CZ30729U1 - Kultivační medium pro mikrobiální produkci pigmentů pomocí submerzních kultur mikroskopických hub - Google Patents

Description

Oblast techniky

Technické řešení se týká kultivačního media pro mikrobiální produkci pigmentů pomocí sub5 merzních kultur mikroskopických hub.

Dosavadní stav techniky

Fermentace zůstává stále vhodným technologickým postupem pro výrobu nej různějších druhů potravin nebo aditiv. Při výrobě barvi v jako potravinářských přídatných látek (aditiv), označovaných evidenčními kódy (E) a majících za úkol obnovit původní vzhled potravin, jejichž barva ío byla dotčena zpracováním, skladováním, balením nebo distribucí, dále zvýšit vizuální přitažlivost potravin a v neposlední řadě obarvit jinak bezbarvé potraviny (Emerton V., Choi E.: Additives.

Essential Guide to Food Additives (3), 101-319, 2008), se využívá nejnovějších poznatků právě z oblasti biotechnologie. Evropský úřad pro bezpečnost potravin (EFSA) prověřuje bezpečnost (zdravotní nezávadnost) všech přídatných látek, přičemž mezi prvními posuzovanými látkami, byla potravinářská barviva. V posledních letech se objevilo podezření, že některá přírodně identická barviva produkovaná synteticky nebo dokonce i přírodní potravinářská barviva (např. košenila) mohou mít vliv na chování dětí. Trendem současné doby je zvýšená iniciativa výrobců potravin a poskytovatelů stravovacích služeb odstranit některá syntetická barviva z výrobků (např. E102, E104, El 10, El 22) a nahradit je přírodními zdravotně nezávadnými.

Názory na zdravotní nezávadnost barviv se neustále vyvíjí a jsou živé. Nedostatečně jsou například zhodnoceny možné toxické interakce mezi látkami ve směsi, chybí pochopit mechanismy toxicity a ustavit prediktivní matematické a biologické modely. Poslední polemiku ohledně genotoxicity způsobila barviva na bázi sulfonovaných azo- sloučenin: Amaranth (E 123), Ponceau 4R (E124), Sunset Yellow FCF (E 110), Tartrazine (E 102) a Azorubine/Carmoisine(E122).

(EFSA Journal 2010;8(10): 1778) Ačkoliv bylo prokázáno, že konzumace těchto aditiv nepředstavuje riziko, EFSA přesto doporučuje další nové doplňující testování a potraviny obsahující jedno nebo více těchto potravinářských barviv (E 110, E104, E 122, E 129, E 102, E 124) musí v označení obsahovat doplňující informace: „mohou nepříznivě ovlivňovat činnost a pozornost dětí“. http://www.europarl.europa.eu/sides/getDoc.do?language=en&type=IM-PRESS&referen- ce=20080707LPR33563; https://www.efsa.europa.eu/en/press/news/ans091112. Biotechnologická produkce potravinářských barviv má potenciál nahradit diskutovaná přírodně identická barviva produkovaná synteticky z vysoce přečištěných ropných produktů, případně přírodní barviva mající své limity v sezónnosti suroviny, dále pak v menší barevné stálosti, citlivosti vůči světlu, záhřevu, oxidaci a mnohdy problematické rozpustnosti ve vodě.

Zdrojem přírodních barevných látek, nej častěji ve formě pigmentů, jsou rostlinné i živočišné druhy, některé mikroorganismy, lišejníky a houby (VelíŠek J., Hajšlová J.: Chemie potravin II, Ossis, Tábor, 602, 2009).

Globální trh s přírodními barvivý byl v roce 2014 odhadován na 1 144 milionů US$ s predikcí růstu na 1 698 US$ milionů do roku 2020, což představuje nárůst 6,8 %, přičemž dominantní podíl představují karotenoidy s podílem na trhu 31,8 %. (http://www.futuremarketinsights.com/reports/global-natural-food-colours-market)

Ke společnostem hrajících významnou roli na mezinárodním globálním trhu patří především firma Chr. Hansen A/S s podílem 18 %, na produkci karminu 70 %. Velká nevyrovnanost v cenách na komoditních burzách, např. 1 kg/400 EUR (2010) a 1 kg/57 EUR (2014) spolu s nutností omezit tento pigment z důvodů legislativního snížení množství hliníku, nutí firmy k významným inovacím.

