CZ2022263A3 - Selenizovaný kmen bakterie Lactococcus lactis subsp. lactis CCM 9190 - Google Patents

Abstract

Průmyslový kmen bakterie Lactococcus lactis subsp. lactis obohacený selenemuložený v České sbírce mikroorganismů, Kamenice 5, Brno, pod číslem CCM 9190 a prostředek obsahující tento kmen pro prevenci a/nebo ošetření stavů způsobených nutričním deficitem selenu v dietě. Prostředek může obsahovat i další probiotické kmeny, základní kultury, případně prebiotika, sušené mléko, vitamíny nebo minerální látky.

Description

Selenizovaný kmen bakterie Lactococcus lactis subsp. lactis CCM 9190

Oblast techniky

Vynález se týká selenizovaných, tj. selenem-obohacených bakteriálních buněk kmene Lactococcus lactis subsp. lactis CCM 9190, které slouží jako zdroj biologicky dostupných forem selenu (Se), kterými jsou především organické sloučeniny Se a nanočástice elementárního Se. Vynález obsahuje kmen ve formě živých, příp. inaktivovaných buněk, pro použití jako přípravek pro prevenci a/nebo ošetření stavů způsobených nutričním deficitem selenu v dietě.

Dosavadní stav techniky

Pro účely lidské výživy je možná suplementace doplňků stravy na bázi anorganického Se dle Nařízení Komise (ES) č. 1170/2009. Podle uvedeného nařízení je možná také suplementace organicky-vázaného Se, a to formou selenem-obohacených, tzv. selenizovaných kvasnic. Takto obohacené kvasnice tvoří součást některých doplňků stravy vyskytujících se v tržní síti. Nicméně, nedostatek těchto preparátů spočívá v tom, že se zde vyskytují kvasnice v inaktivované formě, tj. nepřinášejí konzumentům další benefity, např. dodání živých, prospěšných mikroorganismů, které mohou kolonizovat střevní trakt, a uplatnit se jako probiotika.

Selenizace kvasinek a bakterií mléčného kvašení (BMK) poskytuje výhody, jako jsou následující: i) dodání Se pro biologické procesy; ii) zvýšená biologická dostupnost Se ve formě méně toxických organických sloučenin nebo ve formě nanočástic; iii) individuální zdravotní přínosy BMK a kvasinek v živých nebo inaktivovaných formách (např. produkce organických kyselin, probiotická funkce, produkce antimikrobiálních sloučenin, bakteriocinů atd.

Schopnost transformovat anorganický Se mají kromě kvasinek také BMK, a potenciál Seobohacených BMK, jak naznačují mnohé studie, např. hepatoprotektivní účinek (Yi a kol., 2020), antibakteriální aktivita (Yang a kol., 2009) a další. Selenizované BMK mohou tedy kromě dodání Se v jeho lépe biologicky dostupné a méně toxické, organické formě představovat také zdroj probioticky působících bakterií. Mezi BMK patří rody, jako např. Lactobacillus, Lactococcus, Enterococcus a další. Zejména koky (např. laktokoky z rodu Lactococcus) jsou odolnější vůči působení seleničitanu v růstovém médiu, např. ve srovnání s tyčinkami nebo bifidobakteriemi, které jsou na přítomnost Se v médiu mnohem citlivější. Navíc, koky lépe odolávají také podmínkám lyofilizace, a počty životaschopných buněk u kmene CCM 9190 dosahují cca 10⁹ kolonie-tvořících jednotek (KTJ/g).

Kmen CCM 9190 je součástí startérových mlékařských kultur na výrobu fermentovaných nápojů a některých sýrů. Kmen je dlouhodobě používán v mlékárenském průmyslu pro jeho výhodné senzorické, zejména aromatvorné vlastnosti. Kromě příznivých technologických a senzorických vlastností se kmen vyznačuje také významnou produkcí nisinu a prokázán byl jeho signifikantní antiklostridiální účinek (Havlíková a kol., 2017 a 2018).

