CZ308411B6

CZ308411B6 - Způsob produkce přírodních pigmentů v submerzních kulturách mikroskopické houby Monascus

Info

Publication number: CZ308411B6
Application number: CZ2017-813A
Authority: CZ
Inventors: Lubomír Adámek; Marian URBAN; Ivana Laknerová; Eva Rutová
Original assignee: Výzkumný ústav potravinářský Praha , v.v.i.
Priority date: 2017-12-18
Filing date: 2017-12-18
Publication date: 2020-08-05
Also published as: CZ2017813A3

Abstract

Způsob produkce přírodních pigmentů v submerzních kulturách mikroskopické houby rodulze charakterizovat tak, že proces probíhá dvoustupňově na půdách obsahujících jako hlavní zdroj dusíku hydrolyzáty proteinů a ethanol získaný z prokvašených 3 až 20% hmotn. roztoků mléčných produktů v prvním stupni postupu jako hlavní uhlíkatý zdroj. V prvním stupni postupu je obtížně zkvasitelná laktóza přeměněna pomocí mléčné kultury kvasinekna ethanolové roztoky o koncentracích 1,5 až 9% obj., které jsou dobře asimilovatelné v následujícím druhém stupni kultivace. V druhém stupni postupu jsou po inaktivaci kultury mléčné kvasinkyethanolizované prokvašené roztoky mléčných produktů využity jako ethanolový uhlíkatý zdroj, a to buď vsádkově na počátku kultivace nebo periodickým dávkováním během růstu kultury mikroskopické houby. Ethanolizované roztoky mléčných produktů jsou stabilizovány čpavkovou vodou na hodnotu pH 11 a použity pro udržování aktuálních koncentrací ethanolu 0,2 až 1,0% obj. v živném médiu rostoucí kultury mikroskopické houby rodupři současném zachování rozmezí hodnot pH média 4,5 až 6,0.

Description

Způsob produkce přírodních pigmentů v submerzních kulturách mikroskopické houby Mon ascus

Oblast techniky

Vynález se týká technologie výroby přírodních pigmentů pomocí mikroskopických hub rodu Monascus na mléčných produktech.

Dosavadní stav techniky

Při výrobě barviv jako potravinářských aditiv, označovaných evidenčními kódy (E) a majících za úkol zvýšit vizuální přitažlivost potravin, obnovit původní vzhled potravin, jejichž barva byla dotčena zpracováním, skladováním, balením nebo distribucí a v neposlední řadě obarvit jinak bezbarvé potraviny (Emerton V., Choi E.: Additives. Essential Guide to Food Additives (3), 101319, 2008), se využívá nejnovějších poznatků z oblasti biotechnologie. Evropský úřad pro bezpečnost potravin (EFSA) prověřuje zdravotní nezávadnost všech aditiv, přičemž mezi prvními posuzovanými látkami byla potravinářská barviva. V posledních letech se objevilo podezření, že některá přírodně identická barviva produkovaná synteticky nebo dokonce i přírodní potravinářská barviva (např. košenila) mohou mít vliv na zdraví dětí. Trendem současné doby je zvýšená iniciativa výrobců potravin a poskytovatelů stravovacích služeb odstranit některá syntetická barviva z výrobků (např. El02, El04, El 10, El22) a nahradit je přírodními zdravotně nezávadnými.

Názory na zdravotní nezávadnost barviv se neustále vyvíjí a jsou velmi diskutovanou otázkou. Nedostatečně jsou například zmapovány možné toxické interakce mezi látkami ve směsi, chybí poznatky o mechanismech toxicity a ustavení prediktivních matematických a biologických modelů. Jednu z posledních polemik ohledně genotoxicity způsobila barviva na bázi sulfonovaných azo- sloučenin: Amaranth (El23), Ponceau 4R (El24), Sunset Yellow FCF (E 110), Tartrazine (E102) a Azorubine/Carmoisine(E122). (EFSA Journal 2010;8( 10): 1778). Ačkoliv bylo prokázáno, že konzumace těchto aditiv nepředstavuje riziko, EFSA přesto doporučila další nové doplňující testování a potraviny obsahující jedno nebo více těchto potravinářských barviv (El 10, E104, E122, E129, E102, E124) musí v označení obsahovat doplňující informace: „mohou nepříznivě ovlivňovat činnost a pozornost dětí“ (http://www.europarl.europa.eu/sides/getDoc.do?language=en&type=IM-

