CZ30658U1 - Komplex pro přenos antigenů do drůbežích antigen prezentujících buněk - Google Patents

Description

Oblast techniky

Řešení se týká komplexu pro přenos antígenů do drůbežích antigen prezentujících buněk a je založeno na výhodné kombinaci směrovaných biotinylovaných protilátek, např. DEC 205 (Ly75), rozeznávajících specifické drůbeží buněčné receptory a na proteinové fúzi antígenů s tetramemím streptavidinem (SA) nebo avidinem (neutravidinem), které vážou s vysokou afinitou biotin. Podařilo se připravit potřebnou vakcínu, která zabrání adenovirové infekci u kuřat.

Dosavadní stav techniky

Pro řadu diagnostických a vakcinačních aplikací je důležité specificky stimulovat imunitní odpověď T lymfocytů proti vybraným antigenním epitopům. K tomu je zapotřebí dopravit příslušné antigeny do profesionálních antigen prezentujících buněk (APC). Při vývoji vakcinačních protokolů se pozornost v současné době zaměřuje především na dendritické buňky (DB). Maturované dendritické buňky patří mezi profesionální APC, které konstitutivně exprimují MHC glykoproteiny I. a Π. třídy, stejně jako kostimulační molekuly. Dendritické buňky stimulují naivní CD4 a CD8 T buňky k odpovědi na antigeny nebo aloantigeny efektivněji než ostatní APC (Lipscom and Maštěn, 2002). V roce 2006 byly nejprve charakterizovány kuřecí epidermální dendritické buňky (Igyárto et al., 2006), posléze dendritické buňky derivované z kostní dřeně kuřete (Wu et al., 2009).

Existuje několik strategií dopravy antígenů k výkonným imunokompetentním buňkám. Jedna z nich využívá monoklonální protilátky rozpoznávající endocytující receptory na povrchu APC, např. CDllb, CDllc, DEC 205, DEC 207, Clec9A. Protilátky jsou v tomto případě geneticky fúzovány nebo chemicky konjugovány s příslušnými antigeny s cílem přímé a selektivní dopravy antígenů do APC. Tato strategie byla úspěšně použita pro indukci antigen specifické CD4+ aCD8+ T-buněčné odpovědi (Bonifaz et al., 2002; Castro et al., 2008; Idoyaga et al., 2011). Analogický systém spočívá v molekulárně genetické fúzi streptavidinu s částí protilátky rozpoznávající rovněž endocytující receptory. Biotinylované antigeny jsou následně připojeny pomocí vazby biotin-streptavidin (Wang et al., 2007, Wang et al., 2009). Ve spolupráci s francouzským partnerem byl vyvinut alternativní systém pro dopravu antígenů do myších dendritických buněk (skupina prof. Claude Leclerc). Zmíněný systém dopravy antígenů je založen na výhodné kombinaci směrovaných biotinylovaných protilátek, rozeznávajících specifické buněčné receptory a na proteinové fúzi antígenů s tetramemím streptavidinem. V současné době jsou drůbeží velkochovy pod enormním tlakem oprávněné vakcinace proti závažným infekčním chorobám, které způsobují ekonomicky významné ztráty. Na druhé straně u některých virových onemocnění, jako například adenovirové onemocnění drůbeže - inkluzní hepatitida apod. - není v EU doposud známa vakcína i přesto, že způsobují závažné hospodářské a ekonomické problémy.

Podstata technického řešení

Výše uvedené nedostatky odstraňuje komplex pro dopravu antígenů do drůbežích antigen prezentujících buněk podle technického řešení, jehož podstata spočívá v tom, že se skládá z tetramemího streptavidinového jádra s připojenými adenovirovými antigeny a ze směřující biotinylované monoklonální protilátky specifické proti endocytujícímu receptoru na povrchu kuřecích dendritických buněk.

Komplex podle technického řešení je charakterizován tím, že nejméně 0,lmM až 50mM Ag-SA nebo SA-Ag je kombinováno s 0,lmM až lOOmM směřující biotinylované protilátky proti kuřecí podobě Ly75 a dalších protilátek rozpoznávajících receptory na povrchu kuřecích antigen prezentujících buněk

Komplex podle technického řešení je dále charakterizován tím, že se jedná o spojení anti Ly75-Ag-SA a anti Ly75-SA-Ag.

