CZ304935B6 - Způsob přípravy ječmene se zvýšenou odolností vůči suchu - Google Patents

Abstract

Řešení poskytuje způsob přípravy rostlin ječmene odolných vůči suchu, při němž se do genomu ječmene vloží nukleotidová sekvence obsahující .beta.-glukosidasový promotor a sekvenci, která kóduje enzym s cytokinindehydrogenázovou aktivitou a která má alespoň 80% identitu k sekvenci genu AtCKX1 z rostliny Arabidopsis thaliana. Dále řešení poskytuje expresní kazetu, která obsahuje .beta.-glukosidasový promotor-AtCKX1-terminátor, a použití této expresní kazety pro přípravu rostlin ječmene vykazujících odolnost vůči suchu.

Description

Způsob přípravy ječmene se zvýšenou odolností vůči suchu

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu přípravy geneticky modifikovaných rostlin ječmene, které vykazují, v důsledku změněné hladiny cytokininů převážně v kořenech, zvýšenou odolnost vůči suchu. Modifikace hladiny cytokininů je zajištěna ektopicky produkovanou cytokinindehydrogenasou lokalizovanou v cytosolu, apoplastu nebo vakuolách.

Dosavadní stav techniky

Ječmen setý (Hordeum vulgare) je hospodářsky významnou rostlinou, která se využívá zejména k výrobě sladu a dále je potravinářskou, krmnou a farmaceutickou plodinou. Změna jeho genetických vlastností může vést k významnému zlepšení zemědělských parametrů této obiloviny.

Architektura rostliny může být cíleně upravena změnou hladin cytokininů, rostlinných hormonů (Mok DWS and Mok MC. (2001), Ann Rev Plant Physiol. Plant Mol Biol. 52:89-118), které se podílejí na regulaci řady klíčových procesů probíhajících v rostlinách, jako je např. dělení a diferenciace buněk (Bianco MD, Giustini L, Sabatini S. (2013), New Phytol. 199:324-38), odolnost vůči stresu (Dobrev Pl, Vaňkova R. (2012), Methods Mol Biol. 913:251-61; Kuppu S, MishraN, Hu R, Sun L, Zhu X, Shen G, Blumwald E, Payton P, Zhang H. (2013), PLoS One. 8:e64190) a oddálení senescence (Khan M, Rozhon W, Poppenberger B. (2013), Gerontology (před tiskem). Jednotlivé formy cytokininů a jejich deriváty se liší biologickou aktivitou. Dle zvolených citovaných publikací je patrné, že jsou tyto hormony stále intenzivně studovány pro jejich klíčový vliv na růst a vývoj rostlin, čehož by bylo možné využít při pěstování zemědělsky významných plodin např. ke zvětšení výnosu (Powell AF, Paleczny AR, Olechowski H, Emery RJ. (2013), Plant Physiol Biochem. 64:33-40) či lepší odolnosti vůči biotickému (Reusche M, Klásková J, Thole K, Truskina J, Novák O, Janz D, Strnad M, Spíchal L, Lipka V, Teichmann T. (2013), Mol Plant Microbe Interact. 26:850-60) a abiotickému stresu (Dobrev Pl, Vaňkova R. (2012), Methods Mol Biol. 913:251-61). Vzhledem k nárůstu světové populace probíhají snahy o využití půdy pro zemědělské účely i v oblastech, které nejsou v současné době pro pěstování plodin vhodné. Předpokládá se také, že negativní změny klimatu, včetně těch zapříčiněných lidskou činností, budou mít za následek prodloužení suchých period a zvyšování teploty. Snahy o zvýšení odolnosti významných rostlin vůči stresu suchem za užití rozličných přístupů jsou tedy v posledních letech značné a korespondují se závažností situace (Grayson M. (2013), Agriculture and drought. Nátuře Outlook 01 :S 1).

Odbourávání cytokininů je v každé rostlině zajištěno enzymovou aktivitou cytokinindehydrogenasy (EC 1.5.99.12; CKX) (Galuszka P, Frébort I, Šebela M, Sauer P, Jacobsen S, Peč P. (2001), Eur J Biochem. 268:450-61), která se vyskytuje v rostlinách v různých formách působících v různých buněčných kompartmentech (Werner T, Motyka V, Laucou V, Smets R, Van Onckelen H, Schmůlling T. (2003), Plant Cell. 15:2532-50; Schmulling, T., Werner, T., Riefler, M., Krupková, E. and Bartrina y Manns, I. (2003), J Plant Res. 116:241-52; Liu Z, Lv Y, Zhang M, Liu Y, Kong L, Zou M, Lu G, Cao J, Yu X. (2013), BMC Genomics. 14:594 (před tiskem)', Tsai YC, Weir NR, Hill K, Zhang W, Kim HJ, Shiu SH, Schaller GE, Kieber JJ. (2012), Plant Physiol. 158:1666-84) v různém stadiu vývoje rostlin (Powell AF, Paleczny AR, Olechowski H, Emery RJ. (2013), Plant Physiol Biochem. 64:33—40). Jednotlivé formy CKX mají také odlišnou substrátovou specificitu, což je dáno rozdílnou lokalizací cytokininů v rostlinném pletivu. U rostliny A. thaliana byla substrátová specifita CKX (Galuszka P, Popelková H, Werner T, Frébortová J, Pospíšilová H, Mik V et al. (2007), J Plant Growth Regul. 26:255-67) a lokalizace jednotlivých CKX popsána nejlépe. A. thaliana obsahuje dvě vakuolámí CKX (AtCKXl a ACKX3), jednu cytosolickou CKX (AtCKX7) a zbývající čtyři jsou pravděpodobně apoplastické (Werner, T, Motyka V, Laoucou V, Smets R, Van Onckelen H, Schmůlling T. (2003), Platn Cell. 15:2532— 50). Bylo zjištěno, že sekretované (apoplastické) formy CKX preferují jako substrát volné cytokininové báze, vakuolámí formy zase N-glykosylované cytokininy (Galuszka et al. (2007), J Plant Growth Regul. 26:255-67). Zajímavé je, že vakuolámí CKX preferují di- a trifosfáty cytokininů, které jsou primárními produkty de novo biosyntézy cytokininů v rostlinách (Kowalska

- 1 CZ 304935 B6

M, Galuszka P, Frébortová J, Šebela M, Béres T, Hluska T, Šmehilová M, Bilyeu KD, Frébort I. (2010), Phytochemistry. 71:1970-8). Na základě toho můžeme usuzovat na odlišné biologické funkce jednotlivých forem CKX. Z toho vyplývá, že kombinací požadované formy enzymu, signální sekvence, které protein směruje do jednotlivých kompartmentů, a vhodného pletivově specifického promotoru můžeme cíleně ovlivnit výsledný fenotyp rostliny.

Studium geneticky modifikovaných dvouděložných rostlin s naprodukovanou CKX probíhá již od roku 2001 (Werner T, Motyka V, Strnad M, Schmulling T (2001), Proč Nati Acad Sci USA. 98:10487-92). Fenotyp takovýchto rostlin se nazývá cytokinin-deficientní, a projevuje se zejména sníženou nadzemní částí a produktivitou a dále zvětšením kořenového systému (Werner T, Motyka V, Strnad M, Schmulling T (2001), Proč Nati Acad Sci USA. 98:10487-92; Galuszka P, Frébortová J, Werner T, Yamada M, Strnad M, Schmulling T, Frébort I. (2004), Eur J Biochem. 271:3990-4002). Konkrétně byly připraveny geneticky modifikované rostliny A. thaliana s nadprodukcí AtCKXl, 2, 3, 4, 5 nebo 6, u nichž byl pozorován podobný cytokinin-deficientní fenotyp, který byl nej výraznější u rostlin s nadexpresí AtCKXl, 3 a 5 (Werner et al. (2003), Plant Cell. 15:2532-50). Později byly připraveny rostliny Arabidopsis s kořenově specifickou nadprodukcí AtCKX3 u nichž byla až o 40 % zvětšená hmota kořenů bez negativního vlivu na fertilitu rostlin a modifikované rostliny vykazovaly vyšší odolnost vůči stresu suchem (Werner T, Nehnevajova, E, Kóllmer I, Novák O, Strnad M, Krámer U, Schmůling T. (2010), Plant Cell. 22:390520). Obdobný fenotyp byl pozorován také u tabáku s nadprodukcí AtCKXl, kde byla také potvrzena zvýšená odolnost těchto rostlin vůči suchu (Macková H, Hronková M, Dobrá J, Turečková V, Novák O, Lubovská Z, Motyka V, Haisel D, Hájek T, Prášil IT, Gaudinová A, Štorchová H, Ge E, Werner T, Schmulling T, Vaňková R. (2013), J Exp Bot. 64:2805-15).

Na rozdíl od dvouděložních rostlin jsou jednoděložné rostliny obtížněji transformovatelné, zejména v důsledku nedostatečné regenerace rostlin z nediferencovaného pletiva. Pro získání stabilních linií se stejně jako u dvouděložných využívá transformace pomocí bakterie A. tumefaciens (Harwood WA, Bartlett JG, Alves SC, Perry M, Smedley MA, Leyland N, Snape JW. (2009), In Methods in Molecular Biology, Vol. 478 (Jones H. D, Shewry P. R. ed.), pp. 137-147, Humana Press, New York, USA). Na základě publikovaných údajů byla manipulace s geny pro CKX u jednoděložné rostliny provedena pouze jednou a to u ječmene na našem pracovišti. Jednalo se o kukuřičný gen ZmCKXl (Mrázová K, Jiskrová E, Vyroubalová Š, Novák O, Ohnoutková L, Pospíšilová H, Frébort I, Harwood WA, Galuszka P. (2013), Přijato kpublikaci do PLOS ONE). Na rozdíl od nadprodukce CKX proteinu u dvouděložných rostlin, byl cytokinin-deficientní fenotyp rostlin ječmene s CKX řízenou konstitutivním promotorem příliš silný, což se projevovalo sníženou schopností regenerace transgenních rostlin, jejich sterilitou a předčasnou senescencí. Z tohoto důvodu byl použit β-glukosidasový promotor, který má nejsilnější aktivitu v kořenech (Gu R, Zhao L, Zhang Y, Chen X, Bao J, Zhao J, Wang Z, Fu J, Liu T, Wang J, Wang G. (2006), Plant Cell Rep. 25:1157-65) pro regulaci exprese ZmCKXl (nepublikovaná data). Tyto rostliny měly také sníženou schopnost regenerace a silný cytokinin-deficientní fenotyp (Obr. 1). Bylo získáno 5 nezávislých transgenních linií ječmene, u kterých byla detekována až lOx zvýšená aktivita CKX. Tyto rostliny byly v důsledku vnesené ZmCKXl sterilní a neposkytly žádné potomstvo. Z těchto údajů vyplývá, že výsledky získané při nadprodukcí CKX u dvouděložných rostlin není možné aplikovat na jednoděložné obiloviny, kde může probíhat regulace metabolismu cytokininů odlišným způsobem (Hirose N, Makita N, Kojima M, KamadaNobusada T, Sakakibara H. (2007) Plant Cell Physiol. 48:523-39).

Další dostupné údaje o jednoděložných rostlinách s nadprodukovanou CKX jsou uvedeny v dokumentu US 2009/0165174. Jedná se o nadprodukcí kukuřičných CKX v kukuřici. Dle našich dat uvedených výše je použití kukuřičné ZmCKXl v ječmeni nevhodné a není tedy možné aplikovat výsledky získané studiem geneticky modifikované kukuřice na ječmen.

-2CZ 304935 B6

Podstata vynálezu

Předmětem předkládaného vynálezu je způsob přípravy rostlin ječmene odolných vůči suchu, jehož podstata spočívá v tom, že se do genomu ječmene vloží nukleotidová sekvence obsahující sekvenci s alespoň 80% identitou, s výhodou s alespoň 90% identitou, výhodněji s alespoň 95% identitou k sekvenci genu AtCKXl (cytokinin dehydrogenasa pocházející z rostliny Arabidopsis thaliana) vybrané ze skupiny zahrnující sekvence SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2 a SEQ ID NO. 3, anebo obsahující sekvenci s alespoň 90% identitou, s výhodou s alespoň 95% identitou, k nukleotidové sekvenci kódující polypeptid vybraný ze skupiny zahrnující sekvence SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 9.

Vložená sekvence je řízená β-glukosidasovým promotorem.

S výhodou se sekvence vloží pomocí Agrobacteria tumefaciens.

80% identity, s výhodou 90% identity, výhodněji 95% identity se zde uvedenými sekvencemi se dosáhne například prodloužením či zkrácením sekvence nebo bodovými mutacemi v sekvenci, zejména takovými, které nemění kódované aminokyseliny vzhledem k degeneraci genetického kódu.

V rámci předkládaného vynálezu bylo zjištěno, že pro přípravu geneticky modifikovaných rostlin odolných vůči suchu je vhodná vakuolámí AtCKXl (nukleotidová sekvence SEQ ID NO. 1; přirozená forma; Werner et al. (2001), Proč Nati Acad Sci USA. 98:10487-92, odpovídající aminokyselinová sekvence SEQ ID NO. 7), apoplastická AtCKXl (nukleotidová sekvence SEQ ID NO. 2, signální peptid z AtCKX2, odpovídající aminokyselinová sekvence SEQ ID NO. 8) nebo cytosolická forma AtCKXl (nukleotidová sekvence SEQ ID NO. 3, bez signálního peptidu, odpovídající aminokyselinová sekvence SEQ ID NO. 9), s výhodou řízená β-glukosidasovým promotorem s nejvyšší mírou exprese v kořeni (Gu et al., (2006), Plant Cell Rep. 25:1157-65). Pomocí A. tumefaciens lze tyto sekvence integrovat do genomu ječmene a získat transgenní rostliny, u kterých byla pozorována zvýšená odolnost vůči suchu. Zvýšená odolnost rostlin vůči suchu zvyšuje šanci na přežití rostlin ječmene při růstu v nepříznivých klimatických podmínkách.

Předmětem vynálezu je dále expresní kazeta, která obsahuje β-glukosidasový promotorJ/CALYV-terminátor. AtCKXl je sekvence s alespoň 80% identitou, s výhodou s alespoň 90% identitou, výhodněji s alespoň 95% identitou k sekvenci vybrané ze skupiny zahrnující sekvence SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2 a SEQ ID NO. 3, a nebo sekvence s alespoň 90% identitou, s výhodou s alespoň 95% identitou k nukleotidové sekvenci kódující polypeptid vybraný ze skupiny zahrnující sekvence SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 9. Promotorem je s výhodou β-glukosidasový promotor, terminátorem je s výhodou NOS terminátor.

V jednom výhodném provedení expresní kazeta obsahuje: β-glukosidasový promotor: -.AtCKXl vakuolámí: :NOS terminátor, a má sekvenci s alespoň 80% identitou, s výhodou s alespoň 90% identitou, výhodněji s alespoň 95% identitou k sekvenci SEQ ID NO. 4.

SEQ ID NO. 4:

Pozice jednotlivých funkčních úseků: β-glukosidasový promotor: 50 bp - 950 bp Vakuolámí signální sekvence: 966 bp - 1076 bp AtCKXl (bez zahrnutí signální sekvence): 1077 bp - 2693 bp NOS terminátor: 2721 bp - 2974 bp

I I ¹⁰ 20 30 40 50 60 70 80 90 100

ACAAGTTTGT ACAAAAAAGC AGGCTTTAAA GGAACCAATT CAAGAATTCC AAAGCTGCCG CATTCGGCAA AGCCTGCAAT TCCGGTAGTG TTTTACCACG

110 120 130 140 150 160 170 160 190 200

TTGACAAAAA AAATGAAGAA ATCCGATATT TTAGTCATTA TGGATATGGC GCGGTGTCAA ATCGGTATAG TCATAATCCT TTCCATAGGA TTGTCCCATG

-3CZ 304935 B6

210 220 230 240 250 260 270 280 290 300

CTCGACACAT TAACACTAAG TTTATCCCTG AATAACACGG CTACCTCCAT CCTAATCTTT TCTATTGATC AATTGCCTAT TTTTAAGGCG CAGTTGTTCT

....1....( .,..1....1 ....1....( ....I,.,.} ..,.(....1

310 320 330 340 350 360 370 380 390 400

TGGCCGTATC TGTGGAGATG ATTTTTTTAA AGACGTCCAA CTCTAGCTAG CTAGTCCGTG TATGTGAACG GTGTTAGGTA GTCATTGGAT CCGTTGACTA

....(....( ....(....1 ....1....1 ....(....1 ....I....! ....(....I ....ί....I ....(....1 ....1....(

410 420 430 440 450 460 470 480 490 500

TATTTGTAAA GGTGGTAGCC GTTCTTTTTA ATTTTAACGC CGCTGGGAAG AAATTAAACG TGGTACA7CT ATGTATCGTT TTCTTAACAG TGATATAATA

....[....I | I ....(....I ....(....( ....1....1 ....1....1 ....1....1 ....1...,( .... }....(

510 520 530 540 550 560 570 580 590 600

ATATACTATC ATTGCAAGCG TCCGCAATTG CTCTCTCGCG GCTCGTTCTA CCGTGGGAAG AAGAGCTGAC CCGTCGCCGC CCCACATGCA TACGATGCGT

610 620 630 640 650 660 670 680 690 700

CCTTATCTGT CGCGGCTCGT GCAAACGCGG GGCGGGCTGA GCGCCCCAGC CCACCACTTG CACCACTTGC ATTTACTTAA TTAGTTCATA ACACATCACA

....1....1 ....1....1 ....1....I ι ....1....( ..,.1....1 ....[....i I ....(....1

710 720 730 740 750 760 770 780 790 800

TCTGTATCTT ACATTATCTT TAAAAAAATG ATTCACACAT TATTTATATA TGAGATATAA TAAGTTTCCA GGAAGCATCT TTGGCGACTT ACGTACGTGT

I ....1....1 ....1....1 ....(....( ....(....I ....1....(

810 820 830 840 850 860 670 880 890 900

ATCAGAGACA TGGAGTGATA aactattggg caaccattta gcaatcctag ctagccagct cgtctataaa tagatgcatc agctccactt ggtctacaca

