CZ308139B6

CZ308139B6 - Deriváty strigolaktonů pro regulaci klíčení semen parazitických rostlin

Info

Publication number: CZ308139B6
Application number: CZ2017-660A
Authority: CZ
Inventors: Marcela Dvořáková; Petr Soudek; Tomáš VANĚK
Original assignee: Ústav experimentální botaniky AV ČR, v. v. i.
Priority date: 2017-10-16
Filing date: 2017-10-16
Publication date: 2020-01-22
Also published as: CZ2017660A3

Abstract

Řešení poskytují deriváty strigolaktonů obecného vzorce I, ve kterémRje vybrán z H, C1-C4 alkyl aRje vybrán z C1-C4 alkyl, Br, Cl, OH, O(C1-C4 alkyl), COOH, COO(C1-C4 alkyl), přičemž (RO) je vždy v polozenebo.Deriváty jsou vhodné pro použití jako regulátory klíčení semen parazitických rostlin, zejména rodůa.

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká derivátů strigolaktonů a jejich použití pro regulaci klíčení semen parazitických rostlin.

Dosavadní stav techniky

Strigolaktony jsou seskviterpenoidní laktony biogeneticky příbuzné karotenoidům. Jsou nej mladšími zástupci fytohormonů regulujících růst a větvení výhonků a kořenů, klíčení semen či fbtomorfbgenezi. Zároveň ovlivňují symbiózu rostlin s arbuskulámími mykorhizními houbami (AM houby) a klíčení semen parazitických rostlin. Parazitické rostliny rodu Striga a Orobanche napadají celou řadu zemědělských plodin, jako jsou kukuřice, rýže, čirok, proso, rajče, slunečnice, tabák či luštěniny, a to zejména v oblastech subsaharské Afriky, ve východní a jižní Evropě, ale také ve střední Evropě. Parazitické rostliny dokáží vyprodukovat až 100 000 semen zajedno vegetační období, tato semena jsou schopna přežít v půdě v dormanci až několik let, a k jejich klíčení dochází pouze na základě přijetí signálu vyvolaného stimulátory klíčení, například právě strigolaktony, přítomnými v půdě a signalizujícími přítomnost hostitele. I proto tyto parazitické rostliny způsobují masivní ztráty v produkci zemědělských plodin odhadnuté jen pro rod Striga přes 7 miliard dolarů ročně.

Z tohoto důvodu je velmi důležitá možnost ovlivnění klíčení semen parazitických rostlin k regulaci jejich výskytu a růstu. K takové regulaci lze využít zejména fáze ve vývoji parazitické rostliny, během níž dochází k napojení vyklíčených semen na hostitelskou rostlinu, jež musí proběhnout v řádu několika dnů, jinak vyklíčené semeno zahyne. V této fázi lze využít tzv. sebevražedného klíčení, kdy se pomocí stimulátoru klíčení nechají semena v půdě vyklíčit bez přítomnosti hostitelské rostliny. Podobně jako u parazitických rostlin fungují strigolaktony jako signál k rozeznání hostitele u AM hub, u nichž stimulují vývoj výtrusnic a hyf důležitých pro kolonizaci kořenů a zajišťujících výměnu živin. AM houby jsou závislé na uhlíku, který přijímají od hostitele ve formě cukrů, a výměnou mu zajišťují lepší příjem živin (P, N, minerálů) a zvyšují tak jeho odolnost vůči stresu a patogenům.

Strigolaktony fungují také jako fytohormony, což souvisí s jejich schopností modulovat transport auxinů, dělení buněk, či rozdělení živin. Strigolaktony inhibují dělení buněk kořenů, a tím inhibují jejich náhodný růst; podporují prodlužování kořenových vlásečnic; podporují růst stonku; ovlivňují vývoj hlízek; inhibují vývoj nových výhonků; podporují růst kambia; a také zachovávají fosforovou a dusíkovou rovnováhu v rostlinných buňkách, čímž zajišťují rostlinám optimální růst za daných podmínek.

Strigolaktony jsou produkovány zejména kořeny rostlin, jejich identifikaci a charakterizaci ale ztěžuje jejich velmi nízká koncentrace v kořenových exudátech, která je na úrovni pikogramů. Biosyntéza strigolaktonů vychází z karotenoidů a vede k 1 ΙΛ-karlaktonu (struktura 1A) jako výchozí látce pro následnou syntézu strigolaktonů. Strukturním základem strigolaktonů je různě substituovaný tricyklický lakton (kruhy A,B,C), který je enol etherovou vazbou spojen s a,bnenasyceným fibranonem (kruh D; struktura 1B). Prvním izolovaným strigolaktonem byl (+)(3aR,5S,8bS,2'R)-strigol izolovaný v roce 1966 z kořenových exudátů bavlny (struktura 1B, (+)strigol) (Cook C.E., Whichard L.P., Turner B., Wall M.E., Egley G.H.: Science 154, 1189 (1966)).

