CZ2013948A3 - Způsob přípravy ječmene se zvýšenou odolností vůči suchu - Google Patents
Způsob přípravy ječmene se zvýšenou odolností vůči suchu Download PDFInfo
- Publication number
- CZ2013948A3 CZ2013948A3 CZ2013-948A CZ2013948A CZ2013948A3 CZ 2013948 A3 CZ2013948 A3 CZ 2013948A3 CZ 2013948 A CZ2013948 A CZ 2013948A CZ 2013948 A3 CZ2013948 A3 CZ 2013948A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- leu
- ser
- ile
- lys
- seq
- Prior art date
Links
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Řešení poskytuje způsob přípravy rostlin ječmene odolných vůči suchu, při němž se do genomu ječmene vloží nukleotidová sekvence obsahující .beta.-glukosidasový promotor a sekvenci, která kóduje enzym s cytokinindehydrogenázovou aktivitou a která má alespoň 80 % identitu k sekvenci genu AtCKX1 z rostliny Arabidopsis thaliana. Dále řešení poskytuje expresní kazetu, která obsahuje .beta.-glukosidasový promotor-AtCKX1-terminátor, a použití této expresní kazety pro přípravu rostlin ječmene vykazujících odolnost vůči suchu.
Description
Způsob přípravy ječmene se zvýšenou odolností vůči suchu
Oblast techniky
Vynález se týká způsobu přípravy geneticky modifikovaných rostlin ječmene, které vykazují, v důsledku změněné hladiny cytokininů převážně v kořenech, zvýšenou odolnost vůči suchu. Modifikace hladiny cytokininů je zajištěna ektopicky produkovanou cytokinindehydrogenasou lokalizovanou v cytosolu, apoplastu nebo vakuolách.
Dosavadní stav techniky
Ječmen setý (Hordeum vulgare) je hospodářsky významnou rostlinou, která se využívá zejména k výrobě sladu a dále je potravinářskou, krmnou a farmaceutickou plodinou. Změna jeho genetických vlastností může vést k významnému zlepšení zemědělských parametrů této obiloviny.
Architektura rostliny může být cíleně upravena změnou hladin cytokininů, rostlinných hormonů (Mok DWS and Mok MC. (2001), Ann Rev Plant Physiol Plant Mol Biol. 52:89118), které se podílejí na regulaci řady klíčových procesů probíhajících v rostlinách, jako je např. dělení a diferenciace buněk (Bianco MD, Giustini L, Sabatini S. (2013), New Phytol. 199:324-38), odolnost vůči stresu (Dobrev Pl, Vaňkova R. (2012), Methods Mol Biol. 913:251-61; Kuppu S, MishraN, Hu R, Sun L, Zhu X, Shen G, Blumwald E, Payton P, Zhang H. (2013), PLoS One. 8:e64190) a oddálení senescence (Khan M, Rozhon W, Poppenberger
B. (2013), Gerontology. (před tiskem)). Jednotlivé formy cytokininů a jejich deriváty se liší biologickou aktivitou. Dle zvolených citovaných publikací je patrné, že jsou tyto hormony stále intenzivně studovány pro jejich klíčový vliv na růst a vývoj rostlin, čehož by bylo možné využít při pěstování zemědělsky významných plodin např. ke zvětšení výnosu (Powell AF, Paleczny AR, Olechowski H, Emery RJ. (2013), Plant Physiol Biochem. 64:33-40) či lepší odolnosti vůči biotickému (Reusche M, Klásková J, Thole K, Truskina J, Novák O, Janz D, Strnad M, Spíchal L, Lipka V, Teichmann T. (2013), Mol Plant Microbe Interact. 26:850-60) a abiotickému stresu (Dobrev Pl, Vaňkova R. (2012), Methods Mol Biol. 913:251-61).
Vzhledem k nárůstu světové populace probíhají snahy o využití půdy pro zemědělské účely i v oblastech, které nejsou v současné době pro pěstování plodin vhodné. Předpokládá se také, že negativní změny klimatu, včetně těch zapříčiněných lidskou činností, budou mít za
-2následek prodloužení suchých period a zvyšování teploty. Snahy o zvýšení odolnosti významných rostlin vůči stresu suchem za užití rozličných přístupů jsou tedy v posledních letech značné a korespondují se závažností situace (Grayson M. (2013), Agriculture and drought. Nátuře Outlook 01 :S 1).
Odbourávám cytokininů je v každé rostlině zajištěno enzymovou aktivitou cytokinindehydrogenasy (EC 1.5.99.12; CKX) (Galuszka P, Frébort I, Šebela M, Sauer P, Jacobsen S, Peč P. (2001), Eur J Biochem. 268:450-61), která se vyskytuje v rostlinách v různých formách působících v různých buněčných kompartmentech (Werner T, Motyka V, Laucou V, Smets R, Van Onckelen H, Schmůlling T. (2003), Planí Cell. 15:2532-50; Schmůlling, T., Werner, T., Riefler, M., Krupková, E. and Bartrina y Manns, I. (2003), J Planí Res. 116:241-52; Liu Z, Lv Y, Zhang M, Liu Y, Kong L, Zou M, Lu G, Cao J, Yu X. (2013), BMC Genomics. 14:594 (před tiskem)', Tsai YC, Weir NR, Hill K, Zhang W, Kim HJ, Shiu SH, Schaller GE, Kieber JJ. (2012), Plant Physiol. 158:1666-84) v různém stadiu vývoje rostlin (Powell AF, Paleczny AR, Olechowski H, Emery RJ. (2013), Plant Physiol Biochem. 64:33-40). Jednotlivé formy CKX mají také odlišnou substrátovou specificitu, což je dáno rozdílnou lokalizací cytokininů v rostlinném pletivu. U rostliny A. thaliana byla substrátová specifita CKX (Galuszka P, Popelková H, Werner T, Frébortová J, Pospíšilová H, Mik V et al. (2007), J Plant Growth Regul. 26:255-67) a lokalizace jednotlivých CKX popsána nejlépe. A. thaliana obsahuje dvě vakuolámí CKX (AtCKXl a AtCKX3), jednu cytosolickou CKX (AtCKX7) a zbývající čtyři jsou pravděpodobně apoplastické (Werner T, Motyka V, Laucou V, Smets R, Van Onckelen H, Schmůlling T. (2003), Plant Cell. 15:2532-50). Bylo zjištěno, že sekreto váné (apoplastické) formy CKX preferují jako substrát volné cytokininové báze, vakuolámí formy zase N-glykosylované cytokininy (Galuszka et al. (2007), J Plant Growth Regul. 26:255-67). Zajímavé je, že vakuolámí CKX preferují di- a trifosfáty cytokininů, které jsou primárními produkty de novo biosyntézy cytokininů v rostlinách (Kowalska M, Galuszka P, Frébortová J, Šebela M, Béres T, Hluska T, Šmehilová M, Bilyeu KD, Frébort I. (2010), Phytochemistry. 71:1970-8). Na základě toho můžeme usuzovat na odlišné biologické funkce jednotlivých forem CKX. Z toho vyplývá, že kombinací požadované formy enzymu, signální sekvence, která protein směruje do jednotlivých kompartmentů a vhodného pletivově specifického promotoru můžeme cíleně ovlivnit výsledný fenotyp rostliny.
Studium geneticky modifikovaných dvouděložných rostlin s naprodukovanou CKX probíhá již od roku 2001 (Werner T, Motyka V, Strnad M, Schmůlling T (2001), Proč Nati Acad Sci
USA. 98:10487-92). Fenotyp takovýchto rostlin se nazývá cytokinin-deficientní, a projevuje
.. 3 se zejména sníženou nadzemní částí a produktivitou a dále zvětšením kořenového systému (Werner T, Motyka V, Strnad M, Schmulling T (2001), Proč Nati Acad Sci USA. 98:1048792; Galuszka P, Frébortová J, Werner T, Yamada M, Strnad M, Schmulling T, Frébort I. (2004), Eur J Biochem. 271:3990-4002). Konkrétně byly připraveny geneticky modifikované rostliny A. thaliana s naprodukcí AtCKXl, 2, 3, 4, 5 nebo 6, u nichž byl pozorován podobný cytokinin-deficientní fenotyp, který byl nejvýraznější u rostlin s nadexpresí AtCKXl, 3 a 5 (Werner et al. (2003), Plant Cell. 15:2532-50). Později byly připraveny rostliny Arabidopsis s kořenově specifickou nadprodukcí AtCKX3 u nichž byla až o 40% zvětšená hmota kořenů bez negativního vlivu na fertilitu rostlin a modifikované rostliny vykazovaly vyšší odolnost vůči stresu suchem (Werner T, Nehnevajova E, Kóllmer I, Novák O, Strnad M, Kramer U, Schmulling T. (2010), Plant Cell. 22:3905-20). Obdobný fenotyp byl pozorován také u tabáku s naprodukcí AtCKXl, kde byla také potvrzena zvýšená odolnost těchto rostlin vůči suchu (Macková H, Hronková M, Dobrá J, Turečková V, Novák O, Lubovská Z, Motyka V, Haisel D, Hájek T, Prášil IT, Gaudinová A, Štorchová H, Ge E, Werner T, Schmulling T, Vaňková R. (2013), J Exp Bot. 64:2805-15).