Mezi významné producenty pigmentů dále patří Sensient Technologies Corporation and Kalsec lne., DDW, Naturex S.A., ADM (Wild flavors lne.), ROHA Dyechem Pvt. Ltd., GNT International B.V., DIC Corporation, and LycoRed Ltd.

CZ 30729 Ul

V České republice se výrobou mikrobiálního pigmentu historicky komerčně zabývala pouze jediná firma ASCOLOR BIOTEC s.r.o. s barvivém Arpink RedTM. V současné době na její činnost navázala firma NATURAL RED a.s., ve spolupráci s VÚPP, v.v.i., s poloprovozní výrobou o objemech 3000 1. Producentem tohoto červeného pigmentuje kmen mikroskopické houby Penicillium oxalicum var. Armeniaca. Na základě souhlasného stanoviska Ministerstva zdravotnictví ČR a po předložení požadované dokumentace JECFA konstatoval, že nejsou námitky vůči použití Arpink Red do masných výrobků a analogů masa a masných výrobků (v množství až 100 mg/kg), dále do nealkoholických nápojů (v množství až 100 mg/kg), alkoholických nápojů (v množství až 200 mg/kg), mléčných výrobků (v množství až 150 mg/kg), mrazených krémů (v množství až 150 mg/kg) a cukrovinek (v množství až 300 mg/kg).

S ohledem na předpokládanou změnu legislativních nařízení byla platnost stanoviska JECFA omezena do 31. 12, 2002. V současné době se připravují nové podklady k legislativnímu řízení.

Z nepřeberného množství možných mikrobiálních producentů pigmentů, které mohou nalézt uplatnění v potravinářském průmyslu je možno ilustrativně uvést např.: Xanthophyllomyces dendrorhous - Astaxanthin, Monascus sp. - Ankaflavin Color supplement, Monascorubramin, Rubropunctatin, Penicillium oxalicum - Anthraquinone, Fusarium sporotrichioides - Lycopene, Saccharomyces neoformans - Melanin, Rhodotorula sp. - Torularhodin, FlavobacteriumZeaxanthin, Agrobacterium auranticum - Astaxanthin, Mycobacterium lacticola - Astaxanthin, Flavobacterium sp.- Zeaxanthin, Blakeslea trispora a Dunaliella šalina - i-Carotene, Blakeslea trispora - Lycopene, Spongiococcum excentricum - Lutein. (https://www.hindawi.com/journals/ab/2014/837891/)

Kultivací mikroskopických hub může množství barevně významných složek sekundárních metabolitů, tzn. pigmentů dosahovat ve fermentačním prostředí až několik gramů na litr. O významu vytvořených pigmentů pro vlastní živou kulturu je možno pouze spekulovat. Může se jednat o výsledný konečný produkt některé vedlejší metabolické dráhy, nebo o plnění ochranné funkce vlastní kultury. Mezi výrazné vlastnosti pigmentu patří silná antioxidační aktivita, která má pozitivní vliv zejména v prevenci srdečně cévních a nádorových onemocnění. Uplatnění plísňové myceliámí biomasy jako meziproduktu při biotechnologické výrobě v krmivářství nebo při výrobě potravin je dána základním striktním požadavkem na zdravotní nezávadnost z hlediska produkce toxinů. Tento nárok lze do jisté míry splnit výběrem vhodných kmenů a úpravou složení kultivační půdy. Biotechnologická příprava červeného pigmentu by mohla být alternativní náhradou nebo doplněním dosud používaných červených pigmentů ve farmacii nebo potravinářství (např. košenila).