- 1 CZ 308139 B6

1A

{11 ř^J-Kadakton

IS 1C \ / p-^^c

X. r Y' ^L·' ;

! A £ 8 ά,^Ος. ^{z Q/}..O

OH | D Ά;·Ο i >

3'%ϊ/ ''V {+ ýStrigol ‘⁴ \ GR24 i

Vzhledem k tomu, že v molekulách strigolaktonů se nachází několik center chirality a jejich struktura je poměrně složitá, je i syntéza těchto látek často zdlouhavá, drahá a s nízkými výtěžky. Vývoj nových derivátů strigolaktonů s potenciálně vyšší aktivitou a stabilitou je proto velmi žádoucí. Je důležité připravit strigolaktony se zachovanou bioaktivitou, ale stabilnější vůči hydrolýze, aby byly schopny setrvat v půdě déle a bylo tak možné je využít například k regulaci klíčení parazitických rostlin při tzv. sebevražedném klíčení. Do dnešní doby byla připravena řada syntetických derivátů strigolaktonů, z nichž derivát GR24 (struktura 1C) se používá jako referenční molekula při testech aktivity nových derivátů (Mangnus E.M., Stommen P.L.A., Zwanenburg B.: Plant Growth Regul. 11, 91 (1992)). Od testování GR (germination releaser) derivátů k regulaci výskytu parazitických rostlin bylo upuštěno kvůli nízké stabilitě derivátů v bazické půdě a nízké komerční dostupnosti (Kgosi R.L., Zwanenburg B., Mwakaboko A.S., Murdoch A.J.: Weed Res. 52, 197 (2012)). Tato nízká stabilita je způsobena zejména přítomností enol-etherové vazby, jež je velmi nestabilní vůči hydrolýze ve vodném prostředí. V nedávné době byly připraveny další deriváty strigolaktonů, tzv. debranony. Obecnou strukturu debranonů znázorňuje struktura 2:

V publikaci Fukui et al.: Bioorg. Med. Chem. Lett. 21, 4905-4908 (2011) byly ukázány debranony s R21 = Cl, F, Br, I, CF3, CN, CH3, terc-butyl, OCH3, QOjOCFE. ^!“'^y Tyto látky při testech inhibovaly vývoj výhonků rýže. Dále při testování vlivu na klíčení parazitické rostliny Striga hermonthica bylo zjištěno, že čtyři z těchto látek stimulovaly klíčení semen, a to až při koncentraci 10“⁴ M.

4-bromodebranon (R21 = Br) byl dále testován ve Fukui et al., Molecular Plant, Vol. 6(1), 88-99 (2013), a bylo zjištěno, že inhiboval vývoj nových výhonků rýže a podporoval růst rostliny do výšky, u rostliny Arabidopsis inhiboval větvení výhonků a vývoj laterálních kořenů, zatímco podporoval růst kořenových vlásečnic, a při koncentraci 10“⁶ M nestimuloval klíčení parazitické rostliny Striga hermonthica.

4-bromodebranon, chlorované debranony a debranony se substituovaným naftolem v publikacích Takahashi et al., Pěst Manag Sci 72: 2048-2053 (2016) a Fukui et. al., Front. Plant Sci. 8: 936 (2017) inhibovaly vývoj výhonků rýže a pouze dvě z těchto látek stimulovaly klíčení parazitické rostliny Striga hermonthica, přičemž stimulační účinek se objevil v minimální míře až od koncentrace 10“⁵ M. Debranony disubstituované substituenty F, Cl, Br, NO2 v různých pozicích byly testovány v publikaci Fukui et. al., Front. Plant Sci. 8: 936 (2017). Čtyři z těchto látek

-2CZ 308139 B6 stimulovaly klíčení zlOaž3O%při minimální koncentraci 10 ⁶ M. Látky inhibovaly vývoj výhonků rýže.

Nežádoucí účinky debranonů na vývoj neparazitických rostlin (rýže, Arabidopsis thaliana) jsou dány jejich vyšším účinkem jako fýtohormony. To znamená, že po aplikaci do půdy pro vyvolání „sebevražedného klíčení parazitických rostlin s velkou pravděpodobností negativně ovlivní vývoj a růst následně vysetých nebo vysazených zemědělských plodin.

Úkolem předkládaného vynálezu je poskytnout deriváty strigolaktonů s vyšší účinností na sebevražedné klíčení parazitických rostlin, ale přitom s nižší účinností jako fýtohormony, aby se předešlo nežádoucím negativním účinkům na zemědělské plodiny.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu jsou deriváty strigolaktonů obecného vzorce I,

(I), kde

Ri je vybrán z H, C1-C4 alkyl a, ^k _a

R2 je vybrán z C1-C4 alkyl, Br, Cl, OH, O(C1-C4 alkyl), COOH, COO(C1-C4 alkyl), přičemž (RiO) je vždy v poloze ortho nebo meta.

Ve výhodném provedení je substituent R2 vybrán z C1-C4 alkyl, O(C1-C4 alkyl), Br, Cl, výhodněji je vybrán z CH3, OCH3, Br, Cl.

C1-C4 alkyl zahrnuje methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, terc-butyl. S výhodou je vybraný z methylu, ethylu, propylu, isopropylu, nejvýhodněji se jedná o methyl.

V jednom výhodném provedení mají deriváty strigolaktonů obecný vzorec fa, kde

(fa)

-3 CZ 308139 B6

Ri je vybrán z H, C1-C4 alkyl a

R₂ je vybrán z C1-C4 alkyl, Br, Cl, OH, O(C1-C4 alkyl), COOH, COO(C1-C4 alkyl).

S výhodou je ve vzorci (la) substituent R₂ uspořádán v poloze ortho nebo meta.

V dalším výhodném provedení mají deriváty strigolaktonů obecný vzorec Ib,

(Ib), kde

Ri je H nebo C1-C4 alkyl,

R₂ je vybrán z C1-C4 alkyl, O(C1-C4 alkyl), Br, Cl.

S výhodou jsou deriváty strigolaktonů vzorce I vybrány ze skupiny zahrnující:

5-(3-hydroxyfenoxy)-3-methylfuran-2(5H)-on,

5,5-(1,3 -fenylenbis(oxy))bis(3-methylfůran-2(5H)-on), 5-(3-hydroxy-2-methylfenoxy)-3-methylfůran-2(5H)-on, 5-(2-bromo-3-hydroxyfenoxy)-3-methylfůran-2(5H)-on, 5-(2-chloro-3-hydroxyfenoxy)-3-methylfuran-2(5H)-on, 5-(2-hydroxy-3-methoxyfenoxy)-3-methylfuran-2(5H)-on, 5-(3,5-dimethoxyfenoxy)-3-methylfuran-2(5H)-on, 3-hydroxy-5-((4-methyl-5-oxo-2,5-dihydrofuran-2-yl)oxy)benzoová kyselina, 5-(3-hydroxy-5-methylfenoxy)-3-methylfůran-2(5H)-on, 5-(3-methoxy-5-methylfenoxy)-3-methylfůran-2(5H)-on, 5-(2-methoxy-4-methylfenoxy)-3-methylfůran-2(5H)-on.