-1 CZ 30658 U1

Komplex podle technického řešení je také charakterizován tím, že obsahuje flexibilní linkery oddělující antigenní a streptavidinovou část fuzního proteinu pro zvýšení tetramerizace a stability výsledného komplexu.

Komplex podle technického řešení je též charakterizován tím, že obsahuje specifické protilátky, zejména anti Ly75, získané z různých hybřidomů.

Podstata technického řešení a jedinečnost navrhovaného komplexu podle technického řešení tkví ve výhodné kombinaci směrovaných biotinylovaných protilátek, např. Ly75 (CD205), rozeznávajících specifické drůbeží endocytující buněčné receptory a na proteinové fůzi antigenů s tetramemím streptavidinem (SA) nebo avidinem (neutravidinem), které vážou s vysokou afinitou biotin. Na N- nebo C- terminální konec streptavidinu jsou pak molekulárně geneticky připojeny imunogenní antigeny tak, aby byla zachována schopnost streptavidinu tvořit tetrametry. Díky přímému cílení na profesionální antigen prezentující buňku (APC) pomocí biotynylovaných protilátek, např. Anti-CD205, dojde k aktivaci protektivní T-buněěné imunitní odpovědi (Thl profil, viz obr. 2) a k výraznému snížení účinné dávky ve srovnání s imunizací pomocí volného antigenu. Oproti jiným, výše zmíněným způsobům, má komplex podle technického řešení výhodu ve výběru a kombinovatelnosti vhodných protilátek.

Tetramemí komplexy streptavidinu, nesoucí epitopy z kuřecího ovalbuminu, které původci použili jako model, byly použity k dopravě antigenů do primárních myších dendritických buněk in vitro a in vivo pomocí protilátek proti povrchovým receptorům CD 11b, CDllc a DEC 206 (Staněk et al., 2011). Epitopy byly vystavovány nejen s molekulami MHC Π, ale i v komplexu s molekulami MHC I a došlo k indukci obou T-buněčných odpovědí. Výsledky byly ověřeny na myším modelu s mykobakteriálními antigeny (Dong et al., 2011).

Pro každou Ag-SA fůzi je možné použít celou paletu specifických drůbežích biotinylovaných protilátek, a tak velmi jednoduše provést screening vedoucí k nalezení vhodného receptoru. Na SA je také možno geneticky připojit virové a bakteriální polyepitopy nebo antigeny jak z N-, tak i z C-konce nebo na oba konce současně. Nespornou výhodou komplexu podle technického řešení je použití denaturovaného monomeru, který je oproti tetrameru produkován ve vyšších koncentracích a izolován ve vysoké čistotě. Původci byla také úspěšně ověřena možnost použití biotinylovaných adjuvans k zesílení T-buněčné imunitní odpovědi. Originalita komplexu podle technického řešení je pak navíc podložena mezinárodní patentovou přihláškou na dopravu antigenu do antigen prezentujících buněk u savců, která ale neřeší naprosto odlišnou problematiku u ptáků (EP 09 290 987.8). Komplex podle technického řešení pro dopravu antigenů do drůbežích antigen prezentujících buněk představuje komplexní ochranu drůbeže, která je daná použitým typem antigenů, funguje na principu podpory navozené T buněčné imunity u ptáků, která chrání před projevy intracelumích patogenů.

Jako konečný cíl původců bude časem vývoj nového typu vakcíny, např. proti inkluzní hepatitidě drůbeže, jejímž nosičem jsou adenoviry. Jedná se o poměrně závažné onemocnění kúra domácího, které je charakterizováno nekrotickou hepatitidou, intranukleámími inkluzemi v hepatocytech, které ústí v náhle zvýšenou mortalitu, především u kuřat ve věku 3 až 10 týdnů odchovu. Mortalita může dosáhnout až 20 % v průběhu 8 až 10 dnů, nemoc trvá 1 až 3 týdny, poté zaniká. Specifická terapie v EU není známa. V současné době je známo 12 sérotypů slepičích adenovirů (FAV), analýzou DNA lze rozdělit FAV na 5 typů, vakcinace vzhledem k vysokému počtu sérotypů nebyla zatím v EU na tomto principu vypracována. Komplex podle technického řešení navíc nabízí univerzální systém umožňující dopravu jednoho, popřípadě více antigenů či biologicky aktivních látek, do/na cílené skupiny drůbežích dendritických buněk pomocí specifických protilátek, např. CD205.