....(....I ....1....( I I ....1....( ....1....( ....(-...I

910 920 930 940 950 960 970 980 990 1000

CTTCACAAGC AGCTCAAAGC TCTAGTTCTA GCTAGCTAGC AAAGGGGGGG AAAGGTACCG TCGACATGGG ATTGACCTCA TCCTTACGGT TCCATAGACA

....(....I ....I....1 ...-I....1 ....!....( ....1....1 ....(....1 ....(....1 ....(....1 ....(....( .,..(....1

1010 1020 1030 1040 1050 1060 1070 1080 1090 1100

AAACAACAAG ACTTTCCTCG GAATCTTCAT GATCTTAGTT CTAAGCTGTA TACCAGGTAG AACCAATCTT TGTTCCAATC ATTCTGTTAG TACCCCAAAA

....(....i ....(....I ....(....( ....(....I

1110 1120 1130 1140 1150 1160 1170 1180 1190 1200

GAATTACCTT CTTCAAATCC TTCAGATATT CGTTCCTCAT TAGTTTCACT AGATTTGGAG GGTTATATAA GCTTCGACGA TGTCCACAAT GTGGCCAAGG

....(....I ....(....I ....1....( ....(....i ....1....1 ....(....1 ....(....I ....(....i

1210 1220 1230 1240 1250 1260 1270 1280 1290 1300

ACTTTGGCAA CAGATACCAG TTACCACCTT TGGCAATTCT ACATCCAAGG TCAGTTTTTG ATATTTCATC GATGATGAAG CATATAGTAC ATCTGGGCTC

....1....( ί ,...1....( ...,)....1 ....(....I ....(....I

1310 1320 1330 1340 1350 1360 1370 1380 1390 1400

CACCTCAAAT CTTACAGTAG CAGCTAGAGG CCATGGTCAC TCGCTTCAAG GACAAGCTCT AGCTCATCAA GGTGTTGTCA TCAAAATGGA GTCACTTCGA

I ....1....( ....(....I ..-.I,...! ....(....( ....(....I I ....(....I

1410 1420 1430 1440 1450 1460 1470 1480 1490 1500

AGTCCTGATA TCAGGATTTA TAAGGGGAAG CAACCATA7G TTGATGTCTC AGGTGGTGAA ATATGGATAA ACATTCTACG CGAGACTCTA AAATACGGTC

1510 1520 1530 1540 1550 1560 1570 1580 1590 1600

TTTCACCAAA GTCCTGGACA GACTACCTTC ATTTGACCGT TGGAGGTACA CTATCTAATG CTGGAATCAG CGGTCAAGCA TTCAAGCATG GACCCCAAAT

1610 1620 1630 1640 1650 1660 1670 1680 1690 1700

CAACAACGTC TACCAGGTAG AGATTGTTAC AGGGAAAGGA GAAGTCGTAA CCTGTTCTGA GAAGCGGAAT TCTGAACTTT TCTTCAGTGT TCTTGGCGGG

1710 1720 1730 1740 1750 1760 1770 1780 1790 1800

CTTGGACAGT TTGGCATAAT CACCCGGGCA CGGATCTCTC TTGAACCAGC ACCGCATATG GTTAAATGGA TCAGGGTACT CTACTCTGAC TTTTCTGCAT

....I,...} ....(....I ....(....i ....1....( ,...1....( ....i....I

1810 1820 1830 1840 1850 1860 1870 1880 1890 1900

TTTCAAGGGA CCAAGAATAT CTGATTTCGA AGGAGAAAAC TTTTGATTAC GTTGAAGGAT TTGTGATAAT CAATAGAACA GACCTTCTCA ATAATTGGCG

....1....1 ....1....1 ....1....1 ....1....1 ....1....1 ....1....1 ....1....1 ....1....1 ....1....1 ....1....1

1910 1920 1930 1940 1950 1960 1970 1980 1990 2000

ATCGTCATTC AGTCCCAACG ATTCCACACA GGCAAGCAGA TTCAAGTCAG ATGGGAAAAC TCTTTATTGC CTAGAAGTGG TCAAATATTT CAACCCAGAA

....(....I ....I....! ....I....} ....(....1 ....1....1 ....(....(

2010 2020 2030 2040 2050 2060 2070 2080 2090 2100

GAAGCTAGCT CTATGGATCA GGAAACTGGC AAGTTACTTT CAGAGTTAAA TTATATTCCA TCCACTTTGT TTTCATCTGA AGTGCCATAT ATCGAGTTTC

2110 2120 2130 2140 2150 2160 2170 2180 2190 2200

TGGATCGCGT GCATATCGCA GAGAGAAAAC TAAGAGCAAA GGGTTTATGG GAGGTTCCAC ATCCCTGGCT GAATCTCCTG ATTCCTAAGA GCAGCATATA

2210 2220 2230 2240 2250 2260 2270 2280 2290 2300

CCAATTTGCT ACAGAAGTTT TCAACAACAT TCTCACAAGC AACAACAACG GTCCTATCCT TATTTATCCA GTCAATCAAT CCAAGTGGAA GAAACATACA

I ....1....( ....(....( ....(....I

2310 2320 2330 2340 2350 2360 2370 2380 2390 2400

TCTTTGATAA CTCCAAATGA AGATATATTC TATCTCGTAG CCTTTCTCCC CTCTGCAGTG CCAAATTCCT CAGGGAAAAA CGATCTAGAG TACCTTTTGA

2410 2420 2430 2440 2450 2460 2470 2480 2490 2500

AACAAAACCA AAGAGTTATG AACTTCTGCG CAGCAGCAAA CCTCAACGTG AAGCAGTATT TGCCCCATTA TGAAACTCAA AAAGAGTGGA AATCACACTT

....(....i ....(....i ....ϊ....; ....(....i ....i....) ....(....i

2510 2520 2530 2540 2550 2560 2570 2580 2590 2600

TGGCAAAAGA TGGGAAACAT TTGCACAGAG GAAACAAGCC TACGACCCTC TAGCGATTCT AGCACCTGGC CAAAGAATAT TCCAAAAGAC AACAGGAAAA

2610 2620 2630 2640 2650 2660 2670 2680 2690 2700

TTATCTCCCA TCCAACTCGC AAAGTCAAAG GCAACAGGAA GTCCTCAAAG GTACCATTAC GCATCAATAC TGCCGAAACC TAGAACTGTA TAAGTCGACT

2710 2720 2730 2740 2750 2760 2770 2780 2790 2800

CGAGTCTAGA AGTCGAAGCA GATCGTTCAA ACATTTGGCA ATAAAGTTTC TTAAGATTGA ATCCTGTTGC CGGTCTTGCG ATGATTATCA TATAATTTCT

....i....! ....1....( ....(....i ....(....( ....(....i ....(....I ....(....I

2810 2820 2830 2840 2850 2860 2870 2880 2890 2900

GTTGAATTAC GTTAAGCATG 7AATAATTAA CATGTAATGC ATGACGTTAT TTATGAGATG GGTTTTTATG ATTAGAGTCC CGCAATTATA CATTTAATAC

....1....( ....(....I ....(....( ....(....I ....(,...1 ..,.1....( ....(....(

2910 2920 2930 2940 2950 2960 2970 2980 2990 3000

GCGATAGAAA ACAAAATATA GCGCGCAAAC TAGGATAAAT TATCGCGCGC GGTGTCATCT ATGTTACTAG ATCGACCGGC AAGCAAGCTG ATATGCGGCC

....1....( ....1....1 ....(....I

3010 3020 3030 3040 3050 3060 3070 3080 3090 3100

GCACTCGAGA TATCTAGACC CAGCTTTCTT GTACAAAGTG GTTGATGGGC TGCAGGAATT CGATAICAAG CTTATCGATA CCGTCGACCT CGAGGGGGAT

3110 3120

CACCACTTTG TACAAGAAAG CTG

Protein AtCKXl vakuolární (575 aminokyselin, SEQ ID NO. 7)

AUG GGA UUG Met Gly Leu

ACU UUC CUC Thr Phe Leu

ACC UCA UCC Thr Ser Ser

GGA AUC UUC Gly Ile Phe

UUA CGG UUC Leu Arg Phe

AUG AUC UUA Met Ile Leu

CAU AGA CAA His Arg Gin

GUU CUA AGC Val Leu Ser

AAC AAC

Asn Asn

AAG Lys

UGU AUA CCA Cys Ile Pro

GGU AGA ACC Gly Arg Thr

GAA UUA CCU Glu Leu Pro

UCA COA GAU Ser Leu Asp

GUG GCC AAG Val Ala Lys

AUU CUA CAU

Ile Leu His

CAU AUA GUA

His Ile Val

AGA GGC CAU Arg Gly His

GGU GUU GUC Gly Val Val

AUU UAU AAG Ile Tyr Lys

AUA UGG AUA Ile Trp Ile

CCA AAG UCC Pro Lys Ser

CUA UCU AAU

Leu Ser Asn

CAA AUC AAC

Gin Ile Asn

GAA GUC GUA

Glu Val Val

AGU GUU CUU

Ser Val Leu

AAU CUU UGU Asn Leu Cys

UCU UCA AAU Ser Ser Asn

UUG GAG GGU Leu Glu Gly

GAC UUU GGC Asp Phe Gly

CCA AGG UCA Pro Arg Ser

CAU CUG GGC His Leu Gly

GGU CAC UCG Gly His Ser

AUC AAA AUG Ile Lys Met

GGG AAG CAA Gly Lys Gin

AAC AUU CUA Asn Ile Leu

UGG ACA GAC Trp Thr Asp

GCU GGA AUC Ala Gly Ile

AAC GUC UAC Asn Val Tyr

ACC UGU UCU Thr Cys Ser

GGC GGG CUU Gly Gly Leu

UCC AAU CAU Ser Asn His

CCU UCA GAU Pro Ser Asp

UAU AUA AGC Tyr Ile Ser

AAC AGA UAC Asn Arg Tyr

GUU UUU GAU Val Phe Asp

UCC ACC UCA

Ser Thr Ser

CUU CAA GGA Leu Gin Gly

GAG UCA CUU Glu Ser Leu

CCA UAU GUU Pro Tyr Val

CGC GAG ACU Arg Glu Thr

UAC CUU CAU Tyr Leu His

AGC GGU CAA Ser Gly Gin

CAG CUA GAG Gin Leu Glu

GAG AAG CGG Glu Lys Arg

GGA CAG UUU Gly Gin Phe

UCU GUU AGU Ser Val Ser

AUU CGU UCC Ile Arg Ser

UUC GAC GAU Phe Asp Asp

CAG UUA CCA Gin Leu Pro

AUU UCA UCG

Ile Ser Ser

AAU CUU ACA

Asn Leu Thr

CAA GCU CUA

Gin Ala Leu

CGA AGU CCU Arg Ser Pro

GAU GUC UCA Asp Val Ser

CUA AAA UAC Leu Lys Tyr

UUG ACC GUU

Leu Thr Val

GCA UUC AAG Ala Ph-e Lys

AUU GUU ACA

Ile Val Thr

AAU UCU GAA

Asn Ser Glu

GGC AUA AUC Gly Ile Ile

ACC CCA AAA Thr Pro Lys

UCA UUA GUU Ser Leu Val

GUC CAC AAU

Val His Asn

CCU UUG GCA Pro Leu Ala

AUG AUG AAG Met Met Lys

GUA GCA GCU

Val Ala Ala

GCU CAU CAA Ala His Gin

GAU AUC AGG Asp Ile Arg

GGU GGU GAA Gly Gly Glu

GGU CUU UCA Gly Leu Ser

GGA GGU ACA Gly Gly Thr

CAU GGA CCC His Gly Pro

GGG AAA GGA Gly Lys Gly

CUU UUC UUC Leu Phe Phe

ACC CGG GCA Thr Arg Ala

CGG

AUC

UCU

CUU

GAA

CCA

GCA

CCG

CAU

AUG

GUU

AAA

UGG

AUC

AGG

Arg

Ile

Ser

Leu

Glu

Pro

Ala

Pro

His

Met

Val

Lys

Trp

Ile

Arg

GUA

CUC

UAC

UCU

GAC

UUU

UCU

GCA

UUU

UCA

AGG

GAC

CAA

GAA

UAU

Val

Leu

Tyr

Ser

Asp

Phe

Ser

Ala

Phe

Ser

Arg

Asp

Gin

Glu

Tyr

CUG

AUU

UCG

AAG

GAG

AAA

ACU

UUU

GAU

UAC

GUU

GAA

GGA

UUU

GUG

Leu

Ile

Ser

Lys

Glu

Lys

Thr

Phe

Asp

Tyr

Val

Glu

Gly

Phe

Val

AUA

AUC

AAU

AGA

ACA

GAC

CUU

CUC

AAU

AAU

UGG

CGA

UCG

UCA

UUC

Ile

Ile

Asn

Arg

Thr

Asp

Leu

Leu

Asn

Asn

Trp

Arg

Ser

Ser

Phe

AGU

CCC

AAC

GAU

UCC

ACA

CAG

GCA

AGC

AGA

UUC

AAG

UCA

GAU

GGG

Ser

Pro

Asn

Asp

Ser

Thr

Gin

Ala

Ser

Arg

Phe

Lys

Ser

Asp

Gly

AAA

ACU

CUU

UAU

UGC

CUA

GAA

GUG

GUC

AAA

UAU

UUC

AAC

CCA

GAA

Lys

Thr

Leu

Tyr

Cys

Leu

Glu

Val

Val

Lys

Tyr

Phe

Asn

Pro

Glu

GAA

GCU

AGC

UCU

AUG

GAU

CAG

GAA

ACU

GGC

AAG

UUA

CUU

GCA

GAG

Glu

Ala

Ser

Ser

Met

Asp

Gin

Glu

Thr

Gly

Lys

Leu

Leu

Ser

Glu

UUA

AAU

UAU

AUU

CCA

UCC

ACU

UUG

UUU

UCA

UCU

GAA

GUG

CCA

UAU

Leu

Asn

Tyr

Ile

Pro

Ser

Thr

Leu

Phe

Ser

Ser

Glu

Val

Pro

Tyr

AUC

GAG

UUU

CUG

GAU

CGC

GUG

CAU

AUC

GCA

GAG

AGA

AAA

CUA

AGA

Ile

Glu

Phe

Leu

Asp

Arg

Val

His

Ile

Ala

Glu

Arg

Lys

Leu

Arg

GCA

AAG

GGU

UUA

UGG

GAG

GUU

CCA

CAU

CCC

UGG

CUG

AAU

CUC

CUG

Ala

Lys

Gly

Leu

Trp

Glu

Val

Pro

His

Pro

Trp

Leu

Asn

Leu

Leu

AUU

CCU

AAG

AGC

AGC

AUA

UAC

CAA

UUU

GCU

ACA

GAA

GUU

UUC

AAC

Ile

Pro

Lys

Ser

Ser

Ile

Tyr

Gin

Phe

Ala

Thr

Glu

Val

Phe

Asn

AAC

AUU

CUC

ACA

AGC

AAC

AAC

AAC

GGU

CCU

AUC

CUU

AUU

UAU

CCA

Asn

Ile

Leu

Thr

Ser

Asn

Asn

Asn

Gly

Pro

lite

Leu

Ile

Tyr

Pro

GUC

AAU

CAA

UCC

AAG

UGG

AAG

AAA

CAU

ACA

UCU

UUG

AUA

ACU

CCA

Val

Asn

Gin

Ser

Lys

Trp

Lys

Lys

His

Thr

Ser

Leu

Ile

Thr

Pro

AAU

GAA

GAU

AUA

UUC

UAU

CUC

GUA

GCC

UUU

CUC

CCC

UCU

GCA

GUG

Asn

Glu

Asp

Ile

Phe

Tyr

Leu

Val

Ala

Phe

Leu

Pro

Ser

Ala

Val

CCA

AAU

UCC

UCA

GGG

AAA

AAC

GAU

CUA

GAG

UAC

CUU

UUG

AAA

CAA

Pro

Asn

Ser

Ser

Gly

Lys

Asn

Asp

Leu

Glu

Tyr

Leu

Leu

Lys

Gin

AAC CAA AGA GUU AUG AAC UUC Asn Gin Arg Val Met Asn Phe

AAG CAG UAU UUG CCC CAU UAU Lys Gin Tyr Leu Pro His Tyr

CAC UUU GGC AAA AGA UGG GAA His Phe Gly Lys Arg Trp Glu

UAC GAC CCU CUA GCG AUU CUA Tyr Asp Pro Leu Ala Ile Leu

AAG ACA ACA GGA AAA UUA UCU Lys Thr Thr Gly Lys Leu Ser

GCA ACA GGA AGU CCU CAA AGG Ala Thr Gly Ser Pro Gin Arg

AAA CCU AGA ACU GUA UAA Lys Pro Arg Thr Val End

UGC GCA GCA GCA AAC CUC AAC GUG

Cys Ala Ala Ala Asn Leu Asn Val

GAA ACU CAA AAA GAG UGG AAA UCA

Glu Thr Gin Lys Glu Trp Lys Ser

ACA UUU GCA CAG AGG AAA CAA GCC

Thr Phe Ala Gin Arg Lys Gin Ala

GCA CCU GGC CAA AGA AUA UUC CAA

Ala Pro Gly Gin Arg Ile Phe Gin

CCC AUC CAA CUC GCA AAG UCA AAG

Pro Ile Gin Leu Ala Lys Ser Lys

UAC CAU UAC GCA UCA AUA CUG CCG

Tyr His Tyr Ala Ser Ile Leu Pro

V jiném výhodném provedení expresní kazeta obsahuje: β-glukosidasový promotor::AtCKXl apoplastická: :NOS terminátor, a má sekvenci s alespoň 80% identitou, s výhodou s alespoň 90% identitou, výhodněji s alespoň 95% identitou k sekvenci SEQ ID NO. 5.