Jelikož růstová schopnost v přítomnosti selenu, a tím i tolerance k Se, jako i další vlastnosti (schopnost biotransformovat a zabudovávat do jednotlivých Se-sloučenin a Se-nanočástic) jsou kmenově specifické, je účelem vynálezu získání kmene poskytujícího nejlepší zdroj organicky vázaného selenu, jak z pohledu akumulace Se, distribuce Se-sloučenin a co nejmenší cytotoxicity těchto Se-sloučenin, příp. elementárních forem Se. Navíc, obohacení kmene selenem umožní také zvýšení antioxidační kapacity kmene.

Popsány a patentovány jsou v současné době preparáty různých selenizovaných kmenů jako krmných aditiv, zejména pro použití u zvířat. Ve většině případů se jedná o obohacení pouze přidáním anorganického Se. V případě obohacení selenizovanými kmeny se jedná o směsné

- 1 CZ 2022 - 263 A3 preparáty různých BMK, kvasinek, octových bakterií a bifidobakterií, taky pro použití v krmných aditivech, např. směsná kultura Enterococcus faecium a Lactococcus lactis subsp. lactis. Nevýhodou těchto preparátů je to, že se jedná o směsi, a tudíž se nejedná o monokulturu, tj. jeden specifický kmen. Kromě obohacení selenem, uvedené kmeny, na rozdíl od selenizovaného kmene CCM 9190 nedisponují dalšími příznivými vlastnostmi (např. produkce nisinu, antiklostridiální působení, vhodné technologické a aromatvorné vlastnosti pro aplikaci jako startérové kultury apod.). Také nejsou dostatečně popsány funkční a probiotické vlastnosti těchto selenizovaných kmenů (např. zlepšení antioxidačních vlastností a dalších v důsledku obohacení selenem).

Podstata vynálezu

Výše uvedené nedostatky odstraňuje selenem-obohacený kmen bakterie Lactococcus lactis subsp. lactis, který byl vyselektován ze souboru testovaných 18 kmenů na základě jeho příznivých vlastností za účelem selenizace. Kmen byl deponován v České sbírce mikroorganismů (CCM) v Brně, která má statut mezinárodního ukládacího místa pro patentové kultury ukládané podle Budapešťské smlouvy, pod číslem CCM 9190.

Kmen se vyznačuje: a) dobrou schopností vázat a akumulovat anorganický selen z růstového média, b) produkcí organických forem selenu, ve formě seleno-aminokyselin a Se-nanočástic, c) zlepšenými antioxidačními vlastnostmi vlivem selenizace, d) nízkou toxicitou a dobrou schopností prostupu přes buněčné membrány, a f) dobrou adhezí na tkáňový model lidských epiteálních buněk tlustého střeva in vitro.

Objasnění výkresů

Vynález bude blíže osvětlen pomocí výkresů, kde obr. 1 představuje postup přípravy selenizovaných kmenů. Obr. 2 představuje chromatogramy enzymatického extraktu kmene CCM 9190 rostoucího v médiu o koncentraci seleničitanu sodného 10 mg/l (A) a 50 mg/l (B). Jednotlivé sloučeniny jsou označeny zkratkami: selenan (SeVI), seleničitan (SeIV), selenocystin (SeCys2), methylselenocystin (MeSeCys), selenomethionin (SeMet) a neidentifikované sloučeniny (N1 až N6). Obr. 3 ukazuje suspenzi selenem obohacených buněk před lyofilizací. Koncentrace seleničitanu sodného v médiu 10 mg/l (A) a 50 mg/l (B). Obr. 4 ukazuje snímky provedeny pomocí transmisního elektronového mikroskopu (TEM) (1), distribuce velikostí nanočástic na základě TEM (2) a na základě sp-ICP-MS (3) pro kmen rostoucí v médiu o koncentraci seleničitanu sodného 10 mg/l (A) a 50 mg/l (B). Obr. 5 ukazuje koncentrace selenu ve formě seleničitanu, selenocystinu a neidentifikované sloučeniny N1 v odebraných vzorcích na apikální straně (čas 0 hod) a na bazolaterální straně (časy 0,5; 1; 1,5; 2; 3; 4 h). Jak je patrné z grafů, dochází ke zvýšení propustnosti seleničitanu mezi 30 min s maximálním průchodem po 2 h po podání dárcovského roztoku, následně je vidět sestupná tendence koncentrace mezi 2 a 4 h po přidání dárcovského roztoku. U selenocysteinu je patrné, že z koncentrace v dárcovském roztoku se jen pomalu zvyšuje koncentrace selenocysteinu na basolaterární straně po průchodu přes buněčnou monovrstvu. A s postupujícím časem koncentrace lineárně roste. V testované trávenině byl zaznamenám i neznámý vzorek selenu, kdy jeho vrchol koncentrace byl 1,5 h po přidání dárcovského roztoku, následně se koncentrace snižovala. Na obr. 6 je zobrazen vliv přídavku 0 až 100 mg/l seleničitanu sodného na růst kmene Lactococcus lactis subsp. lactis CCM9190 v M17 bujonu při 30 °C. Graf na obr. 7 ukazuje srovnání cytotoxicity selenizovaného kmene CCM 9190 a seleničitanu sodného. Na obr. 8 jsou zobrazeny adhezní schopnosti selenizovaného kmene CCM 9190 po přídavku 10 a 30 mg/l seleničitanu sodného.

