CZ2016691A3 - Komplex pro přenos antigenů do drůbežích antigen prezentujících buněk - Google Patents

Abstract

Řešení se týká komplexu pro přenos antigenů do drůbežích antigen prezentujících buněk, které je charakterizováno tím, že obsahuje streptavidin nebo avidin nebo neutravidin, na který je geneticky připojen imunogenní antigen, kde tetramerní purifikovaná forma tohoto fúzního proteinu je poté kombinována se specifickými biotinylovanými protilátkami rozpoznávajícími zejména endocytující receptory na dendritických buňkách.

Description

Oblast techniky

Řešení se týká komplexu pro přenos antigenů do drůbežích antigen prezentujících buněk a je založeno na výhodné kombinaci směrovaných biotinylovaných protilátek, např. DEC 205 (Ly75), rozeznávajících specifické drůbeží endocytované buněčné receptory a na proteinové fůzi antigenů s tetramerním streptavidinem (SA) nebo avidinem (neutravidinem), kteří vážou s vysokou afinitou biotin. Podařilo se připravit potřebnou vakcínu, která zabrání adenovirové infekci u kuřat.

Dosavadní stav techniky

Pro řadu diagnostických a vakcinačních aplikací je důležité specificky stimulovat imunitní odpověď T lymfocytů proti vybraným antigenním epitopům. K tomu je zapotřebí dopravit příslušné antigeny do profesionálních antigen prezentujících buněk (APC). Při vývoji vakcinačních protokolů se pozornost v současné době zaměřuje především na dendritické buňky (DB). Maturované dendritické buňky patří mezi profesionální APC, které konstitutivně exprimují MHC glykoproteiny I. a II. třídy, stejně jako kostimulační molekuly. Dendritické buňky stimulují naivní CD4 a CD8 T buňky k odpovědi na antigeny nebo aloantigeny efektivněji než ostatní APC (Lipscom and Maštěn, 2002). V roce 2006 byly nejprve charakterizovány kuřecí epidermální dendritické buňky (Igyárto et al., 2006), posléze dendritické buňky derivované z kostní dřeně kuřete (Wu et al., 2009 ).

Existuje několik strategií dopravy antigenů k výkonným imunokompetentním buňkám. Jedna z nich využívá monoklonální protilátky rozpoznávající endocytované receptory na povrchu APC, např. CD11b, CD11c, DEC 205, • ·· • ·· · • · · · · · •·

DEC 207, Clec9A. Protilátky jsou v tomto případě geneticky fúzovány nebo chemicky konjugovány s příslušnými antigeny s cílem přímé a selektivní dopravy antigenu do APC. Tato strategie byla úspěšně použita pro indukci antigen specifické CD4+ a CD8+ T-buněčné odpovědi (Bonifaz et al., 2002; Castro et al., 2008; Idoyaga et al., 2011). Analogický systém spočívá v molekulárně genetické fúzi streptavidinu s částí protilátky rozpoznávající rovněž endocytické receptory. Biotinylované antigeny jsou následně připojeny pomocí vazby biotin-streptavidin (Wang et al., 2007, Wang et al., 2009). Ve spolupráci s francouzským partnerem byl vyvinut alternativní systém pro dopravu antigenů do myších dendritických buněk (skupina prof. Claude Leclerc). Zmíněný systém dopravy antigenů je založen na výhodné kombinaci směrovaných biotinylovaných protilátek, rozeznávajících specifické buněčné receptory a na proteinové fúzi antigenů s tetramerním streptavidinem. V současné době jsou drůbeží velkochovy pod enormním tlakem oprávněné vakcinace proti závažným infekčním chorobám, které způsobují ekonomicky významné ztráty. Na druhé straně u některých virových onemocnění, jako například adenovirové onemocnění drůbeže - inkluzní hepatitida apod. - není v EU doposud známa vakcína i přesto, že způsobují závažné hospodářské a ekonomické problémy.

Podstata vynálezu

Výše uvedené nedostatky odstraňuje komplex pro dopravu antigenů do drůbežích antigen prezentujících buněk podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že obsahuje streptavidin nebo avidin nebo neutravidin, na který je geneticky připojen imunogenní antigen, kde tetramerní purifikovaná forma tohoto fúzního proteinu je poté kombinována se specifickými biotinylovanými protilátkami rozpoznávajícími zejména endocytující receptory na dendritických buňkách.