Na rozdíl od dvouděložných rostlin jsou jednoděložné rostliny obtížněji transformovatelné, zejména v důsledku nedostatečné regenerace rostlin z nediferencovaného pletiva. Pro získám stabilních linií se stejně jako u dvouděložných využívá transformace pomocí bakterie A. tumefaciens (Harwood WA, Bartlett JG, Alves SC, Perry M, Smedley MA, Leyland N, Snape JW. (2009), In Methods in Molecular Biology, Vol. 478 (Jones H. D, Shewry P. R. ed.), pp. 137-147, Humana Press, New York, USA). Na základě publikovaných údajů byla manipulace s geny pro CKX u jednoděložné rostliny provedena pouze jednou a to u ječmene na našem pracovišti. Jednalo se o kukuřičný gen ZmCKXl (Mřížová K, Jiskrová E, Vyroubalová Š, Novák O, Ohnoutková L, Pospíšilová H, Frébort I, Harwood WA, Galuszka P. (2013), Přijato kpublikaci do PLOS ONE). Na rozdíl od nadprodukce CKX proteinu u dvouděložných rostlin, byl cytokinin-deficientní fenotyp rostlin ječmene s CKX řízenou konstitutivním promotorem příliš silný, což se projevovalo sníženou schopností regenerace transgenních rostlin, jejich sterilitou a předčasnou senescencí. Z tohoto důvodu byl použit β-glukosidasový promotor, který má nej silnější aktivitu v kořenech (Gu R, Zhao L, Zhang Y, Chen X, Bao J, Zhao J, Wang Z, Fu J, Liu T, Wang J, Wang G. (2006), Plant Cell Rep. 25:1157-65) pro regulaci exprese ZmCKXl (nepublikovaná data). Tyto rostliny měly také sníženou schopnost regenerace a silný cytokinin-deficientní fenotyp (Obr. 1). Bylo získáno 5 nezávislých transgenních linií ječmene, u kterých byla detekována až lOx zvýšená aktivita CKX. Tyto . » 4 i
- 4 rostliny byly v důsledku vnesené ZmCKXl sterilní a neposkytly žádné potomstvo. Z těchto údajů vyplývá, že výsledky získané při nadprodukci CKX u dvouděložných rostlin není možné aplikovat na jednoděložné obiloviny, kde může probíhat regulace metabolismu cytokininů odlišným způsobem (Hirose N, Makita N, Kojima M, Kamada-Nobusada T, Sakakibara H. (2007) Plant Cell Physiol. 48:523-39).
Další dostupné údaje o jednoděložných rostlinách s nadprodukovanou CKX jsou uvedeny v dokumentu US 2009/0165174. Jedná se o nadprodukci kukuřičných CKX v kukuřici. Dle našich dat uvedených výše je použití kukuřičné ZmCKXl v ječmeni nevhodné a není tedy možné aplikovat výsledky získané studiem geneticky modifikované kukuřice na ječmen.
Podstata vynálezu
Předmětem předkládaného vynálezu je způsob přípravy rostlin ječmene odolných vůči suchu, jehož podstata spočívá v tom, že se do genomu ječmene vloží nukleotidová sekvence obsahující sekvenci s alespoň 80% identitou, s výhodou s alespoň 90% identitou, výhodněji s alespoň 95% identitou k sekvenci genu AtCKXl (cytokinin dehydrogenasa pocházející z rostliny Arabidopsis thaliand) vybrané ze skupiny zahrnující sekvence SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2 a SEQ ID NO. 3, a nebo obsahující sekvenci s alespoň 90% identitou, s výhodou s alespoň 95% identitou, k nukleotidové sekvenci kódující polypeptid vybraný ze skupiny zahrnující sekvence SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 9.
Vložená sekvence je řízená β-glukosidasovým promotorem.
S výhodou se sekvence vloží pomocí Agrobacteria tumefaciens.
80% identity, s výhodou 90% identity, výhodněji 95% identity se zde uvedenými sekvencemi se dosáhne například prodloužením či zkrácením sekvence nebo bodovými mutacemi v sekvenci, zejména takovými, které nemění kódované aminokyseliny vzhledem k degeneraci genetického kódu.
V rámci předkládaného vynálezu bylo zjištěno, že pro přípravu geneticky modifikovaných rostlin odolných vůči suchu je vhodná vakuolární AtCKXl (nukleotidová sekvence SEQ ID
NO. 1; přirozená forma; Werner et al. (2001), Proč Nati Acad Sci USA. 98:10487-92, odpovídající aminokyselinová sekvence SEQ ID NO. 7), apoplastická AtCKXl (nukleotidová
- 5 sekvence SEQ ID NO. 2, signální peptid z AtCKX2, odpovídající aminokyselinová sekvence SEQ ID NO. 8) nebo cytosolická forma AtCKXl (nukleotidová sekvence SEQ ID NO. 3, bez signálního peptidu, odpovídající aminokyselinová sekvence SEQ ID NO. 9), s výhodou řízená β-glukosidasovým promotorem s nej vyšší mírou exprese v kořeni (Gu et al., (2006), Plant Cell Rep. 25:1157-65). Pomocí A. tumefaciens lze tyto sekvence integrovat do genomu ječmene a získat transgenní rostliny, u kterých byla pozorována zvýšená odolnost vůči suchu. Zvýšená odolnost rostlin vůči suchu zvyšuje šanci na přežití rostlin ječmene při růstu v nepříznivých klimatických podmínkách.
Předmětem vynálezu je dále expresní kazeta, která obsahuje β-glukosidasový promotorAtCKXl-terminátor. AtCKXl je sekvence s alespoň 80% identitou, s výhodou s alespoň 90% identitou, výhodněji s alespoň 95% identitou k sekvenci vybrané ze skupiny zahrnující sekvence SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2 a SEQ ID NO. 3, a nebo sekvence s alespoň 90% identitou, s výhodou s alespoň 95% identitou k nukleotidové sekvenci kódující polypeptid vybraný ze skupiny zahrnující sekvence SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 9. Promotorem je s výhodou β-glukosidasový promotor, terminátorem je s výhodou NOS terminátor.
V jednom výhodném provedení expresní kazeta obsahuje: β-glukosidasový promotor: ‘.AtCKXl vakuolámí::NOS terminátor, a má sekvenci s alespoň 80% identitou, s výhodou s alespoň 90% identitou, výhodněji s alespoň 95% identitou k sekvenci SEQ ID NO. 4.