- 2 CZ 2022 - 263 A3

Příklady uskutečnění vynálezu

Příklad 1

V jednom provedení vynálezu je kmen ve formě biologicky čisté, lyofilizované kultury (obr. 1), jako monokultura kmene Lactococcus lactis subsp. lactis CCM 9190).

Příklad 2

V jiném provedení vynálezu je kmen ve formě inaktivovaných buněk monokultury kmene Lactococcus lactis subsp. lactis CCM 9190 v lyofilizované formě.

Příklad 3

V dalším provedení vynálezu je kmen obsažen v přípravku, který obsahuje i další probiotické kmeny, základní kultury, případně různá prebiotika, sušené mléko, vitamíny nebo minerální látky. Kmen může být součástí tablet, kapslí, prášku nebo potravin, jako jsou např. mléčné výrobky.

Příklad 4

Vynález poskytuje kmen ve formě živých nebo inaktivovaných buněk, jako prostředek pro doplnění selenu v případě jeho deficitu v dietě.

Pracovní postup:

a) identifikace a typizace kmene

Lactococcus lactis subsp. lactis CCM 9190 je deponován v České sbírce mikroorganismů (CCM) na Přírodovědecké fakultě Masarykovy univerzity, na Ústavu experimentální biologie, Kamenice 5, 625 00 Brno.

Kmen je identifikován jako Lactococcus lactis subsp. Lactis pomocí API 50CHL (Biomérieux, Francie), identifikace potvrzena také druhově specifickou PCR; a 16S rRNA (anotovaná sekvence uložena v GenBank pod číslem OM475720). Mikroskopicky se jedná o drobné koky, ojediněle tvoří kratší řetízky koků a tvoří součást mikroflóry základních smetanových kultur.

b) příprava selenem-obohaceného kmene CCM 9190 (selenizace)

Lyofilizovaný kmen Lactococcus lactis subsp. Lactis CCM 9190 se před selenizací nejprve obnoví v M17 buj onu při 30 °C a třikrát se přeočkuje. Poté se M17 buj on s přídavkem seleničitanu sodného inokuluje kmenem v exponenciální fázi růstu a kultivuje se po dobu 24 hodin, viz obr. 1. Selenizované buňky pro další analýzy se dvakrát promyjí sterilní deionizovanou vodou a separují se pomocí centrifugace po dobu 5 minut při zrychlení 4100 g. Následně je selenizovaný kmen zlyofilizován a jsou stanoveny počty živých bakterií plotnovou metodou na M17 agaru při teplotě 30 °C po dobu 48 hodin. Také je stanoven obsah selenu i jednotlivých seleno-sloučenin a selenonanočástic.

c) Vliv různých koncentrací seleničitanu sodného na růst kmene Lactococcus lactis subsp. Lactis CCM 9190

Inhibiční vliv seleničitanu sodného na viabilitu testovaného kmene byl posuzován na základě spektrofotometrického měření změny absorbance při vlnové délce 620 nm během 24-hodinové kultivace při teplotě 30 °C v M17 bujonu s různými koncentracemi seleničitanu sodného (0, 5, 10, 30, 50 a 100 mg/l). Z výsledků je patrný minimální inhibiční efekt za přítomnosti seleničitanu