• ·

Komplex podle vynálezu je charakterizován tím, že nejméně 0,lJnM až 50 mM Ag-SA nebo SA-Ag je kombinována s 0,2 až 100 mM směřující biotinylované protilátky proti kuřecí podobě Ly 175 a dalších protilátek rozpoznávající/^ecifické endocýtující receptory na povrchu kuřecí/^ntigen prezentujících buňky.

Komplex podle vynálezu je dále charakterizován tím, že se jedná o specifickou myší monoklonální protilátku proti kuřecí podobě endocytujícího C-lektinového receptoru CD205/Ly 75, která po konjugaci biotinem na Fc fragment zaciluje SA-Ag nebo Ag-SA fúzní protein do cílových imunokompetentních kuřecích buněk.

Komplex podle vynálezu je také charakterizován tím, že obsahuje flexibilní linkery oddělující antigenní a streptavidinovou část fúzního proteinu zvyšující možnost tetramerizace a stability výsledného komplexu.

Komplex podle vynálezu je též charakterizován tím, že obsahuje specifické protilátky, zejména anti-CD205(Ly75), získané z různých hybridomů.

Podstata vynálezu a jedinečnost navrhovaného komplexu podle vynálezu tkví ve výhodné kombinaci směrovaných biotinylovaných protilátek, např. CD205 (Ly75), rozeznávajících specifické drůbeží endocytované buněčné receptory a na proteinové fůzi antigenů s tetramerním streptavidinem (SA) nebo avidinem (neutravidinem), kteří vážou s. vysokou afinitou biotin. Na N- nebo Cterminální konec streptavidinu jsou pak molekulárně geneticky připojeny imunogenní antigeny tak, aby byla zachována schopnost streptavidinu tvořit tetrametry. Díky přímému cílení na profesionální antigen prezentující buňku (APC) pomocí biotynylovaných protilátek, např. Anti-CD205, dojde k aktivaci protektivní T-buněčné imunitní odpovědi (Th1 profil, viz obr. 2) a k výraznému snížení účinné dávky ve srovnání s imunizací pomocí volného antigenů.

• · • · · · · · ·· · · • ····· · ·· · • · · · ·· · ·· · ·· · ··· ··· · ·

Oproti jiným, výše zmíněným způsobům, má komplex podle vynálezu výhodu ve výběru a kombinovatelnosti vhodných protilátek.

Tetramerní komplexy streptavidinu, nesoucí epitopy z kuřecího ovalbuminu, které původci použili jako model, byly použity k dopravě antigenů do primárních myších dendritických buněk in vitro a in vivo pomocí protilátek proti povrchovým receptorům CD11b; CD11c a DEC 206 (Staněk et al., 2011). Epitopy byly vystavovány nejen s molekulami MHC II, ale i v komplexu s molekulami MHC I a došlo k indukci obou T-buněčných odpovědí. Výsledky byly ověřeny na myším modelu s mykobakteriálními antigeny (Dong et al., 2011).

Pro každou Ag-SA fúzi je možné použít celou paletu specifických drůbežích biotinylovaných protilátek, a tak velmi jednoduše provést screening vedoucí k nalezení vhodného receptoru. Na SA je také možno geneticky připojit virové a bakteriální polyepitopy nebo antigeny jak z N-, tak i z C-konce nebo na oba konce současně. Nespornou výhodou komplexu podle vynálezu je použití denaturovaného monomeru, který je oproti tetrameru produkován ve vyšších koncentracích a izolován ve vysoké čistotě. Původci byla také úspěšně ověřena možnost použití biotinylovaných adjuvans k zesílení T-buněčné imunitní odpovědi. Originalita komplexu podle vynálezu je pak navíc podložena mezinárodní patentovou přihláškou na dopravu antigenů do antigen prezentujících buněk u savců, která ale neřeší naprosto odlišnou problematiku u ptáků (EP 09 290 987.8). Komplex podle vynálezu pro dopravu antigenů do drůbežích antigen prezentujících buněk představuje komplexní ochranu drůbeže, která je daná použitým typem antigenů, funguje na principu podpory navozené T buněčné imunity u ptáků, která chrání před projevy intracelurních patogenů.

