CZ309775B6 - Selenizovaný kmen bakterie Lactococcus lactis subsp. lactis CCM 9190 - Google Patents
Selenizovaný kmen bakterie Lactococcus lactis subsp. lactis CCM 9190 Download PDFInfo
- Publication number
- CZ309775B6 CZ309775B6 CZ2022-263A CZ2022263A CZ309775B6 CZ 309775 B6 CZ309775 B6 CZ 309775B6 CZ 2022263 A CZ2022263 A CZ 2022263A CZ 309775 B6 CZ309775 B6 CZ 309775B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- strain
- selenium
- ccm
- selenized
- lactis
- Prior art date
Links
- 241000194041 Lactococcus lactis subsp. lactis Species 0.000 title claims abstract description 14
- 235000014969 Streptococcus diacetilactis Nutrition 0.000 title claims description 13
- 239000011669 selenium Substances 0.000 claims abstract description 80
- BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N Selenium Chemical compound [Se] BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 56
- 229910052711 selenium Inorganic materials 0.000 claims abstract description 54
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 11
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 claims abstract description 6
- 230000037213 diet Effects 0.000 claims abstract description 6
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 6
- 239000006041 probiotic Substances 0.000 claims abstract description 6
- 230000000529 probiotic effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 235000018291 probiotics Nutrition 0.000 claims abstract description 6
- 208000002720 Malnutrition Diseases 0.000 claims abstract description 5
- 235000018343 nutrient deficiency Nutrition 0.000 claims abstract description 5
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 claims abstract description 4
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 claims abstract description 4
- 239000011707 mineral Substances 0.000 claims abstract description 4
- 235000008476 powdered milk Nutrition 0.000 claims abstract description 4
- 235000013406 prebiotics Nutrition 0.000 claims abstract description 4
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims abstract description 4
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 claims abstract description 4
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 claims abstract description 4
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 claims abstract description 4
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 claims abstract description 4
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims description 21
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 4
- 229940091258 selenium supplement Drugs 0.000 description 47
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 26
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 25
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 22
- BVTBRVFYZUCAKH-UHFFFAOYSA-L disodium selenite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-][Se]([O-])=O BVTBRVFYZUCAKH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 20
- 229960001471 sodium selenite Drugs 0.000 description 20
- 239000011781 sodium selenite Substances 0.000 description 20
- 235000015921 sodium selenite Nutrition 0.000 description 20
- 229940082569 selenite Drugs 0.000 description 17
- MCAHWIHFGHIESP-UHFFFAOYSA-L selenite(2-) Chemical compound [O-][Se]([O-])=O MCAHWIHFGHIESP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 17
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 10
- 238000001095 inductively coupled plasma mass spectrometry Methods 0.000 description 10
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 9
- 238000000034 method Methods 0.000 description 9
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 8
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 7
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 7
- 229940065287 selenium compound Drugs 0.000 description 7
- 150000003343 selenium compounds Chemical class 0.000 description 7
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 6
- JULROCUWKLNBSN-UHFFFAOYSA-N selenocystine Chemical compound OC(=O)C(N)C[Se][Se]CC(N)C(O)=O JULROCUWKLNBSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 5
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 5
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 5
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 5
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 5
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 5
- ZKZBPNGNEQAJSX-UHFFFAOYSA-N selenocysteine Natural products [SeH]CC(N)C(O)=O ZKZBPNGNEQAJSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 241000194035 Lactococcus lactis Species 0.000 description 3
- RJFAYQIBOAGBLC-BYPYZUCNSA-N Selenium-L-methionine Chemical compound C[Se]CC[C@H](N)C(O)=O RJFAYQIBOAGBLC-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- RJFAYQIBOAGBLC-UHFFFAOYSA-N Selenomethionine Natural products C[Se]CCC(N)C(O)=O RJFAYQIBOAGBLC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000014897 Streptococcus lactis Nutrition 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 3
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 3
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 238000009343 monoculture Methods 0.000 description 3
- 229960002718 selenomethionine Drugs 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 238000013334 tissue model Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- BPMQPNDTZAMGQX-ZZJOKYKRSA-N (2r)-2-amino-3-[[(2r)-2-amino-2-carboxyethyl]diselanyl]butanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)C(C)[Se][Se]C[C@H](N)C(O)=O BPMQPNDTZAMGQX-ZZJOKYKRSA-N 0.000 description 2
- FDKWRPBBCBCIGA-REOHCLBHSA-N (2r)-2-azaniumyl-3-$l^{1}-selanylpropanoate Chemical compound [Se]C[C@H](N)C(O)=O FDKWRPBBCBCIGA-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- NBWRJAOOMGASJP-UHFFFAOYSA-N 2-(3,5-diphenyl-1h-tetrazol-1-ium-2-yl)-4,5-dimethyl-1,3-thiazole;bromide Chemical compound [Br-].S1C(C)=C(C)N=C1N1N(C=2C=CC=CC=2)N=C(C=2C=CC=CC=2)[NH2+]1 NBWRJAOOMGASJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000186000 Bifidobacterium Species 0.000 description 2
- FDKWRPBBCBCIGA-UWTATZPHSA-N D-Selenocysteine Natural products [Se]C[C@@H](N)C(O)=O FDKWRPBBCBCIGA-UWTATZPHSA-N 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000194036 Lactococcus Species 0.000 description 2
- 108010053775 Nisin Proteins 0.000 description 2
- NVNLLIYOARQCIX-MSHCCFNRSA-N Nisin Chemical compound N1C(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)C(=C)NC(=O)[C@@H]([C@H](C)CC)NC(=O)[C@@H](NC(=O)C(=C/C)/NC(=O)[C@H](N)[C@H](C)CC)CSC[C@@H]1C(=O)N[C@@H]1C(=O)N2CCC[C@@H]2C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]2C(NCC(=O)N[C@H](C)C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCSC)C(=O)NCC(=O)N[C@H](CS[C@@H]2C)C(=O)N[C@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](CCSC)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]2C(N[C@H](C)C(=O)N[C@@H]3C(=O)N[C@@H](C(N[C@H](CC=4NC=NC=4)C(=O)N[C@H](CS[C@@H]3C)C(=O)N[C@H](CO)C(=O)N[C@H]([C@H](C)CC)C(=O)N[C@H](CC=3NC=NC=3)C(=O)N[C@H](C(C)C)C(=O)NC(=C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(O)=O)=O)CS[C@@H]2C)=O)=O)CS[C@@H]1C NVNLLIYOARQCIX-MSHCCFNRSA-N 0.000 description 2