- 3 CZ 2022 - 263 A3 sodného na růst kmene Lactococcus lactis subsp. lactis CCM 9190, kdy došlo jen k mírnému posunu logaritmické fáze růstu a k nepatrnému snížení počtů mikroorganismů v závislosti na zvyšující se koncentraci seleničitanu sodného v médiu. Výsledky jsou graficky zpracovány na grafu na obr. 6.

d) Vliv selenu na antioxidační aktivitu kmene CCM 9190

Antioxidační aktivita selenizovaného a neselenizovaného kmene CCM 9190 byla stanovena pomocí metody DPPH, která je jednou ze základních metod pro posouzení antiradikálové aktivity. Je založena na reakci testovaného vzorku s DPPH (1,1-difenyl-2-(2,4,6-trinitrofenyl)hydrazyl). Změna absorbance byla stanovena spektrofotometricky při vlnové délce 517 nm. Při porovnání změny antioxidační aktivity selenizovaného (42,4 ±9,9 %) a neselenizovaného (24,8 ±8,6 %) kmene CCM 9190 bylo zjištěno statisticky významné (P <0,05) zvýšení antioxidační aktivity u kmene po selenizaci.

e) akumulace selenu a distribuce seleno-sloučenin v selenem-obohacených bakteriálních buňkách kmene CCM 9190

Celkové množství selenu v lyofilizované kultuře bylo stanoveno metodou hmotnostní spektrometrie s indukčně vázaným plazmatem (ICP-MS) po rozkladu vzorku koncentrovanou HNO3 v mikrovlnném mineralizátoru. Obsah jednotlivých sloučenin selenu pak byl stanoven spojením kapalinové chromatografie s ICP-MS po extrakci proteázou XXIII v Tris-HCl pufru (pH = 7,5) po dobu 24 h při 37 °C (podrobný postup viz Kantorová a kol., 2022). Selen byl v obou případech měřen na linii m /z = 80 a jako vnitřní standard byl použit tellur měřený na linii m /z = 128. Charakterizován byl kmen, který byl kultivován aerobně 24 h při 37 °C v mediu se seleničitanem sodným o koncentracích 10 a 50 mg/l.

Celkový obsah selenu byl u kmene CCM 9190 selenizovaného v médiu s obsahem 50 mg/l seleničitanu významně vyšší (43±15 mg/g) než v médiu s obsahem 10 mg/l seleničitanu (3,85±0,69 mg/g). V extraktech byl identifikován selen ve formě seleničitanu, selenanu, selenocystinu, methylselenocysteinu a selenomehioninu. Dalších šest nalezených sloučenin nebylo identifikováno. Relativní zastoupení jednotlivých sloučenin selenu vzhledem k celkovému obsahu selenu v extraktu se však mezi kmeny selenizovanými v médiích s obsahem selenu 10 a 50 mg/l seleničitanu významně neliší viz, tab.1 a obr. 2A a 2B.

Tab. 1: Chromatogram, celkový obsah selenu, Se-sloučeniny

Celkový obsah selenu, obsah jednotlivých sloučeniny selenu a extrakční účinnost. Hodnoty jsou uváděny jako průměr doplněný rozšířenou nejistotou za symbolem ± nebo směrodatnou odchylkou uvedenou v závorce. Hodnoty jsou vztaženy na lyofilizovaný vzorek. Indexem „N“ jsou označeny sloučeny, jejichž struktura nebyla zatím objasněna.

Koncentrace seleničitanu v médiu	10 mg/l	50 mg/l
Celkový obsah Se	3,85±0,69 mg/g	43±15 mg/g
Obsah Se ve formě selenanu	0,984 (0,039) μg/g	4,0 (1,7) μg/g
Obsah Se ve formě seleničitanu	8,42 (0,88) μg/g	3,27 (0,17) μg/g
Obsah Se ve formě selenocystinu	92,1 (5,5) μg/g	36,2 (3,4) μg/g
Obsah Se ve formě sloučeniny N1	54,6 (5,3) μg/g	37,5 (5,2) μg/g
Obsah Se ve formě methylselenocysteinu	5,45 (0,29) μg/g	3,10 (0,19) μg/g
Obsah Se ve formě sloučeniny N2	2,79 (0,41) μg/g	1,15 (0,12) μg/g
Obsah Se ve formě sloučeniny N3	8,63 (0,20) μg/g	10,7 (1,5) μg/g
Obsah Se ve formě sloučeniny N4	1,86 (0,44) μg/g	1,45 (0,89) μg/g
Obsah Se ve formě sloučeniny N5	4,2 (1,2) μg/g	2,1 (2,9) μg/g
Obsah Se ve formě selenomethioninu	6,54 (0,91) μg/g	4,72 (0,46) μg/g