Informací o komerční nebo potenciální využitelnosti plísňových kultur produkujících pigmenty v krmivářském, farmaceutickém nebo potravinářském průmyslu, je v současné době velmi málo. Při řízené kultivaci mikroskopických hub vzniká souběžně s preferovaným barvivém i plísňová myceliámí biomasa, která je také bohatým zdrojem celé řady biologicky aktivních látek. Plísňovou myceliámí biomasu je možno získat z prokvašené plísňové kultury oddělením na kalolisu nebo separací na odstředivce. Izolovaná myceliámí biomasa obsahuje, vedle významného množství vlákniny, také významné množství proteinů, vitaminů, minerálních látek a některých imunostimulačních faktorů.

Praktické využití samotné plísňové myceliámí biomasy je zatím popsáno jen velmi ojediněle.

V literatuře se uvádí využití této mykoproteinové biomasy v krmivářství jako suplement proteinů a vitaminů pod názvem „Terlikin“ (bílkovinovitaminový preparát získaný z biomasy naprodukované na odpadních produktech při zpracování brambor). V potravinářství tvoří mykoproteinová biomasa základ řady výrobků, které nabízí řetězce supermarketů Sainsbury ve Velké Británii pod názvem „Sainsbury's Quom“ (např. Sainsbury's Quom pie, Quom Swedish style balls).

Velmi perspektivní se ukazuje využití plísňové myceliámí biomasy k izolaci glukanů (Kyanko, M.V., Canel, R.S., Ludemann V., Pose G., Wagner J.R.: β-Glucan content and hydration properties of filamentous fungi. Applied Miochemistry and Mikrobiology (49), 1, 2013, 41-45; Park H.S., Yu Y.M., Lee M.K., Maeng P.J., Kim S.C., Yu J.H.: Velvet-mediated repression of β-glucan synthesis in Aspergillus nidulans spores. Scientific Reports., (5), Article number: 10199

CZ 30729 Ul

2015). Glukany jsou základem vnitřní struktury buněčných stěn. Tvar a síla buněk závisí na glukanové vrstvě. Čisté glukany mohou být využity jako imunostimulátory při aplikacích v medicíně a veterinárním lékařství, protože podporují produkci monocytů, neurofylů, kolagenu, elastinu a stimulují makrofágy, aby zvýšily i interleukinovou reakci. Imunostimulačním působením jsou glukany významné zejména pro přežvýkavce. Glukany hrají významnou roli i v případě snižování cholesterolu.

V patentové literatuře je řada odkazů na použití glukanů v potravinářském průmyslu jako ztužovadel potravin s měkkou strukturou (např. smetanové sýry, náhrady tuků apod.) nebo pro enkapsulaci chuťových látek (Sommer R. (1998): Yeast extract: productions and components. Food ío Australia, (50), č. 4, 181-183).

Velká pozornost v biotechnologii plísňových kultur je věnována samotné produkci a izolaci neprodukovaných pigmentů, které by mohly být náhradou za používaná syntetická přírodně identická barviva. Množství produkovaného pigmentu v tekutých půdách je možné ovlivňovat výběrem vhodných kultivačních médií, dále vzájemným poměrem obsažených složek nebo přídavkem některých stopových prvků.

Produkovaný pigment je možno získávat ze supematantu mikro filtrační a dále nanofiltrační technikou ve formě vysoce koncentrovaného stabilního preparátu využitelného v potravinářství nebo ve farmaceutickém průmyslu.

V rámci řešení projektu MZe QE0180 ve společnosti VÚPP, v.v.i. „ Zpracování a využití odpad2o ního mycelia po výrobě potravinářské kyseliny citrónové pro další průmyslové aplikace,, byly hledány způsoby využití odpadního plísňového mycelia Aspergillus niger jako cenné suroviny (např. s významným obsahem vlákniny potravy, glukanů, amylolytických, pektolytických, proteolytických enzymů a kyselé fosfatázy) pro vývoj nových pekařských, ovocných a zeleninových výrobků a významného zdroje chitinu a chitosanu.

Složení živné půdy zásadně ovlivňuje získávání výše popsaných dvou základních složek fermentace, tzn. pigmentu a myceliámí biomasy. Neexistuje absolutně přímá korelace mezi produkcí plísňové myceliámí biomasy a množstvím vytvořeného pigmentového produktu. Nevhodný poměr uhlíkové a dusíkové složky média vede k nadměrné tvorbě biomasy na úkor preferované produkce pigmentové složky.