- XDSSPSLGNGIIHP-VKHMYHEASA-N Se-methyl-L-selenocysteine Chemical compound C[Se]C[C@H]([NH3+])C([O-])=O XDSSPSLGNGIIHP-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 239000003674 animal food additive Substances 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 2
- 210000004922 colonic epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 2
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- HHEAADYXPMHMCT-UHFFFAOYSA-N dpph Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC([N+](=O)[O-])=CC([N+]([O-])=O)=C1[N]N(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 HHEAADYXPMHMCT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 2
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 231100001231 less toxic Toxicity 0.000 description 2
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000004309 nisin Substances 0.000 description 2
- 235000010297 nisin Nutrition 0.000 description 2
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 2
- AICOOMRHRUFYCM-ZRRPKQBOSA-N oxazine, 1 Chemical compound C([C@@H]1[C@H](C(C[C@]2(C)[C@@H]([C@H](C)N(C)C)[C@H](O)C[C@]21C)=O)CC1=CC2)C[C@H]1[C@@]1(C)[C@H]2N=C(C(C)C)OC1 AICOOMRHRUFYCM-ZRRPKQBOSA-N 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 229940055619 selenocysteine Drugs 0.000 description 2
- 235000016491 selenocysteine Nutrition 0.000 description 2
- 230000001953 sensory effect Effects 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 description 2
- 229910052714 tellurium Inorganic materials 0.000 description 2
- PORWMNRCUJJQNO-UHFFFAOYSA-N tellurium atom Chemical compound [Te] PORWMNRCUJJQNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000283763 Acetobacter aceti Species 0.000 description 1
- 235000007847 Acetobacter aceti Nutrition 0.000 description 1
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 1
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 1
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 1
- 108010062877 Bacteriocins Proteins 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 206010052360 Colorectal adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 1
- 241000194033 Enterococcus Species 0.000 description 1
- 241000194031 Enterococcus faecium Species 0.000 description 1
- 102100031416 Gastric triacylglycerol lipase Human genes 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 206010051925 Intestinal adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 1
- 239000001968 M17 agar Substances 0.000 description 1
- 240000002129 Malva sylvestris Species 0.000 description 1
- 235000006770 Malva sylvestris Nutrition 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N Nitric acid Chemical compound O[N+]([O-])=O GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000002225 anti-radical effect Effects 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 210000000941 bile Anatomy 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000001842 enterocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 235000019985 fermented beverage Nutrition 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 210000004051 gastric juice Anatomy 0.000 description 1
- 108010091264 gastric triacylglycerol lipase Proteins 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 230000007407 health benefit Effects 0.000 description 1
- 230000002443 hepatoprotective effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 210000002490 intestinal epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 1
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 1
- DLBFLQKQABVKGT-UHFFFAOYSA-L lucifer yellow dye Chemical compound [Li+].[Li+].[O-]S(=O)(=O)C1=CC(C(N(C(=O)NN)C2=O)=O)=C3C2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC3=C1N DLBFLQKQABVKGT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 244000005706 microflora Species 0.000 description 1
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N n'-amino-n-iminomethanimidamide Chemical compound N\N=C\N=N VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N 0.000 description 1
- 229910017604 nitric acid Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical group 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- -1 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N renifolin D Natural products CC(=C)[C@@H]1Cc2c(O)c(O)ccc2[C@H]1CC(=O)c3ccc(O)cc3O BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- QYHFIVBSNOWOCQ-UHFFFAOYSA-N selenic acid Chemical compound O[Se](O)(=O)=O QYHFIVBSNOWOCQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GYSDUVRPSWKYDJ-UHFFFAOYSA-N selinone Chemical compound C1=CC(OCC=C(C)C)=CC=C1C1OC2=CC(O)=CC(O)=C2C(=O)C1 GYSDUVRPSWKYDJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 150000003536 tetrazoles Chemical class 0.000 description 1
- 238000004627 transmission electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P3/00—Preparation of elements or inorganic compounds except carbon dioxide
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
Abstract
Průmyslový kmen bakterie Lactococcus lactis subsp. lactis obohacený selenemuložený v České sbírce mikroorganismů, Kamenice 5, Brno, pod číslem CCM 9190 a prostředek obsahující tento kmen pro prevenci a/nebo ošetření stavů způsobených nutričním deficitem selenu v dietě. Prostředek může obsahovat i další probiotické kmeny, základní kultury, případně prebiotika, sušené mléko, vitamíny nebo minerální látky.
Description
Selenizovaný kmen bakterie Lactococcus lactis subsp. lactis CCM 9190
Oblast techniky
Vynález se týká selenizovaných, tj. selenem-obohacených bakteriálních buněk kmene Lactococcus lactis subsp. lactis CCM 9190, které slouží jako zdroj biologicky dostupných forem selenu (Se), kterými jsou především organické sloučeniny Se a nanočástice elementárního Se. Vynález obsahuje kmen ve formě živých, příp. inaktivovaných buněk, pro použití jako přípravek pro prevenci a/nebo ošetření stavů způsobených nutričním deficitem selenu v dietě.
Dosavadní stav techniky
Pro účely lidské výživy je možná suplementace doplňků stravy na bázi anorganického Se dle Nařízení Komise (ES) č. 1170/2009. Podle uvedeného nařízení je možná také suplementace organicky-vázaného Se, a to formou selenem-obohacených, tzv. selenizovaných kvasnic. Takto obohacené kvasnice tvoří součást některých doplňků stravy vyskytujících se v tržní síti. Nicméně, nedostatek těchto preparátů spočívá v tom, že se zde vyskytují kvasnice v inaktivované formě, tj. nepřinášejí konzumentům další benefity, např. dodání živých, prospěšných mikroorganismů, které mohou kolonizovat střevní trakt, a uplatnit se jako probiotika.