SEQ ID NO. 5:

Pozice jednotlivých funkčních úseků: β-glukosidasový promotor : 68 bp - 968 bp Apoplastická signální sekvence: 999 bp - 1067 bp AtCKXl (bez zahrnutí signální sekvence): 1068 bp - 2684 bp

NOS terminátor: 2712 bp - 2965 bp

....1....1 ....1....1 ....1....1 ....1....1 ,...1....1 .,,.1....1 -----

10	20	30	40	50	60	70	80	90	100
ACAAGTTTGT .	ACAAAAAAGC .	AGGCTTTAAA	GGAACCAATT	CAGTCGACTG	GATCCGGTAC	CGAATTCCAA AGCTGCCGCA	TTCGGCAAAG	CCTGCAATTC
.... i ! 110	. ... 1 .... í 120	. ... t .... 1 130	. ... 1 .... 1 140	. ... i .... 1 150	160	. ... 1 .... í 170	. ... f .... 1 180	....1....1 190	200
CGGTAGTGTT	TTACCACGTT	GACAAAAAAA	ATGAAGAAAT	CCGATATTTT	AGTCATTATG	GATATGGCGC	GGTGTCAAAT	CGGTATAGTC .	ATAATCCTTT
.... í .... 1 210	....i....! 220	.... 1 .... í 230	. ... i .... | 240	. ... 1 .... 1 250	....1,...1 260	. ... 1 .... ! 270	. ... 1 .... 1 280	290	. ... í .... i 300

CCATAGGATT GTCCCATGCT CGACACATTA ACACTAAGTT TATCCCTGAA TAACACGGCT ACCTCCATCC TAATCTTTTC TATTGATCAA TTGCCTATTT

-8CZ 304935 B6

....1....1 ....1....1 ....1....1 ....1....1 ....1....1 ....1....1 ....1....1 ....1....1 ....1....1 ....1....1

310 320 330 340 350 360 370 380 390 400

TTAAGGCGCA GTTGTTCTTG GCCGTATCTG TGGAGATGAT TTTTTTAAAG ACGTCCAACT CTAGCTAGCT AGTCCGTGTA TGTGAACGGT GTTAGGTAGT

....1....( ....1...,( ....1....1 ....1....( ....(....I ....I....I ....I....I ....I....I ....I....I ....I....I

410 420 430 440 450 460 470 480 490 500

CATTGGATCG GTTGACTATA TTTGTAAAGG TGGTAGCCGT TCTTTTTAAT TTTAACGCCG CTGGGAAGAA ATTAAACGTG GTACATCTAT GTATCGTTTT

....1....( ....(....( ....(....1 ....(....I ....(....I ....1....( ....1....I ....1....1 ....1....1 ....I....I

510 520 530 540 550 560 570 580 590 600

CTTAACAGTG ATATAATAAT ATACTATCAT TGCAAGCGTC CGCAATTGCT CTCTCGCGGC TCGTTCTACC GTGGGAAGAA GAGCTGACCC GTCGCCGCCC

....1....1 ....1....1 ....1....1 ,...1....1 ....1....1 ....I....I I ....I....! ....I....I ....I....I

610 620 630 640 650 660 670 680 690 700

CACATGCATA CGATGCGTCC TTATCTGTCG CGGCTCGTGC AAACGCGGGG CGGGCTGAGC GCCCCAGCCC ACCACTTGCA CCACTTGCAT TTACTTAATT

710 720 730 740 750 760 770 780 790 800

AGTTCATAAC ACATCACATC TGTATCTTAC ATTATCTTTA AAAAAATGAT TCACACATTA TTTATATATG AGATATAATA AGTTTCCAGG AAGCATCTTT

....I....I ....I....I ....I....I ....I....I ....1....( ....(....I ....1....( ....I....I ....I....I ....I....I

810 820 830 840 850 860 870 880 890 900

GGCGACTTAC GTACGTGTAT CAGAGACAIG GAGTGATAAA CTATTGGGCA ACCATTTAGC AATCCTAGCT AGCCAGCTCG TCTATAAATA GATGCATCAG

910 920 930 940 950 960 970 980 990 1000

CTCCACTTGG TCTACACACT TCACAAGCAG CTCAAAGCTC TAGTTCTAGC TAGCTAGCAA AGGGGGGGAA AGGTACCGTC GACAGATCTA TGGCTTCGAA

....I ....1....( ....1....( ....1....I ....I....I ....(....1 ....(....I ....I....I ....I....I....I ....I....I

1010 1020 1030 1040 1050 1060 1070 1080 1090 1100

TCTTCGTTTA ATGATCACTT TAATCACGGT TTTAATGATC ACCAAATCAT CAAACGGCAT GCTTTCGAAT CATTCTGTTA GTACCCCAAA AGAATTACCT

....I....I ....1....( ....I....I ....I....I ....I....I ....(...., ....I....I ....I....I ....I....I ....I....I

1110 1120 1130 1140 1150 1160 1170 1180 1190 1200

TCTTCAAATC CTTCAGATAT TCGTTCCTCA TTAGTTTCAC TAGATTTGGA GGGTTATATA AGCTTCGACG ATGTCCACAA TGTGGCCAAG GACTTTGGCA

....I....I i ....1....( ....(....I ....1....( ....I....I ..,.1....1 ....I....I ....I....I ....(....I

1210 1220 1230 1240 1250 1260 1270 1280 1290 1300

ACAGATACCA GTTACCACCT TTGGCAATTC TACATCCAAG GTCAGTTTTT GATATTTCAT CGATGATGAA GCATATAGTA CATCTGGGCT CCACCTCAAA

....1....1 ....1....( ....I....I ....1....( ....I....I ....(....( ....1....1 ....I....I

1310 1320 1330 1340 1350 1360 1370 1380 1390 1400

TCTTACAGTA GCAGCTAGAG GCCATGGTCA CTCGCTTCAA GGACAAGCTC TAGCTCATCA AGGTGTTGTC ATCAAAATGG AGTCACTACG AAGTCCTGAT

....1....1 ....1....1 ....1....( ....1....1 ....(....1 ....1......(..,.[ ....I....I ....I....I ....I....I

1410 1420 1430 1440 1450 1460 1470 1480 1490 1500

ATTAGGATTT ATAAGGGGAA GCAACCATAT GTTGATGTCT CAGGTGGTGA AATATGGATA AACATTCTAC GCGAGACTCT AAAAIACGGT CTTTCACCAA

1510 1520 1530 1540 1550 1560 1570 1580 1590 1600

AGTCCTGGAC AGACTACCTT CATTTGACCG TTGGAGGTAC ACTATCTAAT GCTGGAATCA GCGGTCAAGC ATTCAAGCAT GGACCCCAAA TCAACAACGT

....1....1 ....1....1 ....1....( ....1....( ....(....I ....1....1 .,..1..,.( ....1....( I ....I....I

1610 1620 1630 1640 1650 1660 1670 1680 1690 1700

CTACCAGCTA GAGATTGTTA CAGGGAAAGG AGAAGTCGTA ACCTGTTCTG AGAAGCGGAA CTCTGAACTT TTCTTCAGTG TTCTTGGCGG GCTTGGACAG

1710 1720 1730 1740 1750 1760 1770 1780 1790 1800

TTTGGCATAA TCACCCGGGC ACGGATCTCT CTTGAACCAG CACCGCATAT GGTTAAATGG ATCAGGGTAC TCTACTCTGA CTTTTCTGCA TTTTCAAGGG

1810 1820 1830 1840 1850 1860 1870 1880 1890 1900

ACCAAGAATA TCTGATTTCA AAGGAGAAAA CTTTTGATTA CGTTGAAGGA TTTGTGATAA TCAATAGAAC AGACCTTCTC AATAATTGGC GATCGTCATT

....1....1 ....1....1 ....1....( ....1....( ....I....I ....I....I ....I....I ....I....! ...,1....( ....I....I

1910 1920 1930 1940 1950 1960 1970 1980 1990 2000

CAGTCCCAAC GATTCCACAC AGGCAAGCAG ATTCAAGTCA GATGGGAAAA CTCTTTATTG CCTAGAAGTG GTCAAATATT TCAACCCAGA AGAAGCTAGC

-9CZ 304935 B6

....(....I ....1....1 ....1....1 ....1....1 ....1....1 ....ι....! ....[....I ....1....1 ....1....1

2010 2020 2030 2040 2050 2060 2070 2080 2090 2100

TCTATGGATC AGGAAACTGG CAAGTTACTT TCAGAGTTAA ATTATATTCC ATCCACTTTG TTTTCATCTG AAGTGCCATA TATCGAGTTT CTGGATCGCG

2110 2120 2130 2140 2150 2160 2170 2180 2190 2200

TGCATATCGC AGAGAGAAAA CTAAGAGCAA AGGGTTTATG GGAGGTTCCA CATCCCTGGC TGAATCTCCT GATTCCTAAG AGCAGCATAT ACCAATTTGC

....1....1 ....[....I | ..,.1....( ....1....1 ..,.1....1 ....1....1

2210 2220 2230 2240 2250 2260 2270 2280 2290 2300

TACAGAAGTT TTCAACAACA TTCTCACAAG CAACAACAAC GGTCCTATCC TTATTTATCC AGTCAATCAA TCCAAGTGGA AGAAACATAC ATCTTTGATA

2310 2320 2330 2340 2350 2360 2370 2380 2390 2400

ACTCCAAATG AAGATATATT CTATCTCGTA GCCTTTCTCC CCTCTGCAGT GCCAAATTCC TCAGGGAAAA ACGATCTTGA GTACCTTTTG AAACAAAACC

....1...,1 ....I....! ....1....1 1

2410 2420 2430 2440 2450 2460 2470 2480 2490 2500

AAAGAGTTAT GAACTTCTGC GCAGCAGCAA ACCTCAACGT GAAGCAGTAT TTGCCCCATT ATGAAACTCA AAAAGAGTGG AAATCACACT TTGGCAAAAG

....(....( ....(,...1 i | ....1....( ....1....1 I ....1....1 ....1....( ....1.,..1

2510 2520 2530 2540 2550 2560 2570 2580 2590 2600

ATGGGAAACA TTTGCACAGA GGAAACAAGC CTACGACCCT CTAGCGATTC TAGCACCTGG CCAAAGAATA TTCCAAAAGA CAACAGGAAA ATTATCTCCC

.. ....1....( I ....[....I ....(....i ....(....I

2610 2620 2630 2640 2650 2660 2670 26B0 2690 2700

ATCCAACTCG CAAAGTCAAA GGCAACAGGA AGTCCTCAAA GGTATCATTA CGCATCAATA CTGCCGAAAC CTAGAACTGT ATAAGTCGAC TCGAGTCTAG

2710 2720 2730 2740 2750 2760 2770 2780 2790 2800

AAGTCGAAGC AGATCGTTCA AACATTTGGC AATAAAGTTT CTTAAGATTG AATCCTGTTG CCGGTCTTGC GATGATTATC ATATAATTTC TGTTGAATTA

....(....( ....1....1 I ....1....( ...-(....I ....1....( ....1....1 ....(....1 ,...(....(

2810 2820 2830 2840 2850 2860 2870 2880 2890 2900

CGTTAAGCAT GTAATAATTA ACATGTAATG CATGACGTTA TTTATGAGAT GGGTTTTTAT GATTAGAGTC CCGCAATTAT ACATTTAATA CGCGATAGAA

2910 2920 2930 2940 2950 2960 2970 2980 2990 3000

AACAAAATAT AGCGCGCAAA CTAGGATAAA TTATCGCGCG CGGTGTCATC TATGTTACTA GATCGACCGG CAAGCAAGCT GATATGCGGC CGCACTCGAG

....(....I ....1....1 ....1....1 ....1.,..1 ....i....! 1 .,..1....1 .,..1....1

3010 3020 3030 3040 3050 3060 3070 3080 3090 3100

ATATCTAGAC CCAGCTTTCT TGTACAAAGT GGTTGATGGG CTGCAGGAAT TCGATATCAA GCTTATCGAT ACCGTCGACC TCGAGGGGGA TCACCACTTT

3110

GTACAAGAAA GCTG

Protein AtCKXl apoplastická (557 aminokyselin, SEQ ID NO. 8)