Jako konečný cíl původců bude časem vývoj nového typu vakcíny, např. proti inkluzní hepatitidě drůbeže, jejímž nosičem jsou adenoviry. Jedná se o • · ···· · ····· • ••••to · ····· • · · ·· · · • « · ··· ··· ··· · · poměrně závažné onemocnění kúra domácího, které je charakterizováno nekrotickou hepatitidou, intranukleárními inkluzemi v hepatocytech, které ústí v náhle zvýšenou mortalitu, především u kuřat ve věku 3 až 10 týdnů odchovu. Mortalita může dosáhnout až 20 % v průběhu 8 až 10 dnů, nemoc trvá 1 až 3 týdny, poté zaniká. Specifická terapie v EU není známa. V současné době je známo 12 sérotypů slepičích adenovirů (FAV), analýzou DNA lze rozdělit FAV na 5 typů, vakcinace vzhledem k vysokému počtu sérotypů nebyla zatím v EU na tomto principu vypracována. Komplex podle vynálezu navíc nabízí univerzální systém umožňující dopravu jednoho, popřípadě více antigenů či biologicky aktivních látek, do/na cílené skupiny drůbežích dendritických buněk pomocí specifických protilátek, např. CD205.

Přehled obrázků na výkresech

Na přiloženém obr. 1 je znázorněno schéma expresního vektoru a aminokyselinové sekvence strepťavidinu s flexibilním linkerem.

Na obr. 2 je znázorněno schéma principu dopravení navrženého streptavidinového komplexu do antigen prezentující buňky kuřete.

Na obr. 3 je znázorněna ochrana drůbeže před erozí žaludku pomocí imunizace komplexu podle vynálezu. Na snímcích nejsou patrné žádné eroze.

Na obr. 4 je znázorněna eroze žaludku drůbeže u kontrolní skupiny, kde je jasná eroze sliznice žaludku a samotné svaloviny u drůbeže.

Příklady provedení

Příklad 1

Komplex podle vynálezu byl původci připraven tímto způsobem:

···« · · · « · · ·····« · ·· ··· • 5 · · · · · ·· · ··· ··· ··· · ·

a) příprava expresního vektoru pro produkci Ag-SA a SA-Ag fúzních proteinů:

pET28b-SA je univerzální expresní vektor pro produkci Ag-SA a SA-Ag fúzních proteinů. Antigen nebo jinou biologicky aktivní látku lze připojit na Nnebo na C- terminální konec streptavidinu (resp. na 5'- nebo 3'streptavidinový gen). Mezi genem kódující SA a místem pro vkládání genů kódující imunogenní antigeny je vložen flexibilní linker umožňující snadnou tetramerizaci denaturované formy fúze Ag-SA nebo SA-Ag (obr. 1).

pET28b-SA/t aminokyselinová sekvence základního streptavidinového komplexu s flexibilním linkerem na C konci:

masaslaefmEAGITGTWYNQLGSTFIVTAGADGALTGTYESAVGNAESRYVL TGRYDSAPATDGSGTALGWTVAWKNNYRNAHSATTWSGQYVGGAEARINT QWLLTSGTTEANAWKSTLVGHDTFTKVKPSAASleGGSGSGSGGTSFyL/VA QHDEAVDAMDLAEAKVLANRELDKYGVSDYYTTSELM pET28b-t/SA aminokyselinová sekvence základního streptavidinového komplexu s flexibilním linkerem na N konci:

masgslqefFVLNAQHDEAVDAMDLAEAKVLANRELDKYGVSDYYTQFGGSG SGSGGEAGITGTWYNQLGSTFIVTAGADGALTGTYESAVGNAESRYVLTGR YDSAPATDGSGTALGWTVAWKNNYRNAHSATTWSGQYVGGAEARINTQW LLTSGTTEANAWKSTLVGHDTFTKVKPSAASLETSELKL

Streptavidin, flexibilní linker

b) příprava fúzních proteinů Ag-SA nebo SA-Ag:

Příprava fúzních tetramerních komplexů SA-Ag a Ag-SA probíhá v bakteriálních buňkách E. coli BL21 ADE3 v MDO médiu ve 37 °C. Fúze je izolována z inkluzních tělísek pomocí roztoků s 8 M močovinou (50 mM Tris-CI pH 8, 8 M urea - TU pufr). Extrakt je nanesen na iontoměničovou chromatografii DEAE sepharosu (ekvilibrována TU pufrem), ze které je • · eluován stoupajícím gradientem NaCl v TU pufru (5 až 250 nM NaCl). Frakce obsahující čistou fúzi Ag-SA nebo SA-Ag jsou ředěny 50 mM Tris-CI 1 M NaCl pH 8 (TN pufr) na 2 M močovinu a jsou naneseny na hydrofobní chromatografii Phenyl sepharosu. Následným střídavým promýváním kolony 50 mM Tris-CI pH 8 se 60% isopropanolem a 50 mM Tris-CI pH 8 je odstraněna kontaminace endotoxinu LPS. Protein je poté z kolony uvolněn pomocí TU pufru. Takto získaná denaturovaná monomerní fúze Ag-SA nebo SA-Ag je tetramerizována dialýzou proti 50 mM uhličitanu amonného. Tetramerní forma Ag-SA nebo SAAg fúzních proteinů je stabilní po několik týdnů při 4 °C nebo měsíce v -80 °C.

c) příprava SA fúze s adenovirovými antigeny:

Pro imunizaci byly vybrány 2 povrchových adenovirové antigeny: Hexon (Hex) a Hexon associated protein (HexAP). Vzhledem k velikosti obou antigenů byl antigen Hex rozdělen na tři zvájemně se překrývající části - HexA, HexB, HexC a antigen HexAP na dvě části - HexAPa a HexAPb.

Aminokyselinové sekvence SA/t-HexA streptavidinového fúzního proteinu:

masqslaefmEAGITGTWYNQLGSTFIVTAGADGALTGTYESAVGNAESRYVL TGRYDSAPATDGSGTALGWTVAWKNNYRNAHSATTWSGQYVGGAEARINT QWLLTSGTTEANAWKSTLVGHDTFTKVKPSAASleGGSGSGSGGTSFVL/VA QHDEAVDAMDLAEAKVLANRELDKYGVSDYYTTSAAFTPDLTfAJPRLQYF

HIAGPSTREYLSEDLQQFIAATGSYFELKNKFRQTWAPTRNVTTEKAQRLQ IRFYPTQTDDTPNSYRVRYSLNVGDSWVLDMGATYFDIKGVLDRGPSFKPY GGTAYNPLAPREAFFNNWIEDDGNNTTITGQMTNPYKNEAQNTATATAAAI ASVSGSYPNPNVGLAISEVGALTPTLAAQVGLAGRFAKVSNENTRLAYGAY VKPLKDDGSQSLGTTPYYVLDTTAQKYLGVMGVEDFTQSLTYPDSLLIPPP SEYGEVNSGVMKANRPNYIGFRDNFINLLYHDTGVCSGTLNSERSGMNVW ELQDREF

Aminokyselinové sekvence SA/t-HexB streptavidinového fúzního proteinu:

masqslaefmEAGITGTWYNQLGSTFIVTAGADGALTGTYESAVGNAESRYVL TGRYDSAPATDGSGTALGWTVAWKNNYRNAHSATTWSGQYVGGAEARINT QWLLTSGTTEANAWKSTLVGHDTFTKVKPSAASleGGSGSGSGGTSFVLA/A QHDEAVDAMDLAEAKVLANRELDKYGVSDYYTTSGTLUSERSGMNVXNEL • · ···· · · · · · · ··»··« · · * ··« • · · · · · · • « · · · · · · · · · · · ·

QDRNTELSYQYMLADMMSRHHYFALWNQAVDQYDHDVRVFNNDGYEEGV PTYAFSPEGTGQGPISSANITLSGVKVYTNGQNDKGTEVTNLTTYLNAGAVP SYEIDLAASQRRNFIITNIADYLPDKYKYNISGFNPETDNVDPTTYAYMNRRV PLTNWDLFTNIGARWSVDQMDNVNPFNHHRNWGLKYRSQLLGNSRYCRF HIQVPQKYFAIKNLLLLPGTYTYEWVLRKDPNMILQSSLGNDLRADGASIVY SEVNLMANFMPMDHNTSNQLELMLRNATNDQTFADYLGAKNALYQVPAG STALTINIEF