- 4 CZ 2022 - 263 A3

Obsah Se ve formě sloučeniny N6	1,26 (0,10) μg/g	1,41 (0,22) μg/g
Celkový obsah Se v extraktu	356 ± 55 μg/g	202 ± 41 μg/g
Extrakční účinnost *	9,2 ± 1,1 %	0,47 ± 0,09 %

* nízká extrakční účinnost je dána přítomností nanočástic selenu, které jsou z extraktu před speciační analýzou odfiltrovány.

f) produkce nanočástic selenu kmenem CCM 9190 a jejich charakterizace

Nanočástice selenu byly charakterizovány z hlediska velikosti a struktury transmisní elektronovou mikroskopií (TEM), a z hlediska velikosti a číselné koncentrace metodou ICP-MS v režimu měření jednotlivých částic (sp-ICP-MS). Vzorky pro měření metodou sp-ICP-MS byly připravovány tak, že bylo naváženo 0,005 g lyofilizovaného do polyethylenové zkumavky, bylo přidáno 5 ml 1 % (v/v) methanol a vzorek byl sonikován v ultrazvukové lázni po dobu 20 min. Poté byl vzorek zředěn 250* 1 % (v/v) metanolem a ihned analyzován. V případě měření TEM byl vzorek dispergován a ředěn stejným způsobem, avšak pouze v demineralizované vodě. Vzorek byl pak nanesen na měděnou mřížku (velikost 300 mesh), vysušen a analyzován. Pro charakterizaci byl použit kmen, který byl kultivován aerobně 24 h při 37 °C v mediu se seleničitanem sodným o koncentracích 10 a 50 mg/l.

Nanočástice selenu pozorované u kmene CCM 9190 byly produkovány extracelulárně. Podíl selenu ve formě nanočástic na celkovém obsahu selenu byl u kmene CCM 9190 selenizovaného v médiu s obsahem 50 mg/l seleničitanu významně vyšší (68±14 %) než v médiu s obsahem 10 mg/l seleničitanu (36±5 %). To je dáno jak produkcí většího počtu nanočástic (6,5±2,6) * 10¹¹ g^-1 v médiu s obsahem 50 mg/l seleničitanu a 2,31±0,54) * 10¹¹ g^-1 v médiu s obsahem 50 mg/l seleničitanu), tak produkcí částic o větším průměru (171±60 nm v médiu s obsahem 50 mg/l seleničitanu a 98±34 nm v médiu s obsahem 50 mg/l seleničitanu, viz obr. 3 a 4. Vyšší obsah nanočástic selenu se projevuje také výraznějším červeným zabarvením suspenze buněk.

Tab. 2: Velikosti a číselné koncentrace nanočástic a jejich zastoupení ve vzorku.

koncentrace seleničitanu sodného v médiu (mg/D	průměr nanočástic na základě TEM (nm)	průměr nanočástic na základě sp-ICP-MS (nm)	číselná koncentrace nanočástic na základě spICP-MS (g-1)	celkový obsah selenu ve formě nanočástic (mg^	podíl obsahu selenu ve formě nanočástic na celkovém obsahu selenu (%)
10	99 ± 18	98 ± 34	(2,31 ± 0,54) * 1011	1,39 ± 0,29	36 ± 5
50	167 ± 19	171 ± 60	(6,5 ± 2,6) * 1011	29,2 ± 5,9	68 ± 14

Hodnoty jsou uváděny jako průměr ± rozšířená nejistota. Hodnoty jsou vztaženy na lyofilizovaný vzorek. Průměrná velikost nanočástic je uváděna jako maximum normálního rozdělení (pro TEM) a logaritmicko-normálního rozdělení (pro sp-ICP-MS) proloženého histogramem naměřených velikostí.