AUG

AUC

ACU

UUA

AUC

ACG

GUU

UUA

AUG

AUC

ACC

AAA

UCA

UCA

AAC

Met

Ile

Thr

Leu

Ile

Thr

Val

Leu

Met

Ile

Thr

Lys

Ser

Ser

Asn

GGC

AUG

CUU

UCG

AAU

CAU

UCU

GUU

AGU

ACC

CCA

AAA

GAA

UUA

CCU

Gly

Met

Leu

Ser

Asn

His

Ser

Val

Ser

Thr

Pro

Lys

Glu

Leu

Pro

UCU

UCA

AAU

CCU

UCA

GAU

AUU

CGU

UCC

UCA

UUA

GUU

UCA

CUA

GAU

Ser

Ser

Asn

Pro

Ser

Asp

Ile

Arg

Ser

Ser

Leu

Val

Ser

Leu

Asp

UUG

GAG

GGU

UAU

AUA

AGC

UUC

GAC

GAU

GUC

CAC

AAU

GUG

GCC

AAG

Leu

Glu

Gly

Tyr

Ile

Ser

Phe

Asp

Asp

Val

His

Asn

Val

Ala

Lys

- 10CZ 304935 B6

GAC UUU GGC PAC AGA Asp Phe Gly Asn Arg

CCA AGG UCA GUU UUU Pro Arg Ser Val Phe

CAU CUG GGC UCC ACC His Leu Gly Ser Thr

GGU CAC UCG CUU CAA Gly His Ser Leu Gin

AUC AAA AUG GAG UCA Ile Lys Met Glu Ser

GGG AAG CAA CCA UAU Gly Lys Gin Pro Tyr

AAC AUU CUA CGC GAG Asn Ile Leu Arg Glu

UGG ACA GAC UAC CUU Trp Thr Asp Tyr Leu

GCU GGA AUC AGC GGU Ala Gly Ile Ser Gly

AAC GUC UAC CAG CUA Asn Val Tyr Gin Leu

ACC UGU UCU GAG AAG Thr Cys Ser Glu Lys

GGC GGG CUU GGA CAG Gly Gly Leu Gly Gin

CUU GAA CCA GCA CCG

Leu Glu Pro Ala Pro

UCU GAC UUU UCU GCA Ser Asp Phe Ser Ala

AAG GAG AAA ACU UUU Lys Glu Lys Thr Phe

UAC CAG UUA CCA CCU Tyr Gin Leu Pro Pro

GAU AUU UCA UCG AUG Asp Ile Ser Ser Met

UCA AAU CUU ACA GUA

Ser Asn Leu Thr Val

GGA CAA GCU CUA GCU Gly Gin Ala Leu Ala

CUA CGA AGU CCU GAU Leu Arg Ser Pro Asp

GUU GAU GUC UCA GGU Val Asp Val Ser Gly

ACU CUA AAA UAC GGU Thr Leu Lys Tyr Gly

CAU UUG ACC GUU GGA His Leu Thr Val Gly

CAA GCA UUC AAG CAU Gin Ala Phe Lys His

GAG AUU GUU ACA GGG Glu Ile Val Thr Gly

CGG AAC UCU GAA CUU Arg Asn Ser Glu Leu

UUU GGC AUA AUC ACC Phe Gly Ile Ile Thr

CAU AUG GUU AAA UGG His Met Val Lys Trp

UUU UCA AGG GAC CAA Phe Ser Arg Asp Gin

GAU UAC GUU GAA GGA Asp Tyr Val Glu Gly

UUG GCA AUU CUA CAU

Leu Ala Ile Leu His

AUG AAG CAU AUA GUA Met Lys His Ile Val

GCA GCU AGA GGC CAU Ala Ala Arg Gly His

CAU CAA GGU GUU GUC His Gin Gly Val Val

AUU AGG AUU UAU AAG Ile Arg Ile Tyr Lys

GGU GAA AUA UGG AUA Gly Glu Ile Trp Ile

CUU UCA CCA AAG UCC Leu Ser Pro Lys Ser

GGU ACA CUA UCU AAU Gly Thr Leu Ser Asn

GGA CCC CAA AUC AAC Gly Pro Gin Ile Asn

AAA GGA GAA GUC GUA Lys Gly Glu Val Val

UUC UUC AGU GUU CUU

Phe Phe Ser Val Leu

CGG GCA CGG AUC UCU Arg Ala Arg Ile Ser

AUC AGG GUA CUC UAC Ile Arg Val Leu Tyr

GAA UAU CUG AUU UCA Glu Tyr Leu Ile Ser

UUU GUG AUA AUC AAU

Phe Val Ile Ile Asn

- 11 CZ 304935 B6

AGA ACA GAC CUU CUC AAU AAU UGG

Arg Thr Asp Leu Leu Asn Asn Trp

GAU UCC ACA CAG GCA AGC AGA DUC

Asp Ser Thr Gin Ala Ser Arg Phe

UAU UGC CUA GAA GUG GUC AAA UAU

Tyr Cys Leu Glu Val Val Lys Tyr

UCU AUG GAU CAG GAA ACU GGC AAG

Ser Met Asp Gin Glu Thr Gly Lys

AUU CCA UCC ACU UUG UUU UCA UCU

Ile Pro Ser Thr Leu Phe Ser Ser

CUG GAU CGC GUG CAU AUC GCA GAG

Leu Asp Arg Val His Ile Ala Glu

UUA UGG GAG GUU CCA CAU CCC UGG

Leu Trp Glu Val Pro His Pro Trp

AGC AGC AUA UAC CAA UUU GCU ACA

Ser Ser Ile Tyr Gin Phe Ala Thr

ACA AGC AAC AAC AAC GGU CCU AUC

Thr Ser Asn Asn Asn Gly Pro Ile

UCC AAG UGG AAG AAA CAU ACA UCU

Ser Lys Trp Lys Lys His Thr Ser

AUA UUC UAU CUC GUA GCC UUU CUC

Ile Phe Tyr Leu Val Ala Phe Leu

UCA GGG AAA AAC GAU CUU GAG UAC

Ser Gly Lys Asn Asp Leu Glu Tyr

GUU AUG AAC UUC UGC GCA GCA GCA

Val Met Asn Phe Cys Ala Ala Ala

UUG CCC CAU UAU GAA ACU CAA AAA

Leu Pro His Tyr Glu Thr Gin Lys

AAA AGA UGG GAA ACA UUU GCA CAG

Lys Arg Trp Glu Thr Phe Ala Gin

CGA UCG UCA UUC AGU CCC AAC Arg Ser Ser Phe Ser Pro Asn

AAG UCA GAU GGG AAA ACU CUU Lys Ser Asp Gly Lys Thr Leu

UUC AAC CCA GAA GAA GCU AGC

Phe Asn Pro Glu Glu Ala Ser

UUA CUU UCA GAG UUA AAU UAU Leu Leu Ser Glu Leu Asn Tyr

GAA GUG CCA UAU AUC GAG UUU Glu Val Pro Tyr Ile Glu Phe

AGA AAA CUA AGA GCA AAG GGU Arg Lys Leu Arg Ala Lys Gly

CUG AAU CUC CUG AUU CCU AAG Leu Asn Leu Leu Ile Pro Lys

GAA GUU UUC AAC AAC AUU CUC

Glu Val Phe Asn Asn Ile Leu

CUU AUU UAU CCA GUC AAU CAA Leu Ile Tyr Pro Val Asn Gin

UUG AUA ACU CCA AAU GAA GAU Leu Ile Thr Pro Asn Glu Asp

CCC UCU GCA GUG CCA AAU UCC

Pro Ser Ala Val Pro Asn Ser

CUU UUG AAA CAA AAC CAA AGA Leu Leu Lys Gin Asn Gin Arg

AAC CUC AAC GUG AAG CAG UAU Asn Leu Asn Val Lys Gin Tyr

GAG UGG AAA UCA CAC UUU GGC Glu Trp Lys Ser His Phe Gly

AGG AAA CAA GCC UAC GAC CCU Arg Lys Gin Ala Tyr Asp Pro

- 12CZ 304935 B6

CUA

GCG

AUU

CUA

GCA

CCU

GGC

CAA

AGA

AUA

UUC

CAA

AAG

ACA

ACA

Leu

Ala

Ile

Leu

Ala

Pro

Gly

Gin

Arg

Ile

Phe

Gin

Lys

Thr

Thr

GGA

AAA

UUA

UCU

CCC

AUC

CAA

CUC

GCA

AAG

UCA

AAG

GCA

ACA

GGA

Gly

Lys

Leu

Ser

Pro

Ile

Gin

Leu

Ala

Lys

Ser

Lys

Ala

Thr

Gly

AGU

CCU

CAA

AGG

UAU

CAU

UAC

GCA

UCA

AUA

CUG

CCG

AAA

CCU

AGA

Ser

Pro

Gin

Arg

Tyr

His

Tyr

Ala

Ser

Ile

Leu

Pro

Lys

Pro

Arg

ACU GUA UAA

Thr Val End

V dalším výhodném provedení expresní kazeta obsahuje: β-glukosidasový promotor: :AtCKXl cytosolická::NOS terminátor, a má sekvenci s alespoň 80% identitou, s výhodou s alespoň 90% identitou, výhodněji s alespoň 95% identitou k sekvenci SEQ ID NO. 6.

SEQ ID NO. 6:

Pozice jednotlivých funkčních úseků:

β-glukosidasový promotor : 68 bp - 968 bp

AtCKXHjovz zahrnutí signální sekvence): 999 bp - 2615 bp

NOS terminátor: 2643 bp - 2896 bp

....1....( ....1....1 ....1....| ....I....I ....I....I ....I....I ....I....I ....I....! ,...1....1

20 30 40 50 60 70 80 90 100 ňCAAGTTTGT ACAAAAAAOC AGGCTTTAAA GGAACCAATT CAGTCGACTG GATCCGGTAC CGAATTCCAA AGCTGCCGCA TTCGGCAAAG CCTGCAATTC

....I....! ....1...,1 ....1.,..1 ....I....I ....1...,I ....1....( ....I....I | ....1....( ....1....i

110 120 130 140 150 160 170 180 190 200

CGGTAGTGTT TTACCACGTT GACAAAAAAA ATGAAGAAAT CCGATATTTT AGTCATTATG GATAIGGCGC GGTGTCAAAT CGGTATAGTC ATAATCCTTT

.... I.... I .... i.... i .... i.... I .... i.... i .... i.... i .... I.... I .... I.... I .... I.... I .... i.... i .... i.... i

210 220 230 240 250 260 270 280 290 300

CCATAGGATT GTCCCATGCT CGACACATTA ACACTAAGTT TATCCCTGAA TAACACGGCT ACCTCCATCC TAATCTTTTC TATTGATCAA TTGCCTATTT

....1....1 ....1....1 ....1....1 ..,,1....1 ....1....( ....I....I I I ....1..,.| ....I....I

310 320 330 340 350 360 370 380 390 400

TTAAGGCGCA GTTGTTCTTG GCCGTATCTG TGGAGATGAT TTTTTTAAAG ACGTCCAACT CTAGCTAGCT AGTCCGTGTA TGTGAACGGT GTTAGGTAGT

--..1....1 ....1....1 ....1..,.I ....I....I ....1...,1 ....1...,1 ....1....1 ....I....I ....I....I ....I....1

410 420 430 440 450 460 470 480 490 500

CATTGGATCC GTTGACTATA TTTGTAAAGG TGGTAGCCGT TCTTTTTAAT TTTAACGCCG CTGGGAAGAA ATTAAACGTG GTACATCTAT GTATCGTTTT

....1....1 ....1....( ....1....1 ....(....I ....1,..,1 ....I....I ....I....I ....I.,..! ....(....1 ....I....I

510 520 530 540 550 560 570 580 590 600

CTTAACAGTG ATATAATAAT ATACTATCAT TGCAAGCGTC CGCAATTGCT CTCTCGCGGC TCGTTCTACC GTGGGAAGAA GAGCTGACCC GTCGCCGCCC ····1....1 ....1....1 ....1..,,1 ....1....1 ....I....I ....1....I ....I....1 ....I....I ....I....I ....I....I

610 620 630 640 650 660 670 680 690 700

CACATGCATA CGATGCGTCC TTATCTGTCG CGGCTCGTGC AAACGCGGGG CGGGCTGAGC GCCCCAGCCC ACCACTTGCA CCACTTGCAT TTACTTAATT

- 13 CZ 304935 B6

710 720 730 740 750 760 770 780 790 800

AGTTCATAAC ACATCACATC TGTATCTTAC ATTATCTTTA AAAAAATGAT TCACACATTA TTTATATATG AGATATAATA AGTTTCCAGG AAGCATCTTT

....1....( ....1....( ....(....i ....(....i .,..1....( ....(....I ....(....1

810 820 830 840 850 860 870 880 890 900

GGCGACTTAC GTACGTGTAT CAGAGACATG GAGTGATAAA CTATTGGGCA ACCATTTAGC AATCCTAGCT AGCCAGCTCG TCTATAAATA GATGCATCAG

910 920 930 940 950 960 970 980 990 1000

CTCCACTTGG TCTACACACT TCACAAGCAG CTCAAAGCTC TAGTTCTAGC TAGCTAGCAA AGGGGGGGAA AGGTACCGTC GACAGATCTA TGGCTTCGAA

....(....i ....(....i ....(....i | ....(....I ....(....I ....(....I f ....(....I

1010 1020 1030 1040 1050 1060 1070 1080 1090 1100

TCATTCTGTT AGTACCCCAA AAGAATTACC TTCTTCAAAT CCTTCAGATA TTCGTTCCTC ATTAGTTTCA CTAGATTTGG AGGGTTATAT AAGCTTCGAC

1110 1120 1130 1140 1150 1160 1170 1180 1190 1200

GATGTCCACA ATGTGGCCAA GGACTTTGGC AACAGATACC AGTTACCACC TTTGGCAATT CTACATCCAA GGTCAGTTTT TGATATTTCA TCGATGATGA

....(....( ....(....I ....1....( ....(....( ....1....( ....(....i ....(....( ....(....I ....(....i

1210 1220 1230 1240 1250 1260 1270 1280 1290 1300

AGCATATAGT ACATCTGGGC TCCACCTCAA ATCTTACAGT AGCAGCTAGA GGCCATGGTC ACTCGCTTCA AGGACAAGCT CTAGCTCATC AAGGTGTTGT

-...(....I ....(....I ....(....i ....(....I ....I....I -...I....1 ....(....I ....(....( ....(....i ....I....I

1310 1320 1330 1340 1350 1360 1370 1380 1390 1400

CATCAAAATG GAGTCACTAC GAAGTCCTGA TATTAGGATT TATAAGGGGA AGCAACCATA TGTTGATGTC TCAGGTGGTG AAATATGGAT AAACATTCTA

1410 1420 1430 1440 1450 1460 1470 1480 1490 1500

CGCGAGACTC TAAAATACGG TCTTTCACCA AAGTCCTGGA CAGACTACCT TCATTTGACC GTTGGAGGTA CACTATCTAA TGCTGGAATC AGCGGTCAAG

....(....i ....(....i ....1....( ....(....( ....(....I ....(....( ....(....( ....(....i ....(....I

1510 1520 1530 1540 1550 1560 1570 1580 1590 1600

CATTCAAGCA TGGACCCCAA ATCAACAACG TCTACCAGCT AGAGATTGTT ACAGGGAAAG GAGAAGTCGT AACCTGTTCT GAGAAGCGGA ACTCTGAACT

....(....( ....1....1 ....1....( ....(.,..( ....(..,.1 ....1....( ....I.... I ....(....I

1610 1620 1630 1640 1650 1660 1670 1680 1690 1700

TTTCTTCAGT GTTCTTGGCG GGCTTGGACA GTTTGGCATA ATCACCCGGG CACGGATCTC TCTTGAACCA GCACCGCATA TGGTTAAATG GATCAGGGTA

....(....I ....(....I ....1....( ....(....( ....(....( ....(....I ....(....i ....(....i -I

1710 1720 1730 1740 1750 1760 1770 1780 1790 1800

CTCTACTCTG ACTTTTCTGC ATTTTCAAGG GACCAAGAAT ATCTGATTTC AAAGGAGAAA ACTTTTGATT ACGTTGAAGG ATTTGTGATA ATCAATAGAA

....(....i ....(....I ....(....I ....(....I S ....1....( ....(,...( ....(....I ....I....!

1810 1820 1830 1840 1850 1860 1870 1880 1890 1900

CAGACCTTCT CAATAATTGG CGATCGTCAT TCAGTCCCAA CGATTCCACA CAGGCAAGCA GATTCAAGTC AGATGGGAAA ACTCTTTATT GCCTAGAAGT

....(.,..( ....(....i ....(....I ....i....! ....(....i ....(....1 ....(..,.(

1910 1920 1930 1940 1950 1960 1970 1980 1990 2000

GGTCAAATAT TTCAACCCAG AAGAAGCTAG CTCTATGGAT CAGGAAACTG GCAAGTTftCT TTCAGAGTTA AATTATATTC CATCCACTTT GTTTTCATCT

....1....( ....(....I ....(....( ....(....I ....1....( ....1....( ....1....( ....(....I

2010 2020 2030 2040 2050 2060 2070 2080 2090 2100

GAAGTGCCAT ATATCGAGTT TCTGGATCGC GTGCATATCG CAGAGAGAAA ACTAAGAGCA AAGGGTTTAT GGGAGGTTCC ACATCCCTGG CTGAATCTCC

....(....I ..,.1....( ....(....( ....(....( ....(....ι ....(....I ..-.(....i ....(....I

2110 2120 2130 2140 2150 2160 2170 2180 2190 2200

TGATTCCTAA GAGCAGCATA TACCAATTTG CTACAGAAGT TTTCAACAAC ATTCTCACAA GCAACAACAA CGGTCCTATC CTTATTTATC CAGTCAATCA

....(....i ....(....I ....(....I ....(....( ....(....i ....(....( ....(....i ....(....I ....(...,(

2210 2220 2230 2240 2250 2260 2270 2280 2290 2300

ATCCAAGTGG AAGAAACATA CATCTTTGAT AACTCCAAAT GAAGATATAT TCTATCTCGT AGCCTTTCTC CCCTCTGCAG TGCCAAATTC CTCAGGGAAA

- 14CZ 304935 B6

....1....1 ....(....i ....1....1 ....I....} ....1....1 ....(....( ....{....I ....1....( ....(....I

2310 2320 2330 2340 2350 2360 2370 2380 2390 2400

AACGATCTTG AGTACCTTTT GAAACAAAAC CAAAGAGTTA TGAACTTCTG CGCAGCAGCA AACCTCAACG TGAAGCAGTA TTTGCCCCAT TATGAAACTC

....1....1 ....1,...1 .,..1..,.1 ....i....i I ....1....J ....5....1

2410 2420 2430 2440 2450 2460 2470 2480 2490 2500

AAAAAGAGTG GAAATCACAC TTTGGCAAAA GATGGGAAAC ATTTGCACAG AGGAAACAAG CCTACGACCC TCTAGCGATT CTAGCACCTG GCCAAAGAAT

....(....1 ....1....( ........(....i i ....i....i ....(....i

2510 2520 2530 2540 2550 2560 2570 2580 2590 2600

ATTCCAAAAG ACAACAGGAA AATTATCTCC CATCCAACTC GCAAAGTCAA AGGCAACAGG AAGTCCTCAA AGGTATCATT ACGCATCAAT ACTGCCGAAA

....(....i ....(....I ....I....! ....(....1 ....(....i I ....1....( ....(....I I

2610 2620 2630 2640 2650 2660 2670 2680 2690 2700

CCTAGAACTG TATAAGTCGA CTCGAGTCTA GAAGTCGAAG CAGATCGTTC AAACATTTGG CAATAAAGTT TCTTAAGATT GAATCCTGTT GCCGGTCTTG

2710 2720 2730 2740 2750 2760 2770 2780 2790 2800

CGATGATTAT CATATAATTT CTGTTGAATT ACGTTAAGCA TGTAATAATT AACATGTAAT GCATGACGTT ATTTATGAGA TGGGTTTTTA TGATTAGAGT

....(....I ....1....( ....(....I ....1....( ....(....1 ....1,...( ....(....I ....(....i ....(....1

2810 2820 2830 2840 2850 2860 2870 2880 2890 2900

CCCGCAATTA TACATTTAAT ACGCGATAGA AAACAAAATA TAGCGCGCAA ACTAGGATAA ATTATCGCGC GCGGTGTCAT CTATGTTACT AGATCGACCG

....1....( ....(....I t ....(....I

2910 2920 2930 2940 2950 2960 2970 2980 2990 3000

GCAAGCAAGC TGATATGCGG CCGCACTCGA GATATCTAGA CCCAGCTTTC TTGTACAAAG TGGTTGATGG GCTGCAGGAA TTCGATATCA AGCTTATCGA . ... í .... I ....(....i .... Ϊ.... f ....(....I .... I.... I

3010 3020 3030 3040 3050

TACCGTCGAC CTCGAGGGGG ATCACCACTT TGTACAAGAA AGCTG.....

Protein AtCKXl cytosolická (538 aminokyselin, SEQ ID NO. 9)