Aminokyselinové sekvence SA/ř-HexC streptavidinového fúzního proteinu: masqslaefmEAGITGTWYNQLGSTFIVTAGADGALTGTYESAVGNAESRYVL TGRYDSAPATDGSGTALGWTVAWKNNYRNAHSATTWSGQYVGGAEARINT QWLLTSGTTEANAWKSTLVGHDTFTKVKPSAASleGGSGSGSGGTSFVL/VA QHDEA VDAMDLAEAKVLANRELDKYGVSD YY7TSTNDQTFADYLGAKNALY QVPAGSTALTINIPARTWEGMRGWSFTRVKASETPQIGAQYDINFKYSGSIP YSDGTFYLTHTFRNMSVLFDTSINWPGNDRLLAPNLFEIKRNVGIDSEGFTM SQCDITKDWYLIQMATNYNYVFNGYRFWPDRQYFHYDFLRNFDPMTRQGP NFQDSTLFDLTTYEPTLPPAAGGVQTGQDAVRNNSGYIAPRSWPVYSAQQ GESWPANWPYPLIGTESIPPTQWNYKKFLCDNYLWTVPFSSDFMYMGELT DLGQNPMYTNNSHSMVINFELDPMDENTYVYMLYGVFDMVRVNQPERNVL AMAYFRTPFATGNAVEF

d) příprava směřujících protilátek:

1) Příprava myších monoklonálních protilátek proti kuřecímu receptorů

CD205/Ly75:

Zaklonování rekombinantních částí receptorů Ly75

Z extracelulární domény endocytujícího C-lektinového kuřecího receptorů

CD205/Ly75 (NCBI Reference Sequence: NP_001032925.1) s 10 CTLD (Ctype lectin-like domain) byly vybrány dva fragmenty. Tyto vybrané fragmenty byly amplifikovány pomocí PCR, jako templát byla použita cDNA po transkripci RNA ze sleziny Leghornky bílé (Gallus gallus domesticus), sekvence primerů uvedena. Amplifikované fragmenty byly následně zaklonovány mezi restrikční místa Ncol a Xhol expresního vektoru pET28b (Novagen, Darmstadt, Germany).

• ·

Aminokyselinová sekvence částí (Ly75B, Ly75 F) kuřecího lymfocytárního antigenu 75 (CD205/Ly75)

Ly75-B

HCYQFNTQSALSWKEAYVSCQRQGGDLLSIQDASELNYIQAKDDIAEIFWIGL NQLDVSRGWQWSDHKPLNFVNWHPDMWDLSPLDGTSCVAMNAASGQWR SYHCGNPLPYVCKKSFKEVSNLTEFWRHVNTRCDAGWLPHNGFCYMLIHN QASWSTADQLCKANKSNLISIHSLADVELIVTKLHNDAREEVWVGLRNEDVP TLFKWSDRTDWFTYWDQNEPSVPFNATPNCVSYSGKLGQWRVKSCEENL KYVCKK

Ly75-F

YRILQKKLTWYDAVRECKQNMSDLASVHSESQQLFLEDIVKQDGYSLWLGL SIHDGSKANFEWSDGSSFDYYPWELENSNTTENCVLLDTKGSWNRAKCTN VAEGAICYSFSNKKQLEQKQVSRASGCSQLSGELPWIQYKDHCYAFDMAFY NFSVYNVEDAKKVCKKLNPSAALLTIGDAEENAFVSAHIKKNDLITRKVWLGL TQSSTGQTLHWLDGSSVNYANWDNRTTELSEKCSVITSTTGKWSKVDCSRS QSRWCK

Tabulka 1

Sekvence primerů pro PCR amplifikaci vybraných částí kuřecího receptorů

Ly75 (Gene Accession no. NCBI Reference Sequence: NP_001032925.1)

Fragment	Oligonukleotidová sekvence (5'—>3')
ly75B ly75F	ly75Bfor ly75Brew ly75Ffor ly75Frew	TA CCA TGG AT CAT TGC TAC CAG TTC AAC AC TA CTC GAG TTT CTT ACA CAC GTA TTT CAA G TA CCA TGG AT TAC AGA ATT CTT CAG AAA AAG T TA CTC GAG TTT ACA AAC CAC TCT GCT TTG