PRESS&reference=20080707IPR33563;https://www.efsa.europa.eu/en/press/news/ans091112)

Biotechnologická produkce potravinářských barviv má potenciál nahradit diskutovaná přírodně identická barviva produkovaná synteticky z vysoce přečištěných ropných produktů, případně přírodní barviva mající své limity v sezónnosti suroviny, dále pak v menší barevné stálosti, citlivosti vůči světlu, záhřevu, oxidaci a mnohdy problematické rozpustnosti ve vodě. Zdrojem přírodních barevných látek, nej častěji ve formě pigmentů, jsou rostlinné i živočišné druhy, některé mikroorganismy, lišejníky a houby (Velíšek J., Hajšlová J.: Chemie potravin II, Ossis, Tábor, 602, 2009).

Globální trh s přírodními barvivý byl v roce 2014 odhadován na 1 144 milionů US$ s predikcí růstu na 1 698 US$ milionů do roku 2020, což představuje nárůst 6,8 %, přičemž dominantní podíl představují karotenoidy s podílem na trhu 31,8%. (http://www.futuremarketinsights.com/reports/global-natural-food-colours-market)

Ke společnostem hrajícím významnou roh na mezinárodním globálním trhu patří především firma Chr. Hansen A/S, Sensient Technologies Corporation and Kalsec Inc., DDW, Naturex S.A., ADM (Wild flavors Inc.), ROHA Dyechem Pvt. Ltd., GNT International B.V., DIC Corporation, and LycoRed Ltd.

-1 CZ 308411 B6

V České republice se výrobou mikrobiálního pigmentu historicky komerčně zabývala pouze jediná firma ASCOLOR BIOTEC s.r.o. s barvivém Arpink RedTM. V současné době na její činnost navázala firma NATURAL RED a.s., ve spolupráci s VUPP, v.v.i., s poloprovozní výrobou o objemech 3000 1. Producentem tohoto červeného pigmentu je kmen mikroskopické houby Penicillium oxalicum var. Armeniaca. Na základě souhlasného stanoviska Ministerstva zdravotnictví ČR a po předložení požadované dokumentace JECFA konstatoval, že nej sou námitky vůči použití Arpink Red do masných výrobků a analogů masa a masných výrobků (v množství až lOOmg/kg), dále do nealkoholických nápojů (v množství až lOOmg/kg), alkoholických nápojů (v množství až 200 mg/kg), mléčných výrobků (v množství až 150mg/kg), mrazených krémů (v množství až 150 mg/kg) a cukrovinek (v množství až 300 mg/kg).

S ohledem na předpokládanou změnu legislativních nařízení byla platnost stanoviska JECFA omezena do 31. 12. 2002. V současné době se připravují nové podklady k legislativnímu řízení.

Z nepřeberného množství možných mikrobiálních producentů pigmentů, které mohou nalézt uplatnění v potravinářském průmyslu je možno ilustrativně uvést např.: Xanthophyllomyces dendrorhous - Astaxanthin, Monascus sp. - Ankaflavin Color supplement, Monascorubramin, Rubropunctatin, Penicillium oxalicum - Anthraquinone, Fusarium sporotrichioides - Lycopene, Saccharomyces neoformans - Melanin, Rhodotorula sp. - Torularhodin, FlavobacteriumZeaxanthin, Agrobacterium auranticum - Astaxanthin, Mycobacterium lacticola - Astaxanthin, Flavobacterium sp.- Zeaxanthin, Blakeslea trispora a Dunaliella salina - i-Carotene, Blakeslea trispora - Lycopene, Spongiococcum excentricum - Lutein (https://www.hindawi.com/joumals/ab/2014/837891/)

Kultivací mikroskopických hub může množství barevně významných složek sekundárních metabolitů, tzn. pigmentů dosahovat ve fermentačním prostředí až několik gramů na litr. Mezi výrazné vlastnosti pigmentu patří silná antioxidační aktivita, která má pozitivní vliv zejména v prevenci srdečně cévních a nádorových onemocnění. Uplatnění plísňové myceliámí biomasy jako meziproduktu při biotechnologické výrobě v krmivářství nebo při výrobě potravin je dána základním striktním požadavkem na zdravotní nezávadnost z hlediska produkce toxinů. Tento nárok lze do jisté míry splnit výběrem vhodných kmenů a úpravou složení kultivační půdy. Biotechnologická příprava červeného pigmentu by mohla být alternativní náhradou nebo doplněním dosud používaných červených pigmentů ve farmacii nebo potravinářství (např. košenila).