Selenizace kvasinek a bakterií mléčného kvašení (BMK) poskytuje výhody, jako jsou následující: i) dodání Se pro biologické procesy; ii) zvýšená biologická dostupnost Se ve formě méně toxických organických sloučenin nebo ve formě nanočástic; iii) individuální zdravotní přínosy BMK a kvasinek v živých nebo inaktivovaných formách (např. produkce organických kyselin, probiotická funkce, produkce antimikrobiálních sloučenin, bakteriocinů atd.
Schopnost transformovat anorganický Se mají kromě kvasinek také BMK, a potenciál Seobohacených BMK, jak naznačují mnohé studie, např. hepatoprotektivní účinek (Yi a kol., 2020), antibakteriální aktivita (Yang a kol., 2009) a další. Selenizované BMK mohou tedy kromě dodání Se v jeho lépe biologicky dostupné a méně toxické, organické formě představovat také zdroj probioticky působících bakterií. Mezi BMK patří rody, jako např. Lactobacillus, Lactococcus, Enterococcus a další. Zejména koky (např. laktokoky z rodu Lactococcus) jsou odolnější vůči působení seleničitanu v růstovém médiu, např. ve srovnání s tyčinkami nebo bifidobakteriemi, které jsou na přítomnost Se v médiu mnohem citlivější. Navíc, koky lépe odolávají také podmínkám lyofilizace, a počty životaschopných buněk u kmene CCM 9190 dosahují cca 109 kolonie-tvořících jednotek (KTJ/g).
Kmen CCM 9190 je součástí startérových mlékařských kultur na výrobu fermentovaných nápojů a některých sýrů. Kmen je dlouhodobě používán v mlékárenském průmyslu pro jeho výhodné senzorické, zejména aromatvorné vlastnosti. Kromě příznivých technologických a senzorických vlastností se kmen vyznačuje také významnou produkcí nisinu a prokázán byl jeho signifikantní antiklostridiální účinek (Havlíková a kol., 2017 a 2018).
Jelikož růstová schopnost v přítomnosti selenu, a tím i tolerance k Se, jako i další vlastnosti (schopnost biotransformovat a zabudovávat do jednotlivých Se-sloučenin a Se-nanočástic) jsou kmenově specifické, je účelem vynálezu získání kmene poskytujícího nejlepší zdroj organicky vázaného selenu, jak z pohledu akumulace Se, distribuce Se-sloučenin a co nejmenší cytotoxicity těchto Se-sloučenin, příp. elementárních forem Se. Navíc, obohacení kmene selenem umožní také zvýšení antioxidační kapacity kmene.
Popsány a patentovány jsou v současné době preparáty různých selenizovaných kmenů jako krmných aditiv, zejména pro použití u zvířat. Ve většině případů se jedná o obohacení pouze přidáním anorganického Se. V případě obohacení selenizovanými kmeny se jedná o směsné
- 1 CZ 309775 B6 preparáty různých BMK, kvasinek, octových bakterií a bifidobakterií, taky pro použití v krmných aditivech, např. směsná kultura Enterococcus faecium a Lactococcus lactis subsp. lactis. Nevýhodou těchto preparátů je to, že se jedná o směsi, a tudíž se nejedná o monokulturu, tj. jeden specifický kmen. Kromě obohacení selenem, uvedené kmeny, na rozdíl od selenizovaného kmene CCM 9190 nedisponují dalšími příznivými vlastnostmi (např. produkce nisinu, antiklostridiální působení, vhodné technologické a aromatvorné vlastnosti pro aplikaci jako startérové kultury apod.). Také nejsou dostatečně popsány funkční a probiotické vlastnosti těchto selenizovaných kmenů (např. zlepšení antioxidačních vlastností a dalších v důsledku obohacení selenem).
Podstata vynálezu
Výše uvedené nedostatky odstraňuje selenem-obohacený kmen bakterie Lactococcus lactis subsp. lactis, který byl vyselektován ze souboru testovaných 18 kmenů na základě jeho příznivých vlastností za účelem selenizace. Kmen byl deponován v České sbírce mikroorganismů (CCM) v Brně, která má statut mezinárodního ukládacího místa pro patentové kultury ukládané podle Budapešťské smlouvy, pod číslem CCM 9190.
Kmen se vyznačuje: a) dobrou schopností vázat a akumulovat anorganický selen z růstového média, b) produkcí organických forem selenu, ve formě seleno-aminokyselin a Se-nanočástic, c) zlepšenými antioxidačními vlastnostmi vlivem selenizace, d) nízkou toxicitou a dobrou schopností prostupu přes buněčné membrány, a f) dobrou adhezí na tkáňový model lidských epiteálních buněk tlustého střeva in vitro.
Objasnění výkresů
Vynález bude blíže osvětlen pomocí výkresů, kde obr. 1 představuje postup přípravy selenizovaných kmenů. Obr. 2 představuje chromatogramy enzymatického extraktu kmene CCM 9190 rostoucího v médiu o koncentraci seleničitanu sodného 10 mg/l (A) a 50 mg/l (B). Jednotlivé sloučeniny jsou označeny zkratkami: selenan (SeVI), seleničitan (SeIV), selenocystin (SeCys2), methylselenocystin (MeSeCys), selenomethionin (SeMet) a neidentifikované sloučeniny (N1 až N6). Obr. 3 ukazuje suspenzi selenem obohacených buněk před lyofilizací. Koncentrace seleničitanu sodného v médiu 10 mg/l (A) a 50 mg/l (B). Obr. 4 ukazuje snímky provedeny pomocí transmisního elektronového mikroskopu (TEM) (1), distribuce velikostí nanočástic na základě TEM (2) a na základě sp-ICP-MS (3) pro kmen rostoucí v médiu o koncentraci seleničitanu sodného 10 mg/l (A) a 50 mg/l (B). Obr. 5 ukazuje koncentrace selenu ve formě seleničitanu, selenocystinu a neidentifikované sloučeniny N1 v odebraných vzorcích na apikální straně (čas 0 hod) a na bazolaterální straně (časy 0,5; 1; 1,5; 2; 3; 4 h). Jak je patrné z grafů, dochází ke zvýšení propustnosti seleničitanu mezi 30 min s maximálním průchodem po 2 h po podání dárcovského roztoku, následně je vidět sestupná tendence koncentrace mezi 2 a 4 h po přidání dárcovského roztoku. U selenocysteinu je patrné, že z koncentrace v dárcovském roztoku se jen pomalu zvyšuje koncentrace selenocysteinu na basolaterární straně po průchodu přes buněčnou monovrstvu. A s postupujícím časem koncentrace lineárně roste. V testované trávenině byl zaznamenám i neznámý vzorek selenu, kdy jeho vrchol koncentrace byl 1,5 h po přidání dárcovského roztoku, následně se koncentrace snižovala. Na obr. 6 je zobrazen vliv přídavku 0 až 100 mg/l seleničitanu sodného na růst kmene Lactococcus lactis subsp. lactis CCM9190 v M17 bujonu při 30 °C. Graf na obr. 7 ukazuje srovnání cytotoxicity selenizovaného kmene CCM 9190 a seleničitanu sodného. Na obr. 8 jsou zobrazeny adhezní schopnosti selenizovaného kmene CCM 9190 po přídavku 10 a 30 mg/l seleničitanu sodného.