Podstatou vynálezu jsou deriváty strigolaktonů se zachovaným butenolidovým D-kruhem, s enoletherovou vazbou nahrazenou stabilnější etherovou vazbou a se zjednodušenou ABC částí molekuly oproti přírodním strigolaktonům, kdy na místo tricyklické ABC části je použit substituovaný 1,3-dihydroxybenzen, případně 1,2-dihydroxybenzen.

Deriváty podle předkládaného vynálezu lze připravit reakcí 5-bromo-3-methyl-2(5H)-furanonu s příslušným komerčně dostupným substituovaným derivátem 1,3-dihydroxybenzenu, případně 1,2-dihydroxybenzenu. Tato syntéza je jednoduchá a levná a lze pomocí ní získat i gramová množství produktu. Výtěžek reakce je limitován stabilitou 5-bromo-3-methyl-2(5H)-furanonu a pohybuje se v rozmezí 20 až 60 %.

Připravené deriváty strigolaktonů podle předkládaného vynálezu jsou určeny pro použití jako látky stimulující klíčení semen parazitických rostlin (tzv. regulátory klíčení semen parazitických rostlin), zejména parazitických rostlin rodů Striga a Phelipanche. Látky podle vynálezu jsou tedy

-4CZ 308139 B6 určeny k ochraně zemědělských a průmyslových plodin před napadením parazitickými rostlinami vyvoláním tzv. „sebevražedného klíčení. Látky podle vynálezu se používají tak, že se aplikují do půdy před výsevem nebo vysázením zemědělských a/nebo průmyslových plodin. Tím vyvolají klíčení parazitických rostlin, které však nenajdou hostitele a uhynou. Poté se do půdy mohou vysévat nebo vysazovat požadované zemědělské a/nebo průmyslové plodiny.

Příklady uskutečnění vynálezu

Příprava 5-bromo-3-methyl-2(5H)-furanonu (podle Macias, F. A.; Garcia-Diaz, M. D.; Perezde-Luque, A.; Rubiales, D.; Galindo, A. C. G. J. Agric. Food Chem. 2009, 57, 5853-5864):

K roztoku 3-methyl-2(5H)-furanonu (90 % čistota, Sigma-Aldrich Co., 339 mg, 3,11 mmol) v CCL (4 mL) byl přidán NBS (l,lxn, 609 mg, 3,42 mmol) a katalytické množství benzoylperoxidu (0,2xn, 151 mg, 0,62 mmol) jako iniciátoru radikálové reakce. Reakční směs byla zahřátá na 78 °C a při této teplotě míchána 1,5 h. Poté byla zchlazena na 0 °C, zfiltrována a filtrát odpařen. Takto připravený 5-bromo-3-methyl-2(5H)-fiiranon byl ihned použit v dalším kroku syntézy.

Příklad 1

1,3-Dihydroxybenzen (Ixn, 342 mg) byl rozpuštěn v suchém tetrahydrofiiranu (THF, 15 mL) a zchlazen na 0 °C. K roztoku byl poté přidán terc-butoxid draselný (Ixn, 349 mg) a reakční směs byla míchána po dobu 15 min. Následně byl do reakční směsi přidán roztok 5-bromo-3-methyl2(5H)-furanon (Ixn, 550 mg) v 5 mL suchého THF a reakční směs byla míchána 16 h. Reakční směs byla zfiltrována přes fritu s celitem a filtrát byl odpařen. Čisté finální produkty, 5-(3hydroxyfenoxy)-3-methylfiiran-2(5H)-on (MD922) a 5,5'-(l,3-fenylenbis(oxy))bis(3methylfuran-2(5H)-on) (MD921), byly získány sloupcovou chromatografií na silikagelu a jako eluent byla použita směs petrolether/ethylacetát (8/2, v/v).

5-(3-hydroxyfenoxy)-3-methylfuran-2(5H)-on (MD922): Ή-NMR (CD OD. 400MHz): 7,147,10 (2H, m, H-4, Ar), 6.59 (IH, ddd, J = 0,9; 2,3; 8,2; Ar), 6,56 (IH, t, J = 2,3; Ar), 6,53 (IH, ddd, J = 0,9; 2,3; 8,1; Ar), 6,41 (IH, quintet, J = 1,4; H-5), 1,95 (3H, t, J = 1,5; CH₃). ¹³C-NMR (CD3OD, 100MHz): 173,4 (CO), 159,9 (C_Ar), 159,1 (C_Ar), 144,8 (C-4), 144,8 (C_Ar), 134,8 (C-3),

131,8 (CHat), 111,5 (CH_Ar), 108,7 (CH_Ar), 105,3 (CH_Ar), 100,7 (C-5), 10,4 (CH₃). HRMS m/z 229,04712 (kalkulováno pro dH.cAtNa ([M + Na]⁺): 229,04713).

5,5'-(l,3-fenylenebis(oxy))bis(3-methylfiiran-2(5H)-on) (MD921): Ή-NMR (CD₃OD, 400MHz): 7,31 - 7,26 (IH, m, Ar), 6,99 (2H, quintet, H-4a, H-4b), 6.92 - 6,87 (3H, m, Ar), 6,31 (IH, quintet, J = 1,4; H-5a), 6,28 (IH, quintet, J = 1,4; H-5b), 2,02 (3H, d, J = 1,4; CH_3a), 2,01 (3H, d, J = 1,4; CH_3b). ¹³C-NMR (CD₃OD, 100MHz): 171,2 (CO), 171,2 (CO), 157,3 (2xC_Ar), 157,2 (2xC_Ar), 142,2 (C-4a), 142,2 (C-4b), 134,3 (C-3a), 134,3 (C-3b), 130,4 (CHar), 130,4 (CHar), 111,7 (CHA,), 111,5 (CHar), 106,1 (CHar), 106,0 (CHar), 98,8 (C-5a), 98,7 (C-5b), 10,5 (2xCH₃). HRMS m/z 325,06827 (kalkulováno pro C,₆Hi₄O₆Na ([M + Na]⁺): 325,06826).