AAU

CAU

UCU

GUU

AGU

ACC

CCA

AAA

GAA

UUA

CCU

UCU

UCA

AAU

CCU

Asn

His

Ser

Val

Ser

Thr

Pro

Lys

Glu

Leu

Pro

Ser

Ser

Asn

Pro

UCA

GAU

AUU

CGU

UCC

UCA

UUA

GUU

UCA

CUA

GAU

UUG

GAG

GGU

UAU

Ser

Asp

Ile

Arg

Ser

Ser

Leu

Val

Ser

Leu

Asp

Leu

Glu

Gly

Tyr

AUA

AGC

UUC

GAC

GAU

GUC

CAC

AAU

GUG

GCC

AAG

GAC

UUU

GGC

AAC

Ile

Ser

Phe

Asp

Asp

Val

His

Asn

Val

Ala

Lys

Asp

Phe

Gly

Asn

AGA

UAC

CAG

UUA

CCA

CCU

UUG

GCA

AUU

CUA

CAU

CCA

AGG

UCA

GUU

Arg

Tyr

Gin

Leu

Pro

Pro

Leu

Ala

Ile

Leu

His

Pro

Arg

Ser

Val

UUU

GAU

AUU

UCA

UCG

AUG

AUG

AAG

CAU

AUA

GUA

CAU

CUG

GGC

UCC

Phe

Asp

Ile

Ser

Ser

Met

Met

Lys

His

Ile

Val

His

Leu

Gly

Ser

ACC

UCA

AAU

CUU

ACA

GUA

GCA

GCU

AGA

GGC

CAU

GGU

CAC

UCG

CUU

Thr

Ser

Asn

Leu

Thr

Val

Ala

Ala

Arg

Gly

His

Gly

His

Ser

Leu

CAA

GGA

CAA

GCU

CUA

GCU

CAU

CAA

GGU

GUU

GUC

AUC

AAA

AUG

GAG

Gin

Gly

Gin

Ala

Leu

Ala

His

Gin

Gly

Val

Val

Ile

Lys

Met

Glu

- 15CZ 304935 B6

UCA

CUA

CGA

AGU

CCU

GAU

AUU

AGG

AUU

UAU

AAG

GGG

AAG

CAA

CCA

Ser

Leu

Arg

Ser

Pro

Asp

Ile

Arg

Ile

Tyr

Lys

Gly

Lys

Gin

Pro

URU

GUU

GAU

GUC

UCA

GGU

GGU

GAA

AUA

UGG

AUA

AAC

AUU

CUA

CGC

Tyr

Val

Asp

Val

Ser

Gly

Gly

Glu

Ile

Trp

Ile

Asn

Ile

Leu

Arg

GAG

ACU

CUA

AAA

UAC

GGU

CUU

UCA

CCA

AAG

UCC

UGG

ACA

GAC

UAC

Glu

Thr

Leu

Lys

Tyr

Gly

Leu

Ser

Pro

Lys

Ser

Trp

Thr

Asp

Tyr

CUU

CAU

UUG

ACC

GUU

GGA

GGU

ACA

CUA

UCU

AAU

GCU

GGA

AUC

AGC

Leu

His

Leu

Thr

Val

Gly

Gly

Thr

Leu

Ser

Asn

Ala

Gly

Ile

Ser

GGU

CAA

GCA

UUC

AAG

CAU

GGA

CCC

CAA

AUC

AAC

AAC

GUC

UAC

CAG

Gly

Gin

Ala

Phe

Lys

His

Gly

Pro

Gin

Ile

Asn

Asn

Val

Tyr

Gin

CUA

GAG

AUU

GUU

ACA

GGG

AAA

GGA

GAA

GUC

GUA

ACC

UGU

UCU

GAG

Leu

Glu

Ile

Val

Thr

Gly

Lys

Gly

Glu

Val

Val

Thr

Cys

Ser

Glu

AAG

CGG

AAC

UCU

GAA

CUU

UUC

UUC

AGU

GUU

CUU

GGC

GGG

CUU

GGA

Lys

Arg

Asn

Ser

Glu

Leu

Phe

Phe

Ser

Val

Leu

Gly

Gly

Leu

Gly

CAG

UUU

GGC

AUA

AUC

ACC

CGG

GCA

CGG

AUC

UCU

CUU

GAA

CCA

GCA

Gin

Phe

Gly

Ile

Ile

Thr

Arg

Ala

Arg

Ile

Ser

Leu

Glu

Pro

Ala

CCG

CAU

AUG

GUU

AAA

UGG

AUC

AGG

GUA

CUC

UAC

UCU

GAC

UUU

UCU

Pro

His

Met

Val

Lys

Trp

Ile

Arg

Val

Leu

Tyr

Ser

Asp

Phe

Ser

GCA

UUU

UCA

AGG

GAC

CAA

GAA

UAU

CUG

AUU

UCA

AAG

GAG

AAA

ACU

Ala

Phe

Ser

Arg

Asp

Gin

Glu

Tyr

Leu

Ile

Ser

Lys

Glu

Lys

Thr

UUU

GAU

UAC

GUU

GAA

GGA

UUU

GUG

AUA

AUC

AAU

AGA

ACA

GAC

CUU

Phe

Asp

Tyr

Val

Glu

Gly

Phe

Val

Ile

Ile

Asn

Arg

Thr

Asp

Leu

CUC

AAU

AAU

UGG

CGA

UCG

UCA

UUC

AGU

CCC

AAC

GAU

UCC

ACA

CAG

Leu

Asn

Asn

Trp

Arg

Ser

Ser

Phe

Ser

Pro

Asn

Asp

Ser

Thr

Gin

GCA

AGC

AGA

UUC

AAG

UCA

GAU

GGG

AAA

ACU

CUU

UAU

UGC

CUA

GAA

Ala

Ser

Arg

Phe

Lys

Ser

Asp

Gly

Lys

Thr

Leu

Tyr

Cys

Leu

Glu

GUG

GUC

AAA

UAU

UUC

AAC

CCA

GAA

GAA

GCU

AGC

UCU

AUG

GAU

CAG

Val

Val

Lys

Tyr

Phe

Asn

Pro

Glu

Glu

Ala

Ser

Ser

Met

Asp

Gin

GAA

ACU

GGC

AAG

UUA

CUU

UCA

GAG

UUA

AAU

UAU

AUU

CCA

UCC

ACU

Glu

Thr

Gly

Lys

Leu

Leu

Ser

Glu

Leu

Asn

Tyr

Ile

Pro

Ser

Thr

- 16CZ 304935 B6

UUG

UUU

UCA

UCU

GAA

GUG

CCA

UAU

AUC

GAG

UUU

CUG

GAU

CGC

GUG

Leu

Phe

Ser

Ser

Glu

Val

Pro

Tyr

Ile

Glu

Phe

Leu

Asp

Arg

Val

CAU

AUC

GCA

GAG

AGA

AAA

CUA

AGA

GCA

AAG

GGU

UUA

UGG

GAG

GUU

His

Ile

Ala

Glu

Arg

Lys

Leu

Arg

Ala

Lys

Gly

Leu

Trp

Glu

Val

CCA

CAU

CCC

UGG

CUG

AAU

CUC

CUG

AUU

CCU

AAG

AGC

AGC

AUA

UAC

Pro

His

Pro

Trp

Leu

Asn

Leu

Leu

Ile

Pro

Lys

Ser

Ser

Ile

Tyr

CAA

UUU

GCU

ACA

GAA

GUU

UUC

AAC

AAC

AUU

CUC

ACA

AGC

AAC

AAC

Gin

Phe

Ala

Thr

Glu

Val

Phe

Asn

Asn

Ile

Leu

Thr

Ser

Asn

Asn

AAC

GGU

CCU

AUC

CUU

AUU

UAU

CCA

GUC

AAU

CAA

UCC

AAG

UGG

AAG

Asn

Gly

Pro

Ile

Leu

Ile

Tyr

Pro

Val

Asn

Gin

Ser

Lys

Trp

Lys

AAA

CAU

ACA

UCU

UUG

AUA

ACU

CCA

AAU

GAA

GAU

AUA

UUC

UAU

CUC

Lys

His

Thr

Ser

Leu

Ile

Thr

Pro

Asn

Glu

Asp

Ile

Phe

Tyr

Leu

GUA

GCC

UUU

CUC

CCC

UCU

GCA

GUG

CCA

AAU

UCC

UCA

GGG

AAA

AAC

Val

Ala

Phe

Leu

Pro

Ser

Ala

Val

Pro

Asn

Ser

Ser

Gly

Lys

Asn

GAU

CUU

GAG

UAC

CUU

UUG

AAA

CAA

AAC

CAA

AGA

GUU

AUG

AAC

UUC

Asp

Leu

Glu

Tyr

Leu

Leu

Lys

Gin

Asn

Gin

Arg

Val

Met

Asn

Phe

UGC

GCA

GCA

GCA

AAC

CUC

AAC

GUG

AAG

CAG

UAU

UUG

CCC

CAU

UAU

Cys

Ala

Ala

Ala

Asn

Leu

Asn

Val

Lys

Gin

Tyr

Leu

Pro

His

Tyr

GAA

ACU

CAA

AAA

GAG

UGG

AAA

UCA

CAC

UUU

GGC

AAA

AGA

UGG

GAA

Glu

Thr

Gin

Lys

Glu

Trp

Lys

Ser

His

Phe

Gly

Lys

Arg

Trp

Glu

ACA

UUU

GCA

CAG

AGG

AAA

CAA

GCC

UAC

GAC

CCU

CUA

GCG

AUU

CUA

Thr

Phe

Ala

Gin

Arg

Lys

Gin

Ala

Tyr

Asp

Pro

Leu

Ala

Ile

Leu

GCA

CCU

GGC

CAA

AGA

AUA

UUC

CAA

AAG

ACA

ACA

GGA

AAA

UUA

UCU

Ala

Pro

Gly

Gin

Arg

Ile

Phe

Gin

Lys

Thr

Tht

Gly

Lys

Leu

Ser

CCC

AUC

CAA

CUC

GCA

AAG

UCA

AAG

GCA

ACA

GGA

AGU

CCU

CAA

AGG

Pro

Ile

Gin

Leu

Ala

Lys

Ser

Lys

Ala

Thr

Gly

Ser

Pro

Gin

Arg

UAU

CAU

UAC

GCA

UCA

AUA

CUG

CCG

AAA

CCU

AGA

ACU

GUA

UAA

Tyr

His

Tyr

Ala

Ser

Ile

Leu

Pro

Lys

Pro

Arg

Thr

Val

End

Předmětem předkládaného vynálezu je dále použití uvedených expresních kazet pro přípravu rostlin ječmene vykazujících odolnost vůči suchu.

- 17CZ 304935 B6

Objasnění výkresů

Obr. 1: Fenotyp rostlin s nadprodukci ZmCKXl pod β-glukosidasovým promotorem.

1. kontrolní WT ječmen, 2., 3. a 4. geneticky modifikované linie ječmene.

Obr. 2: Počet transkriptů AtCKXl v 1 ng RNA u 1, 2, 5, 8 a 14 týdnů stalých transgenních rostlin.

Obr. 3: Stanovení relativního obsahu vody v listech u 3 měsíce starých rostlin ječmene, z nichž byla polovina rostlin 2 měsíce stresovaná suchem. Transgenní rostliny obsahují vakuolámí formu AtCKXl. Praporcové listy byly odebrány z pěti rostlin z nejstaršího stébla po vystavení suchu min. po dobu 24 hodin.

Obr. 4: Fotodokumentace působení stresu suchem na transgenní a kontrolní WT rostliny ječmene. A) WT ječmen, B) transgenní ječmen s vakuolámí AtCKXl.

Obr. 5: Fotodokumentace působení stresu suchem na transgenní a kontrolní WT rostliny ječmene. A) WT ječmen, B) transgenní ječmen s apoplastickou AtCKXl.

Obr. 6: Fotodokumentace působení stresu suchem na transgenní a kontrolní WT rostliny ječmene. A) WT ječmen, B) transgenní ječmen s cytosolickou AtCKXl.

Příklady uskutečnění vynálezu

Příklad 1: Příprava geneticky modifikovaného ječmene

1. Příprava binárního konstruktu pro vnesení cizorodé DNA do ječmene

Byly připraveny 3 konstrukty obsahující vakuolámí, cytosolickou a apoplastickou formu AtCKXl (původem z rostliny Arabidopsis thaliana). Každý konstrukt obsahuje regulační sekvence - promotor genu pro β-glukosidasu a NOS terminátor. Převaha funkčních úseků byla nasyntetizována komerční firmou Mr. Gene GmbH (Regensburg, Německo). Jedná se o sekvenci promotoru genu pro β-glukosidasu (Gu et al. (2006), Plant Cell Rep. 25:1157-65), gen AtCKXl (Kowalska et al. (2010), Phytochemistry. 71:1970-8) s uměle vytvořeným restrikčním místem pro odštěpení signální sekvence, signální sekreční sekvenci genu AtCKX2 (Werner et al. (2003), Plant Cell. 15:2532-50) a NOS terminátor (Bevan M, Bames WM, Chilton, MD. (1983), Nucleic Acids res. 11:369-85). Další úseky DNA vnášené do ječmene byly získány zakoupením binárního T-DNA plazminu pBRACT209 (John Innes Centre, Norwich, Velká Británie) a poskytnutím plazmidového konstruktu s přirozenou formou AtCKXl Dr. T.Wemerem (Freie Universitát Berlin, Německo), jehož příprava je uvedena ve Werner et al. (2001), Proč Nati Acad Sci USA. 98:10487-92.

Funkční úseky byly pomocí restrikěních endonukleas a T4-DNA ligasy (Sambrook J, Russell DW Molecular cloning: A Laboratory Manual (third ed.), 3:A2.2, Cold Spring Harbor, New York 2001) vneseny do vektoru pENTRla (zakoupen od firmy Invitrogen, Life Technologies Czech Republic s.r.o., Praha), kteiý slouží jako donorový vektor pro vnesení požadovaného úseku DNA do cílového vektoru pBRACT209 pomocí tzv. Gateway klonování (provedeno dle návodu firmy Invitrogen). Výsledné konstrukty byly ověřeny komerční sekvencí a sloužily k transformaci bakterie Agrobacterium tumefaciens (kmen AGL1), jež byla získána od Plant Breeding and Aclimatization Institute (Blonie, Polsko). Transformace A. tumefaciens probíhala dle protokolu uvedeného v Sambrook J, Russell DW Molecular cloning: A Laboratory Manual (third ed.), 3.A2.2, Cold Spring Harbor, New York 2001.

-18CZ 304935 B6

2. Transformace ječmene prostřednictvím Agrobacteria tumefaciens

Transformace ječmene prostřednictvím Agrobacteria tumefaciens probíhala dle publikovaného protokolu uvedeného v Harwood et al. (2009), In Methods in Molecular Biology, Vol. 478 Transgenic Wheat, Barley and Oats (Jones H. D., Shewry P. R. ed.), pp. 137-147, Humana Press, New York, USA. Jediné modifikace spočívaly v užití 0,2 mM acetosyringonu v agrobakteriální suspenzi před vlastní infekcí donorového materiálu, jímž byly štítky ječmene. Další modifikací byl přípravek 6-benzylaminopurinu do regeneračního média (0,4 mg/1 média) pro zajištění dostatečné hladiny cytokininů v regeneruj ících rostlinách.

3. Pěstování transgenního ječmene

Přibližně po třiceti dnech růstu v základním médiu (Harwood et al. (2009), In Methods in Molecular Biology, Vol. 478 Transgenic Wheat, Barley and Oats (Jones H. D, Shewry P. R. ed.), pp. 137-147, Humana Press, New York, USA) byly rostliny přemístěny do rašelinových disků a pěstovány týden ve fytotronu (16 hodin den - 15 °C i 8 hodin noc - 12 °C; osvětlení 300 pM/m²/s na úrovni pěstební nádoby). Nakonec byly rostliny přesazeny do směsi hlína:komerční substrátperlit (poměr 1:1:1) a pěstovány ve fytokomoře za stejných podmínek až do stadia zralosti.

V TI generaci transgenního ječmene byly selektovány linie s jednou integrací T-DNA, u kterých byla na úrovni gDNA, RNA a proteinové úrovni potvrzena a ověřena přítomnost funkčního transgenů. V T2 generaci byly vyselektovány homozygotní linie transgenního ječmene, které byly dále charakterizovány a studovány.

4. Studium exprese AtCKXl řízené β-glukosidasovým promotorem a studium exprese 35S::hpt

Počet transkriptů AtCKXl byl detekován v 1 ng RNA u 1, 2, 5, 8 a 14 týdnů starých transgenních rostlin ječmene s AtCKXl vakuolámí. Počet transkriptů hpt byl detekován v 1 ng RNA u 1, 2, 5 a 8 týdnů starých transgenních rostlin ječmene s AtCKXl vakuolámí. Kvantifikace proběhla za pomoci kalibračních křivek k jejichž přípravě byly použity čisté plasmidy s příslušnými geny o známé koncentraci pomocí Sybr green qPCR (StepOnePlus™ Real-Time PCR System, Life Technologies Czech Republic s.r.o., Praha). Primery byly navrženy pomocí program Primer Express 3.0. Jako endogenní kontrola sloužily geny pro β-aktin, ječmenný cyklofilin a elongační faktor 1.

Kvalitní RNA byla izolována za užití kitu RNAqueous® (Ambion, Life Technologies Czech Republic s.r.o., Praha), ošetřena Turbo DNAsou (Life Technologies Czech Republic s.r.o., Praha) a vyčištěna užitím magnetických kuliček (Agencourt RNA-CLEAN XP, Beckman Coulter, Praha). Následoval přepis do cDNA pomocí reverzní transkriptázy RevertAid H Minus M-MULV (ThermoFischer SCIENTIFIC, Pardubice).

Pro potvrzení integrace požadované funkční kazety do genomu ječmene a tím i pro potvrzení genetické modifikace rostlin byl sledován selekční gen hpt na genomové úrovni i na úrovni RNA. U všech transgenních rostlin byla potvrzena přítomnost i transkripce sledovaného genu hpt (Tab. 1), která je řízena 35S promotorem (součást binárního vektoru pBRACT209).

	Počet transkriptů hpt na ng RNA 1. týden 2. týden 5. týden	8. týden
nadzemní část kořenech	124511 265359 158255 373909	274358 400937	68685 287502

-19CZ 304935 B6

Pro kvantifikaci exprese AtCKXl řízené β-glukosidasovým promotorem byl stanoven počet tanskriptů AtCKXl v 1 ng RNA v nadzemní části a v kořenech u 1, 2, 5, 8 a 14/16 týdnů starých transgenních rostlin ječmene (Obr. 2). Exprese AtCKXl je nejsilnější u 4 týdny starých rostlin, a to v kořenech ječmene. V porovnání s expresí řízenou 35S promotorem (Tab. 1), kterýje považován za středně silný promotor pro použití v obilovinách, můžeme β-glukosidasový promotor považovat za slabý promotor pro expresi cílového genu v jednoděložných rostlinách.

Příklad 2: Aplikace stresu suchem

A. Stres byl aplikován na tři měsíce staré rostliny, které byly pěstovány ve skleníku v 1 kg homogenní směsi hlíny a perlitu v poměru 2:1. Hlína se nechala v pravidelných intervalech vyschnout, což odpovídalo 1 až 3 zálivkám po 200 ml na 1 kg hlíny za týden v závislosti na stáří rostliny a teplotních podmínkách. Nestresované rostliny byly zalévány denně. Bylo stresováno 30 transgenních rostlin ječmene s vakuolámí formou AtCKXl a 30 kontrolních WT. U 3 měsíce starých rostlin byl stanoven relativní obsah vody (RWC) v šesti nejmladších, ale plně vyvinutých listech pro testovanou linii (Turner NC, Abbo S, Berger JD, Chaturvedi SK, French Rj, Ludwig C, Manur DM, Singh SJ, Yadava HS. (2007) J Exp Bot. 58:187-94).

B. Studium působení stresu na 4 týdny staré, hydroponicky pěstované rostliny ječmene rostoucí ve fytotronu (16 hodin den - 23 °C / 8 hodin noc - 20 °C; osvětlení 100 pM/m²/s na úrovni pěstební nádoby, 300 pM/m²/s na úrovni růstového vrcholu 6 týdnů starých rostlin). Stres byl aplikován odlitím živného media z pěstební nádoby (Hoagland DR and Amon DI. (1950), Califomia Agricultural Experiment Station Circular 347:1-32), mírným okapáním a vrácením rostlin do nádoby, kde byly dále pěstovány 24 hodin. Během této doby probíhal v časových intervalech odběr listů (vždy 5 na linii ječmene) pro stanovení relativního obsahu vody a dále probíhala fotodokumentace stresovaných rostlin.

C. Studium působení stresu na 4 týdny staré rostliny ječmene, které byly pěstované v minimálním množství hlíny ve fytotronu (16 hodin den - 22 °C / 8 hodin noc - 20 °C; osvětlení 150 pM/m²/s) pro posouzení schopnosti revitalizace geneticky modifikovaných rostlin. Rostliny byly ponechány 2 dny bez zálivky a pomocí stanovení relativního obsahu vody v listech byl potvrzen silný tress suchem. Kontrola revitalizace probíhala 24 hodin od obnovení zálivky a to odběrem listů (vždy 5 na linii ječmene) pro stanovení relativního obsahu vody.