- 2 CZ 309775 B6
Příklady uskutečnění vynálezu
Příklad 1
V jednom provedení vynálezu je kmen ve formě biologicky čisté, lyofilizované kultury (obr. 1), jako monokultura kmene Lactococcus lactis subsp. lactis CCM 9190).
Příklad 2
V jiném provedení vynálezu je kmen ve formě inaktivovaných buněk monokultury kmene Lactococcus lactis subsp. lactis CCM 9190 v lyofilizované formě.
Příklad 3
V dalším provedení vynálezu je kmen obsažen v přípravku, který obsahuje i další probiotické kmeny, základní kultury, případně různá prebiotika, sušené mléko, vitamíny nebo minerální látky. Kmen může být součástí tablet, kapslí, prášku nebo potravin, jako jsou např. mléčné výrobky.
Příklad 4
Vynález poskytuje kmen ve formě živých nebo inaktivovaných buněk, jako prostředek pro doplnění selenu v případě jeho deficitu v dietě.
Pracovní postup:
a) identifikace a typizace kmene
Lactococcus lactis subsp. lactis CCM 9190 je deponován v České sbírce mikroorganismů (CCM) na Přírodovědecké fakultě Masarykovy univerzity, na Ústavu experimentální biologie, Kamenice 5, 625 00 Brno.
Kmen je identifikován jako Lactococcus lactis subsp. Lactis pomocí API 50CHL (Biomérieux, Francie), identifikace potvrzena také druhově specifickou PCR; a 16S rRNA (anotovaná sekvence uložena v GenBank pod číslem OM475720). Mikroskopicky se jedná o drobné koky, ojediněle tvoří kratší řetízky koků a tvoří součást mikroflóry základních smetanových kultur.
b) příprava selenem-obohaceného kmene CCM 9190 (selenizace)
Lyofilizovaný kmen Lactococcus lactis subsp. Lactis CCM 9190 se před selenizací nejprve obnoví v M17 buj onu při 30 °C a třikrát se přeočkuje. Poté se M17 buj on s přídavkem seleničitanu sodného inokuluje kmenem v exponenciální fázi růstu a kultivuje se po dobu 24 hodin, viz obr. 1. Selenizované buňky pro další analýzy se dvakrát promyjí sterilní deionizovanou vodou a separují se pomocí centrifugace po dobu 5 minut při zrychlení 4100 g. Následně je selenizovaný kmen zlyofilizován a jsou stanoveny počty živých bakterií plotnovou metodou na M17 agaru při teplotě 30 °C po dobu 48 hodin. Také je stanoven obsah selenu i jednotlivých seleno-sloučenin a selenonanočástic.
c) Vliv různých koncentrací seleničitanu sodného na růst kmene Lactococcus lactis subsp. Lactis CCM 9190
Inhibiční vliv seleničitanu sodného na viabilitu testovaného kmene byl posuzován na základě spektrofotometrického měření změny absorbance při vlnové délce 620 nm během 24-hodinové kultivace při teplotě 30 °C v M17 bujonu s různými koncentracemi seleničitanu sodného (0, 5, 10, 30, 50 a 100 mg/l). Z výsledků je patrný minimální inhibiční efekt za přítomnosti seleničitanu
- 3 CZ 309775 B6 sodného na růst kmene Lactococcus lactis subsp. lactis CCM 9190, kdy došlo jen k mírnému posunu logaritmické fáze růstu a k nepatrnému snížení počtů mikroorganismů v závislosti na zvyšující se koncentraci seleničitanu sodného v médiu. Výsledky jsou graficky zpracovány na grafu na obr. 6.
d) Vliv selenu na antioxidační aktivitu kmene CCM 9190
Antioxidační aktivita selenizovaného a neselenizovaného kmene CCM 9190 byla stanovena pomocí metody DPPH, která je jednou ze základních metod pro posouzení antiradikálové aktivity. Je založena na reakci testovaného vzorku s DPPH (1,1-difenyl-2-(2,4,6-trinitrofenyl)hydrazyl). Změna absorbance byla stanovena spektrofotometricky při vlnové délce 517 nm. Při porovnání změny antioxidační aktivity selenizovaného (42,4 ±9,9 %) a neselenizovaného (24,8 ±8,6 %) kmene CCM 9190 bylo zjištěno statisticky významné (P <0,05) zvýšení antioxidační aktivity u kmene po selenizaci.
e) akumulace selenu a distribuce seleno-sloučenin v selenem-obohacených bakteriálních buňkách kmene CCM 9190
Celkové množství selenu v lyofilizované kultuře bylo stanoveno metodou hmotnostní spektrometrie s indukčně vázaným plazmatem (ICP-MS) po rozkladu vzorku koncentrovanou HNO3 v mikrovlnném mineralizátoru. Obsah jednotlivých sloučenin selenu pak byl stanoven spojením kapalinové chromatografie s ICP-MS po extrakci proteázou XXIII v Tris-HCl pufru (pH = 7,5) po dobu 24 h při 37 °C (podrobný postup viz Kantorová a kol., 2022). Selen byl v obou případech měřen na linii m /z = 80 a jako vnitřní standard byl použit tellur měřený na linii m /z = 128. Charakterizován byl kmen, který byl kultivován aerobně 24 h při 37 °C v mediu se seleničitanem sodným o koncentracích 10 a 50 mg/l.