Příklad 2

2,6-Dihydroxytoluen (Ixn, 386 mg) byl rozpuštěn v suchém tetrahydrofiiranu (THF, 15 mL) a zchlazen na 0 °C. K roztoku byl poté přidán terc-butoxid draselný (Ixn, 349 mg) a reakční směs byla míchána po dobu 15 min. Následně byl do reakční směsi přidán roztok 5-bromo-3-methyl2(5H)-furanon (ITi. 550 mg) v 5 mL suchého THF a reakční směs byla míchána 16 h. Reakční směs byla zfiltrována přes fritu s celitem a filtrát byl odpařen. Čistý finální produkt, 5-(3hydroxy-2—methylfenoxy)-3-methylfuran-2(5H)-on (MD1112), byl získán sloupcovou chromatografií na silikagelu a jako eluent byla použita směs petrolether/ethylacetát (8/2, v/v).

-5 CZ 308139 B6

5-(3-hydroxy-2-methylfenoxy)-3-methylfiiran-2(5H)-on (MD1112): Ή-NMR (CDCI,. 400MHz): 7,05 (IH, dt, J = 0,5; 8,2; Ar), 7,00 (IH, quintet, J = 1,6; H-4), 6,82 (IH, d, J = 8,3; Ar), 6,58 (IH, dd, J = 0,4; 8,1; Ar), 6,27 (IH, quintet, J = 1,4; H-5), 4,94 (H, s, OH), 2,13 (3H, s, CH₃Ar), 2,02 (3H, t, J = 1,6; CH₃). ¹³C-NMR (CDC1₃, 100MHz): 171,5 (CO), 155,7 (Cat), 154,7 (C_Ar), 142,4 (C-4), 134,4 (C-3), 126,8 (CH_Ar), 114,1 (Cat), 110,6 (CH_Ar), 108,1 (CH_Ar), 99,6 (C5), 10,6 (CH₃), 8,4 (CH₃Ar). HRMS m/z 221,08086 (kalkulováno pro Ci₂Hi₄O₄ ([M + H]⁺): 221,08084).

Příklad 3

2-Bromo-l,3-dihydroxybenzen (Ixn, 588 mg) byl rozpuštěn v suchém tetrahydrofuranu (THF, 15 mb) a zchlazen na 0 °C. K roztoku byl poté přidán terc-butoxid draselný (Ixn, 349 mg) a reakční směs byla míchána po dobu 15 min. Následně byl do reakční směsi přidán roztok 5bromo-3-methyl-2(5H)-fiiranon (Ixn, 550 mg) v 5 mL suchého THF a reakční směs byla míchána 16 h. Reakční směs byla zfiltrována přes fritu s celitem a fdtrát byl odpařen. Čistý finální produkt, 5-(2-bromo-3-hydroxyfenoxy)-3-methylfiiran-2(5H)-on (MD914), byl získán sloupcovou chromatografií na silikagelu gradientovou elucí směsí petrolether/ethylacetát (9/1 - 3/1, v/v).

5-(2-bromo-3-hydroxyfenoxy)-3-methylfiiran-2(5H)-on (MD914): Ή-NMR (CDC1₃, 400MHz): 7,21 (IH, t, J = 8,2; Ar), 7,05 (IH, quintet, J = 1,6; H-4), 6,90 (IH, dd, J = 1,3; 8,2; Ar), 6,82 (IH, dd, J = 1,3; 8,2; Ar), 6,27 (IH, quintet, J = 1,4; H-5), 5,70 (IH, s, OH), 2,03 (3H, t, J = 1,5; CH₃). ¹³C-NMR (CDC1₃, 100MHz): 171,1 (CO), 153,6 (C_Ar), 153,6 (C_Ar), 141,9 (C-4),

134.8 (C-3), 129,0 (CH_Ar), 111,4 (CH_Ar), 109,2 (CH_Ar), 101,7 (C_Ar), 99,5 (C-5), 10,7 (CH₃). HRMS m/z 284,97582 (kalkulováno pro CnHi₀O₄Br ([M + H]+): 284,97570).

Příklad 4

2-Chloro-l,3-dihydroxybenzen (Ixn, 450 mg) byl rozpuštěn v suchém tetrahydrofuranu (THF, 15 mL) a zchlazen na 0 °C. K roztoku byl poté přidán terc-butoxid draselný (Ixn, 349 mg) a reakční směs byla míchána po dobu 15 min. Následně byl do reakční směsi přidán roztok 5bromo-3-methyl-2(5H)-fiiranon (Ixn, 550 mg) v 5 mL suchého THF a reakční směs byla míchána 16 h. Reakční směs byla zfiltrována přes fritu s celitem a filtrát byl odpařen. Čistý finální produkt, 5-(2-chloro-3-hydroxyfenoxy)-3-methylfuran-2(5H)-on (MD1114), byl získán sloupcovou chromatografií na silikagelu gradientovou elucí směsí petrolether/ethylacetát (9/1 - 8/2, v/v).