Objasnění výkresů

Na přiloženém obr. 1 je znázorněno schéma expresního vektoru a aminokyselinové sekvence streptavidinu s flexibilním linkerem.

Na obr. 2 je znázorněno schéma principu dopravení navrženého streptavidinového komplexu do antigen prezentující buňky kuřete.

-2CZ 30658 U1

Na obr. 3 je znázorněna ochrana drůbeže před erozí žaludku pomocí imunizace komplexu podle technického řešení. Na snímcích nejsou patrné žádné eroze.

Na obr. 4 je znázorněna eroze žaludku drůbeže u kontrolní skupiny, kde je jasná eroze sliznice žaludku a samotné svaloviny u drůbeže.

Příklady uskutečnění technického řešení

Příklad 1

Komplex podle technického řešení byl původci připraven tímto způsobem:

a) příprava expresního vektoru pro produkci Ag-SA a SA-Ag fuzních proteinů:

pET28b-SA je univerzální expresní vektor pro produkci Ag-SA a SA-Ag fuzních proteinů. Antiío gen nebo jinou biologicky aktivní látku lze připojit na N- nebo na C- terminální konec streptavidinu (resp. na 5'- nebo 3'- streptavidinový gen). Mezi genem kódující SA a místem pro vkládání genů kódující imunogenní antigeny je vložen flexibilní linker umožňující snadnou tetramerizaci denaturované formy fuze Ag-SA nebo SA-Ag (obr. 1).

pET28b-SA/f aminokyselinová sekvence základního streptavidinového komplexu s flexibilním linkerem na C konci:

masgslqefmEAGITGTWYNOLGSTFIVTAGADGALTGTYESAVGNAESRYVLTGRYDSAP

ATDGSGTALGWTVAWKNNYRNAHSATTWSGOYVGGAEARINTOWLLTSGTTEANAW

KSTlNGEDTFrKVKPSÁASleGGSGSGSGGTSFVLNAOHDEAVDAMDLAEAKVrANRELnK

YGVSDYYTTSELkl pET28b-ž/&4 aminokyselinová sekvence základního streptavidinového komplexu s flexibilním linkerem na N konci:

masgslqefFFLM4gHD£^ VDAMDLAEAKVLANRELDKYG VSDYYTOFGGSGSGSGGEAGYYGY WYNOLGSTFIVTAGADGALTGTYESAVGNAESRYVLTGRYDSAPATDGSGTALGWTVA

WKNNYRNAHSATTWSGQYVGGAEARINTQWLLTSGTTEANAWKSTLVGHDTFTKVKP

SAASLETSELKL

Streptavidin, flexibilní linker

b) příprava fuzních proteinů Ag-SA nebo SA-Ag:

Příprava fuzních tetramemích komplexů SA-Ag a Ag-SA probíhá v bakteriálních buňkách E. coli BL21 XDE3 vMDO médiu ve 37 °C. Fúze je izolována zinkluzních tělísek pomocí roztoků s 8 M močovinou (50 mM Tris-Cl pH 8, 8 M urea - TU pufr). Extrakt je nanesen na iontoměničovou chromatografii DEAE sepharosu (ekvilibrována TU pufrem), ze které je eluován stoupajícím gradientem NaCl v TU pufru (5 až 250 nM NaCl). Frakce obsahující čistou fůzi Ag-SA nebo SA-Ag jsou ředěny 50 mM Tris-Cl 1 M NaCl pH 8 (TN pufr) na 2 M močovinu a jsou naneseny na hydrofobní chromatografii Phenyl sepharosu. Následným střídavým promýváním kolony