Informací o komerční nebo potenciální využitelnosti plísňových kultur produkujících pigmenty v krmivářském, farmaceutickém nebo potravinářském průmyslu, je v současné době velmi málo.

Při řízené kultivaci mikroskopických hub vzniká souběžně s preferovaným barvivém i plísňová myceliámí biomasa, která je také bohatým zdrojem celé řady biologicky aktivních látek. Izolovaná myceliámí biomasa obsahuje, vedle významného množství vlákniny, také významné množství proteinů, vitaminů, minerálních látek a některých imunostimulačních faktorů. Praktické využití samotné plísňové myceliámí biomasy je zatím popsáno jen velmi ojediněle. V literatuře se uvádí využití této mykoproteinové biomasy v krmivářství jako suplement proteinů a vitaminů pod názvem „Terlikin“ (bílkovinovitaminový preparát získaný z biomasy naprodukované na odpadních produktech při zpracování brambor). V potravinářství tvoří mykoproteinová biomasa základ řady výrobků, které nabízí řetězce supermarketů Sainsbury ve Velké Británii pod názvem „Sainsbury's Quom“ (např. Sainsbury's Quom pie, Quom Swedish style balls). Velmi perspektivní se ukazuje využití plísňové myceliámí biomasy k izolaci glukanů (Kyanko, M.V., Canel, R.S., Ludemann V., Pose G., Wagner J.R. : β-Glucan content and hydration properties of filamentous fiingi. Applied Miochemistry and Mikrobiology (49), 1, 2013, 41-45; Park H.S., Yu Y.M., Lee M.K., Maeng P.J., Kim S.C., Yu J.H.: Velvet-mediated repression of β-glucan synthesis in Aspergillus nidulans spores. Scientific Reports., (5), Article number: 10199 2015). Glukany jsou základem vnitřní struktury buněčných stěn. Čisté glukany mohou být využity jako imunostimulátory při aplikacích

- 2 CZ 308411 B6 v medicíně a veterinárním lékařství, protože podporují produkci monocytů, neurofylů, kolagenu, elastinu a stimulují makrofágy, aby zvýšily i interleukinovou reakci. Imunostimulačním působením jsou glukany významné zejména pro přežvýkavce. Glukany hrají významnou roli i v případě snižování cholesterolu.

Velká pozornost v biotechnologii plísňových kultur je věnována samotné produkci a izolaci naprodukovaných pigmentů, které by mohly být náhradou za používaná syntetická přírodně identická barviva. Množství produkovaného pigmentu v tekutých půdách je možné ovlivňovat výběrem vhodných kultivačních médií, dále vzájemným poměrem obsažených složek nebo přídavkem některých stopových prvků.

Produkovaný pigment je možno získávat ze supematantu mikrofiltrační a dále nanofiltrační technikou ve formě vysoce koncentrovaného stabilního preparátu využitelného v potravinářství nebo ve farmaceutickém průmyslu.

Složení živné půdy zásadně ovlivňuje získávání výše popsaných dvou základních složek fermentace, tzn. pigmentu a myceliámí biomasy. Neexistuje absolutně přímá korelace mezi produkcí plísňové myceliámí biomasy a množstvím vytvořeného pigmentového produktu. Nevhodný poměr uhlíkové a dusíkové složky média vede k nadměrné tvorbě biomasy na úkor preferované produkce pigmentové složky.

Úkolem vynálezců bylo nalezení způsobu vedení kultivačního procesu plísňové kultury rodu Monascus s využitím ethanolu a dalších biologicky aktivních látek přítomných v mléčných produktech. Vynález si dále klade za cíl dát k dispozici racionální technologický postup s cílem zrychlení a dosažení optimální produkce pigmentu v kultivačním médiu.