SEQ ID NO. 4:
Pozice jednotlivých funkčních úseků: β-glukosidasový promotor: 50 bp - 950 bp Vakuolámí signální sekvence: 966 bp - 1076 bp AtCKXl (bez zahrnutí signální sekvence): 1077 bp - 2693 bp NOS terminátor: 2721 bp - 2974 bp
....1....1 ..,.1....1 ....1....1 ..,.1....1 | | ....i.... |
20 30 40 50 60 70 Θ0 90 100
ACAAGTTTGT ACAAAAAAGC AGGCTTTAAA GGAACCAATT CAAGAATTCC AAAGCTGCCG CATTCGGCAA AGCCTGCAAT TCCGGTAGTG TTTTACCACG
....[....I ..I ....1....1
110 120 130 140 150 160 170 180 190 200
TTGACAAAAA AAATGAAGAA ATCCGATATT TTAGTCATTA TGGATATGGC GCGGTGTCAA ATCGGTATAG TCATAATCCT TTCCATAGGA TTGTCCCATG
6210 220 230 240 250 260 270 280 290300
CTCGACACAT TAACACTAAG TTTATCCCTG AATAACACGG CTACCTCCAT CCTAATCTTT TCTATTGATC AATTGCC1AT TTTTAAGGCG CAGTTGTTCT
310 320 330 340 350 360 370 380 390400
TGGCCGTATC TGTGGAGATG ATTTTTTTAA AGACGTCCAA CTCTAGCTAG CTAGTCCGTG TATGTGAACG GTGTTAGGTA GTCATTGGAT CCGTTGACTA
410 420 430 440 450 460 470 480 490500
TATTTGTAAA GGTGGTAGCC GTTCTTTTTA ATTTTAACGC CGCTGGGAAG AAATTAAACG TGGTACATCT ATGTATCGTT TTCTTAACAG TGATATAATA
510 520 530 540 550 560 570 580 590600
ATATACTATC ATTGCAAGCG TCCGCAATTG CTCTCTCGCG GCTCGTTCTA CCGTGGGAAG AAGAGCTGAC CCGTCGCCGC CCCACATGCA TACGATGCGT
610 620 630 640 650 660 670 680 690700
CCTTATCTGT CGCGGCTCGT GCAAACGCGG GGCGGGCTGA GCGCCCCAGC CCACCACTTG CACCACTTGC ATTTACTTAA TTAGTTCATA ACACATCACA
....1....1 ....)....1 ....I | ....I....I
710 720 730 740 750 760 770 780 790800
TCTGTATCTT ACATTATCTT TAAAAAAATG ATTCACACAT TATTTATATA TGAGATATAA TAAGTTTCCA GGAAGCATCT TTGGCGACTT ACGTACGTGT
| 810 | 820 | 830 | 840 | 850 | 860 | 870 | 880 | 890 | 900 |
| ATCAGAGACA | TGGAGTGATA . | AACTATTGGG | CAACCATTTA | GCAATCCTAG | CTAGCCAGCT | CGTCTATAAA | TAGATGCATC AGCTCCACTT | GGTCTACACA | |
| ....i....) 910 | . ... 1 .... 1 920 | . ... 1 .... | 930 | ....)....1 940 | ....I....) 950 | . ... 1 .... | 960 | .... 1 .... 1 970 | 980 | . ... 1 .... 1 990 | . ... 1 .... I 1000 |
CTTCACAAGC AGCTCAAAGC TCTAGTTCTA GCTAGCTAGC AAAGGGGGGG AAAGGTACCG TCGACATGGG ATTGACCTCA TCCTTACGGT TCCATAGACA
1010 1020 1030 1040 1050 1060 1070 1080 10901100
AAACAACAAG ACTTTCCTCG GAATCTTCAT GATCTTAGTT CTAAGCTGTA TACCAGGTAG AACCAATCTT TGTTCCAATC ATTCTGTTAG TACCCCAAAA
....1....1 ....1....1 ...-1-...1 | ....)....1 ....I....I|
1110 1120 1130 1140 1150 1160 1170 1180 11901200
GAATTACCTT CTTCAAATCC TTCAGATATT CGTTCCTCAT TAGTTTCACT AGATTTGGAG GGTTATATAA GCTTCGACGA TGTCCACAAT GTGGCCAAGG
....I·.-.1 ....1....1 ....1....1 ....1....1 ..-.)....1 ....1....1 ....1....1 ..,,1....1 ....1.,..1 ....1.,.. |
1210 1220 1230 1240 1250 1260 1270 1280 12901300
ACTTTGGCAA CAGATACCAG TTACCACCTT TGGCAATTCT ACATCCAAGG TCAGTTTTTG ATATTTCATC GATGATGAAG CATATAGTAC ATCTGGGCTC
....I·. ..i ....I....) ....)-..-1 ....1....1 ....1,...1 ....)....1 ....1....1 ....)....1
1310 1320 1330 1340 1350 1360 1370 1380 13901400
CACCTCAAAT CTTACAGTAG CAGCTAGAGG CCATGGTCAC TCGCTTCAAG GACAAGCTCT AGCTCATCAA GGTGTTGTCA TCAAAATGGA GTCACTTCGA
....1....1 ....1....1 ....1....1 ....1....1 ....1....| ....I....I ....)....1 ...,1,...1 ....).,..) ....I.,..)
1410 1420 1430 1440 1450 1460 1470 1480 14901500
AGTCCTGATA TCAGGATTTA TAAGGGGAAG CAACCATATG TTGATGTCTC AGGTGGTGAA ATATGGATAA ACATTCTACG CGAGACTCTA AAATACGGTC
I I ....)....1 ....I....I I ....I....) ....)....1 ....).. ..| ..,.)....1 ....I....)
1510 1520 1530 1540 1550 1560 1570 1580 15901600
TTTCACCAAA GTCCTGGACA GACTACCTTC ATTTGACCGT TGGAGGTACA CTATCTAATG CTGGAATCAG CGGTCAAGCA TTCAAGCATG GACCCCAAAT
....I..-- I ....1....1 ....)....) ....I....) ....I....) ....)....1 ....)....1
1610 1620 1630 1640 1650 1660 1670 1680 16901700
CAACAACGTC TACCAGCTAG AGATTGTTAC AGGGAAAGGA GAAGTCGTAA CCTGTTCTGA GAAGCGGAAT TCTGAACTTT TCTTCAGTGT TCTTGGCGGG
1710 1720 1730 1740 1750 1760 1770 1780 17901800
CTTGGACAGT TTGGCATAAT CACCCGGGCA CGGATCTCTC TTGAACCAGC ACCGCATATG GTTAAATGGA TCAGGGTACT CTACTCTGAC TTTTCTGCAT
....)....1 ....I....) .... | ....I....)
1810 1820 1830 1840 1850 1860 1870 1880 18901900
TTTCAAGGGA CCAAGAATAT CTGATTTCGA AGGAGAAAAC TTTTGATTAC GTTGAAGGAT TTGTGATAAT CAATAGAACA GACCTTCTCA ATAATTGGCG
1910 1920 1930 1940 1950 1960 1970 1980 19902000
ATCGTCATTC AGTCCCAACG ATTCCACACA GGCAAGCAGA TTCAAGTCAG ATGGGAAAAC TCTTTATTGC CTAGAAGTGG TCAAATATTT CAACCCAGAA
....I....I ....1....1 ,...1....1 ..--1-...1 ....I....I I ....1....1|
2010 2020 2030 2040 2050 2060 2070 2080 20902100
GAAGCTAGCT CTATGGATCA GGAAACTGGC AAGTTACTTT CAGAGTTAAA TTATATTCCA TCCACTTTGT TTTCATCTGA AGTGCCATAT ATCGAGTTTC
....1....1 I -...1-...1
2110 2120 2130 2140 2150 2160 2170 2180 21902200
TGGATCGCGT GCATATCGCA GAGAGAAAAC TAAGAGCAAA GGGTTTATGG GAGGTTCCAC ATCCCTGGCT GAATCTCCTG ATTCCTAAGA GCAGCATATA
2210 2220 2230 2240 2250 2260 2270 2280 22902300
CCAATTTGCT ACAGAAGTTT TCAACAACAT TCTCACAAGC AACAACAACG GTCCTATCCT TATTTATCCA GTCAATCAAT CCAAGTGGAA GAAACATACA
2310 2320 2330 2340 2350 2360 2370 2380 23902400
TCTTTGATAA CTCCAAATGA AGATATATTC TATCTCGTAG CCTTTCTCCC CTCTGCAGTG CCAAATTCCT CAGGGAAAAA CGATCTAGAG TACCTTTTGA
2410 2420 2430 2440 2450 2460 2470 2480 24902500
AACAAAACCA AAGAGTTATG AACTTCTGCG CAGCAGCAAA CCTCAACGTG AAGCAGTATT TGCCCCATTA TGAAACTCAA AAAGAGTGGA AATCACACTT
....1....1 ....1....1 ....I.... I ....1....1 ....1..., |..|
2510 2520 2530 2540 2550 2560 2570 2580 25902600
TGGCAAAAGA TGGGAAACAT TTGCACAGAG GAAACAAGCC TACGACCCTC TAGCGATTCT AGCACCTGGC CAAAGAATAT TCCAAAAGAC AACAGGAAAA
..,.1....1 ....1..,.1 ....I....] ....(....I ..,.)....1|
2610 2620 2630 2640 2650 2660 2670 2680 26902700
TTATCTCCCA TCCAACTCGC AAAGTCAAAG GCAACAGGAA GTCCTCAAAG GTACCATTAC GCATCAATAC TGCCGAAACC TAGAACTGTA TAAGTCGACT