Úkolem vynálezců bylo nalezení vhodné vysokoproteinové přísady do tekuté produkční půdy pro plísňové kultury tak, aby bylo dosaženo omezení produkce nadměrného množství mycelia na úkor produkce pigmentu a zároveň, aby došlo k vyšší efektivitě průběhu kultivačního procesu. Podstata technického řešení

Uvedené nedostatky odstraňuje kultivační medium pro mikrobiální produkci pigmentů pomocí submerzních kultur mikroskopických hub, podle tohoto technického řešení, jehož podstata spočívá vtom, že obsahuje 1,0 až 2,0 % hmotn. sacharózy, 0,05 až 0,1 % hmotn. kvasničného extraktu a 0,2 až 1,0% hmotn. proteinového hydrolyzátu s obsahem amino dusíku 10 až 18% hmotn. Kultivační médium obsahuje 0,03 až 0,18 % hmotn. amino dusíku odvozeného z proteinovového hydrolyzátu. Submerzní kultury mikroskopických hub jsou vybrány z rodu Talaromy40 ces nebo Monascus.

Počáteční poměr obsažených živin v tekutých půdách je udržován na poměru 30 až 150 mg amino dusíku na 1 g vložených sacharidů, přičemž živiny v tomto poměru jsou vloženy na počátku kultivace. Počáteční poměr obsažených živin v tekutých půdách je udržován na poměru 30 až 150 mg amino dusíku na 1 g vložených sacharidů, přičemž tento poměr živin je udržován po45 stupným dávkováním roztoků uhlíkatého zdroje nebo vysokoproteinového hydrolyzátu s upraveným pH na 9,5 až 10 pomocí časového harmonogramu nebo regulačním pH metrem při poklesu pH média. Jako složky živného média jsou využívány vysokoproteinové hydrolyzáty, vyrobené na bázi živočišných, rostlinných nebo mikrobiálních proteinů, dále asimilovatelné sacharidy a mikrodávky kvasničného extraktu. Optimální počáteční poměr uhlíkatých a amino dusíkatých složek živného média je v rozmezí 50 mg až 80 mg amino dusíku na 1 g vloženého sacharido- 3 CZ 30729 U1 vého zdroje. Udržování optimálního poměru živin je zajištěno dávkováním amoniakálního roztoku sacharózy, resp. roztoku vysokoproteinového hydrolyzátu upravených na pH 9,5 až 10. Vhodnými rody mikroorganismů tvořící barevné pigmenty jsou Talaromyces nebo Monascus.

Technické řešení si klade za cíl dát k dispozici vysokoproteinovou přísadu do tekutých půd urče5 nou k optimalizaci technologickéhlo postupu s cílem zrychlení a dosažení zvýšení produkce pigmentu v kultivačním médiu.

Pro maximální produkci pigmentu, byla provedena úprava poměru základních složek média (tzn. dusíkaté a uhlíkaté) ve prospěch dusíkaté tak, aby počáteční poměr obsahu amino dusíku a uhlíku v kultivačním médiu byl udržován na optimálním poměru minimálně 30 až 80 mg amino dusíku κι na 1 g vloženého uhlíkatého zdroje. Tohoto optimálního poměru uhlíkatých a dusíkatých látek lze dosáhnout úpravou receptury přípravy půdy s využitím nově zavedeného vysokoproteinového hydrolyzátu, obsahujícího minimálně o 150 % větší množství asimilovatelných amino dusíkatých látek oproti původně používanému kvasničnému zdroji dusíku. Zvýšený obsah dusíkatých látek je v optimálním množství zaveden buď na začátku kultivace, nebo je udržován postupným dávíš kováním rozdělené celkové uhlíkaté dávky, nebo postupným doplňováním spotřebovaného zdroje amino dusíku. Využívá se k tomu, vedle vlastního analytického stanovení obsahů živin, úprava časového harmonogramu dávkovaných složek nebo dávkování těchto živin pomocí regulačního pH metru. Optimalizovaný kultivační postup zvyšuje rychlost produkce barevného pigmentu, a to při radikálním snížení výrobních nákladů na přípravu produkční živné půdy.