Podstata vynálezu

Uvedené nedostatky odstraňuje způsob produkce přírodních pigmentů v submerzních kulturách mikroskopické houby rodu Monascus, podle tohoto vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že proces probíhá dvoustupňové na půdách obsahujících jako hlavní zdroj dusíku hydrolyzáty proteinů a ethanol získaný z prokvašených 3 až 20% hmota, roztoků mléčných produktů v prvním stupni postupu jako hlavní uhlíkatý zdroj.

V prvním stupni postupuje obtížně zkvasitelná laktóza přeměna pomocí mléčné kultury kvasinek Kluyveromyces marxianus na ethanolové roztoky o koncentracích 1,5 až 9% obj., které jsou dobře asimilovatelné v následujícím druhém stupni kultivace. V druhém stupni postupu jsou po inaktivaci kultury mléčné kvasinky Kluyveromyces marxianus ethanolizované prokvašené roztoky mléčných produktů využity jako ethanolový uhlíkatý zdroj, a to buď vsádkově na počátku kultivace nebo periodickým dávkováním během růstu kultury mikroskopické houby. Ethanolizované roztoky mléčných produktů jsou stabilizovány čpavkovou vodou na hodnotu pH 11 a použity pro udržování aktuálních koncentrací ethanolu 0,2 až 1,0% obj. v živném médiu rostoucí kultury mikroskopické houby roduMonascus při současném zachování rozmezí hodnot pH média 4,5 až 6,0.

Způsob využívá biogenní prvky, laktózu a další biologicky aktivní látky obsažené v mléčných produktech. Laktóza, která je obtížně zkvasitelná touto mikroskopickou houbou, je v prvním stupni metabolicky přeměněna pomocí mléčného kmene kvasinky Kluyveromyces marxianus na nízkoalkoholový roztok, který je základním a dobře zkvasitelným zdrojem pro následující kultivaci mikroskopické houby Monascus purpureus. Po alkalizaci tohoto nízkoalkoholového roztoku čpavkovou vodou je tato směs využita v kultivacích s periodickým doplňováním zdroje živin dusíku a uhlíku a při současném zajištění optimální koncentrace ethanolu při změnách pH kultivačního prostředí.

-3CZ 308411 B6

Následující příklady provedení fermentačního procesu, podle vynálezu, pouze dokládají, aniž by ho, jakkoliv omezovaly. Způsob podle vynálezu byl úspěšně vyzkoušen původci v praxi u přihlašovatele ve Výzkumném ústavu potravinářském Praha, v.v.i., CZ.

Příklady uskutečnění vynálezu

Příklad 1

Porovnání asimilovatelných uhlíkatých zdrojů na produkci přírodního pigmentu kulturou mikroskopické houby Monascus.

V Tabulce č. 1 jsou uvedeny výsledky kultivačních pokusů na živných půdách s různým obsahem uhlíkatých látek. Seriální kultivační pokus byl proveden v Erlenmayerových baňkách s užitečným plněním 500 ml živné půdy obsahující stejná množství hydrolyzátu proteinu 0,2 % hmota, a kvasničného extraktu 0,1 % hmota, a různé přídavky asimilovatelných uhlíkatých zdrojů a ethanolu ve dvou různých koncentracích. Pokusy byly provedeny na rotační třepačce (100 RPM) při teplotě 30 °C bez úpravy pH. Po uplynutí 100 kultivačních hodin byly jednotlivé varianty z tohoto seriálního pokusu zhodnoceny z hlediska produkce pigmentu měřením absorbance A494. Ve variantě živných půd s ethanolem byl použit ethanolový zdroj ve formě 20% hmota, deproteinované syrovátky o koncentraci 8 % obj. ethanolu prokvašené kulturou mléčné kvasinky Kluveromyces marxianus tak, aby konečná koncentrace ethanolu v médiu v Erlenmayerových baňkách byla 1 nebo 2 % obj. Porovnáním naměřených hodnot je zřejmá vhodnost všech použitých uhlíkatých zdrojů s různým stupněm využitelnosti. Nejlepších výsledků bylo dosaženo ve variantách živných půd obsahujících 2 % hmota, sacharózy a 1 % obj. ethanolu. Porovnáním dosažených hodnot u jednotlivých zdrojů uhlíku je zřejmé, že vyšší obsah uhlíkatého zdroje v případě varianty živné půdy se sacharózou 4 % hmota, a ve variantě živné půdy s ethanolem 2 % obj. způsobuje zpomalování produkce pigmentu.