Celkový obsah selenu byl u kmene CCM 9190 selenizovaného v médiu s obsahem 50 mg/l seleničitanu významně vyšší (43±15 mg/g) než v médiu s obsahem 10 mg/l seleničitanu (3,85±0,69 mg/g). V extraktech byl identifikován selen ve formě seleničitanu, selenanu, selenocystinu, methylselenocysteinu a selenomehioninu. Dalších šest nalezených sloučenin nebylo identifikováno. Relativní zastoupení jednotlivých sloučenin selenu vzhledem k celkovému obsahu selenu v extraktu se však mezi kmeny selenizovanými v médiích s obsahem selenu 10 a 50 mg/l seleničitanu významně neliší viz, tab.1 a obr. 2A a 2B.
Tab. 1: Chromatogram, celkový obsah selenu, Se-sloučeniny
Celkový obsah selenu, obsah jednotlivých sloučeniny selenu a extrakční účinnost. Hodnoty jsou uváděny jako průměr doplněný rozšířenou nejistotou za symbolem ± nebo směrodatnou odchylkou uvedenou v závorce. Hodnoty jsou vztaženy na lyofilizovaný vzorek. Indexem „N“ jsou označeny sloučeny, jejichž struktura nebyla zatím objasněna.
Koncentrace seleničitanu v médiu | 10 mg/l | 50 mg/l |
Celkový obsah Se | 3,85±0,69 mg/g | 43±15 mg/g |
Obsah Se ve formě selenanu | 0,984 (0,039) μg/g | 4,0 (1,7) μg/g |
Obsah Se ve formě seleničitanu | 8,42 (0,88) μg/g | 3,27 (0,17) μg/g |
Obsah Se ve formě selenocystinu | 92,1 (5,5) μg/g | 36,2 (3,4) μg/g |
Obsah Se ve formě sloučeniny N1 | 54,6 (5,3) μg/g | 37,5 (5,2) μg/g |
Obsah Se ve formě methylselenocysteinu | 5,45 (0,29) μg/g | 3,10 (0,19) μg/g |
Obsah Se ve formě sloučeniny N2 | 2,79 (0,41) μg/g | 1,15 (0,12) μg/g |
Obsah Se ve formě sloučeniny N3 | 8,63 (0,20) μg/g | 10,7 (1,5) μg/g |
Obsah Se ve formě sloučeniny N4 | 1,86 (0,44) μg/g | 1,45 (0,89) μg/g |
Obsah Se ve formě sloučeniny N5 | 4,2 (1,2) μg/g | 2,1 (2,9) μg/g |
Obsah Se ve formě selenomethioninu | 6,54 (0,91) μg/g | 4,72 (0,46) μg/g |
- 4 CZ 309775 B6
Obsah Se ve formě sloučeniny N6 | 1,26 (0,10) μg/g | 1,41 (0,22) μg/g |
Celkový obsah Se v extraktu | 356 ± 55 μg/g | 202 ± 41 μg/g |
Extrakční účinnost * | 9,2 ± 1,1 % | 0,47 ± 0,09 % |
* nízká extrakční účinnost je dána přítomností nanočástic selenu, které jsou z extraktu před speciační analýzou odfiltrovány.
f) produkce nanočástic selenu kmenem CCM 9190 a jejich charakterizace
Nanočástice selenu byly charakterizovány z hlediska velikosti a struktury transmisní elektronovou mikroskopií (TEM), a z hlediska velikosti a číselné koncentrace metodou ICP-MS v režimu měření jednotlivých částic (sp-ICP-MS). Vzorky pro měření metodou sp-ICP-MS byly připravovány tak, že bylo naváženo 0,005 g lyofilizovaného do polyethylenové zkumavky, bylo přidáno 5 ml 1 % (v/v) methanol a vzorek byl sonikován v ultrazvukové lázni po dobu 20 min. Poté byl vzorek zředěn 250* 1 % (v/v) metanolem a ihned analyzován. V případě měření TEM byl vzorek dispergován a ředěn stejným způsobem, avšak pouze v demineralizované vodě. Vzorek byl pak nanesen na měděnou mřížku (velikost 300 mesh), vysušen a analyzován. Pro charakterizaci byl použit kmen, který byl kultivován aerobně 24 h při 37 °C v mediu se seleničitanem sodným o koncentracích 10 a 50 mg/l.
Nanočástice selenu pozorované u kmene CCM 9190 byly produkovány extracelulárně. Podíl selenu ve formě nanočástic na celkovém obsahu selenu byl u kmene CCM 9190 selenizovaného v médiu s obsahem 50 mg/l seleničitanu významně vyšší (68±14 %) než v médiu s obsahem 10 mg/l seleničitanu (36±5 %). To je dáno jak produkcí většího počtu nanočástic (6,5±2,6) * 1011 g-1 v médiu s obsahem 50 mg/l seleničitanu a 2,31±0,54) * 1011 g-1 v médiu s obsahem 50 mg/l seleničitanu), tak produkcí částic o větším průměru (171±60 nm v médiu s obsahem 50 mg/l seleničitanu a 98±34 nm v médiu s obsahem 50 mg/l seleničitanu, viz obr. 3 a 4. Vyšší obsah nanočástic selenu se projevuje také výraznějším červeným zabarvením suspenze buněk.
Tab. 2: Velikosti a číselné koncentrace nanočástic a jejich zastoupení ve vzorku.
koncentrace seleničitanu sodného v médiu (mg/D | průměr nanočástic na základě TEM (nm) | průměr nanočástic na základě sp-ICP-MS (nm) | číselná koncentrace nanočástic na základě spICP-MS (g-1) | celkový obsah selenu ve formě nanočástic (mg^ | podíl obsahu selenu ve formě nanočástic na celkovém obsahu selenu (%) |
10 | 99 ± 18 | 98 ± 34 | (2,31 ± 0,54) * 1011 | 1,39 ± 0,29 | 36 ± 5 |
50 | 167 ± 19 | 171 ± 60 | (6,5 ± 2,6) * 1011 | 29,2 ± 5,9 | 68 ± 14 |
Hodnoty jsou uváděny jako průměr ± rozšířená nejistota. Hodnoty jsou vztaženy na lyofilizovaný vzorek. Průměrná velikost nanočástic je uváděna jako maximum normálního rozdělení (pro TEM) a logaritmicko-normálního rozdělení (pro sp-ICP-MS) proloženého histogramem naměřených velikostí.