Následující příklady provedení fermentačního procesu, podle technického řešení, pouze dokládají, aniž by ho jakkoliv omezovaly.

Příklady uskutečnění technického řešení

Příklad 1

Vliv dělené dusíkaté složky v živné srovnávací tekuté kontrolní půdě na průběh produkce červe25 ného pigmentu - různý počáteční poměr dusíkaté a uhlíkaté složky.

Kultivační pokusy s kmenem Talaromyces purpurogenus byly vedeny v Erlenmayerových baňkách s užitečným plněním 500 ml živné půdy na rotační třepačce (100 RPM) při teplotě 29 °C s dobou kultivace 48, resp. 140 hodin. Podmínky srovnávacích pokusů byly nastaveny tak, aby u všech variant kultivačních půd (tzn. E, F, G a kontrolní H) byla vložena na počátku kultivace stejná množství uhlíkatého zdroje (tzn. sacharóza) ve výši 1,8 % hmotn. a různé počáteční dávky dusíkaté složky (kvasničný extrakt) od extrémně nízké dávky 0,1 % hmotn. až po konečnou koncentraci dusíkaté složky 0,6 % hmotn. Po 48 hodinách kultivace byla média E, F a G suplementována dodatečným odstupňovaným množstvím přídatného dusíkatého zdroje až po doplnění na finální koncentraci 0,6 % hmotn. Doplněním této složky bylo vyrovnáno celkové složení živných látek ve všech variantách půd. V průběhu kultivace byl u všech variant ověřován rozdíl v produkci pigmentu a tvorbě plísňové biomasy (Tab. 1). Na základě výsledků bylo konstatováno, že množství počáteční koncentrace dusíkaté složky bylo v přímé korelaci s rychlostí a výtěžností pigmentu (vyjádřeno absorbancí A494). Srovnávací variantu představovala kultivační půda H o složení dle patentu CZ285 721 B6 určená pro kultivaci mikroskopické houby Peni40 cillium oxalicum var. Armeniaca. Nejvyšší produkce pigmentu v tomto srovnávacím pokusu byla zjištěna ve variantě půdy H s počátečním nejvyšším poměrem složek dusíku a uhlíku 34,4 mg dusíku (16,6 mg amino dusíku) na 1 g vložené uhlíkaté složky. Snížení počáteční předlohy dusíku od 5,7 do 22,8 mg na 1 g vložené sacharózy (zdroj uhlíku) negativně ovlivňovala produkci pigmentu. Naproti tomu byla při těchto nižších dusíkatých předlohách zjištěna vyšší produkce myceliámí biomasy.

CZ 30729 Ul

Tabulka 1. Sledování vlivu podmínek kultivace mikroskopické houby kmene Talaromvces purpurogenus na tekutých půdách s různým obsahem amino dusíkatých živin

Varianty živné půdy	E	F	G	H
Počáteční předloha N-složky média (kvasničný extrakt) (%)	0,1	0,2	0,4	0,6
Počáteční obsah amino dusíku (mg)	5	10	20	30
Počáteční předloha C-složky média (sacharóza) (%)	1,8	1,8	1,8	1,8
Počáteční poměr mg dusíku/1 g sacharózy	5,7	11,4	22,8	34,4
Počáteční obsah mg amino dusíku/1 g sacharózy	2,7	5,5	11,1	16,6
Počáteční refrakce Rf (%)	2,2	2,2	2,4	2,6
Rozdělené dávkování N živin po 48 hodinách - regulace pH metrem nebo dle časového harmonogramu
Dodatek zbývajícího množství N-složky (%)	0,50	0,40	0,20	0
Celkové vložené množství N-složky (%)	0,6	0,6	0,6	0,6
Počáteční pH	6,65	6,22	5,77	5,55
Změna pH po 48 h	6,18	5,97	5,75	5,86
Změna pH po 140 h	6,30	6,38	5,68	6,52
Snížení Rf po 48 h	0,2	0,2	0,4	0,6
Snížení Rf po 140 h	0,6	0,6	0,6	0,6
Dosažená absorbance A494 po 48 h	0,110	0,080	0,123	0,213
Dosažená absorbance A494PO 140 h	0,297	0,413	0,286	1,759
Index A494/% Rf po 48 h	0,555	0,400	0,307	0,355
Index A494/% Rf po 140 h	0,495	0,688	0,476	2,931
Koncentrace biomasy v médiu po 48 h (%)	0,56	0,22	0,32	0,36
Koncentrace biomasy v médiu po 140 h (%)	1,2	0,92	0,52	0,56