Tabulka 1- Složení kultivačních médií s různým obsahem asimilovatelných zdrojů

C-zdroj	Sacharóza	Maltóza	Glukóza	Ethanol
0/ /0	2	4	2	4	2	4	1	2
Kvasničný extrakt (%)	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1
Vysokoprotein. hydrolyzát (%)	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
Absorbance (494 nm)	2,974	0,540	0,337	0,695	0,238	0,490	2,458	2,077

Příklad 2

Srovnávací kultivační pokus na deproteinované syrovátce s mikroskopickou houbou Monascus purpureus s různými variantami složení půdy.

Kultivační pokusy s kmenem Monascus purpureus byly vedeny v Erlenmayerových baňkách s užitečným plněním 500 ml kultivačního média. Základ půdy tvořila deproteinovaná syrovátka 5% hmota. Kultivační půda u obou variant I a II dále obsahovala stejná množství kvasničného extraktu 0,1 % hmota., ale různá množství hydrolyzátu proteinu 0,2, resp. 0,4 % hmota. Základním uhlíkatým zdrojem v obou variantách půd byl ethanol obsažený v dávkované prokvašené kultuře

-4CZ 308411 B6 mléčné kvasinky Kluyveromyces marxianus. Před zahájením kultivačního pokusu byl ethanol přidán ve formě mléčné kultury do živného média tak, aby v obou variantách živné půdy byla počáteční koncentrace ethanolu 0,6 % obj. Po vnesení ethanolu byla zahájena kultivace na rotační třepačce (100 RPM) při teplotě 29 °C. Během 144hodinové kultivace v periodicky odebíraných vzorcích byla stanovována hodnota absorbance pro posouzení produkce přírodních pigmentů a byly sledovány aktuální koncentrace ethanolu. Z tabulky č. 2 je zřejmé, že nejvyšší dosažená absorbance byla naměřena ve variantě živné půdy II, kde byl vyšší poměr živných látek dusíku ku obsaženému zdroji uhlíku, tj. 53 mg aminodusíku/lml, resp. 106 mg aminodusíku/1 ml vloženého ethanolu.

Tabulka 2 - Srovnávací kultivační pokus s produkcí přírodních pigmentů v kulturách mikroskopické houby Monascus purpureus na ethanolu obsaženém v 5% hmota, deproteinované syrovátce (různé poměry živných látek dusíku a uhlíku).

Složky půdy	I	II
Deproteinová syrovátka (5 % hmota.)	500	500
Kvasničný extrakt (% hmota.)	0,1	0,1
Vysokoprotein. hydrolyzát (% hmota.)	0,2	0,4
Ethanol (% obj)- počáteční koncentrace	0,6	0,6
Čas (hod.)	Aktuální obsah ethanolu v živném médiu (obj. %)
0
72	0,324 (slabě červená)	0,278 (slabě červená)
96	červená	červená
120	0,866	1,460
144	1,132	2,902
264	4,244	7,600
Čas (hod.)	Aktuální obsah ethanolu v živném médiu (obj. %)
0 (počát.koncentrace)	0,6	0,6
72	0,41	0,52
120	0,21	0,22
144	0,05	0,004

Příklad 3

Produkce přírodních pigmentů mikroskopické plísně Monascus purpureus na živných půdách obsahujících různé zdroje ethanolu (ethanol obsažený v prokvašené kvasinkové kultuře směsi mléka a syrovátky).

Srovnávací kultivační pokusy s mikroskopickou kulturou Monascus purpureus byly provedeny na rotační třepačce (100 RPM) při teplotě 29 °C s použitím různých variant živných půd obsahujících jako základ roztoky 3% hmota, deproteinované syrovátky a přídavky 0,1% hmota, kvasničného extraktu, 0,4% hmota, hydrolyzátu proteinu a 1% hmota, sacharózy. Obsažená sacharóza u všech variant půd byla použita na rozkvašení kultury mikroskopické houby. Po uplynutí 96 hodin, kdy došlo k vyčerpání obsažené sacharózy, byl do variant živných půd II a III dodán rozdílný uhlíkatý ethanolový zdroj. Ve variantě II živné půdy, v intervalu 96 až 120 hodin ve formě dělených dávek, to byl ethanol obsažený v alkalizovaném prokvašeném roztoku mléka a syrovátky pomocí kvasinky Kluyveromyces marxianus a ve srovnávací variantě III bylo použito uhlíkatého zdroje komerčního koncentrovaného ethanolu. Varianta I sloužila jako kontrolní půda, tzn. kultivace pokračovala bez přídavku ethanolu. V pokračující kultivaci na rotační třepačce byly sledovány