A. Zvýšená odolnost transgenních rostlin ječmene pěstovaných v 1 kg pěstebního substrátu a dlouhodobě stresovaných suchem.

Transgenní rostliny s vakuolámí formou AtCKXl byly pěstovány v 1 kg pěstebního substrátu ve skleníku. Po dvou měsících sucha byly odebrány praporcové listy pěstovaných rostlin pro stanovení relativního obsahu vody. Bylo zjištěno, že v porovnání s kontrolními WT rostlinami mají transgenní rostliny o více než 10 % vyšší obsah vody během aplikace dlouhotrvajícího stresu (Obr. 3). V porovnání s kontrolními podmínkami (tj. bez aplikace stresu) je patrné, že u geneticky modifikovaných rostlin, na rozdíl od WT ječmene, nedošlo během stresu k výraznému poklesu vody v listech (Obr. 3).

B. Zvýšená odolnost při stresu suchem u hydroponicky pěstovaných rostlin

Rostliny ječmene (transgenní linie a WT ječmen) byly hydroponicky pěstovány v Hoaglandově živném roztoku pro zajištění optimálního příjmu živin a vody kořeny, což je ideální pro stanovení studovaných parametrů (RWC, celková suchá hmota listů a kořenů po dvoutýdenní regeneraci rostlin) během stresu suchem a revitalizace. Během experimentu byl sledován fenotyp rostlin. Vzhledem k odlišnému místu působení ektopicky produkované CKX byly získány odlišné výsledky pro transgenní rostliny s vakuolámí, cytosolickou nebo apoplastickou CKX.

-20CZ 304935 B6

Ječmen s AtCKXl vakuolámí

Během stresu a revitalizace hydroponicky pěstovaných rostlin nebylo pozorováno zvýšení RWC oproti WT ječmeni. Po dvoutýdenní regeneraci měly transgenní rostliny o 32 % zvětšenou hmotu nadzemní části než WT, což bylo dáno větším množstvím odnoží. Z hlediska fenotypu je u transgenních rostlin patrná rychlejší regenerace již po 4 hodinách revitalizace (Obr. 4).

Ječmen s AtCKXl apoplastickou

Během stresu hydroponicky pěstovaných rostlin byl po 20 hodinách bez růstového média detekován nárůst RWC až o 19 % v porovnání s kontrolními WT rostlinami, po 24 hodinách stresu až p 12 % vyšší RWC oproti WT ječmeni. Hmota nadzemní části nebo kořenů nebyl po aplikaci stresu vyšší než u stejně stresovaných WT rostlin. Z hlediska fenotypu je jasně viditelná odolnost transgenních rostlin během stresu i rychlejší regenerace těchto rostlin ve srovnání s WT ječmenem (Obr. 5).

Ječmen s AtCKXl cytosolickou

Během dvouhodinové revitalizace hydroponicky pěstovaných rostlin byl detekován o 18 % větší relativní obsah vody v listech než u kontrolních WT rostlin. Po dvoutýdenní regeneraci rostlin měly transgenní rostliny o 17 % zvětšenou hmotu nadzemní části a o 17 % větší hmotu kořenů než WT. Počet odnoží byl srovnatelný s WT ječmenem, rostliny byly většího vzrůstu. Z hlediska fenotypu je patrná větší odolnost transgenních rostlin vůči stresu během celých 24 hodin a rychlá revitalizace již za 2 hodiny po přidání živného media k rostlinám (Obr. 6).

C. Zvýšená schopnost revitalizace transgenních rostlin ječmene pěstovaných v minimálním množství pěstebního substrátu

Transgenní rostliny s vakuolámí, cytosolickou nebo apoplastickou formou AtCKXl byly pěstovány v minimálním množství pěstebního substrátu ve íytotronu. Po aplikaci sucha (ukončení zálivky) a během revitalizace (obnovení zálivky) byly odebrány nejmladší, ale již plně vyvinuté listy pěstovaných rostlin pro stanovení relativního obsahu vody. Vzhledem k tomu, že rostliny rostly pouze v omezeném množství zeminy a byly tudíž značně prostorově a nutričně omezeny, nemohly během stresu využít plně svého potenciálu. Tento experiment byl tedy zaměřen na schopnost revitalizace geneticky modifikovaných rostlin po předchozí aplikaci a potvrzení stresu suchem. Po obnovení zálivky byla u transgenních rostlin pozorována, ve srovnání s WT ječmenem, výrazně rychlejší revitalizace nadzemní části rostlin (Tab. 3). U linie s cytosolickou AtCKXl byl potvrzen o 25 % větší obsah vody v listech než u WT ječmene. U rostlin s apoplastickou AtCKXl byl RWC o 17 % větší, u linie s vakuolámí AtCKXl byla hodnota RWC o 15 % vyšší než u WT ječmene. Transgenní rostliny s ektopicky nadprodukovanou AtCKXl tedy měly v prostředí s dostatečným množstvím zálivky větší schopnost dodat rychle potřebné množství vody do nadzemní části rostliny.

Tabulka 3: Stanovení relativního obsahu vody v listech (RWC) během revitalizace transgenních a WT rostlin ječmene po aplikaci stresu suchem.

Linie ječmene	RWC v % během 24 hodinové revitalizace
WT	78
AtCKXl cytosolická	98
AtCKXl apoplastické	92
AtCKXl vakuolámí	90

-21 CZ 304935 B6

Přehled sekvencí <110> Univerzita Palackeho v Olomouci <120> ZPŮSOB PRIPRAVY JEČMENE SE ZVÝŠENOU ODOLNOSTI VUCI SUCHU <130> P <160> 9 <170> Patentln version 3.5 <210> 1 <211> 1728 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 1

atgggattga	cctcatcctt	acggttccat	agacaaaaca	acaagacttt	cctcggaatc	60
ttcatgatct	tagttctaag	ctgtatacca	ggtagaacca	atctttgttc	caatcattct	120
gttagtaccc	caaaagaatt	accttcttca	aatccttcag	atattcgttc	ctcattagtt	180
tcactagatt	tggagggtta	tataagcttc	gacgatgtcc	acaatgtggc	caaggacttt	240
ggcaacagat	accagttacc	acctttggca	attctacatc	caaggtcagt	ttttgatatt	300
tcatcgatga	tgaagcatat	agtacatctg	ggctccacct	caaatcttac	agtagcagct	360
agaggccatg	gtcactcgct	tcaaggacaa	gctctagctc	atcaaggtgt	tgtcatcaaa	420
atggagtcac	ttcgaagtcc	tgatatcagg	atttataagg	ggaagcaacc	atatgttgat	480
gtctcaggtg	gtgaaatatg	gataaacatt	ctacgcgaga	ctctaaaata	cggtctttca	540
ccaaagtcct	ggacagacta	ccttcatttg	accgttggag	gtacactatc	taatgctgga	600
atcagcggtc	aagcattcaa	gcatggaccc	caaatcaaca	acgtctacca	gctagagatt	660
gttacaggga	aaggagaagt	cgtaacctgt	tctgagaagc	ggaattctga	acttttcttc	720
agtgttcttg	gcgggcttgg	acagtttggc	ataatcaccc	gggcacggat	ctctcttgaa	780
ccagcaccgc	atatggttaa	atggatcagg	gtactctact	ctgacttttc	tgcattttca	840
agggaccaag	aatatctgat	ttcgaaggag	aaaacttttg	attacgttga	aggatttgtg	900
ataatcaata	gaacagacct	tctcaataat	tggcgatcgt	cattcagtcc	caacgattcc	960
acacaggcaa	gcagattcaa	gtcagatggg	aaaactcttt	attgcctaga	agtggtcaaa	1020
tatttcaacc	cagaagaagc	tagctctatg	gatcaggaaa	ctggcaagtt	actttcagag	1080
ttaaattata	ttccatccac	tttgttttca	tctgaagtgc	catatatcga	gtttctggat	1140
cgcgtgcata	tcgcagagag	aaaactaaga	gcaaagggtt	tatgggaggt	tccacatccc	1200
tggctgaatc	tcctgattcc	taagagcagc	atataccaat	ttgctacaga	agttttcaac	1260
aacattctca	caagcaacaa	caacggtcct	atccttattt	atccagtcaa	tcaatccaag	1320
tggaagaaac	atacatcttt	gataactcca	aatgaagata	tattctatct	cgtagccttt	1380
ctcccctctg	cagtgccaaa	ttcctcaggg	aaaaacgatc	tagagtacct	tttgaaacaa	1440
aaccaaagag	ttatgaactt	ctgcgcagca	gcaaacctca	acgtgaagca	gtatttgccc	1500

-22CZ 304935 B6 cattatgaaa ctcaaaaaga gtggaaatca cactttggca aaagatggga aacatttgca 1560 cagaggaaac aagcctacga ccctctagcg attctagcac ctggccaaag aatattccaa 1620 aagacaacag gaaaattatc tcccatccaa ctcgcaaagt caaaggcaac aggaagtcct 1680 caaaggtacc attacgcatc aatactgccg aaacctagaa ctgtataa 1728 <210> 2 <211> 1686 <212> DNA <213> Artificial <220>

<223> Sekvence AtCKXl (bez signálního peptidu) z Arabidopsis thaliana spojená se sekvencí apoplastickéno signálního peptidu z Arabidopsis thaliana

<400> 2 aatcttcgtt	taatgatcac	tttaatcacg	gttttaatga	tcaccaaatc	atcaaacggc	60
atgctttcga	atcattctgt	tagtacccca	aaagaattac	cttcttcaaa	tccttcagat	120
attcgttcct	cattagtttc	actagatttg	gagggttata	taagcttcga	cgatgtccac	180
aatgtggcca	aggactttgg	caacagatac	cagttaccac	ctttggcaat	tctacatcca	240
aggtcagttt	ttgatatttc	atcgatgatg	aagcatatag	tacatctggg	ctccacctca	300
aatcttacag	tagcagctag	aggccatggt	cactcgcttc	aaggacaagc	tctagctcat	360
caaggtgttg	tcatcaaaat	ggagtcacta	cgaagtcctg	atattaggat	ttataagggg	420
aagcaaccat	atgttgatgt	ctcaggtggt	gaaatatgga	taaacattct	acgcgagact	480
ctaaaatacg	gtctttcacc	aaagtcctgg	acagactacc	ttcatttgac	cgttggaggt	540
acactatcta	atgctggaat	cagcggtcaa	gcattcaagc	atggacccca	aatcaacaac	600
gtctaccagc	tagagattgt	tacagggaaa	ggagaagtcg	taacctgttc	tgagaagcgg	660
aactctgaac	ttttcttcag	tgttcttggc	gggcttggac	agtttggcat	aatcacccgg	720
gcacggatct	ctcttgaacc	agcaccgcat	atggttaaat	ggatcagggt	actctactct	780
gacttttctg	cattttcaag	ggaccaagaa	tatctgattt	caaaggagaa	aacttttgat	840
tacgttgaag	gatttgtgat	aatcaataga	acagaccttc	tcaataattg	gcgatcgtca	900
ttcagtccca	acgattccac	acaggcaagc	agattcaagt	cagatgggaa	aactctttat	960
tgcctagaag	tggtcaaata	tttcaaccca	gaagaagcta	gctctatgga	tcaggaaact	1020
ggcaagttac	tttcagagtt	aaattatatt	ccatccactt	tgttttcatc	tgaagtgcca	1080
tatatcgagt	ttctggatcg	cgtgcatatc	gcagagagaa	aactaagagc	aaagggttta	1140
tgggaggttc	cacatccctg	gctgaatctc	ctgattccta	agagcagcat	ataccaattt	1200
gctacagaag	ttttcaacaa	cattctcaca	agcaacaaca	acggtcctat	ccttatttat	1260
ccagtcaatc	aatccaagtg	gaagaaacat	acatctttga	taactccaaa	tgaagatata	1320
ttctatctcg	tagcctttct	cccctctgca	gtgccaaatt	cctcagggaa	aaacgatctt	1380
gagtaccttt	tgaaacaaaa	ccaaagagtt	atgaacttct	gcgcagcagc	aaacctcaac	1440

-23 CZ 304935 B6 gtgaagcagt atttgcccca ttatgaaact caaaaagagt ggaaatcaca ctttggcaaa 1500 agatgggaaa catttgcaca gaggaaacaa gcctacgacc ctctagcgat tctagcacct 1560 ggccaaagaa tattccaaaa gacaacagga aaattatctc ccatccaact cgcaaagtca 1620 aaggcaacag gaagtcctca aaggtatcat tacgcatcaa tactgccgaa acctagaact 1680 gtataa 1686 <210> 3 <211> 1617 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 3 aatcattctg ttagtacccc aaaagaatta ccttcttcaa atccttcaga tattcgttcc 60 tcattagttt cactagattt ggagggttat ataagcttcg acgatgtcca caatgtggcc 120 aaggactttg gcaacagata ccagttacca cctttggcaa ttctacatcc aaggtcagtt 180 tttgatattt catcgatgat gaagcatata gtacatctgg gctccacctc aaatcttaca 240 gtagcagcta gaggccatgg tcactcgctt caaggacaag ctctagctca tcaaggtgtt 300 gtcatcaaaa tggagtcact acgaagtcct gatattagga tttataaggg gaagcaacca 360 tatgttgatg tctcaggtgg tgaaatatgg ataaacattc tacgcgagac tctaaaatac 420 ggtctttcac caaagtcctg gacagactac cttcatttga ccgttggagg tacactatct 480 aatgctggaa tcagcggtca agcattcaag catggacccc aaatcaacaa cgtctaccag 540 ctagagattg ttacagggaa aggagaagtc gtaacctgtt ctgagaagcg gaactctgaa 600 cttttcttca gtgttcttgg cgggcttgga cagtttggca taatcacccg ggcacggatc 660 tctcttgaac cagcaccgca tatggttaaa tggatcaggg tactctactc tgacttttct 720 gcattttcaa gggaccaaga atatctgatt tcaaaggaga aaacttttga ttacgttgaa 780 ggatttgtga taatcaatag aacagacctt ctcaataatt ggcgatcgtc attcagtccc 840 aacgattcca cacaggcaag cagattcaag tcagatggga aaactcttta ttgcctagaa 900 gtggtcaaat atttcaaccc agaagaagct agctctatgg atcaggaaac tggcaagtta 960 ctttcagagt taaattatat tccatccact ttgttttcat ctgaagtgcc atatatcgag 1020 tttctggatc gcgtgcatat cgcagagaga aaactaagag caaagggttt atgggaggtt 1080 ccacatccct ggctgaatct cctgattcct aagagcagca tataccaatt tgctacagaa 1140 gttttcaaca acattctcac aagcaacaac aacggtccta tccttattta tccagtcaat 1200 caatccaagt ggaagaaaca tacatctttg ataactccaa atgaagatat attctatctc 1260 gtagcctttc tcccctctgc agtgccaaat tcctcaggga aaaacgatct tgagtacctt 1320 ttgaaacaaa accaaagagt tatgaacttc tgcgcagcag caaacctcaa cgtgaagcag 1380 tatttgcccc attatgaaac tcaaaaagag tggaaatcac actttggcaa aagatgggaa 1440 acatttgcac agaggaaaca agcctacgac cctctagcga ttctagcacc tggccaaaga 1500 atattccaaa agacaacagg aaaattatct cccatccaac tcgcaaagtc aaaggcaaca 1560

-24CZ 304935 B6 ggaagtcctc aaaggtatca ttacgcatca atactgccga aacctagaac tgtataa 1617 <210> 4 <211> 3123 <212> DNA <213> Artificial <22O>

<223> Expresní kazeta beta-glukosidasový promotor::AtCKXl vakuolární::NOS terminátor

<400> 4 acaagtttgt	acaaaaaagc	aggctttaaa	ggaaccaatt	caagaattcc	aaagctgccg	60
cattcggcaa	agcctgcaat	tccggtagtg	ttttaccacg	ttgacaaaaa	aaatgaagaa	120
atccgatatt	ttagtcatta	tggatatggc	gcggtgtcaa	atcggtatag	tcataatcct	180
ttccatagga	ttgtcccatg	ctcgacacat	taacactaag	tttatccctg	aataacacgg	240
ctacctccat	cctaatcttt	tctattgatc	aattgcctat	ttttaaggcg	cagttgttct	300
tggccgtatc	tgtggagatg	atttttttaa	agacgtccaa	ctctagctag	ctagtccgtg	360
tatgtgaacg	gtgttaggta	gtcattggat	ccgttgacta	tatttgtaaa	ggtggtagcc	420
gttcttttta	attttaacgc	cgctgggaag	aaattaaacg	tggtacatct	atgtatcgtt	480
ttcttaacag	tgatataata	atatactatc	attgcaagcg	tccgcaattg	ctctctcgcg	540
gctcgttcta	ccgtgggaag	aagagctgac	ccgtcgccgc	cccacatgca	tacgatgcgt	600
ccttatctgt	cgcggctcgt	gcaaacgcgg	ggcgggctga	gcgccccagc	ccaccacttg	660
caccacttgc	atttacttaa	ttagttcata	acacatcaca	tctgtatctt	acattatctt	720
taaaaaaatg	attcacacat	tatttatata	tgagatataa	taagtttcca	ggaagcatct	780
ttggcgactt	acgtacgtgt	atcagagaca	tggagtgata	aactattggg	caaccattta	840
gcaatcctag	ctagccagct	cgtctataaa	tagatgcatc	agctccactt	ggtctacaca	900
cttcacaagc	agctcaaagc	tctagttcta	gctagctagc	aaaggggggg	aaaggtaccg	960
tcgacatggg	attgacctca	tccttacggt	tccatagaca	aaacaacaag	actttcctcg	1020
gaatcttcat	gatcttagtt	ctaagctgta	taccaggtag	aaccaatctt	tgttccaatc	1080
attctgttag	taccccaaaa	gaattacctt	cttcaaatcc	ttcagatatt	cgttcctcat	1140
tagtttcact	agatttggag	ggttatataa	gcttcgacga	tgtccacaat	gtggccaagg	1200
actttggcaa	cagataccag	ttaccacctt	tggcaattct	acatccaagg	tcagtttttg	1260
atatttcatc	gatgatgaag	catatagtac	atctgggctc	cacctcaaat	cttacagtag	1320
cagctagagg	ccatggtcac	tcgcttcaag	gacaagctct	agctcatcaa	ggtgttgtca	1380
tcaaaatgga	gtcacttcga	agtcctgata	tcaggattta	taaggggaag	caaccatatg	1440
ttgatgtctc	aggtggtgaa	atatggataa	acattctacg	cgagactcta	aaatacggtc	1500
tttcaccaaa	gtcctggaca	gactaccttc	atttgaccgt	tggaggtaca	ctatctaatg	1560
ctggaatcag	cggtcaagca	ttcaagcatg	gaccccaaat	caacaacgtc	taccagctag	1620