Příklad 2

Vliv dělené uhlíkaté složky v kultivačních půdách na průběh produkce červeného pigmentu 5 různý počáteční poměr dusíkaté a uhlíkaté složky média.

CL 30729 U1

Kultivační pokusy s kmenem Talaromyces purpurogenus byly vedeny v Erlenmayerových baňkách s užitečným plněním 500 ml živné půdy na rotační třepačce (100 RPM) při teplotě 29 °C s dobou kultivace 40, resp. 160 hodin. Významný vliv poměru počáteční dusíkaté složky na vložený uhlíkatý zdroj popsaný v příkladu 1 byl potvrzen dalším srovnávacím pokusem, v kterém bylo u všech variant použitých půd vloženo stejné počáteční množství dusíkaté látky (0,6 % hmotn. kvasničného extraktu) a u jednotlivých variant srovnávacího pokusu bylo měněno pouze množství počáteční dávky uhlíkaté složky. Po 40 hodinách byl obsah uhlíkatých látek doplněn na obsah 1,8 % obsahu sacharózy. Srovnávací pokusy potvrdily, že na produkci pigmentu a biomasy má vliv počáteční poměr dusíkaté složky ku zdroji uhlíku (Tab. 2). Srovnávací variantou byla io v tomto případě kontrolní půda D, ve které byly veškeré dusíkaté i uhlíkaté živiny přidány na počátku pokusu, což představuje poměr 34 mg dusíku (16 mg amíno dusíku) na 1 g vložené sacharózy (zdroj uhlíku). U ostatních variant živných půd se počáteční poměr dusíku na 1 g sacharózy pohyboval v rozmezí 41 až 102 mg. Výsledky analytického šetření po 40 hodinách, resp. 160 hodinách potvrdily významnost tohoto poměru. Nejnižších výsledků, které se týkaly pro15 dukce pigmentu, bylo jednoznačně dosaženo ve srovnávacích pokusech s kontrolní variantou půdy D, kdy byla produkce pigmentu po 40 a 160 hodinách nižší o 32, resp. 37 % hmotn. ve srovnání s půdou A. Nižší obsah předlohy dusíkaté složky na 1 g sacharózy měl pozitivní vliv na tvorbu plísňové biomasy, přičemž rozdíl jednotlivých variant byl od 5 do 35 % hmotn. po 40 hodinách a od 4 do 37 % hmotn. po 160 hodinách kultivace. Hodnocení tvorby pigmentu vy2» jádřené absorbancí a úbytkem refrakce ukazovalo nižší výtěžnost pigmentu na jednotku snížené refrakce (1,43 v kontrolní půdě D vůči 1,72 ve variantě A).

Tabulka 2. Srovnávací kultivační test mikroskopické kultury Talaromyces na tekutých půdách s různou počáteční koncentrací C zdroje (sacharóza) a vliv na kultivační parametry (rychlost produkce pigmentu (absorbance A494), produkce biomasy a výtěžnost během kultivace)