2) Exprese amplifikovaných fragmentů kuřecího receptorů CD205, purifikace rekombinantních proteinů

Plasmidy byly transformovány do E. coli Rosetta 2 (DE3) celíš (Novagen, Darmstadt, Germany), bakteriální kultury byly kultivovány v LB mediu obsahujícím 60 mg/ml kanamycinu při 37 °C. Po dosažení optické density 0,6 při 600 nm byla exprese fragmentů indukována přidáním IPTG do finální • * · · ·· · · • · · ·· ···» * • · · · · ····· ······ · ····· • · · ·· · · • · · ··· ··· ··· · · koncentrace 0,5 mM. Buňky byly sklizeny po 4 hodinách, promyty v 50 mM CH3COONH4, pH 9 (AC buffer) a uchovány při -20 °C. Fragmenty byly dále extrahovány z inkluzních tělísek pomocí roztoků s 8 M močovinou (50 mM Tris-CI pH 8, 8 M urea - TU pufr). Extrakt byl nanesen na iontoměničovou chromatografií DEAE sefarozu (ekvilibrována TU pufrem), ze které byl eluován stoupajícím gradientem NaCl v TU pufru (5 až 250 nM NaCl). Čisté fragmenty pak byly dialyzovány v 50 mM (NH₄)₂CO₃. Rekombinantně se podařilo připravit pouze dvě části extracelulární domény receptorů Dec205 (Clect region 227341 a 370-485, označená B) a (Clect region 1406-1514 a 1548-1668, označená F).

3) Imunizace myší, příprava hybridomů, testování monoklonálních protilátek

Myši Balb/c byly imunizovány intraperitoneálně 100 ug směsi purifikovaných rekombinantních fragmentů (B+F) receptorů Ly75 v kombinaci s kompletním Fr. adjuvans (Sigma, St. Louis, MO). Dále byly imunizovány i.p. třikrát po 12-ti dnech 25 ug antigenů v kombinaci s nekompletním Fr. adjuvans. Tři dny po posledním boosteru byly myši euthanizovány a slezinné lymfocyty z imunizovaných myší byly fúzovány s myelomovou myší linií SP2. Vzniklé hybridomy (n=365) byly testovány na přítomnost specifických monoklonálních protilátek pomocí testů ELISA, western blotu a průtokové cytometrie. Na základě ověření specifity jednotlivých monoklonálních protilátek pak bylo vybráno 8 hybridomů (18-1d11/A3, 172-3C10/B5, 172-3D11/C8, 1723D11/D11, 130-3G3/G3, 130-3G3/H7, 45-1G1/C10, 268/E8), které reagovaly v jedné, případně ve všech zmíněných metodách. U protilátek byla provedena izotypová analýza.

4) Purifikace vybrané monoklonální protilátky, konjugace biotinem

Vybraný hybridom 104-2C4/D8 byl namnožen v kultivačním mediu do velkého objemu. Specifická monoklonální protilátka byla poté izolována ze zahuštěného tkáňového supernatantu podle izotypu buď v případě IgM pomocí Pierce™ IgM Purification Kit (Thermo Scientific) dle doporučení výrobce^nebo v případě IgG izotypu pomocí Melon gel IgG Purification Kit (Thermo Scientific) rovněž podle doporučení výrobce. Specifita purifikované protilátky byla poté ověřena ve Western blotu a/nebo pomocí průtokové cytometrie, čistota byla kontrolována pomocí SDS PAGE elektroforézy. Konjugace biotinem byla provedena pomocí soupravy EZ-Link™ Sulfo-NHS-LCBiotinylation Kit (Hermo Fischer Scientific).

e) příprava a detekce viru:

Infikovaná žaludeční sliznice byla rozdrcena v hmoždíři v tekutém dusíku N₂ a homogenát se 3x zmrazil a rozmrazil v DMEM. Odstředěním v centrifuze se odstranily zbytky tkáně, supematant byl přefiltrován přes 0,22 pm filtr a zamražen jako zásobní roztok viru.