g) simulace průchodu selenem-obohaceného kmene CCM 9190 trávicím traktem v in vitro podmínkách

Trávení proběhlo podle standardizovaného in vitro statického modelu trávení INFOGEST, rozděleného na orální, žaludeční a intestinální fázi. V orální části bylo naváženo 5 g lyofilizovaného vzorku a následně přidáno 5 ml simulované slinné šťávy (chlorid vápenatý 1,5mM, slinná amyláza 75 jednotek/ml). Po 2-minutové inkubaci byla přidána žaludeční šťáva (pepsin 2 000 jednotek, gastrická lipáza jednotek/ml, chlorid vápenatý s výslednou koncentrací 0,15 mmol/l) a bylo sníženo pH na 3,0. Vzorek byl 2 hodiny inkubován ve vodní lázni při 37 °C s pravidelným promícháním vzorku. Po dvou hodinách byla přidána simulovaná střevní šťáva

- 5 CZ 2022 - 263 A3 (chlorid vápenatý 0,6 mmol/1, žluč 10 mmol/1, pankreatin 100 jednotek/ml) a upraveno pH na 7,0 s následnou 2hodinovou inkubací při 37 °C s průběžným mícháním vzorku. Po ukončení testu byl trávicí proces ukončen zamražením vzorku na -80 °C (Brodkorb et al. 2019), vzorky byly zamraženy až do dalšího testování.

h) stanovení cytotoxicity selenem-obohaceného kmene CCM 9190 v in vitro podmínkách za použití tkáňového modelu

Buněčné linie HT29 a Caco-2 byly kultivovány pomocí modifikované metody dle Mosmann (1983). Ke stanovení cytotoxicity bylo využito žluté rozpustné tetrazolové soli 3-(4,5dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyl tetrazol bromid (MTT). MTT vytváří v mitochondriích živých buněk rozpustné fialové krystaly hvězdicovitého tvaru nazývané formazán, který je následně rozpuštěn prostřednictvím dimethylsulfoxidu a spektrofotometricky měřen při vlnové délce 555 nm na přístroji Tecan Infinite M Nano+ (Tecan, Austria). Naměřená absorbance je lineárně úměrná množství buněk, které v roztoku přežily.

Pro testování cytotoxicity byl použit kmen, který byl kultivován aerobně 24 h při 37 °C v médiu se seleničitanem sodným o koncentracích 0, 5, 10 a 30 mg/L Následně byl kmen centrifúgován při 2000 RPM 10 min a 3^X promyt 5 ml Dulbecco's Phospate Buffered Saline (PBS). Dále byl kmen o všech koncentracích dle potřeby naředěn na stejnou optickou denzitu a zlyzovány v lázni při 80 °C 20 min. Po následném zchlazení byl kmen ještě jednou centrifúgován, bylo odstraněno PBS a nahrazeno stejným množstvím média Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose (EMEM) (Sigma - Aldrich CZ) s přídavky 10 % Fetal Bovine Serum (Sigma - Aldrich CZ), 1 % hydrogenuhličitanu sodného (Sigma - Aldrich CZ), 1 % pyrvátu sodného (Sigma - Aldrich CZ), 1 % neesenciálních aminokyselin (Sigma - Aldrich CZ). Takto připravený kmen byl pipeto ván po jednotlivých koncentracích seleničitanu na 96 - jamkovou destičku s buněčnými liniemi Caco-2 a HT29 v poměru 9:1. Jako kontrola bylo použito obohacené medium DMEM bez přidaného kmene. Destička byla kultivována 72 h při 37 °C a 5 % CO2.

Zvolené koncentrace 0, 5 a 10 mg/1 seleničitanu sodného nevykazovaly žádné toxické účinky na testovaných buněčných liniích, koncentrace 30 mg/1 seleničitanu sodného již vykazovala toxické účinky na testovaných buněčných liniích patrné. Z dostupných údajů lze říct, že přídavek selenemobohaceného kmene až o koncentraci 10 mg/L může být považován za bezpečný. Výsledky jsou znázorněny v grafu na obr. 7.

ch) stanovení prostupu seleno-sloučenin vytvořených kmenem CCM 9190 přes slizniční membrány in vitro