g) simulace průchodu selenem-obohaceného kmene CCM 9190 trávicím traktem v in vitro podmínkách
Trávení proběhlo podle standardizovaného in vitro statického modelu trávení INFOGEST, rozděleného na orální, žaludeční a intestinální fázi. V orální části bylo naváženo 5 g lyofilizovaného vzorku a následně přidáno 5 ml simulované slinné šťávy (chlorid vápenatý 1,5mM, slinná amyláza 75 jednotek/ml). Po 2-minutové inkubaci byla přidána žaludeční šťáva (pepsin 2 000 jednotek, gastrická lipáza jednotek/ml, chlorid vápenatý s výslednou koncentrací 0,15 mmol/l) a bylo sníženo pH na 3,0. Vzorek byl 2 hodiny inkubován ve vodní lázni při 37 °C s pravidelným promícháním vzorku. Po dvou hodinách byla přidána simulovaná střevní šťáva
- 5 CZ 309775 B6 (chlorid vápenatý 0,6 mmol/1, žluč 10 mmol/1, pankreatin 100 jednotek/ml) a upraveno pH na 7,0 s následnou 2hodinovou inkubací při 37 °C s průběžným mícháním vzorku. Po ukončení testu byl trávicí proces ukončen zamražením vzorku na -80 °C (Brodkorb et al. 2019), vzorky byly zamraženy až do dalšího testování.
h) stanovení cytotoxicity selenem-obohaceného kmene CCM 9190 v in vitro podmínkách za použití tkáňového modelu
Buněčné linie HT29 a Caco-2 byly kultivovány pomocí modifikované metody dle Mosmann (1983). Ke stanovení cytotoxicity bylo využito žluté rozpustné tetrazolové soli 3-(4,5dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyl tetrazol bromid (MTT). MTT vytváří v mitochondriích živých buněk rozpustné fialové krystaly hvězdicovitého tvaru nazývané formazán, který je následně rozpuštěn prostřednictvím dimethylsulfoxidu a spektrofotometricky měřen při vlnové délce 555 nm na přístroji Tecan Infinite M Nano+ (Tecan, Austria). Naměřená absorbance je lineárně úměrná množství buněk, které v roztoku přežily.
Pro testování cytotoxicity byl použit kmen, který byl kultivován aerobně 24 h při 37 °C v médiu se seleničitanem sodným o koncentracích 0, 5, 10 a 30 mg/l. Následně byl kmen centrifúgován při 2000 RPM 10 min a 3X promyt 5 ml Dulbecco's Phospate Buffered Saline (PBS). Dále byl kmen o všech koncentracích dle potřeby naředěn na stejnou optickou denzita a zlyzovány v lázni při 80 °C 20 min. Po následném zchlazení byl kmen ještě jednou centrifúgován, bylo odstraněno PBS a nahrazeno stejným množstvím média Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose (EMEM) (Sigma - Aldrich CZ) s přídavky 10 % Fetal Bovine Serum (Sigma - Aldrich CZ), 1 % hydrogenuhličitanu sodného (Sigma - Aldrich CZ), 1 % pyrváta sodného (Sigma - Aldrich CZ), 1 % neesenciálních aminokyselin (Sigma - Aldrich CZ). Takto připravený kmen byl pipeto ván po jednotlivých koncentracích seleničitanu na 96 - jamkovou destičku s buněčnými liniemi Caco-2 a HT29 v poměru 9:1. Jako kontrola bylo použito obohacené medium DMEM bez přidaného kmene. Destička byla kultivována 72 h při 37 °C a 5 % CO2.
Zvolené koncentrace 0, 5 a 10 mg/l seleničitanu sodného nevykazovaly žádné toxické účinky na testovaných buněčných liniích, koncentrace 30 mg/l seleničitanu sodného již vykazovala toxické účinky na testovaných buněčných liniích patrné. Z dostupných údajů lze říct, že přídavek selenemobohaceného kmene až o koncentraci 10 mg/L může být považován za bezpečný. Výsledky jsou znázorněny v grafu na obr. 7.
ch) stanovení prostupu seleno-sloučenin vytvořených kmenem CCM 9190 přes slizniční membrány in vitro
Propustnost přes buňky střevního epithelu byla stanovena na buněčné linii Caco-2. Caco-2 je buněčná linie, která se získává z lidského kolorektálního adenokarcinomu. Ačkoli se jedná o buňky rakovinného původu, velmi se podobají lidským intestinálním enterocytům a hodnoty permeability získané pomocí Caco-2 modelu korelují s absorpcí účinné látky v lidském organismu. Inserty před vlastním vysetím buněk byly na apikální straně navlhčeny kompletním DMEM mediem a po 2 minutách bylo přidáno medium s koncentrací buněk 0,6 x 106 buněk/ml. Následně bylo přidáno medium na bazolaterální stranu. Po 6 hodinách došlo k výměně media na obou stranách pro
-6CZ 309775 B6 odstranění neadherovnaých buněk. Inserty byly kultivovány 21 dnů, aby došlo ke vzniku z morfologického a fyziologického hlediska plně vyvinuté konfluentní buněčné monovrstvy. První dva týdny probíhalo krmení každý druhý den, kdy bylo kompletní DMEM medium měněno na apikální i bazolaterální straně. Poslední týden byly inserty s buněčnou vrstvou krmeny každý den, kdy bylo medium měněno na apikální i bazolaterální straně. Poslední výměna media před vlastním pokusem byla provedena nejpozději 16 hodin před samotným experimentem.
V den pokusu byly inserty přeneseny do nové destičky a 3* promyty pomocí HBSS (Hank’s Balanced Salt Solution) s pH 7,4. Následně bylo na apikální a bazolaterální stranu přidáno 500 ml čerstvého HBSS a byla změřena hodnota transepiteliální elektrické rezistence (TEER). Následně byla přidána Luciferová žluť o koncentraci 25 μmol/l a destička byla inkubována na orbitální třepačce umístěné v inkubátoru po dobu 1 hodiny při 150 rpm. Z bazolaterální strany byl odebrán vzorek, který byl následně změřen při vlnové délce 480 nm/530 nm. Inserty, ve kterých byla integrita více než 95 %, byly zařazeny do testu.