2710 2720 2730 2740 2750 2760 2770 2780 27902800
CGAGTCTAGA AGTCGAAGCA GATCGTTCAA ACATTTGGCA ATAAAGTTTC TTAAGATTGA ATCCTGTTGC CGGTCTTGCG ATGATTATCA TATAATTTCT
I | ....I....! I|
2810 2820 2830 2840 2850 2860 2870 2880 28902900
GTTGAATTAC GTTAAGCATG TAATAATTAA CATGTAATGC ATGACGTTAT TTATGAGATG GGTTTTTATG ATTAGAGTCC CGCAATTATA CATTTAATAC
I II
2910 2920 2930 2940 2950 2960 2970 2980 29903000
GCGATAGAAA ACAAAATATA GCGCGCAAAC TAGGATAAAT TATCGCGCGC GGTGTCATCT ATGTTACTAG ATCGACCGGC AAGCAAGCTG ATATGCGGCC
I -..-1-...1 ...-I....I ....(....I ....I....I
3010 3020 3030 3040 3050 3060 3070 3080 30903100
GCACTCGAGA TATCTAGACC CAGCTTTCTT GTACAAAGTG GTTGATGGGC TGCAGGAATT CGATATCAAG CTTATCGATA CCGTCGACCT CGAGGGGGAT
31103120
CACCACTTTG TACAAGAAAG CTG
Protein AtCKXl vakuolární (575 aminokyselin, SEQ ID NO. 7)
| AUG | GGA | UUG | ACC | UCA | ucc | UUA | CGG | UUC | CAU | AGA | CAA | AAC | AAC | AAG |
| Met | Gly | Leu | Thr | Ser | Ser | Leu | Arg | Phe | His | Arg | Gin | Asn | Asn | Lys |
| ACU | uuc | CUC | GGA | AUC | UUC | AUG | AUC | UUA | GUU | CUA | AGC | UGU | AUA | CCA |
| Thr | Phe | Leu | Gly | Ile | Phe | Met | Ile | Leu | Val | Leu | Ser | Cys | Ile | Pro |
- 8 '
| GGU | AGA | ACC | AAU | CUU | UGU | UCC | AAU | CAU | UCU | GUU | AGU | ACC | CCA | AAA |
| Gly | Arg | Thr | Asn | Leu | Cys | Ser | Asn | His | Ser | Val | Ser | Thr | Pro | Lys |
| GAA | UUA | CCU | UCU | UCA | AAU | CCU | UCA | GAU | AUU | CGU | UCC | UCA | UUA | GUU |
| Glu | Leu | Pro | Ser | Ser | Asn | Pro | Ser | Asp | Ile | Arg | Ser | Ser | Leu | Val |
| UCA | CUA | GAU | UUG | GAG | GGU | UAU | AUA | AGC | UUC | GAC | GAU | GUC | CAC | AAU |
| Ser | Leu | Asp | Leu | Glu | Gly | Tyr | Ile | Ser | Phe | Asp | Asp | Val | His | Asn |
| GUG | GCC | AAG | GAC | UUU | GGC | AAC | AGA | UAC | CAG | UUA | CCA | CCU | UUG | GCA |
| Val | Ala | Lys | Asp | Phe | Gly | Asn | Arg | Tyr | Gin | Leu | Pro | Pro | Leu | Ala |
| AUU | CUA | CAU | CCA | AGG | UCA | GUU | UUU | GAU | AUU | UCA | UCG | AUG | AUG | AAG |
| Ile | Leu | His | Pro | Arg | Ser | Val | Phe | Asp | Ile | Ser | Ser | Met | Met | Lys |
| CAU | AUA | GUA | CAU | CUG | GGC | UCC | ACC | UCA | AAU | CUU | ACA | GUA | GCA | GCU |
| His | Ile | Val | His | Leu | Gly | Ser | Thr | Ser | Asn | Leu | Thr | Val | Ala | Ala |
| AGA | GGC | CAU | GGU | CAC | UCG | CUU | CAA | GGA | CAA | GCU | CUA | GCU | CAU | CAA |
| Arg | Gly | His | Gly | His | Ser | Leu | Gin | Gly | Gin | Ala | Leu | Ala | His | Gin |
| GGU | GUU | GUC | AUC | AAA | AUG | GAG | UCA | CUU | CGA | AGU | CCU | GAU | AUC | AGG |
| Gly | Val | Val | Ile | Lys | Met | Glu | Ser | Leu | Arg | Ser | Pro | Asp | Ile | Arg |
| AUU | UAU | AAG | GGG | AAG | CAA | CCA | UAU | GUU | GAU | GUC | UCA | GGU | GGU | GAA |
| Ile | Tyr | Lys | Gly | Lys | Gin | Pro | Tyr | Val | Asp | Val | Ser | Gly | Gly | Glu |
| AUA | UGG | AUA | AAC | AUU | CUA | CGC | GAG | ACU | CUA | AAA | UAC | GGU | CUU | UCA |
| Ile | Trp | Ile | Asn | Ile | Leu | Arg | Glu | Thr | Leu | Lys | Tyr | Gly | Leu | Ser |
| CCA | AAG | UCC | UGG | ACA | GAC | UAC | CUU | CAU | UUG | ACC | GUU | GGA | GGU | ACA |
| Pro | Lys | Ser | Trp | Thr | Asp | Tyr | Leu | His | Leu | Thr | Val | Gly | Gly | Thr |
| CUA | UCU | AAU | GCU | GGA | AUC | AGC | GGU | CAA | GCA | UUC | AAG | CAU | GGA | CCC |
| Leu | Ser | Asn | Ala | Gly | Ile | Ser | Gly | Gin | Ala | Phe | Lys | His | Gly | Pro |
| CAA | AUC | AAC | AAC | GUC | UAC | CAG | CUA | GAG | AUU | GUU | ACA | GGG | AAA | GGA |
| Gin | Ile | Asn | Asn | Val | Tyr | Gin | Leu | Glu | Ile | Val | Thr | Gly | Lys | Gly |
| GAA | GUC | GUA | ACC | UGU | UCU | GAG | AAG | CGG | AAU | UCU | GAA | CUU | UUC | UUC |
| Glu | Val | Val | Thr | Cys | Ser | Glu | Lys | Arg | Asn | Ser | Glu | Leu | Phe | Phe |
| AGU | GUU | CUU | GGC | GGG | CUU | GGA | CAG | UUU | GGC | AUA | AUC | ACC | CGG | GCA |
| Ser | Val | Leu | Gly | Gly | Leu | Gly | Gin | Phe | Gly | Ile | Ile | Thr | Arg | Ala |
| CGG | AUC | UCU | CUU | GAA | CCA | GCA | CCG | CAU | AUG | GUU | AAA | UGG | AUC | AGG |
| Arg | Ile | Ser | Leu | Glu | Pro | Ala | Pro | His | Met | Val | Lys | Trp | Ile | Arg |
| GUA | CUC | UAC | UCU | GAC | UUU | UCU | GCA | UUU | UCA | AGG | GAC | CAA | GAA | UAU |
| Val | Leu | Tyr | Ser | Asp | Phe | Ser | Ala | Phe | Ser | Arg | Asp | Gin | Glu | Tyr |
| CUG | AUU | UCG | AAG | GAG | AAA | ACU | UUU | GAU | UAC | GUU | GAA | GGA | UUU | GUG |
| Leu | Ile | Ser | Lys | Glu | Lys | Thr | Phe | Asp | Tyr | Val | Glu | Gly | Phe | Val |
| AUA | AUC | AAU | AGA | ACA | GAC | CUU | CUC | AAU | AAU | UGG | CGA | UCG | UCA | UUC |
| Ile | Ile | Asn | Arg | Thr | Asp | Leu | Leu | Asn | Asn | Trp | Arg | Ser | Ser | Phe |
| AGU | CCC | AAC | GAU | UCC | ACA | CAG | GCA | AGC | AGA | UUC | AAG | UCA | GAU | GGG |
| Ser | Pro | Asn | Asp | Ser | Thr | Gin | Ala | Ser | Arg | Phe | Lys | Ser | Asp | Gly |
| AAA | ACU | CUU | UAU | UGC | CUA | GAA | GUG | GUC | AAA | UAU | UUC | AAC | CCA | GAA |
| Lys | Thr | Leu | Tyr | Cys | Leu | Glu | Val | Val | Lys | Tyr | Phe | Asn | Pro | Glu |
| GAA | GCU | AGC | UCU | AUG | GAU | CAG | GAA | ACU | GGC | AAG | UUA | CUU | UCA | GAG |
| Glu | Ala | Ser | Ser | Met | Asp | Gin | Glu | Thr | Gly | Lys | Leu | Leu | Ser | Glu |
| UUA | AAU | UAU | AUU | CCA | UCC | ACU | UUG | UUU | UCA | UCU | GAA | GUG | CCA | UAU |
| Leu | Asn | Tyr | Ile | Pro | Ser | Thr | Leu | Phe | Ser | Ser | Glu | Val | Pro | Tyr |
| AUC | GAG | UUU | CUG | GAU | CGC | GUG | CAU | AUC | GCA | GAG | AGA | AAA | CUA | AGA |