5-(2-chloro-3-hydroxyfenoxy)-3-methylfuran-2(5H)-on (MD1114): Ή-NMR (CDC1₃, 400MHz): 7,16 (IH, t, J = 8,3; Ar), 7,05 (IH, quintet, J = 1,6; H-4), 6,92 (IH, dd, J = 1,4; 8,4; Ar), 6,82 (IH, dd, J = 1,4; 8,3; Ar), 6,27 (IH, quintet, J = 1,4; H-5), 5,68 (IH, s, OH), 2,03 (3H, t, J = 1,6; CH₃). ¹³C-NMR (CDC1₃, 100MHz): 171,1 (CO), 152,7 (C_Ar), 152,5 (C_Ar), 141,9 (C-4),

134.9 (C-3), 127,9 (CH_Ar), 111,5 (CH_Ar), 109,3 (CH_Ar), 99,4 (C-5), 10,7 (CH₃). HRMS m/z 263,00819 (kalkulováno pro CnHgClNa ([M + Na]⁺): 263,00816).

Příklad 5 l,2-Dihydroxy-3-methoxybenzen (Ixn, 436 mg) byl rozpuštěn v suchém tetrahydrofuranu (THF, 15 mL) a zchlazen na 0 °C. K roztoku byl poté přidán terc-Butoxid draselný (Ixn, 349 mg) a reakční směs byla míchána po dobu 15 min. Následně byl do reakční směsi přidán roztok 5-bromo-3-methyl-2(5H)-fiiranon (Ixn, 550 mg) v 5 mL suchého THF a reakční směs byla míchána 16 h. Reakční směs byla zfiltrována přes fritu s celitem a filtrát byl odpařen. Čistý finální produkt, 5-(2-hydroxy-3-methoxyfenoxy)-3-methylfiiran-2(5H)-on (MD932), byl získán sloupcovou chromatografií na silikagelu gradientovou elucí směsí petrolether/ethylacetát (8/2 - 3/1, v/v).

-6CZ 308139 B6

5-(2-hydroxy-3-methoxyfenoxy)-3-methylfuran-2(5H)-on (MD932): Ή-NMR (CDCI,. 400MHz): 7,10 (1H, quintet, J = 1,6; H-4), 7,01 (1H, t, J = 8,3; Ar), 6,63 (1H, dd, J = 1,4; 8,3; Ar), 6,49 (1H, dd, J = 1,4; 8,3; Ar), 6,23 (1H, quintet, J = 1,4; H-5), 5,79 (1H, s, OH), 3,87 (3H, s, CH₃O), 1,99 (3H, t, J = 1,5; CH₃). ¹³C-NMR (CDC1₃, 100MHz): 170,9 (CO), 151,9 (Cat), 150,0 (C_Ar), 142,6 (C-4), 134,3 (C-3), 132,1 (Cat), 126,0 (CH_Ar), 109,2 (CH_Ar), 103,7 (CH_Ar), 102,8 (C-5), 56,0 (CH₃O), 10,6 (CH₃).). HRMS m/z 259,05760 (kalkulováno pro Cj₂H|₂O_;Na ([M + Na]⁺): 259,05769).

Příklad 6

3.5- Dimethoxyfenol (Ixn, 479 mg) byl rozpuštěn v suchém tetrahydrofuranu (THF, 15 mh) a zchlazen na 0 °C. K roztoku byl poté přidán terc-butoxid draselný (Ixn, 349 mg) a reakční směs byla míchána po dobu 15 min. Následně byl do reakční směsi přidán roztok 5-bromo-3-methyl2(5H)-furanon (Ixn, 550 mg) v 5 mh suchého THF a reakční směs byla míchána 16 h. Reakční směs byla zfiltrována přes fritu s celitem a filtrát byl odpařen. Čistý finální produkt, 5-(3,5dimethoxyfenoxy)-3-methylfuran-2(5H)-on (MD1096), byl získán sloupcovou chromatografií na silikagelu gradientovou elucí směsí petrolether/ethylacetát (9/1 - 8/2, v/v).

5-(3,5-dimethoxyfenoxy)-3-methylfuran-2(5H)-on (MD1096): Ή-NMR (CDC1₃, 400MHz): 6,96 (1H, quintet, J = 1,6; H-4), 6,31 (2H, d, J = 2,2; Ar), 6,28 (1H, quintet, J = 1,4; H-5), 6,22 (1H, t, J = 2,2; Ar), 3,78 (6H, s, CH₃O_Ar), 2,03 (3H, t, J = 1,5; CH₃). ¹³C-NMR (CDC1₃, 100MHz): 171,3 (CO), 161,5 (C_Ar), 161,5 (C_Ar), 158,2 (C_Ar), 142,2 (C-4), 134,5 (C-3), 98,9 (C5), 95,8 (CH_Ar), 95,6 (2xCH_Ar), 55,5 (2xCH₃O_Ar), 10,6 (CH₃). HRMS m/z 273,07335 (kalkulováno pro Ci₃Hi₄O₅Na ([M + H]⁺): 273,07334).

Příklad 7

3.5- Dihydroxybenzoová kyselina (Ixn, 479 mg) byl rozpuštěn v suchém tetrahydrofuranu (THF, 15 mh) a zchlazen na 0 °C. K roztoku byl poté přidán terc-butoxid draselný (Ixn, 349 mg) a reakční směs byla míchána po dobu 15 min. Následně byl do reakční směsi přidán roztok 5bromo-3-methyl-2(5H)-furanon (Ixn, 550 mg) v 5 mh suchého THF a reakční směs byla míchána 16 h. Reakční směs byla zfiltrována přes fritu s celitem a filtrát byl odpařen. Čistý finální produkt, 3-hydroxy-5-((4-methyl-5-oxo-2,5-dihydrofiiran-2-yl)oxy)benzoová kyselina (MD1097), byl získán sloupcovou chromatografií na silikagelu gradientovou elucí směsí chloroform/methanol (98/2 - 9/1, v/v).