Před vlastním testem byly inserty opět 3* promyty HBSS. Následně byl připraven dárcovský roztok s testovaným vzorkem, kdy bylo smícháno 400 μl HBSS a 100 μ] tráveniny s testovaným vzorkem. 500 μl takto připraveného vzorku bylo přidáno na apikální stranu. Na bazolaterální stranu bylo přidáno 500 μl čistého HBSS. Z apikální strany bylo ihned odebráno 50 μl vzorku jako čas 0 h. Následně byla destička inkubována při 37 °C na orbitální třepačce umístěné v inkubátoru při 150 rpm. V časech 0,5; 1; 1,5; 2; 3; 4 h bylo odebráno z bazolaterální strany vždy 250 μl vzorku, který byl okamžitě zamražen. Odebraný objem byl vždy nahrazen 250 μl čistého HBSS. Po ukončení pokusu byl odebrán i zbytek z apikální strany a vzorky zamraženy. Inserty byly následně 3* promyty HBSS a poté sklizeny pomoci metanolu a také zamraženy. Všechny takto připravené vzorky byly skladovány při -80 °C až do stanovení obsahu jednotlivých sloučenin selenu spojením kapalinové chromatografie s ICP-MS. Vzorek byl analyzován přímo bez jakékoliv další úpravy. Selen byl v obou případech měřen na linii m /z = 80 a jako vnitřní standard byl použit tellur měřený na linii m /z = 128. Popis k testování permeability je uveden při popisu obr. 5, v kapitole „Objasnění výkresů“.
i) adheze selenizovaného kmene CCM 9091 na tkáňový model lidských epiteliálních buněk tlustého střeva in vitro
Ke stanovení adherence selenem-obohaceného kmene CCM 9190 byly použity buněčné linie lidského střevního adenokarcinomu Caco2 a HT-29 v poměru 9 : 1 a koncentraci 4 * 104, které byly kultivovány na 24 - jamkových destičkách po dobu 14 dní při 37 °C a 5 % koncentrací CO2. Po odsátí a promytí buněčných linií byly na destičku pipetovány bakteriální suspenze o koncentraci 107, které byly připraveny z čerstvě narostlých bakteriálních kmenů kultivovaných za přítomnosti 10 a 30 mg/l seleničitanu sodného, jako kontrola byl použit bakteriální kmen kultivovaný v mediu bez přítomnosti seleničitanu sodného. Buněčné linie s bakteriální suspenzí byly kultivovány 90 min v inkubátoru při 37 °C a 5 % koncentrací CO2. Pro stanovení adherence bylo použito desítkové ředění a následně byla použita plotnová metoda.
Na základě analýz je možné konstatovat, že obohacení kmene CCM 9091 selenem (přídavkem seleničitanu sodného do kultivačního média o koncentraci 10 a 30 mg/l), má za následek zvýšení jeho adhezní schopnosti. Výsledky adheze jsou graficky znázorněny na obr.8.
Průmyslová využitelnost
Selenem obohacený kmen Lactococcus lactis subsp. lactis CCM 9190 je využitelný pro prevenci a/nebo ošetření stavů způsobených nutričním deficitem selenu v dietě. Využitelný je samotný kmen v lyofilizované formě se zachováním dostatečného množství životaschopných buněk, jako i kmen inaktivovaný (postbiotikum). Další aplikační formou je prostředek obsahující selenizovaný kmen
- 7 CZ 309775 B6
CCM 9190, který může obsahovat i další probiotické kmeny, základní kultury, případně prebiotika, sušené mléko, vitamíny nebo minerální látky.
Literatura:
Brodkorb, A. et al. (2019): INFOGEST static in vitro simulation of gastrointestinal food digestion. Nature Protocols 14.
Havlíková, Š., Marková, J., Dráb, V., Kavková, M. (2017): The anti-clostridial effect of lactococci adjunct cultures in Dutch type of low scalded cheese: from selection to application. Microbial Spoilers in Foods, pp 73.
Havlíková, Š., Kvasničková, E., Kavková, M., Němečková, I. (2018): The anticlostridial effect of lactococcal and enterococcal adjunct starters in Dutch-type low-scalded cheese. International Journal of Dairy Technology, 71, 107-119.
Kantorová, V., Kaňa, A., Krausová, G., Hyršlová, I., Mestek, O. (2022): Effect of protease XXIII on selenium species interconversion during their extraction from biological samples. Journal of Food Composition and Analysis, 105, 104260.
Nařízení Komise (ES) č. 1170/2009 ze dne 30. listopadu 2009, kterým se mění směrnice Evropského parlamentu a Rady 2002/46/ES a nařízení Evropského parlamentu a Rady (ES) č. 1925/2006, pokud jde o seznamy vitaminů a minerálních látek a jejich forem, které lze přidávat do potravin, včetně doplňků stravy.
Yang, J., Huang, K., Qin, S., Wu, X., Zhao, Z., Chen, F. (2009): Antibacterial action of seleniumenriched probiotics against pathogenic Escherichia coli. Dig. Dis. Sci., 54, 246-254.
Yi, H.W., Zhu, X.X., Huang, X.L., Lai, Y.Z., Tang, Y. (2020): Selenium-enriched Bifidobacterium longum protected alcohol and high fat diet induced hepatic injury in mice. Chin. J. Nat. Med., 18, 169-177.
Claims (4)
1. Selenizovaný kmen bakterie Lactococcus lactis subsp. lactis CCM 9190 pro řešení nutričního deficitu selenu v dietě, který je deponován v České sbírce mikroorganismů, CCM, na 5 Přírodovědecké fakultě Masarykovy univerzity, na Ústavu experimentální biologie, Kamenice 5,
625 00 Brno.
2. Selenizovaný kmen bakterie Lactococcus lactis subsp. lactis CCM 9190, podle nároku 1, vyznačující se tím, že obsahuje organicky vázaný selen, nebo selen v jeho elementární formě nanočástic.
10
3. Přípravek pro prevenci a/nebo ošetření stavů způsobených nutričním deficitem selenu v dietě, vyznačující se tím, že obsahuje selnizovaný kmen bakterie podle nároku 2.