Propustnost přes buňky střevního epithelu byla stanovena na buněčné linii Caco-2. Caco-2 je buněčná linie, která se získává z lidského kolorektálního adenokarcinomu. Ačkoli se jedná o buňky rakovinného původu, velmi se podobají lidským intestinálním enterocytům a hodnoty permeability získané pomocí Caco-2 modelu korelují s absorpcí účinné látky v lidském organismu. Inserty před vlastním vysetím buněk byly na apikální straně navlhčeny kompletním DMEM mediem a po 2 minutách bylo přidáno medium s koncentrací buněk 0,6 ^x 10⁶ buněk/ml. Následně bylo přidáno medium na bazolaterální stranu. Po 6 hodinách došlo k výměně media na obou stranách pro

-6CZ 2022 - 263 A3 odstranění neadherovnaých buněk. Inserty byly kultivovány 21 dnů, aby došlo ke vzniku z morfologického a fyziologického hlediska plně vyvinuté konfluentní buněčné monovrstvy. První dva týdny probíhalo krmení každý druhý den, kdy bylo kompletní DMEM medium měněno na apikální i bazolaterální straně. Poslední týden byly inserty s buněčnou vrstvou krmeny každý den, kdy bylo medium měněno na apikální i bazolaterální straně. Poslední výměna media před vlastním pokusem byla provedena nejpozději 16 hodin před samotným experimentem.

V den pokusu byly inserty přeneseny do nové destičky a 3* promyty pomocí HBSS (Hank’s Balanced Salt Solution) s pH 7,4. Následně bylo na apikální a bazolaterální stranu přidáno 500 ml čerstvého HBSS a byla změřena hodnota transepiteliální elektrické rezistence (TEER). Následně byla přidána Luciferová žluť o koncentraci 25 pmol/l a destička byla inkubována na orbitální třepačce umístěné v inkubátoru po dobu 1 hodiny při 150 rpm. Z bazolaterální strany byl odebrán vzorek, který byl následně změřen při vlnové délce 480 nm/530 nm. Inserty, ve kterých byla integrita více než 95 %, byly zařazeny do testu.

Před vlastním testem byly inserty opět 3* promyty HBSS. Následně byl připraven dárcovský roztok s testovaným vzorkem, kdy bylo smícháno 400 pl HBSS a 100 pl tráveniny s testovaným vzorkem. 500 pl takto připraveného vzorku bylo přidáno na apikální stranu. Na bazolaterální stranu bylo přidáno 500 pl čistého HBSS. Z apikální strany bylo ihned odebráno 50 pl vzorku jako čas 0 h. Následně byla destička inkubována při 37 °C na orbitální třepačce umístěné v inkubátoru při 150 rpm. V časech 0,5; 1; 1,5; 2; 3; 4 h bylo odebráno z bazolaterální strany vždy 250 pl vzorku, který byl okamžitě zamražen. Odebraný objem byl vždy nahrazen 250 pl čistého HBSS. Po ukončení pokusu byl odebrán i zbytek z apikální strany a vzorky zamraženy. Inserty byly následně 3* promyty HBSS a poté sklizeny pomoci metanolu a také zamraženy. Všechny takto připravené vzorky byly skladovány při -80 °C až do stanovení obsahu jednotlivých sloučenin selenu spojením kapalinové chromatografie s ICP-MS. Vzorek byl analyzován přímo bez jakékoliv další úpravy. Selen byl v obou případech měřen na linii m /z = 80 a jako vnitřní standard byl použit tellur měřený na linii m /z = 128. Popis k testování permeability je uveden při popisu obr. 5, v kapitole „Objasnění výkresů“.

i) adheze selenizovaného kmene CCM 9091 na tkáňový model lidských epiteliálních buněk tlustého střeva in vitro

Ke stanovení adherence selenem-obohaceného kmene CCM 9190 byly použity buněčné linie lidského střevního adenokarcinomu Caco2 a HT-29 v poměru 9 : 1 a koncentraci 4 * 10⁴, které byly kultivovány na 24 - jamkových destičkách po dobu 14 dní při 37 °C a 5 % koncentrací CO2. Po odsátí a promytí buněčných linií byly na destičku pipetovány bakteriální suspenze o koncentraci 10⁷, které byly připraveny z čerstvě narostlých bakteriálních kmenů kultivovaných za přítomnosti 10 a 30 mg/l seleničitanu sodného, jako kontrola byl použit bakteriální kmen kultivovaný v mediu bez přítomnosti seleničitanu sodného. Buněčné linie s bakteriální suspenzí byly kultivovány 90 min v inkubátoru při 37 °C a 5 % koncentrací CO2. Pro stanovení adherence bylo použito desítkové ředění a následně byla použita plotnová metoda.