| Ile | Glu | Phe | Leu | Asp | Arg | Val | His | Ile | Ala | Glu | Arg | Lys | Leu | Arg |
| GCA | AAG | GGU | UUA | UGG | GAG | GUU | CCA | CAU | CCC | UGG | CUG | AAU | CUC | CUG |
| Ala | Lys | Gly | Leu | Trp | Glu | Val | Pro | His | Pro | Trp | Leu | Asn | Leu | Leu |
| AUU | CCU | AAG | AGC | AGC | AUA | UAC | CAA | UUU | GCU | ACA | GAA | GUU | UUC | AAC |
| Ile | Pro | Lys | Ser | Ser | Ile | Tyr | Gin | Phe | Ala | Thr | Glu | Val | Phe | Asn |
| AAC | AUU | CUC | ACA | AGC | AAC | AAC | AAC | GGU | CCU | AUC | CUU | AUU | UAU | CCA |
| Asn | Ile | Leu | Thr | Ser | Asn | Asn | Asn | Gly | Pro | Ile | Leu | Ile | Tyr | Pro |
| GUC | AAU | CAA | UCC | AAG | UGG | AAG | AAA | CAU | ACA | UCU | UUG | AUA | ACU | CCA |
| Val | Asn | Gin | Ser | Lys | Trp | Lys | Lys | His | Thr | Ser | Leu | Ile | Thr | Pro |
| AAU | GAA | GAU | AUA | UUC | UAU | CUC | GUA | GCC | UUU | CUC | CCC | UCU | GCA | GUG |
| Asn | Glu | Asp | Ile | Phe | Tyr | Leu | Val | Ala | Phe | Leu | Pro | Ser | Ala | Val |
| CCA | AAU | UCC | UCA | GGG | AAA | AAC | GAU | CUA | GAG | UAC | CUU | UUG | AAA | CAA |
| Pro | Asn | Ser | Ser | Gly | Lys | Asn | Asp | Leu | Glu | Tyr | Leu | Leu | Lys | Gin |
| AAC | CAA | AGA | GUU | AUG | AAC | UUC | UGC | GCA | GCA | GCA | AAC | CUC | AAC | GUG |
| Asn | Gin | Arg | Val | Met | Asn | Phe | Cys | Ala | Ala | Ala | Asn | Leu | Asn | Val |
| AAG | CAG | UAU | UUG | CCC | CAU | UAU | GAA | ACU | CAA | AAA | GAG | UGG | AAA | UCA |
| Lys | Gin | Tyr | Leu | Pro | His | Tyr | Glu | Thr | Gin | Lys | Glu | Trp | Lys | Ser |
| CAC | UUU | GGC | AAA | AGA | UGG | GAA | ACA | UUU | GCA | CAG | AGG | AAA | CAA | GCC |
| His | Phe | Gly | Lys | Arg | Trp | Glu | Thr | Phe | Ala | Gin | Arg | Lys | Gin | Ala |
| UAC | GAC | CCU | CUA | GCG | AUU | CUA | GCA | CCU | GGC | CAA | AGA | AUA | UUC | CAA |
| Tyr | Asp | Pro | Leu | Ala | Ile | Leu | Ala | Pro | Gly | Gin | Arg | Ile | Phe | Gin |
| AAG | ACA | ACA | GGA | AAA | UUA | UCU | CCC | AUC | CAA | CUC | GCA | AAG | UCA | AAG |
| Lys | Thr | Thr | Gly | Lys | Leu | Ser | Pro | Ile | Gin | Leu | Ala | Lys | Ser | Lys |
| GCA | ACA | GGA | AGU | CCU | CAA | AGG | UAC | CAU | UAC | GCA | UCA | AUA | CUG | CCG |
| Ala | Thr | Gly | Ser | Pro | Gin | Arg | Tyr | His | Tyr | Ala | Ser | Ile | Leu | Pro |
| AAA | CCU | AGA | ACU | GUA | UAA | |||||||||
| Lys | Pro | Arg | Thr | Val | End |
V jiném výhodném provedení expresní kazeta obsahuje: β-glukosidasový promotor::AtCKXl apoplastická::NOS terminátor, a má sekvenci s alespoň 80% identitou, s výhodou s alespoň 90% identitou, výhodněji s alespoň 95% identitou k sekvenci SEQ ID NO. 5.
SEQ ID NO. 5:
Pozice jednotlivých funkčních úseků: β-glukosidasový promotor : 68 bp - 968 bp
Apoplastická signální sekvence: 999 bp - 1067 bp
AtCKXl (bez zahrnutí signální sekvence): 1068 bp - 2684 bp
NOS terminátor: 2712 bp - 2965 bp
.... 1-..-1 ....I·... I ...I ....(....I ....(....I ....(....I
20 30 40 50 60 70 80 90100
ACAAGTTTGT ACAAAAAAGC AGGCTTTAAA GGAACCAATT CAGTCGACTG GATCCGGTAC CGAATTCCAA AGCTGCCGCA TTCGGCAAAG CCTGCAATTC
110 120 130 140 150 160 170 180 190200
CGGTAGTGTT TTACCACGTT GACAAAAAAA ATGAAGAAAT CCGATATTTT AGTCATTATG GATATGGCGC GGTGTCAAAT CGGTATAGTC ATAATCCTTT
210 220 230 240 250 260 270 280 290300
CCATAGGATT GTCCCATGCT CGACACATTA ACACTAAGTT TATCCCTGAA TAACACGGCT ACCTCCATCC TAATCTTTTC TATTGATCAA TTGCCTATTT . 11
....1....1 ....1....1 ....1....1 ....1....1 ....1....1 i ....1....1 ....1....1 ....1....(
310 320 330 340 350 360 370 380390
TTAAGGCGCA GTTGTTCTTG GCCGTATCTG TGGAGATGAT TTTTTTAAAG ACGTCCAACT CTAGCTAGCT AGTCCGTGTA TGTGAACGGT GTTAGGTAGT
400
410 420 430 440 450 460 470 480 490500
CATTGGATCC GTTGACTATA TTTGTAAAGG TGGTAGCCGT TCTTTTTAAT TTTAACGCCG CTGGGAAGAA ATTAAACGTG GTACATCTAT GTATCGTTTT
510 520 530 540 550 560 570 580 590600
CTTAACAGTG ATATAATAAT ATACTATCAT TGCAAGCGTC CGCAATTGCT CTCTCGCGGC TCGTTCTACC GTGGGAAGAA GAGCTGACCC GTCGCCGCCC
....(....I ....(....I | ....I....I ....(....1 ....(....I
610 620 630 640 650 660 670 680 690700
CACATGCATA CGATGCGTCC TTATCTGTCG CGGCTCGTGC AAACGCGGGG CGGGCTGAGC GCCCCAGCCC ACCACTTGCA CCACTTGCAT TTACTTAATT
710 720 730 740 750 760 770 780 790800
AGTTCATAAC ACATCACATC TGTATCTTAC ATTATCTTTA AAAAAATGAT TCACA.CATTA TTTATATATG AGATATAATA AGTTTCCAGG AAGCATCTTT
....l.-.-l I I ....(....I ....I....I ....I....I ....(....I ....(....I
810 820 830 840 850 860 870 880 890900
GGCGACTTAC GTACGTGTAT CAGAGACATG GAGTGATAAA CTATTGGGCA ACCATTTAGC AATCCTAGCT AGCCAGCTCG TCTATAAATA GATGCATCAG
910 920 930 940 950 960 970 980 9901000
CTCCACTTGG TCTACACACT TCACAAGCAG CTCAAAGCTC TAGTTCTAGC TAGCTAGCAA AGGGGGGGAA AGGTACCGTC GACAGATCTA TGGCTTCGAA
....( ....(....I ....(....I ....1....( ....(....I ....(....( ....(....I . . . . | . . . . | . . . . |
1010 1020 1030 1040 1050 1060 1070 1080 10901100
TCTTCGTTTA ATGATCACTT TAATCACGGT TTTAATGATC ACCAAATCAT CAAACGGCAT GCTTTCGAAT CATTCTGTTA GTACCCCAAA AGAATTACCT
1110 1120 1130 1140 1150 1160 1170 1180 11901200
TCTTCAAATC CTTCAGATAT TCGTTCCTCA TTAGTTTCAC TAGATTTGGA GGGTTATATA AGCTTCGACG ATGTCCACAA TGTGGCCAAG GACTTTGGCA
....1....1 ....(....I ....(....I | | ....(....( ....(....i
1210 1220 1230 1240 1250 1260 1270 1280 12901300
ACAGATACCA GTTACCACCT TTGGCAATTC TACATCCAAG GTCAGTTTTT GATATTTCAT CGATGATGAA GCATATAGTA CATCTGGGCT CCACCTCAAA
1310 1320 1330 1340 1350 1360 1370 1380 13901400
TCTTACAGTA GCAGCTAGAG GCCATGGTCA CTCGCTTCAA GGACAAGCTC TAGCTCATCA AGGTGTTGTC ATCAAAATGG AGTCACTACG AAGTCCTGAT
....(.--.I I ....(....I | ....I....)