-25CZ 304935 B6

agattgttac	agggaaagga	gaagtcgtaa	cctgttctga	gaagcggaat	tctgaacttt	1680
tcttcagtgt	tcttggcggg	cttggacagt	ttggcataat	cacccgggca	cggatctctc	1740
ttgaaccagc	accgcatatg	gttaaatgga	tcagggtact	ctactctgac	ttttctgcat	1800
tttcaaggga	ccaagaatat	ctgatttcga	aggagaaaac	ttttgattac	gttgaaggat	1860
ttgtgataat	caatagaaca	gaccttctca	ataattggcg	atcgtcattc	agtcccaacg	1920
attccacaca	ggcaagcaga	ttcaagtcag	atgggaaaac	tctttattgc	ctagaagtgg	1980
tcaaatattt	caacccagaa	gaagctagct	ctatggatca	ggaaactggc	aagttacttt	2040
cagagttaaa	ttatattcca	tccactttgt	tttcatctga	agtgccatat	atcgagtttc	2100
tggatcgcgt	gcatatcgca	gagagaaaac	taagagcaaa	gggtttatgg	gaggttccac	2160
atccctggct	gaatctcctg	attcctaaga	gcagcatata	ccaatttgct	acagaagttt	2220
tcaacaacat	tctcacaagc	aacaacaacg	gtcctatcct	tatttatcca	gtcaatcaat	2280
ccaagtggaa	gaaacataca	tctttgataa	ctccaaatga	agatatattc	tatctcgtag	2340
cctttctccc	ctctgcagtg	ccaaattcct	cagggaaaaa	cgatctagag	taccttttga	2400
aacaaaacca	aagagttatg	aacttctgcg	cagcagcaaa	cctcaacgtg	aagcagtatt	2460
tgccccatta	tgaaactcaa	aaagagtgga	aatcacactt	tggcaaaaga	tgggaaacat	2520
ttgcacagag	gaaacaagcc	tacgaccctc	tagcgattct	agcacctggc	caaagaatat	2580
tccaaaagac	aacaggaaaa	ttatctccca	tccaactcgc	aaagtcaaag	gcaacaggaa	2640
gtcctcaaag	gtaccattac	gcatcaatac	tgccgaaacc	tagaactgta	taagtcgact	2700
cgagtctaga	agtcgaagca	gatcgttcaa	acatttggca	ataaagtttc	ttaagattga	2760
atcctgttgc	cggtcttgcg	atgattatca	tataatttct	gttgaattac	gttaagcatg	2820
taataattaa	catgtaatgc	atgacgttat	ttatgagatg	ggtttttatg	attagagtcc	2880
cgcaattata	catttaatac	gcgatagaaa	acaaaatata	gcgcgcaaac	taggataaat	2940
tatcgcgcgc	ggtgtcatct	atgttactag	atcgaccggc	aagcaagctg	atatgcggcc	3000
gcactcgaga	tatctagacc	cagctttctt	gtacaaagtg	gttgatgggc	tgcaggaatt	3060
cgatatcaag	cttatcgata	ccgtcgacct	cgagggggat	caccactttg	tacaagaaag	3120
ctg						3123

<210> 5 <211> 3114 <212> DNA <213> Artificial <220>

<223> Expresní kazeta obsahující beta-glukosidasový promotor::AtCKXl apoplastickou::NOS terminátor <400> 5 acaagtttgt acaaaaaagc aggctttaaa ggaaccaatt cagtcgactg gatccggtac 60 cgaattccaa agctgccgca ttcggcaaag cctgcaattc cggtagtgtt ttaccacgtt 120 gacaaaaaaa atgaagaaat ccgatatttt agtcattatg gatatggcgc ggtgtcaaat 180

cggtatagtc	ataatccttt	ccataggatt	gtcccatgct	cgacacatta	acactaagtt	240
tatccctgaa	taacacggct	acctccatcc	taatcttttc	tattgatcaa	ttgcctattt	300
ttaaggcgca	gttgttcttg	gccgtatctg	tggagatgat	ttttttaaag	acgtccaact	360
ctagctagct	agtccgtgta	tgtgaacggt	gttaggtagt	cattggatcc	gttgactata	420
tttgtaaagg	tggtagccgt	tctttttaat	tttaacgccg	ctgggaagaa	attaaacgtg	480
gtacatctat	gtatcgtttt	cttaacagtg	atataataat	atactatcat	tgcaagcgtc	540
cgcaattgct	ctctcgcggc	tcgttctacc	gtgggaagaa	gagctgaccc	gtcgccgccc	600
cacatgcata	cgatgcgtcc	ttatctgtcg	cggctcgtgc	aaacgcgggg	cgggctgagc	660
gccccagccc	accacttgca	ccacttgcat	ttacttaatt	agttcataac	acatcacatc	720
tgtatcttac	attatcttta	aaaaaatgat	tcacacatta	tttatatatg	agatataata	780
agtttccagg	aagcatcttt	ggcgacttac	gtacgtgtat	cagagacatg	gagtgataaa	840
ctattgggca	accatttagc	aatcctagct	agccagctcg	tctataaata	gatgcatcag	900
ctccacttgg	tctacacact	tcacaagcag	ctcaaagctc	tagttctagc	tagctagcaa	960
agggggggaa	aggtaccgtc	gacagatcta	tggcttcgaa	tcttcgttta	atgatcactt	1020
taatcacggt	tttaatgatc	accaaatcat	caaacggcat	gctttcgaat	cattctgtta	1080
gtaccccaaa	agaattacct	tcttcaaatc	cttcagatat	tcgttcctca	ttagtttcac	1140
tagatttgga	gggttatata	agcttcgacg	atgtccacaa	tgtggccaag	gactttggca	1200
acagatacca	gttaccacct	ttggcaattc	tacatccaag	gtcagttttt	gatatttcat	1260
cgatgatgaa	gcatatagta	catctgggct	ccacctcaaa	tcttacagta	gcagctagag	1320
gccatggtca	ctcgcttcaa	ggacaagctc	tagctcatca	aggtgttgtc	atcaaaatgg	1380
agtcactacg	aagtcctgat	attaggattt	ataaggggaa	gcaaccatat	gttgatgtct	1440
caggtggtga	aatatggata	aacattctac	gcgagactct	aaaatacggt	ctttcaccaa	1500
agtcctggac	agactacctt	catttgaccg	ttggaggtac	actatctaat	gctggaatca	1560
gcggtcaagc	attcaagcat	ggaccccaaa	tcaacaacgt	ctaccagcta	gagattgtta	1620
cagggaaagg	agaagtcgta	acctgttctg	agaagcggaa	ctctgaactt	ttcttcagtg	1680
ttcttggcgg	gcttggacag	tttggcataa	tcacccgggc	acggatctct	cttgaaccag	1740
caccgcatat	ggttaaatgg	atcagggtac	tctactctga	cttttctgca	ttttcaaggg	1800
accaagaata	tctgatttca	aaggagaaaa	cttttgatta	cgttgaagga	tttgtgataa	1860
tcaatagaac	agaccttctc	aataattggc	gatcgtcatt	cagtcccaac	gattccacac	1920
aggcaagcag	attcaagtca	gatgggaaaa	ctctttattg	cctagaagtg	gtcaaatatt	1980
tcaacccaga	agaagctagc	tctatggatc	aggaaactgg	caagttactt	tcagagttaa	2040
attatattcc	atccactttg	ttttcatctg	aagtgccata	tatcgagttt	ctggatcgcg	2100
tgcatatcgc	agagagaaaa	ctaagagcaa	agggtttatg	ggaggttcca	catccctggc	2160
tgaatctcct	gattcctaag	agcagcatat	accaatttgc	tacagaagtt	ttcaacaaca	2220

-27CZ 304935 B6

ttctcacaag	caacaacaac	ggtcctatcc	ttatttatcc	agtcaatcaa	tccaagtgga	2280
agaaacatac	atctttgata	actccaaatg	aagatatatt	ctatctcgta	gcctttctcc	2340
cctctgcagt	gccaaattcc	tcagggaaaa	acgatcttga	gtaccttttg	aaacaaaacc	2400
aaagagttat	gaacttctgc	gcagcagcaa	acctcaacgt	gaagcagtat	ttgccccatt	2460
atgaaactca	aaaagagtgg	aaatcacact	ttggcaaaag	atgggaaaca	tttgcacaga	2520
ggaaacaagc	ctacgaccct	ctagcgattc	tagcacctgg	ccaaagaata	ttccaaaaga	2580
caacaggaaa	attatctccc	atccaactcg	caaagtcaaa	ggcaacagga	agtcctcaaa	2640
ggtatcatta	cgcatcaata	ctgccgaaac	ctagaactgt	ataagtcgac	tcgagtctag	2700
aagtcgaagc	agatcgttca	aacatttggc	aataaagttt	cttaagattg	aatcctgttg	2760
ccggtcttgc	gatgattatc	atataatttc	tgttgaatta	cgttaagcat	gtaataatta	2820
acatgtaatg	catgacgtta	tttatgagat	gggtttttat	gattagagtc	ccgcaattat	2880
acatttaata	cgcgatagaa	aacaaaatat	agcgcgcaaa	ctaggataaa	ttatcgcgcg	2940
cggtgtcatc	tatgttacta	gatcgaccgg	caagcaagct	gatatgcggc	cgcactcgag	3000
atatctagac	ccagctttct	tgtacaaagt	ggttgatggg	ctgcaggaat	tcgatatcaa	3060
gcttatcgat	accgtcgacc	tcgaggggga	tcaccacttt	gtacaagaaa	gctg	3114

<210> 6 <211> 3045 <212> DNA <213> Artificial <220>

<223> Expresní kazeta obsahující beta-glúkosídasový promotor::AtCKXl cytosoli ckou::NOS terminátor

<400> 6 acaagtttgt	acaaaaaagc	aggctttaaa	ggaaccaatt	cagtcgactg	gatccggtac	60
cgaattccaa	agctgccgca	ttcggcaaag	cctgcaattc	cggtagtgtt	ttaccacgtt	120
gacaaaaaaa	atgaagaaat	ccgatatttt	agtcattatg	gatatggcgc	ggtgtcaaat	180
cggtatagtc	ataatccttt	ccataggatt	gtcccatgct	cgacacatta	acactaagtt	240
tatccctgaa	taacacggct	acctccatcc	taatcttttc	tattgatcaa	ttgcctattt	300
ttaaggcgca	gttgttcttg	gccgtatctg	tggagatgat	ttttttaaag	acgtccaact	360
ctagctagct	agtccgtgta	tgtgaacggt	gttaggtagt	cattggatcc	gttgactata	420
tttgtaaagg	tggtagccgt	tctttttaat	tttaacgccg	ctgggaagaa	attaaacgtg	480
gtacatctat	gtatcgtttt	cttaacagtg	atataataat	atactatcat	tgcaagcgtc	540
cgcaattgct	ctctcgcggc	tcgttctacc	gtgggaagaa	gagctgaccc	gtcgccgccc	600
cacatgcata	cgatgcgtcc	ttatctgtcg	cggctcgtgc	aaacgcgggg	cgggctgagc	660
gccccagccc	accacttgca	ccacttgcat	ttacttaatt	agttcataac	acatcacatc	720
tgtatcttac	attatcttta	aaaaaatgat	tcacacatta	tttatatatg	agatataata	780

-28CZ 304935 B6

agtttccagg	aagcatcttt	ggcgacttac	gtacgtgtat	cagagacatg	gagtgataaa	840
ctattgggca	accatttagc	aatcctagct	agccagctcg	tctataaata	gatgcatcag	900
ctccacttgg	tctacacact	tcacaagcag	ctcaaagctc	tagttctagc	tagctagcaa	960
agggggggaa	aggtaccgtc	gacagatcta	tggcttcgaa	tcattctgtt	agtaccccaa	1020
aagaattacc	ttcttcaaat	ccttcagata	ttcgttcctc	attagtttca	ctagatttgg	1080
agggttatat	aagcttcgac	gatgtccaca	atgtggccaa	ggactttggc	aacagatacc	1140
agttaccacc	tttggcaatt	ctacatccaa	ggtcagtttt	tgatatttca	tcgatgatga	1200
agcatatagt	acatctgggc	tccacctcaa	atcttacagt	agcagctaga	ggccatggtc	1260
actcgcttca	aggacaagct	ctagctcatc	aaggtgttgt	catcaaaatg	gagtcactac	1320
gaagtcctga	tattaggatt	tataagggga	agcaaccata	tgttgatgtc	tcaggtggtg	1380
aaatatggat	aaacattcta	cgcgagactc	taaaatacgg	tctttcacca	aagtcctgga	1440
cagactacct	tcatttgacc	gttggaggta	cactatctaa	tgctggaatc	agcggtcaag	1500
cattcaagca	tggaccccaa	atcaacaacg	tctaccagct	agagattgtt	acagggaaag	1560
gagaagtcgt	aacctgttct	gagaagcgga	actctgaact	tttcttcagt	gttcttggcg	1620
ggcttggaca	gtttggcata	atcacccggg	cacggatctc	tcttgaacca	gcaccgcata	1680
tggttaaatg	gatcagggta	ctctactctg	acttttctgc	attttcaagg	gaccaagaat	1740
atctgatttc	aaaggagaaa	acttttgatt	acgttgaagg	atttgtgata	atcaatagaa	1800
cagaccttct	caataattgg	cgatcgtcat	tcagtcccaa	cgattccaca	caggcaagca	1860
gattcaagtc	agatgggaaa	actctttatt	gcctagaagt	ggtcaaatat	ttcaacccag	1920
aagaagctag	ctctatggat	caggaaactg	gcaagttact	ttcagagtta	aattatattc	1980
catccacttt	gttttcatct	gaagtgccat	atatcgagtt	tctggatcgc	gtgcatatcg	2040
cagagagaaa	actaagagca	aagggtttat	gggaggttcc	acatccctgg	ctgaatctcc	2100
tgattcctaa	gagcagcata	taccaatttg	ctacagaagt	tttcaacaac	attctcacaa	2160
gcaacaacaa	cggtcctatc	cttatttatc	cagtcaatca	atccaagtgg	aagaaacata	2220
catctttgat	aactccaaat	gaagatatat	tctatctcgt	agcctttctc	ccctctgcag	2280
tgccaaattc	ctcagggaaa	aacgatcttg	agtacctttt	gaaacaaaac	caaagagtta	2340
tgaacttctg	cgcagcagca	aacctcaacg	tgaagcajgta	tttgccccat	tatgaaactc	2400
aaaaagagtg	gaaatcacac	tttggcaaaa	gatgggaaac	atttgcacag	aggaaacaag	2460
cctacgaccc	tctagcgatt	ctagcacctg	gccaaagaat	attccaaaag	acaacaggaa	2520
aattatctcc	catccaactc	gcaaagtcaa	aggcaacagg	aagtcctcaa	aggtatcatt	2580
acgcatcaat	actgccgaaa	cctagaactg	tataagtcga	ctcgagtcta	gaagtcgaag	2640
cagatcgttc	aaacatttgg	caataaagtt	tcttaagatt	gaatcctgtt	gccggtcttg	2700
cgatgattat	catataattt	ctgttgaatt	acgttaagca	tgtaataatt	aacatgtaat	2760
gcatgacgtt	atttatgaga	tgggttttta	tgattagagt	cccgcaatta	tacatttaat	2820

-29CZ 304935 B6 acgcgataga aaacaaaata tagcgcgcaa actaggataa attatcgcgc gcggtgtcat ctatgttact agatcgaccg gcaagcaagc tgatatgcgg ccgcactcga gatatctaga cccagctttc ttgtacaaag tggttgatgg gctgcaggaa ttcgatatca agcttatcga taccgtcgac ctcgaggggg atcaccactt tgtacaagaa agctg