Virus byl propagován na kultuře kuřecích buněk LMH. Ty byly kultivovány v DMEM s 5% FBS, 1% NEAA a 1% Penicilín Streptomycin Glutamin solution (KM). Zásobní roztok viru se zředil v čistém DMEM v poměru 1:300. Kultivační láhev (75 cm²) se nechala porůst LMH buňkami do přibližně 90% konfluence, odstranilo se KM, přidaly se 3 ml ředěného viru a jednu hodinu se kultivovala v 37 °C, 5% CO₂ v inkubátoru. Poté se odstranilo médium, přidalo se 10 ml KM a pokračovala inkubace. V době nejsilnějšího cytopatického efektu se buňky sklidily, virus se uvolnil opakovaným zmražením/rozmražením (3x), buňky byly odstraněny odstředěním v centrifuze a supematant byl zamražen jako roztok pro infekci.

Detekce viru:

Z 200 pl zásobního roztoku byla izolována DNA pomocí Qiagen Blood&Tissue DNA Isolation Kit podle instrukcí výrobce. Pomocí PCR byl detekován gen pro virový Hexon protein. Nukleotidová sekvence primerů byla: HFw 5'GTGCGTAACAACTCGGGCTA 3', HRv - 5' TTGCGTTCGGGTTGGTTCAC 3'. PCR proběhla s Taq DNA polymerázou při 95 °C 3 min, 30x 95 °C 30 s, 55 °C 30 s, 72 °C 40 s a 72 °C 5 min.

f) imunizace zvířat a výsledek in vivo experimentů:

Byly realizovány tři pokusy s brojlerovými kuřaty nosnými SPF kuřičkami.

Pokus 1

Byl proveden celkem na 45 SPF kuřičkách ve stáří 21 dnů. Kuřičky byly rozděleny do devíti skupin po pěti jedincích: (CD205) Sk1, Sk2, Sk3, (CD11c) K1 (kontrola), K2 (imunizace inaktivovaným agens) a K3 (neinfikovaná kontrola). Kontrolně byl opakován ještě 2x.

Imunizační dávka pro jedno kuře obsahovala 10 pg antigenu + 15 pg protilátky v celkovém objemu 300 pl PBS. Inaktivace viru proběhla sterilizací zásobního roztoku v autoklávu po dobu 30 minut. V den zahájení (dO) byly Sk skupiny intramuskulárně imunizovány 300 pl vakcíny a skupině K2 bylo intramuskulárně podáno 300 μΙ inaktivovaného viru. V d7 byly intramuskulárně imunizovány skupiny Sk2 a Sk3, v d14 pak skupiny Sk3. V d21 byly všechny skupiny s výjimkou K3 zatíženy per orálně podáním 1 ml roztoku pro infekci. V d29 byla zvířata utracena a ve svalnatém žaludku byl sledován výskyt erozí.

Tabulka 2

Počet erozí na skupinu

skupiny	K1	K2	K3	(CD11c )Sk1	(CD 11c) Sk2	(CD11c) Sk3	(Ly75) Sk1	(Ly75 )Sk2	(Ly75) Sk3
Eroze (ks)	5	0	0	3	3	3	2	0	2

Tento výsledek byl 2 x potvrzen u kontrolních skupin (Ly75) Sk2 a to na 15 ks drůbeže v každé skupině.

• 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 • · · · · · · • · · ··· 9 99 9 9 9 9 9

Jasně se ukázal ochranný efekt provedené imunizace pomocí směrovaných biotinylovaných protilátek CD 205 (Ly75), viz Obr. 3 a 4.

Průmyslová využitelnost

Nový komplex pro přenos antigenů do drůbežích antigen prezentujících buněk umožňuje přípravu vakcíny proti adenovirům na ochranu drůbeže. Oproti jiným dosavadním způsobům má tento komplex výhodu ve výběru a kombinovatelnosti vhodných protilátek.