3-hydroxy-5-((4-methyl-5-oxo-2,5-dihydrofuran-2-yl)oxy)benzoová kyselina (MD1097): Ή-NMR (CDC1₃, 400MHz): 7,21 (1H, quintet, J = 1,6; H-4), 7,07 (1H, quintet, J = 1,5; H-5), 6,93 (2H, d, J = 2,3; Ar), 6,52 (1H, t, J = 2,3; Ar), 1,98 (3H, t, J = 1,4; CH₃). ¹³C-NMR (CDC1₃, 100MHz): 173,1 (CO), 166,1 (CO), 161,5 (C_Ar), 160,0 (2xC_Ar), 144,5 (C-4), 135,2 (C-3), 131,5 (C_Ar), 109,2 (2xCH_Ar), 109,1 (CH_Ar), 94,6 (C-5), 10,5 (CH₃). HRMS m/z 249,04053 (kalkulováno pro ί’ιΉΉή ([M - H]⁺): 249,04046).

Příklad 8

3.5- Dihydroxytoluen (orcinol) (Ixn, 386 mg) byl rozpuštěn v suchém tetrahydrofuranu (THF, 15 mh) a zchlazen na 0 °C. K roztoku byl poté přidán terc-butoxid draselný (Ixn, 349 mg) a reakční směs byla míchána po dobu 15 min. Následně byl do reakční směsi přidán roztok 5-bromo-3methyl-2(5H)-fiiranon (Ixn, 550 mg) v 5 mh suchého THF a reakční směs byla míchána 16 h. Reakční směs byla zfiltrována přes fritu s celitem a filtrát byl odpařen. Čistý finální produkt, 5(3-hydroxy-5-methylfenoxy)-3-methylfiiran-2(5H)-on (MD1105), byl získán sloupcovou chromatografií na silikagelu gradientovou elucí směsí petrolether/ethylacetát (9/1 - 8/2, v/v).

5-(3-hydroxy-5-methylfenoxy)-3-methylfuran-2(5H)-on (MD1105): Ή-NMR (CDC1₃, 400MHz): 6,96 (1H, quintet, J = 1,6; H-4), 6,54 (1H, br.s, Ar), 6,45 (1H, t, J = 2,1; Ar), 6,41

-7CZ 308139 B6 (IH, br.s, Ar), 6,26 (IH, quintet, J = 1,4; H-5), 6,22 (IH, t, J = 2,2; Ar), 4,97 (IH, s, OH), 2,28 (3H, d, J = 0,3; CH₃Ar), 2,01 (3H, t, J = 1,5; CH₃). ¹³C-NMR (CDC1₃, 100MHz): 171,5 (CO), 157,4 (C_Ar), 156,5 (C_Ar), 142,3 (C-4), 141,1 (C_Ar), 134,4 (C-3), 111,5 (CH_Ar), 109,9 (CH_Ar),

101.7 (CH_Ar), 99,1 (C-5), 21,5 (CH₃Ar), 10,6 (CH₃). HRMS m/z 221,08080 (kalkulováno pro Ci₂Hi₃O₄ ([M + H]⁺): 221,08084).

Příklad 9

3-Methoxy-5-methylfenol (Ixn, 430 mg) byl rozpuštěn v suchém tetrahydrofúranu (THF, 15 mL) a zchlazen na 0 °C. K roztoku byl poté přidán terc-butoxid draselný (Ixn, 349 mg) a reakční směs byla míchána po dobu 15 min. Následně byl do reakční směsi přidán roztok 5-bromo-3methyl-2(5H)-fúranon (Ixn, 550 mg) v 5 mL suchého THF a reakční směs byla míchána 16 h. Reakční směs byla zfiltrována přes fritu s celitem a filtrát byl odpařen. Čistý finální produkt, 5(3-methoxy-5-methylfenoxy)-3-methylfuran-2(5H)-on (MD1108), byl získán sloupcovou chromatografií na silikagelu gradientovou elucí směsí petrolether/ethylacetát (9/1 - 8/2, v/v).

5-(3-methoxy-5-methylfenoxy)-3-methylfiiran-2(5H)-on (MD1108): Ή-NMR (CDC1₃) 400MHz): 6,96 (IH, quintet, J = 1,6; H-4), 6,57 (IH, br.d, J = 0,4; Ar), 6,49-6,47 (2H, m, Ar), 6,27 (IH, quintet, J = 1,4; H-5), 3,78 (3H, s, CH₃O_Ar), 2,31 (3H, d, J = 0,5; CH₃Ar), 2,01 (3H, t, J = 1,6; CH₃). ¹³C-NMR (CDC1₃, 100MHz): 171,4 (CO), 160,6 (C_Ar), 157,4 (C_Ar), 142,3 (C-4),

140.7 (Cat), 134,4 (C-3), 110,2 (CH_Ar), 109,6 (CH_Ar), 100,3 (CH_Ar), 99,1 (C-5), 55,3 (CH₃O_Ar),

21.7 (CH₃Ar), 10,6 (CH₃). HRMS m/z 235,09642 (kalkulováno pro Ci₃Hi₅0₄ ([M + H]⁺): 235,09649).

Příklad 10

2-Methoxy-4-methylfenenol (Ixn, 430 mg) byl rozpuštěn v suchém tetrahydrofuranu (THF, 15 mL) a zchlazen na 0 °C. K roztoku byl poté přidán terc-butoxid draselný (Ixn, 349 mg) a reakční směs byla míchána po dobu 15 min. Následně byl do reakční směsi přidán roztok 5-bromo-3methyl-2(5H)-fiiranon (Ixn, 550 mg) v 5 mL suchého THF a reakční směs byla míchána 16 h. Reakční směs byla zfiltrována přes fritu s celitem a filtrát byl odpařen. Čistý finální produkt 5(2-methoxy-4-methylfenoxy)-3-methylfuran-2(5H)-on (MD1116), byl získán sloupcovou chromatografií na silikagelu gradientovou elucí směsí petrolether/ethylacetát (9/1 - 8/2, v/v).