2880

2940

3000

3045 <210> 7 <211> 575 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 7

Met 1

Gly

Leu Thr ser ser Leu Arg Phe 5

Hi S 10

Arg

Gin Asn

Asn

Lys 15

Thr

Phe

Leu

Gly

ile

Phe

Met

ile

Leu

val

Leu

Ser

Cys

ile

Pro

Gly

Arg

20

25

30

Thr

Asn

Leu

cys

Ser

Asn

Hi s

Ser

val

Ser

Thr

Pro

Lys

Glu

Leu

pro

35

40

45

ser

Ser

Asn

pro

Ser

Asp

Ile

Arg

ser

Ser

Leu

Val

ser

Leu

Asp

Leu

50

55

60

Glu

Gly

Tyr

ile

Ser

Phe

Asp

Asp

val

His

Asn

val

Ala

Lys

Asp

Phe

65

70

75

80

Gly

Asn

Arg

Tyr

Gin

Leu

pro

pro

Leu

Ala

Ile

Leu

His

Pro

Arg

Ser

85

90

95

Val

Phe

Asp

Ile

Ser

Ser

Met

Met

Lys

His

Ile

val

His

Leu

Gly

Ser

100

105

110

Thr

ser

Asn

Leu

Thr

val

Ala

Ala

Arg

Gly

His

Gly

His

Ser

Leu

Gin

115

120

125

Gly

Gin

Ala

Leu

Ala

His

Gin

Gly

val

val

Ile

Lys

Met

Glu

Ser

Leu

130

135

140

Arg

ser

Pro

Asp

ile

Arg

ile

Tyr

Lys

Gly

Lys

Gin

Pro

Tyr

val

Asp

145

150

155

160

val

Ser

Gly Gly

Glu

Ile

Trp

ile

Asn

Ile

Leu

Arg

Glu

Thr

Leu

Lys

165

170

175

Tyr

Gly

Leu

Ser

Pro

Lys

Ser

Trp

Thr

Asp

Tyr

Leu

His

Leu

Thr

Val

180

185

190

Gly Gly

Thr

Leu

Ser

Asn

Ala

Gly

ile

Ser

Gly

Gin

Ala

Phe

Lys

His

195 200 205

-30CZ 304935 B6

Gly Pro Gin Ile 210

Asn

Asn Val Tyr Gin Leu Glu ile val Thr Gly Lys

215

220

Gly

Glu

Val

val

Thr

cys

Ser

Glu

Lys

Arg

Asn

ser

Glu

Leu

Phe

Phe

225

230

235

240

Ser

val

Leu

Gly Gly

Leu

Gly

Gin

phe

Gly

Ile

ile

Thr

Arg

Ala

Arg

245

250

255

Ile

Ser

Leu

Glu

Pro

Ala

Pro

His

Met

Val

Lys

Trp

Ile

Arg

val

Leu

260

265

270

Tyr

Ser

Asp

Phe

Ser

Ala

Phe

Ser

Arg

Asp

Gin

Glu

Tyr

Leu

Ile

Ser

275

280

285

Lys

Glu

Lys

Thr

Phe

Asp

Tyr

val

Glu

Gly

Phe

val

Ile

ile

Asn

Arg

290

295

300

Thr

Asp

Leu

Leu

Asn

Asn

Trp

Arg

Ser

Ser

Phe

Ser

Pro

Asn

Asp

Ser

305

310

315

320

Thr

Gin

Ala

Ser

Arg

Phe

Lys

Ser

Asp

Gly

Lys

Thr

Leu

Tyr

cys

Leu

325

330

335

Glu

val

val

Lys

Tyr

Phe

Asn

Pro

Glu

Glu

Ala

Ser

Ser

Met

ASp

Gin

340

345

350

Glu

Thr

Gly

Lys

Leu

Leu

Ser

Glu

Leu

Asn

Tyr

ile

pro

Ser

Thr

Leu

355

360

365

Phe

Ser

Ser

Glu

val

Pro

Tyr

Ile

Glu

Phe

Leu

Asp

Arg

Val

His

Ile

370

375

380

Ala

Glu

Arg

Lys

Leu

Arg

Ala

Lys

Gly

Leu

Trp

Glu

val

Pro

His

Pro

385

390

395

400

Trp

Leu

Asn

Leu

Leu

ile

Pro

Lys

Ser

Ser

Ile

Tyr

Gin

Phe

Ala

Thr

405

410

415

Glu

val

Phe

Asn

Asn

ile

Leu

Thr

Ser

Asn

Asn

Asn

Gly

Pro

Ile

Leu

420

425

430

Ile

Tyr

Pro

Val

Asn

Gin

Ser

Lys

Trp

Lys

Lys

His

Thr

Ser

Leu

Ile

435

440

445

Thr

Pro

Asn

Glu

Asp

Ile

Phe

Tyr

Leu

val

Ala

Phe

Leu

Pro

Ser

Ala

450

455

460

val

Pro

Asn

Ser

Ser

Gly

Lys

Asn

Asp

Leu

Glu

Tyr

Leu

Leu

Lys

Gin

465

470

475

480

Asn

Gin Arg

val

Met 485

Asn

Phe

Cys Ala Ala Ala 490

Asn

Leu

Asn

val 495

Lys

Gin

Tyr

Leu

Pro

His

Tyr

Glu

Thr

Gin

Lys

Glu

Trp

Lys

Ser

Hi S

Phe

500

505

510

Gly

Lys

Arg

Trp

Glu

Thr

Phe

Ala

Gin

Arg

Lys

Gin

Ala

Tyr

ASP

Pro

515

520

525

Leu

Ala

ile

Leu

Ala

Pro

Gly

Gin

Arg

Ile

Phe

Gin

Lys

Thr

Thr

Gly

530

535

540

Lys

Leu

Ser

Pro

Ile

Gin

Leu

Ala

Lys

Ser

Lys

Ala

Thr

Gly

Ser

Pro

545

550

555

560

Gin

Arg

Tyr

His

Tyr

Ala

ser

ile

Leu

pro

Lys

Pro

Arg

Thr

val

565

570

575

<210> 8 <211> 561 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> Sekvence AtCKXl (bez signálního peptidu) z Arabidopsis thaliana spojená se sekvencí apoplastického signálního peptidu z Arabidopsis thaliana <400> 8

Asn Leu Arg 1

Leu

Met Ile Thr Leu ile Thr val

Leu

Met

Ile

Thr 15

Lys

5

10

Ser

Ser

Asn

Gly

Met

Leu

Ser

Asn

His

Ser

val

Ser

Thr

Pro

Lys

Glu

20

25

30

Leu

Pro

ser

Ser

Asn

pro

Ser

Asp

ile

Arg

ser

ser

Leu

val

Ser

Leu

35

40

45

Asp

Leu

Glu

Gly

Tyr

ile

Ser

Phe

Asp

Asp

val

His

Asn

val

Ala

Lys

50

55

60

Asp

Phe

Gly

Asn

Arg

Tyr

Gin

Leu

pro

pro

Leu

Ala

ile

Leu

His

pro

65

70

75

80

Arg

Ser

Val

Phe

Asp

Ile

Ser

Ser

Met

Met

Lys

His

Ile

Val

His

Leu

85

90

95

Gly

Ser

Thr

Ser

Asn

Leu

Thr

val

Ala

Ala

Arg

Gly

His

Gly

His

Ser

100

105

110

Leu

Gin

Gly

Gin

Ala

Leu

Ala

His

Gin

Gly

val

val

Ile

Lys

Met

Glu

115

120

125

-32CZ 304935 B6

Ser Leu Arg

Ser Pro Asp

ile Arg 135

Ile Tyr

Lys

Gly 140

Lys Gin

Pro

Tyr

130

val

Asp

val

ser

Gly Gly

Glu

ile

Trp

ile

Asn

Ile

Leu

Arg

Glu

Thr

145

150

155

160

Leu

Lys

Tyr

Gly

Leu

Ser

Pro

Lys

Ser

Trp

Thr

Asp

Tyr

Leu

His

Leu

165

170

175

Thr

val

Gly Gly

Thr

Leu

Ser

Asn

Ala

Gly

Ile

Ser

Gly

Gin

Ala

Phe

180

185

190

Lys

His

Gly

Pro

Gin

Ile

Asn

Asn

Val

Tyr

Gin

Leu

Glu

Ile

val

Thr

195

200

205

Gly

Lys

Gly

Glu

val

val

Thr

cys

ser

Glu

Lys

Arg

Asn

Ser

Glu

Leu

210

215

220

Phe

Phe

Ser

Val

Leu

Gly Gly

Leu

Gly

Gin

Phe

Gly

Ile

Ile

Thr

Arg

225

230

235

240

Ala

Arg

Ile

Ser

Leu

Glu

Pro

Ala

Pro

His

Met

Val

Lys

Trp

ile

Arg

245

250

255

val

Leu

Tyr

Ser

Asp

Phe

Ser

Ala

Phe

Ser

Arg

Asp

Gin

Glu

Tyr

Leu

260

265

270

ile

ser

Lys

Glu

Lys

Thr

Phe

Asp

Tyr

val

Glu

Gly

Phe

Val

ile

ile

275

280

285

Asn

Arg

Thr

Asp

Leu

Leu

Asn

Asn

Trp

Arg

Ser

Ser

Phe

Ser

Pro

Asn

290

295

300

Asp

Ser

Thr

Gin

Ala

Ser

Arg

Phe

Lys

Ser

Asp

Gly

Lys

Thr

Leu

Tyr

305

310

315

320

Cys

Leu

Glu

Val

val

Lys

Tyr

Phe

Asn

Pro

Glu

Glu

Ala

Ser

Ser

Met

325

330

335

Asp

Gin

Glu

Thr

Gly

Lys

Leu

Leu

ser

Glu

Leu

Asn

Tyr

ile

Pro

Ser

340

345

350

Thr

Leu

Phe

Ser

Ser

Glu

Val

Pro

Tyr

Ile

Glu

Phe

Leu

Asp

Arg

val

355

360

365

His

ile

Ala

Glu

Arg

Lys

Leu

Arg

Ala

Lys

Gly

Leu

Trp

Glu

val

Pro

370

375

380

His

Pro

Trp

Leu

Asn

Leu

Leu

ile

Pro

Lys

Ser

Ser

ile

Tyr

Gin

Phe

385

390

395

400

-33CZ 304935 B6

Ala Thr

Glu

Val

Phe Asn Asn Ile Leu Thr

Ser Asn Asn Asn Gly 415

Pro

405

410

Ile

Leu

Ile

Tyr

Pro

val

Asn

Gin

Ser

Lys

Trp

Lys

Lys

HÍS

Thr

Ser

420

425

430

Leu

Ile

Thr

Pro

Asn

Glu

Asp

Ile

Phe

Tyr

Leu

Val

Ala

Phe

Leu

Pro

435

440

445

Ser

Ala

Val

Pro

Asn

Ser

Ser

Gly

Lys

Asn

Asp

Leu

Glu

Tyr

Leu

Leu

450

455

460

Lys

Gin

Asn

Gin

Arg

Val

Met

Asn

Phe

Cys

Ala

Ala

Ala

Asn

Leu

Asn

465

470

475

480

val

Lys

Gin

Tyr

Leu

Pro

His

Tyr

Glu

Thr

Gin

Lys

Glu

Trp

Lys

Ser

485

490

495

His

Phe

Gly

Lys

Arg

Trp

Glu

Thr

Phe

Ala

Gin

Arg

Lys

Gin

Ala

Tyr

500

505

510

Asp

Pro

Leu

Ala

ile

Leu

Ala

Pro

Gly

Gin

Arg

ile

Phe

Gin

Lys

Thr

515

520

525

Thr

Gly

Lys

Leu

Ser

Pro

ile

Gin

Leu

Ala

Lys

ser

Lys

Ala

Thr

Gly

530

535

540

Ser

Pro

Gin

Arg

Tyr

His

Tyr

Ala

ser

ile

Leu

Pro

Lys

Pro

Arg

Thr

545

550

555

560

Val <210> 9 <211> 538 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 9

Asn

His

ser

val

Ser

Thr

Pro

Lys

Glu

Leu

Pro

Ser

Ser

Asn

Pro

Ser

1

5

10

·-

15

ASp

ile

Arg

Ser

Ser

Leu

val

ser

Leu

Asp

Leu

Glu

Gly

Tyr

ile

Ser

20

25

30

Phe

Asp

Asp

Val

His

Asn

Val

Ala

Lys

Asp

Phe

Gly

Asn

Arg

Tyr

Gin

35

40

45

Leu

Pro

Pro

Leu

Ala

Ile

Leu

His

Pro

Arg

Ser

Val

Phe

Asp

Ile

Ser

50

55

60

Ser

Met

Met

Lys

His

Ile

val

Hi S

Leu

Gly

Ser

Thr

Ser

Asn

Leu

Thr

-34CZ 304935 B6

70 75 80

val

Ala Ala Arg

Gly 85

His

Gly

His

Ser Leu Gin Gly Gin Ala Leu

Ala

90

95

His

Gin

Gly

val

val

Ile

Lys

Met

Glu

Ser

Leu

Arg

Ser

Pro

Asp

ile

100

105

110

Arg

Ile

Tyr

Lys

Gly

Lys

Gin

Pro

Tyr

val

Asp

val

Ser

Gly Gly

Glu

115

120

125

ile

Trp

Ile

Asn

ile

Leu

Arg

Glu

Thr

Leu

Lys

Tyr

Gly

Leu

Ser

Pro

130

135

140

Lys

Ser

Trp

Thr

Asp

Tyr

Leu

His

Leu

Thr

val

Gly Gly

Thr

Leu

Ser

145

150

155

160

Asn

Ala

Gly

Ile

Ser

Gly

Gin

Ala

Phe

Lys

His

Gly

Pro

Gin

Ile

Asn

165

170

175

Asn

val

Tyr

Gin

Leu

Glu

ile

val

Thr

Gly

Lys

Gly

Glu

val

val

Thr

180

185

190

cys

Ser

Glu

Lys

Arg

Asn

Ser

Glu

Leu

Phe

Phe

Ser

val

Leu

Gly Gly

195

200

205

Leu

Gly

Gin

Phe

Gly

Ile

Ile

Thr

Arg

Ala

Arg

ile

Ser

Leu

Glu

Pro

210

215

220

Ala

pro

Hi s

Met

val

Lys

Trp

ile

Arg

val

Leu

Tyr

Ser

Asp

Phe

Ser

225

230

235

240

Ala

Phe

ser

Arg

Asp

Gin

Glu

Tyr

Leu

Ile

Ser

Lys

Glu

Lys

Thr

Phe

245

250

255

Asp

Tyr

val

Glu

Gly

Phe

val

Ile

Ile

Asn

Arg

Thr

Asp

Leu

Leu

Asn

260

265

270

Asn

Trp

Arg

Ser

Ser

Phe

Ser

Pro

Asn

Asp

Ser

Thr

Gin

Ala

Ser

Arg

275

280

285

Phe

Lys

Ser

Asp

Gly

Lys

Thr

Leu

Tyr

cys

Leu

Glu

val

val

Lys

Tyr

290

295

300

Phe

Asn

Pro

Glu

Glu

Ala

Ser

Ser

Met

Asp

Gin

Glu

Thr

Gly

Lys

Leu

305

310

315

320

Leu

Ser

Glu

Leu

Asn

Tyr

Ile

Pro

Ser

Thr

Leu

Phe

Ser

ser

Glu

val

325

330

335

Pro

Tyr

ile

Glu

Phe

Leu

Asp

Arg

val

Hi S

Ile

Ala

Glu

Arg

Lys

Leu

-35 CZ 304935 B6

340 345 350

Arg Ala Lys

Gly

Leu

Trp Glu

val 360

Pro

His

Pro

Trp

Leu 365

Asn

Leu

Leu

355

Ile

Pro

Lys

Ser

Ser

Ile

Tyr

Gin

Phe

Ala

Thr

Glu

Val

Phe

Asn

Asn

370

375

380

ile

Leu

Thr

Ser

Asn

Asn

Asn

Gly

pro

Ile

Leu

ile

Tyr

Pro

Val

Asn

385

390

395

400

Gin

Ser

Lys

Trp

Lys

Lys

His

Thr

ser

Leu

Ile

Thr

Pro

Asn

Glu

Asp

405

410

415

Ile

Phe

Tyr

Leu

Val

Ala

Phe

Leu

Pro

Ser

Ala

val

Pro

Asn

Ser

Ser

420

425

430

Gly

Lys

Asn

Asp

Leu

Glu

Tyr

Leu

Leu

Lys

Gin

Asn

Gin

Arg

val

Met

435

440

445

Asn

Phe

cys

Ala

Ala

Ala

Asn

Leu

Asn

Val

Lys

Gin

Tyr

Leu

Pro

His

450

455

460

Tyr

Glu

Thr

Gin

Lys

Glu

Trp

Lys

Ser

His

Phe

Gly

Lys

Arg

Trp

Glu

465

470

475

480

Thr

Phe

Ala

Gin

Arg

Lys

Gin

Ala

Tyr

Asp

Pro

Leu

Ala

Ile

Leu

Ala

485

490

495

Pro

Gly

Gin

Arg

ile

Phe

Gin

Lys

Thr

Thr

Gly

Lys

Leu

Ser

Pro

ile

500

505

510

Gin

Leu

Ala

Lys

Ser

Lys

Ala

Thr

Gly

Ser

Pro

Gin

Arg

Tyr

Hi s

Tyr

515

520

525

Ala

Ser

Ile

Leu

Pro

Lys

Pro

Arg

Thr

Val

530

535

Claims (7)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Způsob přípravy rostlin ječmene odolných vůči suchu, vyznačený tím, že se do genomu ječmene vloží nukleotidová sekvence obsahující β-glukosidasový promotor a sekvenci, která kóduje enzym s cytokinindehydrogenázovou aktivitou a která má alespoň 80% identitu k sekvenci genu AtCKXl vybrané ze skupiny zahrnující sekvence SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2 a SEQ ID NO. 3, anebo alespoň 90% identitu k nukleotidové sekvenci kódující polypeptid vybraný ze skupiny zahrnující sekvence SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 9, přičemž sekvence kódující enzym s cytokinindehydrogenázovou aktivitou je řízená β-glukosidasovým promotorem.
2. 2. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, že nukleotidová sekvence se vloží pomocí Agrobacteria tumefaciens.
3. 3. Expresní kazeta, vyznačená tím, že obsahuje β-glukosidasový promotor-4/CALY7terminátor, přičemž AtCKXl je sekvence s alespoň 80% identitou k sekvenci vybrané ze skupiny zahrnující sekvence SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2 a SEQ ID NO. 3, anebo sekvence s alespoň 90% identitou k nukleotidové sekvenci kódující polypeptid vybraný ze skupiny zahrnující sekvence SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 9, přičemž sekvence kóduje enzym s cytokinindehydrogenázovou aktivitou.
4. 4. Expresní kazeta podle nároku 3, vyznačená tím, že obsahuje β-glukosidasový promotor::AtCKXl vakuolámí::NOS terminátor, a má sekvenci s alespoň 80% identitou, s výhodou s alespoň 90% identitou k sekvenci SEQ ID NO. 4.
5. 5. Expresní kazeta podle nároku 3, vyznačená tím, že obsahuje β-glukosidasový promotor::AtCKXl apoplastická::NOS terminátor, a má sekvenci s alespoň 80% identitou, s výhodou s alespoň 90% identitou k sekvenci SEQ ID NO. 5.
6. 6. Expresní kazeta podle nároku 3, vyznačená tím, že obsahuje β-glukosidasový promotor::AtCKXl cytosolická::NOS terminátor, a má sekvenci s alespoň 80% identitou, s výhodou s alespoň 90% identitou k sekvenci SEQ ID NO. 6.
7. 7. Použití expresní kazety podle kteréhokoliv z nároků 3 až 6 pro přípravu rostlin ječmene vykazujících odolnost vůči suchu.