-5CZ 308411 B6 obsahy ethanolu a množství produkovaného pigmentu vyjádřeného hodnotou absorbance při vlnové délce 494 nm. Zatímco ve variantě I, kde nebyl obsažen ethanolový suplement, docházelo k plynulému zvyšování pH a velmi mírnému vzestupu hodnot naměřeného množství pigmentů, zřejmě způsobeného vlivem jeho uvolnění z nitra buněk, v ostatních variantách II a III růst 5 pokračoval a byl doprovázen postupným snižováním hodnoty pH média a zvyšováním produkce pigmentů. Ve variantě II se suplementem ethanolizovaného mléčného produktu byla pozorovaná zvýšená produkce pigmentů v médiu, svědčící o tom, že ethanol produkovaný kvasinkovou kulturou Kluveromyces marxianus v roztoku mléčného produktu může být velmi dobrým uhlíkatým zdrojem pro produkci pigmentů.

Tabulka 3 - Produkce mikrobiálních pigmentů mikroskopickou houbou Monascus na různých zdrojích ethanolu (komerční ethanol a ethanol obsažený v prokvašeném mléčném produktu)

	Kontrola
Čas j RU pH (hod.) Í % i	A«,í	EtOH íobj.%) 0	Rf % 4,9	pH		EtOH (obj.%)	Rf %	pH 5,08	N/A	EtOH 0
0 \| 4,9 \| 5,08	N/A	5,08	N/A	O í Ό
96	4.4 1 7,03	1.-289	0	4,4	7,08	1,455	4,4 4.6	7,06	1,311	0
po přidání ethanolu 120.............	4,ϊ [ 7Ž39		$ 0	4,8	7,49	'Ý020 '	0_řS8	7,08	1,704	0,60
1,391	0,04	4,0		0,56 0,37	4,4	6,8	0,59
144 í 4,4 í 7,62	1,630	0,04	3,5	5,52 \| 6,370	4,5	6,54	3,075	0,38

*bez přídavku ethanolu, **přídavek ethanolu obsaženého v prokvašeném mléčném produktu, ***přídávek ethanolu koncentrovaného komerčního

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob produkce přírodních pigmentů v submerzních kulturách mikroskopické houby rodu Monascus, vyznačující se tím, že proces probíhá dvoustupňové na půdách obsahujících jako hlavní zdroj dusíku hydrolyzáty proteinů a ethanol získaný z prokvašených 3 až 20% hmota, roztoků mléčných produktů v prvním stupni postupu jako hlavní uhlíkatý zdroj.

2. Způsob produkce pigmentů v submerzních kulturách mikroskopické houby Monascus podle nároku 1, vyznačující se tím, že v prvním stupni postupuje obtížně zkvasitelná laktóza přeměněna pomocí mléčné kultury kvasinek Kluyveromyces marxianus na ethanolové roztoky o koncentracích 1,5 až 9 % obj., které jsou dobře asimilovatelné v následujícím druhém stupni kultivace.

3. Způsob produkce pigmentů v submerzních kulturách mikroskopické houby Monascus podle nároků 1 a 2, vyznačující se tím, že v druhém stupni postupu jsou po inaktivaci kultury mléčné kvasinky Kluyveromyces marxianus ethanolizované prokvašené roztoky mléčných produktů využity jako ethanolový uhlíkatý zdroj, a to buď vsádkově na počátku kultivace nebo periodickým dávkováním během růstu kultury mikroskopické houby.

4. Způsob produkce pigmentů v submerzních kulturách mikroskopické houby Monascus podle nároků 1, 2 a 3, vyznačující se tím, že ethanolizované roztoky mléčných produktů jsou stabilizovány čpavkovou vodou na hodnotu pH 11a použity pro udržování aktuálních koncentrací ethanolu 0,2 až 1,0 % obj. v živném médiu rostoucí kultury mikroskopické houby roduMonascus při současném zachování rozmezí hodnot pH média 4,5 až 6,0.