1410 1420 1430 1440 1450 1460 1470 1480 14901500
ATTAGGATTT ATAAGGGGAA GCAACCATAT GTTGATGTCT CAGGTGGTGA AATATGGATA AACATTCTAC GCGAGACTCT AAAATACGGT CTTTCACCAA
1510 1520 1530 1540 1550 1560 1570 1580 15901600
AGTCCTGGAC AGACTACCTT CATTTGACCG TTGGAGGTAC ACTATCTAAT GCTGGAATCA GCGGTCAAGC ATTCAAGCAT GGACCCCAAA TCAACAACGT
I ....1....( ....(.... | ....(....I ....(....I ....f....| ....I....I ....I....I
1610 1620 1630 1640 1650 1660 1670 1680 16901700
CTACCAGCTA GAGATTGTTA CAGGGAAAGG AGAAGTCGTA ACCTGTTCTG AGAAGCGGAA CTCTGAACTT TTCTTCAGTG TTCTTGGCGG GCTTGGACAG
1710 1720 1730 1740 1750 1760 1770 1780 17901800
TTTGGCATAA TCACCCGGGC ACGGATCTCT CTTGAACCAG CACCGCATAT GGTTAAATGG ATCAGGGTAC TCTACTCTGA CTTTTCTGCA TTTTCAAGGG
....(....I ....(....( ....(....I ....(....I ....(....I ....1..,.(
1810 1820 1830 1840 1850 1860 1870 1880 18901900
ACCAAGAATA TCTGATTTCA AAGGAGAAAA CTTTTGATTA CGTTGAAGGA TTTGTGATAA TCAATAGAAC AGACCTTCTC AATAATTGGC GATCGTCATT
1910 1920 1930 1940 1950 1960 1970 1980 19902000
CAGTCCCAAC GATTCCACAC AGGCAAGCAG ATTCAAGTCA GATGGGAAAA CTCTTTATTG CCTAGAAGTG GTCAAATATT TCAACCCAGA AGAAGCTAGC
....1....1 ....1....1 ....1....1 ....1....1 ....1....1 ....1....1 ....1....1 ....1....1 ....1....1 ....1....1
2010 2020 2030 2040 2050 2060 2070 2080 20902100
TCTATGGATC AGGAAACTGG CAAGTTACTT TCAGAGTTAA ATTATATTCC ATCCACTTTG TTTTCATCTG AAGTGCCATA TATCGAGTTT CTGGATCGCG | ....(....I
2110 2120 2130 2140 2150 2160 2170 2180 21902200
TGCATATCGC AGAGAGAAAA CTAAGAGCAA AGGGTTTATG GGAGGTTCCA CATCCCTGGC TGAATCTCCT GATTCCTAAG AGCAGCATAT ACCAATTTGC
2210 2220 2230 2240 2250 2260 2270 2280 22902300
TACAGAAGTT TTCAACAACA TTCTCACAAG CAACAACAAC GGTCCTATCC TTATTTATCC AGTCAATCAA TCCAAGTGGA AGAAACATAC ATCTTTGATA
2310 2320 2330 2340 2350 2360 2370 2380 23902400
ACTCCAAATG AAGATATATT CTATCTCGTA GCCTTTCTCC CCTCTGCAGT GCCAAATTCC TCAGGGAAAA ACGATCTTGA GTACCTTTTG AAACAAAACC
2410 2420 2430 2440 2450 2460 2470 2480 24902500
AAAGAGTTAT GAACTTCTGC GCAGCAGCAA ACCTCAACGT GAAGCAGTAT TTGCCCCATT ATGAAACTCA AAAAGAGTGG AAATCACACT TTGGCAAAAG
2510 2520 2530 2540 2550 2560 2570 2580 25902600
ATGGGAAACA TTTGCACAGA GGAAACAAGC CTACGACCCT CTAGCGATTC TAGCACCTGG CCAAAGAATA TTCCAAAAGA CAACAGGAAA ATTATCTCCC
---.1----1 I | ....1....1 ....1....1 ....1....( ....I....I|
2610 2620 2630 2640 2650 2660 2670 2680 26902700
ATCCAACTCG CAAAGTCAAA GGCAACAGGA AGTCCTCAAA GGTATCATTA CGCATCAATA CTGCCGAAAC CTAGAACTGT ATAAGTCGAC TCGAGTCTAG
2710 2720 2730 2740 2750 2760 2770 2780 27902800
AAGTCGAAGC AGATCGTTCA AACATTTGGC AATAAAGTTT CTTAAGATTG AATCCTGTTG CCGGTCTTGC GATGATTATC ATATAATTTC TGTTGAATTA
2810 2820 2830 2840 2850 2860 2870 2880 28902900
CGTTAAGCAT GTAATAATTA ACATGTAATG CATGACGTTA TTTATGAGAT GGGTTTTTAT GATTAGAGTC CCGCAATTAT ACATTTAATA CGCGATAGAA
I | | ....[....I ....I....! ....1..,.1 ....1,...(|
2910 2920 2930 2940 2950 2960 2970 2980 29903000
AACAAAATAT AGCGCGCAAA CTAGGATAAA TTATCGCGCG CGGTGTCATC TATGTTACTA GATCGACCGG CAAGCAAGCT GATATGCGGC CGCACTCGAG
....1....1 ....1....1 | .... I....I ....I....I
3010 3020 3030 3040 3050 3060 3070 3080 30903100
ATATCTAGAC CCAGCTTTCT TGTACAAAGT GGTTGATGGG CTGCAGGAAT TCGATATCAA GCTTATCGAT ACCGTCGACC TCGAGGGGGA TCACCACTTT
..--1.-..1 ....)
3110
GTACAAGAAA GCTG
Protein AtCKXl apoplastická (557 aminokyselin, SEQ ID NO. 8)
| AUG | AUC | ACU | UUA | AUC | ACG | GUU | UUA | AUG | AUC | ACC | AAA | UCA | UCA | AAC |
| Met | Ile | Thr | Leu | Ile | Thr | Val | Leu | Met | Ile | Thr | Lys | Ser | Ser | Asn |
| GGC | AUG | CUU | UCG | AAU | CAU | UCU | GUU | AGU | ACC | CCA | AAA | GAA | UUA | CCU |
| Gly | Met | Leu | Ser | Asn | His | Ser | Val | Ser | Thr | Pro | Lys | Glu | Leu | Pro |
| UCU | UCA | AAU | CCU | UCA | GAU | AUU | CGU | UCC | UCA | UUA | GUU | UCA | CUA | GAU |
| Ser | Ser | Asn | Pro | Ser | Asp | Ile | Arg | Ser | Ser | Leu | Val | Ser | Leu | Asp |
| UUG | GAG | GGU | UAU | AUA | AGC | UUC | GAC | GAU | GUC | CAC | AAU | GUG | GCC | AAG |
| Leu | Glu | Gly | Tyr | Ile | Ser | Phe | Asp | Asp | Val | His | Asn | Val | Ala | Lys |
| GAC | UUU | GGC | AAC | AGA | UAC | CAG | UUA | CCA | CCU | UUG | GCA | AUU | CUA | CAU |
| Asp | Phe | Gly | Asn | Arg | Tyr | Gin | Leu | Pro | Pro | Leu | Ala | Ile | Leu | His |
| CCA | AGG | UCA | GUU | UUU | GAU | AUU | UCA | UCG | AUG | AUG | AAG | CAU | AUA | GUA |
| Pro | Arg | Ser | Val | Phe | Asp | Ile | Ser | Ser | Met | Met | Lys | His | Ile | Val |
| CAU | CUG | GGC | UCC | ACC | UCA | AAU | CUU | ACA | GUA | GCA | GCU | AGA | GGC | CAU |
| His | Leu | Gly | Ser | Thr | Ser | Asn | Leu | Thr | Val | Ala | Ala | Arg | Gly | His |
| GGU | CAC | UCG | CUU | CAA | GGA | CAA | GCU | CUA | GCU | CAU | CAA | GGU | GUU | GUC |
| Gly | His | Ser | Leu | Gin | Gly | Gin | Ala | Leu | Ala | His | Gin | Gly | Val | Val |
| AUC | AAA | AUG | GAG | UCA | CUA | CGA | AGU | CCU | GAU | AUU | AGG | AUU | UAU | AAG |
| Ile | Lys | Met | Glu | Ser | Leu | Arg | Ser | Pro | Asp | Ile | Arg | Ile | Tyr | Lys |
| GGG | AAG | CAA | CCA | UAU | GUU | GAU | GUC | UCA | GGU | GGU | GAA | AUA | UGG | AUA |
| Gly | Lys | Gin | Pro | Tyr | Val | Asp | Val | Ser | Gly | Gly | Glu | Ile | Trp | Ile |
| AAC | AUU | CUA | CGC | GAG | ACU | CUA | AAA | UAC | GGU | CUU | UCA | CCA | AAG | UCC |