50 mM Tris-Cl pH 8 se 60% isopropanolem a 50 mM Tris-Cl pH 8 je odstraněna kontaminace endotoxinu LPS. Protein je poté z kolony uvolněn pomocí TU pufru. Takto získaná denaturovaná monomemí fuze Ag-SA nebo SA-Ag je tetramerizována dialýzou proti 50 mM uhličitanu amonného. Tetramemí forma Ag-SA nebo SA-Ag fuzních proteinů je stabilní po několik týdnů při 4 °C nebo měsíce v -80 °C.

c) příprava SA fuze s adenovirovými antigeny:

Pro imunizaci byly vybrány 2 povrchových adenovirové antigeny: Hexon (Hex) a Hexon associated protein (HexAP). Vzhledem k velikosti obou antigenů byl antigen Hex rozdělen na tři vzájemně se překrývající části - HexA, HexB, HexC a antigen HexAP na dvě části - HexAPa a HexAPb.

-3CZ 30658 U1

Aminokyselinové sekvence SA/t-HexA streptavidinového fuzního proteinu:

masgslaefmEAGITGTWYNOLGSTFIVTAGADGALTGTYESAVGNAESRYVLTGRYDSAP

ATDGSGTALGWTVAWKNNYRNAHSATTWSGQYVGGAEARINTQWLLTSGTTEANAW

KSTLVGlíDTFTKVKPSAASleGGSGSGSGGTSFVLNAOHDEAVDAMDLAEAKVLANRELDK

TGFSDmTSAAFTPDLTTATPRLQYFHIAGPSTREYLSEDLQQFIAATGSYFELKNKFRQT

WAPTRNVTTEKAQRLQIRFYPTQTDDTPNSYRVRYSLNVGDSWVLDMGATYFDIKGV

LDRGPSFKPYGGTAYNPLAPREAFFNNWIEDDGNNTnTGQMTNPYKNEAQNTATATAA

AIASVSGSYPNPNVGLAISEVGALTPTLAAQVGLAGRFAKVSNENTRLAYGAYVKPLKD

DGSQSLGTTPYYVLDTTAQKYLGVMGVEDFTQSLTYPDSLLIPPPSEYGEVNSGVMKAN

RPNYIGFRDNFINLLYHDTGVCSGTLNSERSGMNWVELQDREF

Aminokyselinové sekvence SA/í-HexB streptavidinového fuzního proteinu:

masgslaefinEAGITGTWYNOLGSTFIVTAGADGALTGTYESAVGNAESRYVLTGRYDSAP

ATDGSGTALGWTVAWKNNYRNAHSATTWSGQYVGGAEARINTOWLLTSGTTEANAW

KSALVGHOAFYKVKPSAASleGGSGSGSGGTSFVLNAOHDEAVDAMDLAEAKVLANRELDK

PGFSDmTSGTLNSERSGMNVVVELQDRNTELSYQYMLADMMSRHHYFALWNQAVD

QYDHDVRVFNNDGYEEGVPTYAFSPEGTGQGPISSANITLSGVKVYTNGQNDKGTEVTN

LTTYLNAGAVPSYEIDLAASQRRNFUTNIADYLPDKYKYNISGFNPETDNVDPTTYAYM

NRRVPLTNVVDLFTNIGARWSVDQMDNVNPFNHHRNWGLKYRSQLLGNSRYCRFHIQ

VPQKYFAIKNLLLLPGTYTYEWVLRKDPNMILQSSLGNDLRADGASIVYSEVNLMANFM

PMDHNTSNQLELMLRNATNDQTFADYLGAKNALYQVPAGSTALTINIEF

Aminokyselinové sekvence SAft-HexC streptavidinového fuzního proteinu:

masgslaefmEAGITGTWYNOLGSTFIVTAGADGALTGTYESAVGNAESRYVLTGRYDSAP

ATDGSGTALGWTVAWKNNYRNAHSATTWSGQYVGGAEARINTOWLLTSGTTEANAW

KSTLVGHDTFYKVKPSAASteGGSGSGSGGTSFVLNAOHDEAVDAMDLAEAKVLANRELDK yGKSDÍT7T5TNDQTFADYLGAKNALYQVPAGSTALTINIPARTWEGMRGWSFTRVKAS

