CZ308099A3 - Mikrobiální biotransformace - Google Patents

Description

Mikrobiální biotransformace

Oblast vynálezu __ Předložený vynález se týká použití mikrobiální biotransformace k O-demethylaci určitých farmaceutických meziproduktových sloučenin. Zejména se týká použití určitých mikroorganizmů k O-demethylaci určitých farmaceutických meziproduktových sloučenin.

Dosavadní stav techniky

Článek v Analytica Chimica Acta (1990) 233, 191-198 se zabývá použitím Cunnighamella elegans k demethylaci určitých n-propylnoraporfinových sloučenin.

Článek v Biomedical and Enviromental Mass Spectrometry (1986) 13, 223-229 se zabývá použitím Cunninghamella elegans k produkci potenciálních metabolitů N-n-propylnorapomorfinu.

Překladový článek publikovaný v Enzyme and Microbial Technology (1984) 6, 242-253, na str. 250-252, široce popisuje použití určitých mikroorganizmů, například fungálních druhů jako jsou Cunninghamella, Aspergillus, Thamnostylura, Penicillium Sepedonium k O-dealkylaci určitých sloučenin.

Kapitola 5.5 z Biotransformations in Preparative Organic Chemistry od H.G.Daviese a j. se týká použití Sepedonium chrisospermum a Cunninghamella elegans k demethylaci určitých sloučenin včetně vindolinu a 10,11-dimethoxyaporfinu.

Článek v Phytochemistry (1997) 44 (8), 1479-1482, se zabývá použitím Aspergillus niger k produkci (-)-pinoresinolu ·· 9999

9 9

9999

•9 99 · · 9 9 9

9 9 9 9

99 99

O-demethylací (+)-eudesminu.

US patent č. 5 618 707 udělený 18.dubna 1997 se týká po užití Zygosaccharomyces bailii ATGC. 38924 k stereoselektivní redukci sloučeniny pentanové kyseliny na fenyloxazolidinový produkt.

US patent č. 5 580 764 se zabývá použitím oxido/redukta z Lactobacillus plantarum, Pichia haplophila, Candida utilis, Lactobacillus buchmans, Aspergillus flavus a Neurospora crassa k redukci meziproduktů při syntéze uhlíkatých anhydrasových inhibitorů.

Stručný popis výkresů

Obr. 1 až 4 znázorňují profily vysokotlaké kapalinové chromato grafie vytvořené za použití mikrobiální biotransformace třemi fungálními kulturami.

Podstata vynálezu

V jednom provedení je předložený vynález zaměřen na způ sob výroby sloučeniny vzorce I

•4 4444 • 4 4 4444 4444

4 444· 4444

4 44 44 44 444 444 • · 4444 4 4

94444 44 44 44 44

- 3 ze sloučeniny vzorce II

zahrnující selektivní demethylaci sloučeniny vzorce II v přítomnosti enzymu odvozeného z kultury mikoorganizmu rodu Monosporium.

Výhodný je postup, když uvedení mikroorganizmus je Mono sporium olivacerum.

Také je výhodný způsob, kde uvedený Monosporium olivacerum je Monosporium olivacerum ATCC 36300.

V dalším provedení je předložený vynález zaměřen na způ sob přípravy sloučeniny vzorce III

HO

(III)

4 4444

4

4

- 4 44 4 4 4 •· 4444

4 4 4 · • 44 4444

44 ··· 444

4 4 4 4 4

44 44 44 ze sloučeniny vzorce II

zahrnující selektivní demethylaci sloučeniny vzorce II v přítomnosti enzymu odvozeného od mikroorganizmu rodu Thamnostylum. Výhodný je způsob, v němž je uvedeným mikroorganizmem Thamnostylum piriforme.

Také je výhodný způsob, kde Thamnostylum piriforme je Thamnostylum piriforme ATCC 8992.

V dalším provedení je předložený vynález zaměřen na použití sloučeniny vzorce II

·· ····

Výhodné je použití, kde sloučenina vzorce XI je neselektivně demethylována.

Detailní popis vynálezu

Tento vynález zahrnuje použití mikroorganizmů k zajištění demethylace meziproduktu při syntéze CP-336 156 (estorogenový agonist/osteoporosa). Použití mikrobů eliminuje chemický krok, který produkuje methylbromid, skleníkový plyn, který se těžko a nákladně zachycuje jako vedlejší produkt.

Biotransformace se může provádět za použití celobuněčných kultur mikroorganizmů, buněčných extraktů mikroorganizmů, nebo vyčištěnaých enzymů z mikroorganizmů.

Výchozí materiál pro tuto mikrobiální biotransformaci je CP-324 198, který je směsí cis-diastereoisomerů. Byly zjištěny 3 houby, které provádějí tuto reakci s rozdílnými stereoselektivitami.