Na základě analýz je možné konstatovat, že obohacení kmene CCM 9091 selenem (přídavkem seleničitanu sodného do kultivačního média o koncentraci 10 a 30 mg/l), má za následek zvýšení jeho adhezní schopnosti. Výsledky adheze jsou graficky znázorněny na obr.8.

Průmyslová využitelnost

Selenem obohacený kmen Lactococcus lactis subsp. lactis CCM 9190 je využitelný pro prevenci a/nebo ošetření stavů způsobených nutričním deficitem selenu v dietě. Využitelný je samotný kmen v lyofilizované formě se zachováním dostatečného množství životaschopných buněk, jako i kmen inaktivovaný (postbiotikum). Další aplikační formou je prostředek obsahující selenizovaný kmen

- 7 CZ 2022 - 263 A3

CCM 9190, který může obsahovat i další probiotické kmeny, základní kultury, případně prebiotika, sušené mléko, vitamíny nebo minerální látky.

Literatura:

Brodkorb, A. et al. (2019): INFOGEST static in vitro simulation of gastrointestinal food digestion. Nature Protocols 14.

Havlíková, Š., Marková, J., Dráb, V., Kavková, M. (2017): The anti-clostridial effect of lactococci adjunct cultures in Dutch type of low scalded cheese: from selection to application. Microbial Spoilers in Foods, pp 73.

Havlíková, Š., Kvasničková, E., Kavková, M., Němečková, I. (2018): The anticlostridial effect of lactococcal and enterococcal adjunct starters in Dutch-type low-scalded cheese. International Journal of Dairy Technology, 71, 107-119.

Kantorová, V., Kaňa, A., Krausová, G., Hyršlová, I., Mestek, O. (2022): Effect of protease XXIII on selenium species interconversion during their extraction from biological samples. Journal of Food Composition and Analysis, 105, 104260.

Nařízení Komise (ES) č. 1170/2009 ze dne 30. listopadu 2009, kterým se mění směrnice Evropského parlamentu a Rady 2002/46/ES a nařízení Evropského parlamentu a Rady (ES) č. 1925/2006, pokud jde o seznamy vitaminů a minerálních látek a jejich forem, které lze přidávat do potravin, včetně doplňků stravy.

Yang, J., Huang, K., Qin, S., Wu, X., Zhao, Z., Chen, F. (2009): Antibacterial action of seleniumenriched probiotics against pathogenic Escherichia coli. Dig. Dis. Sci., 54, 246-254.

Yi, H.W., Zhu, X.X., Huang, X.L., Lai, Y.Z., Tang, Y. (2020): Selenium-enriched Bifidobacterium longum protected alcohol and high fat diet induced hepatic injury in mice. Chin. J. Nat. Med., 18, 169-177.

Claims (4)

1. Selenizovaný kmen bakterie Lactococcus lactis subsp. lactis CCM 9190 pro řešení nutričního deficitu selenu v dietě, který je deponován v České sbírce mikroorganismů, CCM, na 5 Přírodovědecké fakultě Masarykovy univerzity, na Ústavu experimentální biologie, Kamenice 5,

625 00 Brno.

2. Selenizovaný kmen bakterie Lactococcus lactis subsp. lactis CCM 9190, podle nároku 1, vyznačující se tím, že obsahuje organicky vázaný selen, nebo selen v jeho elementární formě nanočástic.

10

3. Přípravek pro prevenci a/nebo ošetření stavů způsobených nutričním deficitem selenu v dietě, vyznačující se tím, že obsahuje selnizovaný kmen bakterie podle nároku 2.

4. Přípravek podle nároku 3, vyznačující se tím, že dále obsahuje další probiotické kmeny, základní kultury, případně prebiotika, sušené mléko, vitamíny nebo minerální látky.

15 6 výkresů