ETPQIGAQYDINFKYSGSIPYSDGTFYLTHTFRNMSVLFDTSINWPGNDRLLAPNLFEIKR

NVGIDSEGFTMSQCDITKDWYLIQMATNYNYVFNGYRFWPDRQYFHYDFLRNFDPMTR

QGPNFQDSTLFDLTTYEPTLPPAAGGVQTGQDAVRNNSGYIAPRSWPVYSAQQGESWPA

NWPYPLIGTESIPPTQWNYKKFLCDNYLWTVPFSSDFMYMGELTDLGQNPMYTNNSHS

MVINFELDPMDENTYVYMLYGVFDMVRVNQPERNVLAMAYFRTPFATGNAVEF

d) příprava směřujících protilátek:

1) Příprava myších monoklonálních protilátek proti kuřecímu receptoru CD205/Ly7 5:

Zaklonování rekombinantních částí receptoru Ly75

Z extracelulámí domény ho C-lektinového kuřecího receptoru CD205/Ly75 (NCBI Reference Sequence: NP_001032925.1) s 10 CTLD (C-type lectin-like domain) byly vybrány dva fragmenty. Tyto vybrané fragmenty byly amplifikovány pomocí PCR, jako templát byla použita cDNA po transkripci RNA ze sleziny Leghomky bílé (Gallus gallus domesticus), sekvence primerů je uvedena vtab. 1. Amplifikované fragmenty byly následně zaklonovány mezi restrikční místa Ncol a Xhol expresního vektoru pET28b (Novagen, Darmstadt, Germany).

Aminokyselinová sekvence částí (Ly75-B, Ly75-F) kuřecího lymfocytámího antigenu 75 (CD205/Ly75)

Ly75-B

HCYQFNTQSALSWKEAYVSCQRQGGDLLSIQDASELNYIQAKDDIAEIFWIGLNQLDVSR

GWQWSDHKPLNFVNWHPDMWDLSPLDGTSCVAMNAASGQWRSYHCGNPLPYVCKKS

FKEVSNLTEFWRHVNTRCDAGWLPHNGFCYMLIHNQASWSTADQLCKANKSNLISIHSL

ADVELIVTKLHNDAREEVWVGLRNEDVPTLFKWSDRTDWFTYWDQNEPSVPFNATPN

CVSYSGKLGQWRVKSCEENLKYVCKK

-4CZ 30658 Ul

Ly75-F

YRILQKKLTWYDAVRECKQNMSDLASVHSESQQLFLEDIVKQDGYSLWLGLSIHDGSK

ANFEWSDGSSFDYYPWELENSNTTENCVLLDTKGSWNRAKCTNVAEGAICYSFSNKKQ

LEQKQVSRASGCSQLSGELPWIQYKDHCYAFDMAFYNFSVYNVEDAKKVCKKLNPSAA

LLTIGDAEENAFVSAHKKNDLITRKVWLGLTQSSTGQTLHWLDGSSVNYANWDNRTTE

LSEKCSVITSTTGKWSKVDCSRSQSRWCK

Tabulka 1

Sekvence primerů pro PCR amplifikaci vybraných částí kuřecího receptoru Ly75 (Gene Accession no. NCBI Reference Sequence: NP_001032925.1)

Fragment

Ly75B

Ly75F

Oligonukleotidová sekvence (5'—>3') ly75Bfor TA CCA TGG AT CAT TGC TAC CAG TTC AAC AC ly75Brew TA CTC GAG TTT CTT ACA CAC GTA TTT CAA G ly75Ffor TA CCA TGG AT TAC AGA ATT CTT CAG AAA AAG T ly75Frew TA CTC GAG TTT ACA AAC CAC TCT GCT TTG

2) Exprese amplifikovaných fragmentů kuřecího receptoru CD205, purifikace rekombinantních proteinů