ΦΦ ΦΦΦΦ

ΦΦ ΦΦ ΦΦ ·· • φ · ΦΦΦΦ φ · · φ φ φ ΦΦΦΦ ΦΦΦΦ • φ φφφφφφ φφφ φφφ φ φ ΦΦΦΦ · ·

ΦΦΦΦ · ΦΦΦΦ ΦΦΦΦ

- 6 Cunninghamella echinulata O-demethyluje oba diastereoisomery k vytvoření racemické směsi nazývané CP-319 609, která je složena z diastereoisomerů 336 156 a CP-335 992. Monosporium olivaceum a Thamnostylum piriforme působí pouze na jeden z diastereoisomerů v CP-324 098 a poskytuje 1 diastereoisomerní produkt jak je dále uvedeno.

CP-324 098

Cunninghamella echinulata Thamnostylum piriforme

Monosporium olivaceumm

CP-336 156 není diastereoselektivní diastereoselektivní-méně žádoucí produkt (CP-335 992) diastereoselektivní-požadovaný produkt (CP-336 156)

Výchozí materiál a produkty tytvořené těmito třemi organizmy byly určeny chirální HPLC jak je znázorněno v obr. 1-4. Finální produkty reakcí všech tří organizmů byly izolovány z fermentačního bujónu a charakterizovány pomocí NMR MS, a chirální HPLC k potvrzení jejich identity.

000« • 0 0 0 · · · • 0 0 · 00 • 0 · 0 · · · 0 0 0 0 0 0

0000 0 00 00

00 0 0 0 · • 0 0 0

000 0·0

0

0 0 0

Příklady provedení vynálezu

Jelikož je vynález popsán obecnými termíny, odkazuje se nyní na specifické příklady provedení. Je třeba vědět, že tyto příklady nejsou míněny k omezení předloženého vynálezu, jehož rozsah je určen připojenými patentovými nároky.

Monosporium olivaceum ATCC 36300 a Thamnostylum piriforme ATCC 8992 mohou být získány z Americké sbírky typových kultur. Kultura takto získaná se přidá do vhodného růstového media a inkubuje se za třepání až započne růst. Kultury takto získané se použití k naočkování šikmin. Části těchto šikmin se zmrazí jako základní zásoba. Příslušné mikroorganizmy se inokulují ze šikmin do dvou baněk obsahujících růstové medium, jehož složení je uvedeno dále. Fermentace se provádí při teplotách v rozmezí od asi 22 °C do asi 32 °C, avšak pro optimální výsledky je výhodné provádět fermentaci při asi 28 °C.

pH media se řídí při asi pH 6-7 použitím vhodných organic kých nebo anorganických pufrů začleněných do fermentačního media nebo periodickým přidáváním zásady. Dobrý růst mikroorganizmu se dosáhne během 48 až 72 hodin.

Obsahy baněk se převedou do Fernbachovy baňky obsahující čerstvé růstové medium, které má totéž složení jako dříve použité růstové medium. Změny media mění výtěžek sloučeniny a rychlost produkce. Výhodné složení media je shrnuto v příkladové sekci. Po třepání po jeden další den se přidá sterilně filtrovaný roztok rapamycinu ve vhodném rozpouštědle jako je dimethylsulfoxid nebo dimethylformamid. Fermentace pokračuje jeden až 6 dnů. Je výhodné, aby fermenatace pokračovala po dobu asi 2 dnů.

Vhodné růstové medium pro použití při způsobu tohoto vynálezu obsahuje zdroj nebo zdroje asimilovatelného uhlíku,

Κ 99*9 • 9 ···· • · 9 « » 9 9 9 9 • » · · · 9 9 9 9 · * · · 99 999 · ♦ · • 9 9 9 9 9 9

99 99 99 99 asimilovatelného dusíku a anorganických solí obsahujících nezbytné minerály.

Obecně může být použito mnoho glycidů jako zdrojů asimilovatelného dusíku, jako je glukosa, maltosa, mannosa, sacharosa, škrob, glycerint prosný gel, melasy, sojové oříšky a pod.

Zdroje asimilovatelného dusíku zahrnují takové materiály jako jsou kvasnicové a kaseinové hydrolyzáty, původní kvasnice, kvasnicové extrakty, mouka ze semen bavlníku, tuhé sojové látky, extrakty z pšeničných klíčků, pepton, kukuřičná výluhová kapalina a amoniové soli

Živiny anorganických solí, které mohou být začleněny v kultivačním mediu jsou obvyklé soli poskytující sodík, železo, hořčík, draslík, kobalt, fosforečnan a podobně.

Obecně však není použitá technologie omezena.