5-(2-methoxy-4-methylfenoxy)-3-methylfuran-2(5H)-on (MD1116): Ή-NMR (CDC1₃, 400MHz): 7,10 (IH, d, J = 8,0; Ar), 7,04 (IH, quintet, J = 1,6; H-4), 6,74 (IH, s, Ar), 6,71 (IH, d, J = 8,1; Ar), 6,23 (IH, quintet, J = 1,4; H-5), 3,86 (3H, s, CH₃O_Ar), 2,32 (3H, s, CH₃Ar), 1,97 (3H, t, J = 1,5; CH₃). ¹³C-NMR (CDC1₃, 100MHz): 171,6 (CO), 149,9 (C_Ar), 142,9 (C_Ar), 142,6 (C-4), 134,8 (C-3), 134,4 (C_Ar), 121,2 (CH_Ar), 119,5 (CH_Ar), 113,1 (CH_Ar), 100,5 (C-5), 55,8 (CH₃0_Ar), 21,23 (CH₃Ar), 10,6 (CH₃). HRMS m/z 257,08745 (kalkulováno pro Ci₃Hi₄0₄Na ([M + Na]⁺): 257,07843).

Příklad 11

Stimulace klíčení semen parazitických rostlin vlivem nových derivátů strigolaktonů testovaná pomocí MTT biotestu

K testování byla použita semena parazitických rostlin Striga hermonthica (Súdán, 2007), Phelipanche ramosa (Francie, hostitel Cannabis sativa, 2012) a Phelipanche ramosa (Francie, hostitel Brassica napus, 2015). Semena byla sterilizována v roztoku 2% (v/v) chlornanu sodného a 1% Tritonu X-100 (v/v) za intenzivního míchání na magnetické míchačce po dobu 6 min. Poté byla semena promyta 200 ml sterilní MilliQ vody pomocí skleněné frity a vakuové vývěvy. Inkubace semen probíhala v 1 mM HEPES pufiru o pH 7,5 a 0,1% PPM (Plant Preservative Mixture), v případě Striga hermonthica 4 dny při 27 °C a Phelipanche ramosa alespoň 7 dnů při

- 8 CZ 308139 B6 °C. Dalším krokem byla distribuce suspenze semen do 96jamkové desky opakovači pipetou v množství 50 pl na jamku.

Klíčení bylo indukováno 10 μΐ testovaných látek v koncentračním rozsahu 10“¹³ až 10“⁵ a objem 5 v jamce byl doplněn sterilní vodou do 100 μΐ. Negativní kontrolou byl 0,1% aceton. Klíčení probíhalo 4 dny v inkubátoru při výše zmíněných teplotách bez přístupu světla. Poté bylo do každé jamky přidáno 10 μΐ roztoku MTT (3-[4,5-dimetylthiazol-2-yl]-2,5-difenyltetrazolium bromid) o koncentraci 5 g/1. Po 24 hodinách byl přidán lyzační roztok (10% Triton X-100 a 0,04% HC1 v isopropanolu) za účelem rozpuštění vzniklého formazánu. Po dalších 24 hodinách ίο byl změřen rozdíl absorbancí při 570 a 690 nm pro každou jamku. Data byla vyhodnocena nelineární regresí v programu GraphPad Prism 5.0 a byly stanoveny hodnoty EC50, které jsou prezentovány v následující tabulce. Test byl proveden dvakrát pro každou testovanou látku.

Stimulace klíčení semen parazitických rostlin (EC50). Bn = Brassica napus, Cs = Cannabis 15 sativa melami

Stríga hermontica

Phelipanche ramosa (Bn)

Látka/EC50 í hmotnost (mo!/L) í

I IgfatolJ

Phelipanche ramosa (Cs)

Látka podle | příkladu 1 206,20 (M.D922)

Látka podle příkladu (MD921)

7.39x*lff

7,19x10'

Látka podle ΐ příkladu 2 | 220,22 (MD1112) I

Látka podle | příkladu 3 285,09 (MD914) I

Látka podle příkladu 4 (MD1114)

Látka podle příkladu 5 (MD932)

Látka podle příkladu 6 (MI) 1096)

8,5 Jx 10'·

1J6 iff

240,64	2,26-< Iff'	1 2,52 MO*
236,22	2,19x10*	1,30x10'*
250,23	4,25xl.O'⁷	1 4,83x10·’

4,06* Iff’

8,31x10

-9CZ 308139 B6

Látka podle

příkladu 7 250,20 (MD1097)	I :.;4' 10'	2,58x10*	5.42* iO*
Látka podle í
přikladu 8 220,22		n.t.	1,51 %0^;	7,30x10*
(MD1105)				1
Látka podle					I
přikladu 9 \| 234,25 (MD1I08)		2.88' lir	4,90*10''’	9,3810	i
Látka podle					i
příkladu 10 \| 234,25		5.29% ÍL	1,97x10’⁸	1,24*10’
(MD1116) i

n.t. = netestováno

Příklad 12

Semena rostlin Arabidopsis thaliana byla získána z NASC (The European Arabidopsis Stock Centre, NASC ID: N1092). Semena byla omyta v 70% (v/v) EtOH po dobu 10 min, poté sterilizována v 10% (v/v) NaOCl po dobu 15 min, ponořena do sterilní vody na 10 min a klíčena na bezhormonovém Murashige a Skoog (MS) mediu při 25 °C, 16 h fotoperioda (záření o 115 pmol-nU-s“¹). Po vývoji prvního páru listů (cca 7 dní) byly sazeničky použity pro testování.