Plasmidy byly transformovány do E. coli Rosetta 2 (DE3) cells (Novagen, Darmstadt, Germany), bakteriální kultury byly kultivovány v LB mediu obsahujícím 60 mg/ml kanamycinu při 37 °C. Po dosažení optické density 0,6 při 600 nm byla exprese fragmentů indukována přidáním IPTG do finální koncentrace 0,5 mM. Buňky byly sklizeny po 4 hodinách, promyty v 50 mM CH3COONH4, pH9 (AC buffer) a uchovány při -20 °C. Fragmenty byly dále extrahovány z inkluzních tělísek pomocí roztoků s 8 M močovinou (50 mM Tris-Cl pH 8, 8 M urea - TU pufr). Extrakt byl nanesen na iontoměničovou chromatografii DEAE sefarozu (ekvilibrována TU pufrem), ze které byl eluován stoupajícím gradientem NaCl v TU pufru (5 až 250 nM NaCl). Čisté fragmenty pak byly dialyzovány v 50 mM (NH4)₂CO₃. Rekombinantně se podařilo připravit pouze dvě části extracelulámí domény receptoru Dec205 (Clect region 227-341 a 370-485, označená B) a (Clect region 1406-1514 a 1548-1668, označená F).

3) Imunizace myší, příprava hybridomů, testování monoklonálních protilátek

Myši Balb/c byly imunizovány intraperitoneálně 100 ug směsi purifikovaných rekombinantních fragmentů (B+F) receptoru Ly75 v kombinaci s kompletním Fr. adjuvans (Sigma, St. Louis, MO). Dále byly imunizovány i.p. třikrát po 12-ti dnech 25 ug antigenu v kombinaci s nekompletním Fr. adjuvans. Tři dny po posledním boosteru byly myši euthanizovány a slezinné lymfocyty z imunizovaných myší byly fúzovány s myelomovou myší linií SP2. Vzniklé hybridomy (n=365) byly testovány na přítomnost specifických monoklonálních protilátek pomocí testů ELISA, western blotu a průtokové cytometrie. Na základě ověření specifity jednotlivých monoklonálních protilátek pak bylo vybráno 8 hybridomů (18-ldll/A3, 172-3C10/B5, 172-3D11/C8, 172-3D11/D11, 130-3G3/G3, 130-3G3/H7, 45-1G1/C10, 268/E8), které reagovaly v jedné, případně ve všech zmíněných metodách. U protilátek byla provedena izotypová analýza.

4) Purifikace vybrané monoklonální protilátky, konjugace biotinem

Vybraný hybridom 104-2C4/D8 byl namnožen v kultivačním mediu do velkého objemu. Specifická monoklonální protilátka byla poté izolována ze zahuštěného tkáňového supematantu podle izotypu buď v případě IgM pomocí Pierce™ IgM Purification Kit (Thermo Scientific) dle doporučení výrobce nebo v případě IgG izotypu pomocí Melon gel IgG Purification Kit (Thermo Scientific) rovněž podle doporučení výrobce. Specifita purifikované protilátky byla poté ověřena ve Western blotu a/nebo pomocí průtokové cytometrie, čistota byla kontrolována pomocí SDS

-5CZ 30658 U1

PAGE elektroforézy. Konjugace biotinem byla provedena pomocí soupravy EZ-Link™ SulfoNHS-LC-Biotinylation Kit (Hermo Fischer Scientific).

e) příprava a detekce viru:

Infikovaná žaludeční sliznice byla rozdrcena v hmoždíři v tekutém dusíku N₂ a homogenát se 3x zmrazil a rozmrazil v DMEM. Odstředěním v centrifuze se odstranily zbytky tkáně, supematant byl přefiltrován přes 0,22 pm filtr a zamrazen jako zásobní roztok viru.

Virus byl propagován na kultuře kuřecích buněk LMH. Ty byly kultivovány v DMEM s 5% FBS, 1% NEAA a 1% Penicilín Streptomycin Glutamin solution (KM). Zásobní roztok viru se zředil v čistém DMEM v poměru 1:300. Kultivační láhev (75 cm²) se nechala porůst LMH buňkami do přibližně 90% konfluence, odstranilo se KM, přidaly se 3 ml ředěného viru a jednu hodinu se kultivovala v37°C, 5% CO₂ v inkubátoru. Poté se odstranilo médium, přidalo se 10 ml KM a pokračovala inkubace. V době nej silnějšího cytopatického efektu se buňky sklidily, virus se uvolnil opakovaným zmražením/rozmrazením (3x), buňky byly odstraněny odstředěním v centrifuze a supematant byl zamrazen jako roztok pro infekci.