Vhodná růstová media zahrnují media jako jsou (a) dextrosa (20 g), kvasnicový extrakt (5 g), sojová mouka (5 g), NaCl (5 g), K₂HPO₄ (5 g) a destilovaná voda (1000 ml), kde pH je nastaveno na hodnotu 7,0 vodnou HCl, (b) dextrin (10 g), hovězí extrakt (3 g), ardamin pH (5g),

N-Z amin typu E (5 g), MgSO₄.7H₂O (0,5 g), KH₂PO₄ (0,37 g),

CaCO₃ (0,5 g), destilovaná voda (1000 ml), kde hodnota pH je nastavena na 7,1 vodnou HCl, načež následuje druhé stadium glukosa (10 g), Hy-Case SP (2 g), hovězí extrakt (1 g), kukuřičná výluhová kapalina (3 g), destilovaná voda (1000 ml), kde pH se nastaví na 7,0, (c) glukosa (10 g), kukuřičná kapalina (6 g), KH₂PO₄ (3 g), CaCO₃ (3,5 g), sojový olej (surový, 2,2 ml), kvasnicový ·· ·««· • 8 8 9 9 0 8 0 9 9 9 · · · · 8 «··· • 8 9 8 9 9 9 0 999 998 fl · · 0 9 * · fl

9898 9 90 8» 88 09 extrakt (2,5 g), destilovaná voda (1000 ml), kde pH je nastaveno na hodnotu 7,0 až 7,3 vodnou HC1, (d) sladový sirup (20 g), sojové maso (5 g), kasein (1 g), sušené kvasnice (1 g), NaCl (5 g), destilovaná voda (1000 ml), (e) laktosa (75 g), Pharmamedia (nahrazuje kvasnicový extrakt, 40 g), CaCOg (10 g), Na₂SOg (4 g) , destilovaná voda (1000 ml), (f) ISP č. 3 (h) ISP č. 4 (i( ISP č. 5 a podobně.

Postupy

Kultury: Cunninghamella echinulata ATCC 9244 a ATCC 36190, Monosporium olivaceum ATCC 36300 a Thamnostylum piriforme ATCC 8992.

Biotransformace

Růstové medium (inokulum a biotransformační stadia):

glukosa 20 g/1 pH k 7,0 sojová mouka a 5 sojové maso kvasnicový extrakt 5

NaCl 5

K₂HPO₄ 5 ml na 125 ml Erlenmeyerovu baňku pro inokulum a biotransformaci.

Inokuluje se ze šikmin nebo zmrazených zásobních kultur do 25 ml výše uvedeného media ve 125 ml Erlenmeyerově baňce a inokuluje se za třepání při 28 °C po dobu 2 až 3 dnů.

2,5 ml se převede do 25 ml čerstvého bujónu v Erlenmeyerově baňce a třepe se další den.

0« 0000 » · 0 • ·

9 • 0 00 00 ·

Přidá se CP-324 098 rozpuštěný v DMSO a sterilně se filtruje do konečné koncentrace 0,2 mg/ml. Další substrát může být nadávkován v jednodenních intervalech. Pokračuje inkubace za třepání po dobu 1 až 6 dnů.

00			0«	0«	010
•	•	•		• 0·	• <»
•	•		··	• ·	β ·
•	•	•		• 0 000	0··
•	•	•		0 0	•
• 0			0·	*·	00

Extrakce a čištění

Bujón se extrahuje dvakarát svým objemem ethylacetatu v dělicí nálevce. Fáze se oddělí odstředěním při 1000.g po dobu 5 minut, načež se horní acetatová fáze pečlivě odstraní a odpaří do sucha. Methanol také dobře pracuje jako extrakční rozpouštědlo. Produkt může být vyčištěn pomocí extrakce v pevné fázi a preparativní HPLC.

Chirální HPLG zkouška

Sloupec rychlost proudění rozměr vzorku koncentrace teplota detekce mobilní fáze

Chiral OD, 4,6 x 250 mm (Daicel, Chiral Technologies)

0,7 ml/min mikrolitrů

0,1 mg/ml °C

UV při 220 nm

100 ml ethylalkoholu (USP,dehydratovaný 200 proof)+ 900 ml hexanu plus 1 ml Ν'Ν'-diethylamin

Vzorky se rozpustí v ethanolu.

Claims (7)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   9 9 9 ···· ···· • · ···· · · · · • · ·· ·· ♦ · ······ • · 9 9 9 9 9 9

   9 999 9 99 99 99 99

   1. Způsob výroby sloučeniny vzorce I vyznačený tím, že se selektivně demethyluje sloučenina vzorce II v přítomnosti enzymu odvozeného od kultury mikroorganizmu rodu Monosporium.

   • · · · · · » ·· ·· ·« • · · · · · • · · · · · ·· · · · · · ·«
2. 2. Způsob podle nároku 1 vyznačený tím, že mikroorganizmem je Monosporium olivaceum.
3. 3. Způsob podle nároku 2 vyznačený tím, že Monosporium olivaceum je Monosporium olivaceum ATCC 36300.
4. 4. Způsob výroby sloučeniny vzorce III ze sloučeniny vzorce II vyznačený tím, že se selektivně demethyluje sloučeniny vzorce II v přítomnosti enzymu odvozeného od kultury mikroorganizmu rodu Tharanostylum.

   - 13
5. 5. Způsob podle nároku 4 vyznačený tím, že uvedeným mikroorganizmem je Thamnostylum piriforme.
6. 6. Způsob podle nároku 5 vyznačený tím, že Thamnostylum piriforme je Thamnostylum piriforme ATCC 8992.
7. 7. Použití sloučeniny vzorce II (II) k výrobě sloučeniny vzorce I (I) θ· Použití podle nároku Ί, kde sloučenina vzorce II je neselektivně O-dimethylovaná.