| Asn | Ile | Leu | Arg | Glu | Thr | Leu | Lys | Tyr | Gly | Leu | Ser | Pro | Lys | Ser |
| UGG | ACA | GAC | UAC | CUU | CAU | UUG | ACC | GUU | GGA | GGU | ACA | CUA | UCU | AAU |
| Trp | Thr | Asp | Tyr | Leu | His | Leu | Thr | Val | Gly | Gly | Thr | Leu | Ser | Asn |
| GCU | GGA | AUC | AGC | GGU | CAA | GCA | UUC | AAG | CAU | GGA | CCC | CAA | AUC | AAC |
| Ala | Gly | Ile | Ser | Gly | Gin | Ala | Phe | Lys | His | Gly | Pro | Gin | Ile | Asn |
| AAC | GUC | UAC | CAG | CUA | GAG | AUU | GUU | ACA | GGG | AAA | GGA | GAA | GUC | GUA |
| Asn | Val | Tyr | Gin | Leu | Glu | Ile | Val | Thr | Gly | Lys | Gly | Glu | Val | Val |
| ACC | UGU | UCU | GAG | AAG | CGG | AAC | UCU | GAA | CUU | UUC | UUC | AGU | GUU | CUU |
| Thr | Cys | Ser | Glu | Lys | Arg | Asn | Ser | Glu | Leu | Phe | Phe | Ser | Val | Leu |
| GGC | GGG | CUU | GGA | CAG | UUU | GGC | AUA | AUC | ACC | CGG | GCA | CGG | AUC | UCU |
| Gly | Gly | Leu | Gly | Gin | Phe | Gly | Ile | Ile | Thr | Arg | Ala | Arg | Ile | Ser |
| CUU | GAA | CCA | GCA | CCG | CAU | AUG | GUU | AAA | UGG | AUC | AGG | GUA | CUC | UAC |
| Leu | Glu | Pro | Ala | Pro | His | Met | Val | Lys | Trp | Ile | Arg | Val | Leu | Tyr |
| UCU | GAC | UUU | UCU | GCA | UUU | UCA | AGG | GAC | CAA | GAA | UAU | CUG | AUU | UCA |
| Ser | Asp | Phe | Ser | Ala | Phe | Ser | Arg | Asp | Gin | Glu | Tyr | Leu | Ile | Ser |
| AAG | GAG | AAA | ACU | UUU | GAU | UAC | GUU | GAA | GGA | UUU | GUG | AUA | AUC | AAU |
| Lys | G1U | Lys | Thr | Phe | Asp | Tyr | Val | Glu | Gly | Phe | Val | Ile | Ile | Asn |
| AGA | ACA | GAC | CUU | CUC | AAU | AAU | UGG | CGA | UCG | UCA | UUC | AGU | CCC | AAC |
| Arg | Thr | Asp | Leu | Leu | Asn | Asn | Trp | Arg | Ser | Ser | Phe | Ser | Pro | Asn |
| GAU | UCC | ACA | CAG | GCA | AGC | AGA | UUC | AAG | UCA | GAU | GGG | AAA | ACU | CUU |
| Asp | Ser | Thr | Gin | Ala | Ser | Arg | Phe | Lys | Ser | Asp | Gly | Lys | Thr | Leu |
| UAU | UGC | CUA | GAA | GUG | GUC | AAA | UAU | UUC | AAC | CCA | GAA | GAA | GCU | AGC |
| Tyr | Cys | Leu | Glu | Val | Val | Lys | Tyr | Phe | Asn | Pro | Glu | Glu | Ala | Ser |
| UCU | AUG | GAU | CAG | GAA | ACU | GGC | AAG | UUA | CUU | UCA | GAG | UUA | AAU | UAU |
| Ser | Met | Asp | Gin | Glu | Thr | Gly | Lys | Leu | Leu | Ser | Glu | Leu | Asn | Tyr |
| AUU | CCA | UCC | ACU | UUG | UUU | UCA | UCU | GAA | GUG | CCA | UAU | AUC | GAG | UUU |
| Ile | Pro | Ser | Thr | Leu | Phe | Ser | Ser | Glu | Val | Pro | Tyr | Ile | Glu | Phe |
| CUG | GAU | CGC | GUG | CAU | AUC | GCA | GAG | AGA | AAA | CUA | AGA | GCA | AAG | GGU |
| Leu | Asp | Arg | Val | His | Ile | Ala | Glu | Arg | Lys | Leu | Arg | Ala | Lys | Gly |
| UUA | UGG | GAG | GUU | CCA | CAU | CCC | UGG | CUG | AAU | CUC | CUG | AUU | CCU | AAG |
| Leu | Trp | Glu | Val | Pro | His | Pro | Trp | Leu | Asn | Leu | Leu | Ile | Pro | Lys |
| AGC | AGC | AUA | UAC | CAA | UUU | GCU | ACA | GAA | GUU | UUC | AAC | AAC | AUU | CUC |
| Ser | Ser | Ile | Tyr | Gin | Phe | Ala | Thr | Glu | Val | Phe | Asn | Asn | Ile | Leu |
| ACA | AGC | AAC | AAC | AAC | GGU | CCU | AUC | CUU | AUU | UAU | CCA | GUC | AAU | CAA |
| Thr | Ser | Asn | Asn | Asn | Gly | Pro | Ile | Leu | Ile | Tyr | Pro | Val | Asn | Gin |
| UCC | AAG | UGG | AAG | AAA | CAU | ACA | UCU | UUG | AUA | ACU | CCA | AAU | GAA | GAU |
| Ser | Lys | Trp | Lys | Lys | His | Thr | Ser | Leu | Ile | Thr | Pro | Asn | Glu | Asp |
| AUA | UUC | UAU | CUC | GUA | GCC | UUU | CUC | CCC | UCU | GCA | GUG | CCA | AAU | UCC |
| Ile | Phe | Tyr | Leu | Val | Ala | Phe | Leu | Pro | Ser | Ala | Val | Pro | Asn | Ser |
| UCA | GGG | AAA | AAC | GAU | CUU | GAG | UAC | CUU | UUG | AAA | CAA | AAC | CAA | AGA |
| Ser | Gly | Lys | Asn | Asp | Leu | Glu | Tyr | Leu | Leu | Lys | Gin | Asn | Gin | Arg |
| GUU | AUG | AAC | UUC | UGC | GCA | GCA | GCA | AAC | CUC | AAC | GUG | MX.G | CAG | UAU |
| Val | Met | Asn | Phe | Cys | Ala | Ala | Ala | Asn | Leu | Asn | Val | Lys | Gin | Tyr |
| UUG | CCC | CAU | UAU | GAA | ACU | CAA | AAA | GAG | UGG | AAA | UCA | CAC | UUU | GGC |
| Leu | Pro | His | Tyr | Glu | Thr | Gin | Lys | Glu | Trp | Lys | Ser | His | Phe | Gly |
| AAA | AGA | UGG | GAA | ACA | UUU | GCA | CAG | AGG | AAA | CAA | GCC | UAC | GAC | CCU |
| Lys | Arg | Trp | Glu | Thr | Phe | Ala | Gin | Arg | Lys | Gin | Ala | Tyr | Asp | Pro |
| CUA | GCG | AUU | CUA | GCA | CCU | GGC | CAA | AGA | AUA | UUC | CAA | AAG | ACA | ACA |
| Leu | Ala | Ile | Leu | Ala | Pro | Gly | Gin | Arg | Ile | Phe | Gin | Lys | Thr | Thr |
| GGA | AAA | UUA | UCU | CCC | AUC | CAA | CUC | GCA | AAG | UCA | AAG | GCA | ACA | GGA |
| Gly | Lys | Leu | Ser | Pro | Ile | Gin | Leu | Ala | Lys | Ser | Lys | Ala | Thr | Gly |
| AGU | CCU | CAA | AGG | UAU | CAU | UAC | GCA | UCA | AUA | CUG | CCG | AAA | CCU | AGA |
| Ser | Pro | Gin | Arg | Tyr | His | Tyr | Ala | Ser | Ile | Leu | Pro | Lys | Pro | Arg |
ACU GUA UAA
Thr Val End
V dalším výhodném provedení expresní kazeta obsahuje: β-glukosidasový promotor::AtCKXl cytosolická::NOS terminátor, a má sekvenci s alespoň 80% identitou, s výhodou s alespoň 90% identitou, výhodněji s alespoň 95% identitou k sekvenci SEQ ID NO. 6.