Detekce viru:

Z 200 μΐ zásobního roztoku byla izolována DNA pomocí Qiagen Blood&Tissue DNA Isolation Kit podle instrukcí výrobce. Pomocí PCR byl detekován gen pro virový Hexon protein. Nukleotidová sekvence primerů byla: HFw - 5'GTGCGTAACAACTCGGGCTA 3',

HRv - 5' TTGCGTTCGGGTTGGTTCAC 3'. PCR proběhla s Taq DNA polymerázou při 95 °C 3 min, 30x 95 °C 30 s, 55 °C 30 s, 72 °C 40 s a 72 °C 5 min.

f) imunizace zvířat a výsledek in vivo experimentů:

Byly realizovány tři pokusy s brojlerovými kuřaty nosnými SPF kuřičkami.

Pokus 1

Byl proveden celkem na 45 SPF kuričkách ve stáří 21 dnů. Kuřičky byly rozděleny do devíti skupin po pěti jedincích: (CD205) Ski, Sk2, Sk3, (CDllc) K1 (kontrola), K2 (imunizace inaktivovaným agens) a K3 (neinfikovaná kontrola). Kontrolně byl opakován ještě 2x.

Imunizačm dávka pro jedno kuře obsahovala 10 pg antigenu + 15 pg protilátky v celkovém objemu 300 pl PBS. Inaktivace viru proběhla sterilizací zásobního roztoku v autoklávu po dobu 30 minut. V den zahájení (dO) byly Sk skupiny intramuskulámě imunizovány 300 pl vakcíny a skupině K2 bylo intramuskulámě podáno 300 pl inaktivovaného viru. V d7 byly intramuskulámě imunizovány skupiny Sk2 a Sk3, v dl4 pak skupiny Sk3. V d21 byly všechny skupiny s výjimkou K3 zatíženy per orálně podáním 1 ml roztoku pro infekci. V d29 byla zvířata utracena a ve svalnatém žaludku byl sledován výskyt erozí.

Tabulka 2

Počet erozí na skupinu

skupiny	K1	K2	K3	(CDllc) Ski	(CDllc) Sk2	(CDllc) Sk3	(Lý75) Ski	(Ly75) Sk2	(Ly75) Sk3
Eroze (ks)	5	0	0	3	3	3	2	0	2

Tento výsledek byl 2 x potvrzen u kontrolních skupin (Ly75) Sk2 a to na 15 ks drůbeže v každé skupině.

Jasně se ukázal ochranný efekt provedené imunizace pomocí směrovaných biotinylovaných protilátek CD 205 (Ly75), viz Obr. 3 a 4.

-6CZ 30658 U1

Průmyslová využitelnost

Nový komplex pro přenos antigenů do drůbežích antigen prezentujících buněk umožňuje přípravu vakcíny proti adenovirům na ochranu drůbeže. Oproti jiným dosavadním způsobům má tento komplex výhodu ve výběru a kombinovatelnosti vhodných protilátek.

Seznam zkratek:

APC	antigen prezentující buňky, kdy buňka, která je schopná pohltit antigen, svým proteolytickým aparátem ho rozštěpit a antigenní determinanty vystavit na svém povrchu, kde jsou rozpoznány specifickými lymfocyty
Ag-SA	fuzní protein streptavidinu s antigenem, kdy je antigen připojen na N koncovou část streptavidinu
SA-Ag	fuzní protein streptavidinu s antigenem, kdy je antigen připojen na C koncovou část streptavidinu
Ly75	povrchový receptor, který je analogem lidského CD 205 (DEC 205) receptoru
Fc	konstantní část struktury imunoglobulinu
směřující protilátky	protilátky, které specificky rozpoznávají povrchový receptor na APC
biotinylované protilátky	jsou protilátky konjugované biotinem
Biotin = vitamin H	má vysokou afinitu k streptavidinu, avidinu, neutravidinu

Seznam použité literatury

Lipscomb, M.F., Maštěn, B.J., 2002. Dendritic cells: immune regulátore in health and disease. Physiol. Rev. 82, 97-130. dořlO.l 152/physrev 00023.2001