4. Přípravek podle nároku 3, vyznačující se tím, že dále obsahuje další probiotické kmeny, základní kultury, případně prebiotika, sušené mléko, vitamíny nebo minerální látky.
15 6 výkresů
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CZ2022-263A CZ309775B6 (cs) | 2022-06-14 | 2022-06-14 | Selenizovaný kmen bakterie Lactococcus lactis subsp. lactis CCM 9190 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CZ2022-263A CZ309775B6 (cs) | 2022-06-14 | 2022-06-14 | Selenizovaný kmen bakterie Lactococcus lactis subsp. lactis CCM 9190 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CZ2022263A3 CZ2022263A3 (cs) | 2023-09-27 |
CZ309775B6 true CZ309775B6 (cs) | 2023-09-27 |
Family
ID=88093201
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CZ2022-263A CZ309775B6 (cs) | 2022-06-14 | 2022-06-14 | Selenizovaný kmen bakterie Lactococcus lactis subsp. lactis CCM 9190 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CZ (1) | CZ309775B6 (cs) |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN108735670A (zh) * | 2017-04-13 | 2018-11-02 | 中芯国际集成电路制造(北京)有限公司 | 一种半导体器件及其制造方法和电子装置 |
-
2022
- 2022-06-14 CZ CZ2022-263A patent/CZ309775B6/cs unknown
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN108735670A (zh) * | 2017-04-13 | 2018-11-02 | 中芯国际集成电路制造(北京)有限公司 | 一种半导体器件及其制造方法和电子装置 |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
CHEN, YUE, ET AL.: "Protective effect of selenium nanoparticle-enriched Lactococcus lactis NZ9000 against enterotoxigenic Escherichia coli K88-induced intestinal barrier damage in mice", APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, vol. 87, no. 23, pages 1 - 15, ISSN: 0099-2240 * |
HYRŠLOVÁ, IVANA, ET AL.: "Selenium accumulation and biotransformation in Streptococcus, Lactococcus, and Enterococcus strains", JOURNAL OF FUNCTIONAL FOODS, vol. 92, 6 April 2022 (2022-04-06), pages 1 - 9, XP087027031, ISSN: 1756-4646, DOI: 10.1016/j.jff.2022.105056 * |
KRAUSOVÁ, GABRIELA, ET AL.: "Development of selenized lactic acid bacteria and their selenium bioaccumulation capacity", FERMENTATION, vol. 6, no. 3, ISSN: 2311-5637 * |
KRAUSOVÁ, GABRIELA, ET AL.: "In vivo bioavailability of selenium in selenium-enriched Streptococcus thermophilus and Enterococcus faecium in CD IGS rats", ANTIOXIDANTS, vol. 10, no. 3, ISSN: 2076-3921 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CZ2022263A3 (cs) | 2023-09-27 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN110964653B (zh) | 一种可调节肠道菌群平衡的副干酪乳杆菌et-22 | |
de Caire et al. | Effect of Spirulina platensis biomass on the growth of lactic acid bacteria in milk | |
CN108348559B (zh) | 用于生产共轭亚油酸的副干酪乳杆菌、含有其的营养制剂和药物制剂及其用途 | |
CN110964655A (zh) | 一种可调节胃肠道菌群的乳双歧杆菌bl-99及其应用 | |
CN108384735B (zh) | 植物乳杆菌ccfm1019、其发酵食品及其在制备药物中的应用 | |
Akalin et al. | Influence of Spirulina platensis biomass on microbiological viability in traditional and probiotic yogurts during refrigerated storage | |
KR20180021777A (ko) | 세균성 질증의 치료를 위한 락토바실러스 람노서스 박테리아 | |
US11492588B2 (en) | Lactococcus lactis subsp. lactis CCFM1018 and application thereof in preparation of food and medicine for excreting plasticizer | |
Wansutha et al. | Antioxidant activities of almond milk fermented with lactic acid bacteria | |
US20200405790A1 (en) | Lactobacillus plantarum CCFM1019, Fermented Foods thereof, and Application thereof in Preparation of Medicine for Promoting Excretion of Plasticizers and Metabolites thereof from Body | |
BG111161A (bg) | Асоциация от пробиотични млечнокисели микроорганизми за получаване на диетични млечни продукти | |
CA2983685A1 (en) | Dietary supplement comprising a probiotic and ferric pyrophosphate | |
EP2323504A1 (en) | Temperature-induced delivery of nutrients by micro-organisms in the gastrointestinal tract | |
KR20220164034A (ko) | 장내 세균총 개선용 조성물 | |
del Olmo et al. | Probiotic dynamics during the fermentation of milk supplemented with seaweed extracts: The effect of milk constituents | |
CN114574387A (zh) | 一株促进生长与生殖发育的高富集有机锌动物双歧杆菌 | |
WO2001080663A1 (en) | Animal feed additives and method of producing the same | |
EP3781279A2 (en) | Date palm medium compositions and methods | |
RU2261909C1 (ru) | КОНСОРЦИУМ БИФИДОБАКТЕРИЙ Bifidobacterium bifidum 791-МБ, Bifidobacterium longum В 379М-МБ, Bifidobacterium adolescentis Г-7513- МБ, Bifidobacterium infantis 73-15-МБ, Bifidobacterium breve 79-119-МБ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ КИСЛО-МОЛОЧНЫХ, НЕФЕРМЕНТИРОВАННЫХ ПРОДУКТОВ, БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ДОБАВОК, БИФИДОСОДЕРЖАЩИХ ПРЕПАРАТОВ, КОСМЕТИЧЕСКИХ И ГИГИЕНИЧЕСКИХ СРЕДСТВ | |
Buruleanu et al. | Fermentation of vegetable juices by Lactobacillus acidophilus LA-5 | |
CZ309775B6 (cs) | Selenizovaný kmen bakterie Lactococcus lactis subsp. lactis CCM 9190 | |
AU2022392707A1 (en) | Bacterial strain and the use thereof | |
CN116064313A (zh) | 植物乳杆菌ccfm1281在缓解运动性疲劳中的应用 | |
CN116963607A (zh) | 乳酸菌抑制产甲烷菌生长或减少甲烷排放的用途 | |
Ibrahim et al. | Isolation, identification and selection of lactic acid bacterial cultures for production of riboflavin and folate |