Test biologické aktivity: Devět sazeniček A. thaliana bylo umístěno do devíti plastových petriho misek (jedna sazenička na misku) o rozměrech 10x10 cm se 40 mL bezhormonového MS media s agarem do něhož bylo přidáno 100 pL testované látky v koncentracích 10“⁷ M až 10“⁴ M. Testování bylo prováděno ve třech opakováních. Rostliny byly vystaveny působení testovaných látek po dobu 7 dní při 16 h fotoperiodě (záření o 115 pmol-nri-s“¹) při 25 °C ve svislé poloze misek.

Měření kořenů: Kořeny každé rostliny byly skenovány EPSON PERFECTION V700 PHOTO scanner. Skeny kořenů byly poté zprocesovány pomocí softwaru WinRHIZO (Regent Instruments, Inc., Ville de Quebec, Canada), který spočítá celkovou délku kořenů. Délka kořenuje uváděna v cm.

Statistika: Rozdíly mezi experimenty byly analyzovány pomocí jednosměrného ANOVA testu s Fisher LSD pos-hoc testem. Použitá hladina významnosti: P = 0,05. STATISTICA 7 (StatSoft, Tulsa, OK, U.S.A.) software byl použit pro všechny výpočty.

- 10 CZ 308139 B6

1 koncentrace testované látky (μΜ)
testovaná látka	0	0,1	tool 10,00	100,00
kontrola	14,96*4,35
MD922		18,12*3,41	16,46*4,26	18,27*4,65	9,08*2,24
MD921		12,18*1,26	15,67*4,16	15,22*3.44	5,74*1,Π
MD914		13,67*4,95	15,26*3,43	16,57*4,64	9,32*2,46
MD1I14		15,53*5,07	14,92^2.55	13,85*4,57	4,44*1,35
MD932		14,76*3,81	11,40*2,15	12,81*1,82	10,07*2,06
1 MD1096		12,44*2,48	12,72*4,09	10,17*1,39	4,81*1,82
MDW97		16,36*1,95	17,06*5,00	12,93*5,12	10,99*2,55
MD1108		15,71*4,11	12,87*2,50	18,18*4,30	2,69*0,76
MD1116		12,64*2,99	16,07*5,02	17,70*4,26	10,85*1,95

Testované látky nejevily statisticky signifikantní hormonální aktivitu na rostlinách A. thaliana při žádné z testovaných koncentrací (ΙΟ^-7 M - l(H M). Při nejvyšší koncentraci (ΙΟ^-4 M) se projevila toxicita této vysoké koncentrace na rostliny. Tato toxická koncentrace je ale minimálně o řád vyšší než koncentrace, při které látky vykazovaly aktivitu při klíčení semen parazitických rostlin (Příklad 11).

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

1. Derivát strigolaktonů obecného vzorce I,

(I), kde

Ri je vybrán z H, C1-C4 alkyl a * , a

R

2 je vybrán z C1-C4 alkyl, Br, Cl, OH, O(C1-C4 alkyl), COOH, COO(C1-C4 alkyl), přičemž (RiO) je vždy v poloze ortho nebo meta.

Ί. Derivát strigolaktonů podle nároku 1, kde je substituent R2 vybrán z C1-C4 alkyl, O(C1-C4 alkyl), Br, Cl.

- 11 CZ 308139 B6

3. Derivát strigolaktonů podle nároku 1, mající obecný vzorec la,

(la), kde

Ri je vybrán z H, C1-C4 alkyl a .a

4. Derivát strigolaktonů podle nároku 3, kde je substituent R₂ uspořádán v poloze ortho nebo meta.

5. Derivát strigolaktonů podle nároku 1, mající obecný vzorec Ib,

Ú A x Λ (Ib), kde

Ri je H nebo C1-C4 alkyl,

R₂ je vybrán z C1-C4 alkyl, O(C1-C4 alkyl), Br, Cl.

6. Derivát strigolaktonů podle nároku 1, vybraný ze skupiny zahrnující:

5-(3-hydroxyfenoxy)-3-methylfuran-2(5H)-on,

5,5'-(l,3-fenylenbis(oxy))bis(3-methylfuran-2(5H)-on),

5-(3-hydroxy-2-methylfenoxy)-3-methylfůran-2(5H)-on,

5-(2-bromo-3-hydroxyfenoxy)-3-methylfůran-2(5H)-on,

5 -(2-chloro-3 -hydroxyfenoxy)-3 -methylfuran-2 (5H)-on,

5-(2-hydroxy-3-methoxyfenoxy)-3-methylfuran-2(5H)-on,

5-(3,5-dimethoxyfenoxy)-3-methylfuran-2(5H)-on,

3-hydroxy-5-((4-methyl-5-oxo-2,5-dihydrofuran-2-yl)oxy)benzoová kyselina,

5-(3-hydroxy-5-methylfenoxy)-3-methylfůran-2(5H)-on,

5-(3-methoxy-5-methylfenoxy)-3-methylfůran-2(5H)-on,

- 12 CZ 308139 B6

5-(2-methoxy-4-methylfenoxy)-3-methylfůran-2(5H)-on.

7. Způsob přípravy derivátu strigolaktonů podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, vyznačený tím, že se 5-bromo-3-methyl-2(5H)-fůranon podrobí reakci se substituovaným

5 derivátem 1,3-dihydroxybenzenu nebo 1,2-dihydroxybenzenu nesoucím substituenty ORi a R2.

8. Použití derivátu strigolaktonů podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6 pro ochranu zemědělských a/nebo průmyslových plodin před napadením parazitickými rostlinami vyvoláním předčasného klíčení parazitických rostlin.

9. Použití podle nároku 8, kde parazitickými rostlinami jsou parazitické rostliny rodů Striga a Phelipanche.

10. Použití podle nároku 8 nebo 9, kde se derivát strigolaktonů aplikuje do půdy před výsevem 15 nebo vysázením zemědělských a/nebo průmyslových plodin, a průmyslové a/nebo zemědělské plodiny se vysejí nebo vysadí až po předčasném vyklíčení a uhynutí parazitických rostlin.