 (en) Screening under isothermal denaturing conditions
Kimoto et al. Site‐specific functional labeling of nucleic acids by in vitro replication and transcription using unnatural base pair systems
CZ2024359A3 (cs) Způsob určení aktivity enzymů přeměňujících cytosinové deriváty na uracilové deriváty v roztocích
US20020022228A1 (en) Method and test kit for analyzing DNA repair
WO2008024052A1 (en) A method and a kit for determination of an enzyme activity involved in metabolic production of a deoxynucleoside triphosphate and use thereof
CZ2014579A3 (cs) Způsob stanovení aktivity enzymů přeměňujících cytosinové deriváty na uracilové deriváty v buňkách, tkáních a organismech
US20050118593A1 (en) Method for detection and quantitative analysis of nucleic acid molecules comprising an extraction step with a strong base and applications
US20100105058A1 (en) Method for Measuring DNA Methylation
US20070065809A1 (en) Compositions and methods screening using populations of surrogate antibodies
DE4119075A1 (de) Nucleosidtriphosphorsaeureester und deren verwendung
Tagiri-Endo A colorimetric assay for inorganic pyrophosphate that is also useful for measuring product accumulation in polymerase chain reactions