Igyártó, B.-Z., Lackó, E., Oláh, I., Magyar, A., 2006. Characterization of chicken epidermal dendritic cells. Immunology 119, 278-88. dořlO.l lll/j.l365-2567.2006.02432.x

Wu, Z., Rothwell, L., Young, J.R., Kaufman, J., Butter, C., Kaiser, P., 2010. Generation and characterization of chicken bone marrow-derived dendritic cells. Immunology 129, 133-145. doi:10.1111/j.l365-2567.2009.03129.x

Bonifaz, L., Bonnyay, D., Mahnke, K., Rivera, M., Nussenzweig, M.C., Steinman, R.M., 2002. Efficient targeting of protein antigen to the dendritic cell receptor DEC-205 in the steady statě leads to antigen presentation on major histocompatibility complex class I products and peripheral CD8+ T cell tolerance. J. Exp. Med. 196, 1627-38.

Castro, F. V., Tutt, A. L., White, A. L., Teeling, J. L., James, S., French, R. R., et al. (2008). CDllc provides an effective immunotarget for the generation of both CD4 and CD8 T cell responses. European Journal of Immunology, 38, 2263-2273.

Idoyaga, J., Lubkin, A., Fiorese, C., Lahoud, M.H., Caminschi, I., Huang, Y., Rodriguez, A., Clausen, B.E., Park, C.G., Trumpfheller, C., Steinman, R.M., 2011. Comparable T helper 1 (Thl) and CD8 T-cell immunity by targeting HIV gag p24 to CD8 dendritic cells within antibodies to Langerin, DEC205, and Clec9A. Proč. Nati. Acad. Sci. U. S. A. 108, 2384-9. doi:10.1073/pnas. 1019547108

Wang, W. W., Das, D., McQuarrie, S. A., & Suresh, M. R. (2007). Design of a biíunctional íusion protein for ovarian cancer drug delivery: single-chain anti-CA125 core-streptavidin fusion protein. European Journal of Pharmaceutics and Biopharma- ceutics,

Wang, W. W., Das, D., & Suresh, M. R. (2009). A versatile biíunctional dendritic cell targeting vaccine vector. Molecular Pharmacology, 6,158-172.

-7 CZ 30658 U1

Stanek, O., Linhartova, I., Majlessi, L., Leclerc, C., Sebo, P., 2012. Complexes of streptavidinfused antigens with biotinylated antibodies targeting receptors on dendritic cell surface: a novel tool for induction of specific T-cell immune responses. Mol. Biotechnol. 51, 221-32. doi: 10.1007/s 12033-011 -9459-6

Leclerc, C., 2003. New approaches in vaccine development. Comp. Immunol. Microbiol. Infect. Dis. 26, 329-41. doi:10.1016/S0147-9571(03)00018-3

Claims (5)

1. NÁROKY NA OCHRANU

   1. Komplex pro dopravu antigenů do drůbežích antigen prezentujících buněk, vyznačující se tím, že se skládá z tetramemího streptavidinového jádra s připojenými adenoviroío vými antigeny a ze směřující biotinylované monoklonální protilátky specifické proti endocytujícímu receptoru na povrchu kuřecích dendritických buněk.
2. 2. Komplex podle nároku 1, vyznačující se tím, že nejméně 0,1 mM až 50mM Ag-SA nebo SA-Ag je kombinováno s 0,lmM až lOOmM směřující biotinylované protilátky proti kuřecí podobě Ly75 a dalších protilátek rozpoznávajících receptory na povrchu kuřecích

   15 antigen prezentujících buněk.
3. 3. Komplex podle nároků 1 a 2, vyznačující se tím, že se jedná o spojení anti Ly75-Ag-SA a anti Ly75-SA-Ag.
4. 4. Komplex podle nároků laž3, vyznačující se tím, že obsahuje flexibilní linkery oddělující antigenní a streptavidinovou část fuzního proteinu pro zvýšení tetramerizace

   20 a stability výsledného komplexu.
5. 5. Komplex podle nároků laž 4, vyznačující se tím, že obsahuje specifické protilátky, zejména anti Ly75, získané z různých hybridomů.