Varianty půdy	A	B	C	D
Počáteční předloha C-složky média (sacharóza) (%)	0,6	1,0	1,5	1,8
Počáteční předloha N-složky média (kvasničný extrakt) (%)	0,6	0,6	0,6	0,6
Počáteční obsah amino dusíku (mg)	30	30	30	30
Počáteční obsah mg amino dusíku/1 g sacharózy	50	30	20	16
Počáteční refrakce Rf (%)	1,4	1,8	2,4	2,7
Přepokládaná refrakce Rf (%)	2,7	2,7	2,7	2,7
Rozdělené dávkování C živin po 40 hodinách - regulace pH metrem a dle časového harmonogramu
Dodatek zbývajícího množství C-složky (%)	1,2	0,8	0,3	0
Celková vložená C-složka	1,8	1,8	1,8	1,8
Počáteční pH	6,2	6,3	6,2	6,2
Změna pH po 40 h	5,9	5,8	5,9	5,9
Změna pH po 160 h	6,4	6,8	6,3	6,2
Snížení Rf po 40 h	0,4	0,4	0,5	0,4
Snížení Rf po 160 h	1,4	1,3	1,3	1,1

CZ 30729 Ul

Varianty půdy	A	B	C	D
Dosažená absorbance A494 po 40 h	0,292	0,306	0,258	0,198
Dosažená absorbance A494 po 160 h	2,408	2,312	1,920	1,527
Index A494/% Rf po 40 h	0,73	0,76	0,51	0,49
Index A494/% Rf po 160 h	1,72	1,77	1,47	1,43
Koncentrace biomasy v médiu po 40 h (%)	0,24	0,60	0,64	0,60
Koncentrace biomasy v médiu po 160h (%)	0,48	0,76	0,88	0,92

Příklad 3

Produkce červeného pigmentu kmenem Talaromyces purpurogenus s různým poměrem dusíkatých a uhlíkatých látek v živném médiu.

Výsledky srovnávacích kultivačních pokusů uvedených v příkladu 1 a jejich ověření srovnávacími kultivačními pokusy uvedenými v příkladu 2 zřetelně ukazují na význam počátečního poměru vložených dusíkatých látek na 1 g uhlíkatého zdroje (sacharózy). Na základě těchto poznatků byl navržen a připraven nový typ kultivační půdy s využitím jiného dusíkatého zdroje (proteinový hydrolyzát), který má nesrovnatelně vyšší množství obsaženého amino dusíku v biomase (16 % hmotn.). Navíc proteinový hydrolyzát použitý v daném množství je ekonomicky mnohem výhodnější než kvasničný extrakt. V receptuře nové živné půdy bylo zároveň rovněž sníženo celkové množství sacharidického zdroje živin až na 1 % hmotn. a minimalizován přídavek kvasničného extraktu. Význam dusíkaté složky při tomto složení nového média ukazuje Tabulka 3 s variantami živných půd Cl až C4 obsahující různé množství počátečního vloženého proteinového hydrolyzátu (0,3 až 0,5 % hmotn.) a kvasničného extraktu (0,02 až 0,05 % hmotn.). Srovnávací půdou byla v těchto případech standardizovaná komerční půda obsahující na počátku 1,8 % hmotn. sacharózy a 0,6 % hmotn. kvasničného extraktu odpovídající poměru živin 34 mg dusíku na 1 g vložené sacharózy. Poměr dusíkatých živin na 1 g sacharózy u nových variant navrhovaných půd Cl až C4 byl zvýšen a pohyboval se v rozmezí 48 až 80 mg dusíku na 1 g sacharózy oproti nákladnější kontrolní půdě obsahující 1,8 % hmotn. sacharózy a 0,6% hmotn. kvasničného extraktu. Měřítkem efektivnosti nově připravených živných půd byla rychlost produkce pigmentu vyjádřená měřením absorbance při vlnové délce 494 nm. Výsledky získané v časových kultivačních intervalech 24, 48 a 120 hod. potvrdily jednoznačný pozitivní vliv na rychlost produkce a výtěžnost pigmentu. Ve všech variantách nově navrhované půdy obsahující různá množství dusíkatých látek od 48 do 80 mg dusíku na 1 g sacharózy bylo nalezeno významnější množství naprodukovaného pigmentu. Tento rozdíl byl nej výraznější po 120 hodinách u varianty nově navrhované živné půdy C4 obsahující 1 % hmotn. sacharózy, 0,5 % hmotn. proteinového hydrolyzátu s přídavkem 0,05 % hmotn. kvasničného extraktu. Z analytických výsledků rovněž vyplývá, že kontrolní půda pro svůj vysoký obsah růstových látek významně stimuluje hlavně tvorbu myceliámí biomasy na úkor produkce pigmentu. Naprodukované množství biomasy v kontrolní půdě po 120 hodinách bylo 0,76% hmotn. Hodnoty obsahu biomasy ve srovnávacích pokusných variantách na nové půdě se pohybovaly pouze v rozmezí 0,28 až 0,36 % hmotn. sušiny.