Seznam použité literatury

Lipscomb, M.F., Maštěn, B.J., 2002. Dendritic celíš: immune regulators in health and disease. Physiol. Rev. 82, 97-130. doi:10.1152/physrev 00023.2001

Igyártó, B.-Z., Lackó, E., Oláh, I., Magyar, A., 2006. Characterization of chicken epidermal dendritic cells. Immunology 119, 278-88.

doi: 10.1111/j.1365~2567.2006.02432.x

Wu, Z., Rothwell, L., Young, J.R., Kaufman, J., Butter, C., Kaiser, P., 2010. Generation and characterization of chicken bone marrow-derived dendritic cells. Immunology 129, 133-145. doi: 10.1111/j. 13652567.2009.03129.x

Bonifaz, L., Bonnyay, D., Mahnke, K., Rivera, M., Nussenzweig, M.C., Steinman, R.M., 2002. Efficient targeting of protein antigen to the dendritic cell receptor DEC-205 in the steady statě leads to antigen presentation on major histocompatibility complex class I products and peripheral CD8+ T cell tolerance. J. Exp. Med. 196, 1627-38.

Castro, F. V., Tutt, A. L., White, A. L., Teeling, J. L., James, S., French, R. R., et al. (2008). CD11c provides an effective immiinotarget for the generation of both CD4 and CD8 T cell responses. European Journal of Immunology, 38, 2263-2273.

Idoyaga, J., Lubkin, A., Fiorese, C., Lahoud, M.H., Caminschi, I., Huang, Y., Rodriguez, A., Clausen, B.E., Park, C.G., Trumpfheller, C., Steinman, R.M., 2011. Comparable T helper 1 (Th1) and CD8 T-cell immunity by targeting HIV gag p24 to CD8 dendritic celíš within antibodies to Langerin, DEC205, and Clec9A. Proč. Nati. Acad. Sci. U. S. A. 108, 2384-9. doi: 10.1073/pnas. 1019547108

Wang, W. W., Das, D., McQuarrie, S. A., & Suresh, M. R. (2007). Design of a bifunctional fusion protein for ovarian cancer drug delivery: singlechain anti-CA125 core-streptavidin fusion protein. European Journal of Pharmaceutics and Biopharma- ceutics,

Wang, W. W., Das, D., & Suresh, M. R. (2009). A versatile bifunctional dendritic cell targeting vaccine vector. Molecular Pharmacology, 6, 158-172.

Stanek, O., Linhartova, I., Majlessi, L., Leclerc, C., Sebo, P., 2012. Complexes of streptavidin-fused antigens with biotinylated antibodies targeting receptors on dendritic cell surface: a novel tool for induction of specific T-cell immune responses. Mol. Biotechnol. 51, 221-32. doi:10.1007/s12033-0119459-6

Leclerc, C., 2003. New approaches in vaccine development. Comp. Immunol. Microbiol. Infect. Dis. 26, 329-41. doi:10.1016/S01479571(03)00018-3

• · • · · • · • · • ·

Claims (5)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1) Komplex pro dopravu antigenů do drůbežích antigen prezentujících buněk, vyznačující se tím, že obsahuje streptavidin nebo avidin nebo neutravidin, na který je geneticky připojen imunogenní antigen, kde tetramerní purifikovaná forma tohoto fúzního proteinu je poté kombinována se specifickými biotinylovanými protilátkami rozpoznávajícími zejména endocytující receptory na dendritických buňkách.
2. 2) Komplex podle nároku 1, vyznačující se tím, že nejméně 0,1 mM až 50 c

   mM Ag-SA nebo SA-Ag je kombinována s 0,2 až 100| mM směřující biotinylované protilátky proti kuřecí podobě Ly 75 a dalších protilátek rozpoznávající^pecifické endocytující receptory na

   A prezentujících buňky.

   povrchu kuřecí%ntigen
3. 3) Komplex podle nároku 1, vyznačující se tím, že se jedná o specifickou myší monoklonální protilátku proti kuřecí podobě endocytujícího C-lektinového receptorů CD205/Ly[75, která po konjugaci biotinem na Fc fragment zaciluje SA-Ag nebo Ag-SA fúzní protein do cílových imunokompetentních kuřecích buněk.
4. 4) Komplex podle nároku 1, vyznačující se tím, že obsahuje flexibilní linkery oddělujících antigenní a streptavidinovou část fúzního proteinu zvyšující možnost tetramerizace a stability výsledného komplexu.
5. 5) Komplex podle nároku 1, vyznačující se tím, že obsahuje specifické protilátky, zejména anti-CD205(Ly75), získané z různých hybridomů.

   Ζ-0\<ο