-7CZ 30729 U1

Tabulka 3. Srovnávací kultivační test kultury mikroskopické houby Talaromyces na tekutých půdách: sledování vlivu obsahu dusíkatého zdroje (hydrolyzát želatiny nebo kvasničný extrakt) na kultivační parametry (rychlost produkce pigmentu (absorbance A494) a produkce biomasy). Porovnání kultivačních výsledků na optimalizovaných půdách (Cl až C4) s výsledky kultivač5 nich postupů na standardizované kontrolní komerční živné půdě.

Médium	Kontrolní půda	Cl	C2	C3	C4
Složení média	Sacharóza 1,8%	Hydrolyzát želatiny 0,3%	Hydrolyzát želatiny 0,3%	Hydrolyzát želatiny 0,5%	Hydrolyzát želatiny 0,5%
	Kvasničný extrakt 0,6%	Sacharóza 1 %	Sacharóza 1%	Sacharóza 1%	Sacharóza 1%
		Kvasničný extrakt 0,02%	Kvasničný extrakt 0,05%	Kvasničný extrakt 0,02%	Kvasničný extrakt 0,05%
mg amino dusíku/1 g sacharózy	16,6	48	48	80	80
Počáteční Rf %	2,5	1,5	1,5	1,7	1,7
Počáteční pH	5,91	6,28	6,28	6,23	6,19
	0-24 h kultivace
A494	0,534	4,302	3,816	4,058	3,374
Rf%	2,3	1,5	1,5	1,6	1,6
pH	6,08	6,18	6,29	6,31	6,28
Přírůstek A v čas. intervalu	0,534	4,302	3,816	4,058	3,374
	0-48 h kultivace
A494	4,856	14,480	14,046	14,796	14,784
Rf%	2,0	1,3	1,3	1,3	1,3
pH	6,35	5,82	5,45	5,47	5,38
Přírůstek A v čas. intervalu	4,322	10,178	10,230	10,216	11,410
	0-120 h kultivace
A494	18,466	23,370	27,072	32,329	38,597
Rí%	0,9	0,4	0,6	0,5	0,6
pH	5,87	4,71	4,40	4,50	4,64
Přírůstek A v čas. intervalu	13,610	8,890	13,026	17,533	13,813
Produkce biomasy (sušina, 120 hodin)(%)	0,76	0,28	0,34	0,30	0,36 »
Rf%	2,5-0,9	1,5-0,4	1,7-0,6	1,7-0,5	1,7-0,6

. 8 .

CZ 30729 Ul

Médium	Kontrolní půda	Cl	C2	C3	C4
Pokles o % Rf	1,6	1,1	0,9	1,2	1,1
♦AWU/oRf	11,53	21,2	30,0	26,9	35,1
*Pokles A494 připadající na snížení 1% reí	rakce média

NÁROKY NA OCHRANU

Claims (3)

1. NÁROKY NA OCHRANU

   1. Kultivační medium pro mikrobiální produkci pigmentů pomocí submerzních kultur mikroskopických hub, vyznačující se tím, že obsahuje 1,0 až 2,0 % hmotn. sacharózy, 0,05

   5 až 0,1 % hmotn. kvasničného extraktu a 0,2 až 1,0 % hmotn. proteinového hydrolyzátu s obsahem amino dusíku 10 až 18 % hmotn.
2. 2. Kultivační médium podle nároku 1, vyznačující se tím, že obsahuje 0,03 až 0,18% hmotn. amino dusíku, odvozeného z proteinového hydrolyzátu.
3. 3. Kultivační médium podle nároků la2, vyznačující se tím, že submerzní kulio tury mikroskopických hub jsou vybrány z rodu Talaromyces nebo Monascus.

   Konec dokumentu