SEQ ID NO. 6:
Pozice jednotlivých funkčních úseků: β-glukosidasový promotor : 68 bp - 968 bp
AtCKXlfbez zahrnutí signální sekvence): 999 bp - 2615 bp
NOS terminátor: 2643 bp - 2896 bp
....1....1 ....1....1 ....1....1 ....1....1 ....1....( ....1....1 ....1...,1 ...,1....1 ....1....1 ....1...,1
20 30 40 50 60 70 80 90100
ACAAGTTTGT ACAAAAAAGC AGGCTTTAAA GGAACCAATT CAGTCGACTG GATCCGGTAC CGAATTCCAA AGCTGCCGCA TTCGGCAAAG CCTGCAATTC
....1....1 ....1....1 ....(....1 ....1....1 ....1....1 ....(....I ....I....I ....1....( ....(....I
110 120 130 140 150 160 170 180 190200
CGGTAGTGTT TTACCACGTT GACAAAAAAA ATGAAGAAAT CCGATATTTT AGTCATTATG GATATGGCGC GGTGTCAAAT CGGTATAGTC ATAATCCTTT
210 220 230 240 250 260 270 280 290300
CCATAGGATT GTCCCATGCT CGACACATTA ACACTAAGTT TATCCCTGAA TAACACGGCT ACCTCCATCC TAATCTTTTC TATTGATCAA TTGCCTATTT
....(....1 ....i....I ....(....I ....(....I ....(....I ....(....I
310 320 330 340 350 360 370 380 390400
TTAAGGCGCA GTTGTTCTTG GCCGTATCTG TGGAGATGAT TTTTTTAAAG ACGTCCAACT CTAGCTAGCT AGTCCGTGTA TGTGAACGGT GTTAGGTAGT
I ....1....( | ....(....I I ....(....I ....(....I
410 420 430 440 450 460 470 480 490500
CATTGGATCC GTTGACTATA TTTGTAAAGG TGGTAGCCGT TCTTTTTAAT TTTAACGCCG CTGGGAAGAA ATTAAACGTG GTACATCTAT GTATCGTTTT
....(....I ....I.... | ....(....I ....(....I ....(....1 ....1....( .... 1....( ....1....1
510 520 530 540 550 560 570 580 590600
CTTAACAGTG ATATAATAAT ATACTATCAT TGCAAGCGTC CGCAATTGCT CTCTCGCGGC TCGTTCTACC GTGGGAAGAA GAGCTGACCC GTCGCCGCCC
610 620 630 640 650 660 670 680 690700
CACATGCATA CGATGCGTCC TTATCTGTCG CGGCTCGTGC AAACGCGGGG CGGGCTGAGC GCCCCAGCCC ACCACTTGCA CCACTTGCAT TTACTTAATT
710 720 730 740 750 760 770 780 790800
AGTTCATAAC ACATCACATC TGTATCTTAC ATTATCTTTA AAAAAATGAT TCACACATTA TTTATATATG AGATATAATA AGTTTCCAGG AAGCATCTTT
....1....1 ....1....1 ....1....1 I II
910 820 830 840 850 860 870 880 890900
GGCGACTTAC GTACGTGTAT CAGAGACATG GAGTGATAAA CTATTGGGCA ACCATTTAGC AATCCTAGCT AGCCAGCTCG TCTATAAATA GATGCATCAG
910 920 930 940 950 960 970 980 9901000
CTCCACTTGG TCTACACACT TCACAAGCAG CTCAAAGCTC TAGTTCTAGC TAGCTAGCAA AGGGGGGGAA AGGTACCGTC GACAGATCTA TGGCTTCGAA
1010 1020 1030 1040 1050 1060 1070 1080 10901100
TCATTCTGTT AGTACCCCAA AAGAATTACC TTCTTCAAAT CCTTCAGATA TTCGTTCCTC ATTAGTTTCA CTAGATTTGG AGGGTTATAT AAGCTTCGAC
1110 1120 1130 1140 1150 1160 1170 1180 11901200
GATGTCCACA ATGTGGCCAA GGACTTTGGC AACAGATACC AGTTACCACC TTTGGCAATT CTACATCCAA GGTCAGTTTT TGATATTTCA TCGATGATGA
1210 1220 1230 1240 1250 1260 1270 1280 12901300
Z-sGCATATAGT ACATCTGGGC TCCACCTCAA ATCTTACAGT AGCAGCTAGA GGCCATGGTC ACTCGCTTCA AGGACAAGCT CTAGCTCATC AAGGTGTTGT
1310 1320 1330 1340 1350 1360 1370 1380 13901400
CATCAAAATG GAGTCACTAC GAAGTCCTGA TATTAGGATT TATAAGGGGA AGCAACCATA TGTTGATGTC TCAGGTGGTG AAATATGGAT AAACATTCTA | | ....I....]
1410 1420 1430 1440 1450 1460 1470 1480 14901500
CGCGAGACTC TAAAATACGG TCTTTCACCA AAGTCCTGGA CAGACTACCT TCATTTGACC GTTGGAGGTA CACTATCTAA TGCTGGAATC AGCGGTCAAG
I ....1....1 | ....1.. ,.| ....1....1 ....I....I ....I....I
1510 1520 1530 1540 1550 1560 1570 1580 15901600
CATTCAAGCA TGGACCCCAA ATCAACAACG TCTACCAGCT AGAGATTGTT ACAGGGAAAG GAGAAGTCGT AACCTGTTCT GAGAAGCGGA ACTCTGAACT
1610 1620 1630 1640 1650 1660 1670 1680 16901700
TTTCTTCAGT GTTCTTGGCG GGCTTGGACA GTTTGGCATA ATCACCCGGG CACGGATCTC TCTTGAACCA GCACCGCATA TGGTTAAATG GATCAGGGTA | ....I....I ...J.... | ....1....1 ....1....1 ,...| ....|
1710 1720 1730 1740 1750 1760 1770 1780 17901800
CTCTACTCTG ACTTTTCTGC ATTTTCAAGG GACCAAGAAT ATCTGATTTC AAAGGAGAAA ACTTTTGATT ACGTTGAAGG ATTTGTGATA ATCAATAGAA
1810 1820 1830 1840 1850 1860 1870 1880 18901900
CAGACCTTCT CAATAATTGG CGATCGTCAT TCAGTCCCAA CGATTCCACA CAGGCAAGCA GATTCAAGTC AGATGGGAAA ACTCTTTATT GCCTAGAAGT
1910 1920 1930 1940 1950 1960 1970 1980 19902000
GGTCAAATAT TTCAACCCAG AAGAAGCTAG CTCTATGGAT CAGGAAACTG GCAAGTTACT TTCAGAGTTA AATTATATTC CATCCACTTT GTTTTCATCT
2010 2020 2030 2040 2050 2060 2070 2080 20902100
GAAGTGCCAT ATATCGAGTT TCTGGATCGC GTGCATATCG CAGAGAGAAA ACTAAGAGCA AAGGGTTTAT GGGAGGTTCC ACATCCCTGG CTGAATCTCC
2110 2120 2130 2140 2150 2160 2170 2180 21902200
TGATTCCTAA GAGCAGCATA TACCAATTTG CTACAGAAGT TTTCAACAAC ATTCTCACAA GCAACAACAA CGGTCCTATC CTTATTTATC CAGTCAATCA
2210 2220 2230 2240 2250 2260 2270 2280 22902300
ATCCAAGTGG AAGAAACATA CATCTTTGAT AACTCCAAAT GAAGATATAT TCTATCTCGT AGCCTTTCTC CCCTCTGCAG TGCCAAATTC CTCAGGGAAA
2310 2320 2330 2340 2350 2360 2370 2380 23902400
AACGATCTTG AGTACCTTTT GAAACAAAAC CAAAGAGTTA TGAACTTCTG CGCAGCAGCA AACCTCAACG TGAAGCAGTA TTTGCCCCAT TATGAAACTC
2410 2420 2430 2440 2450 2460 2470 2480 24902500
AAAAAGAGTG GAAATCACAC TTTGGCAAAA GATGGGAAAC ATTTGCACAG AGGAAACAAG CCTACGACCC TCTAGCGATT CTAGCACCTG GCCAAAGAAT
2510 2520 2530 2540 2550 2560 2570 2580 25902600
ATTCCAAAAG ACAACAGGAA AATTATCTCC CATCCAACTC GCAAAGTCAA AGGCAACAGG AAGTCCTCAA AGGTATCATT ACGCATCAAT ACTGCCGAAA
....I.... | I ....(....I I ....I....!
2610 2620 2630 2640 2650 2660 2670 2680 26902^00
CCTAGAACTG TATAAGTCGA CTCGAGTCTA GAAGTCGAAG CAGATCGTTC AAACATTTGG CAATAAAGTT TCTTAAGATT GAATCCTGTT GCCGGTCTTG
2710 2720 2730 2740 2750 2760 2770 2780 27902800
CGATGATTAT CATATAATTT CTGTTGAATT ACGTTAAGCA TGTAATAATT AACATGTAAT GCATGACGTT ATTTATGAGA TGGGTTTTTA TGATTAGAGT
2810 2820 2830 2840 2850 2860 2870 2880 28902900
CCCGCAATTA TACATTTAAT ACGCGATAGA AAACAAAATA TAGCGCGCAA ACTAGGATAA ATTATCGCGC GCGGTGTCAT CTATGTTACT AGATCGACCG
2910 2920 2930 2940 2950 2960 2970 2980 29903000
GCAAGCAAGC TGATATGCGG CCGCACTCGA GATATCTAGA CCCAGCTTTC TTGTACAAAG TGGTTGATGG GCTGCAGGAA TTCGATATCA AGCTTATCGA
.... I .... I | | | | | | ||
3010 3020 3030 30403050
TACCGTCGAC CTCGAGGGGG ATCACCACTT TGTACAAGAA AGCTG.....
Protein AtCKXl cytosolická (538 aminokyselin, SEQ ID NO. 9)
| AAU | CAU | UCU | GUU | AGU | ACC | CCA | AAA | GAA | UUA | CCU | UCU | UCA | AAU | CCU |
| Asn | His | Ser | Val | Ser | Thr | Pro | Lys | Glu | Leu | Pro | Ser | Ser | Asn | Pro |
| UCA | GAU | AUU | CGU | UCC | UCA | UUA | GUU | UCA | CUA | GAU | UUG | GAG | GGU | UAU |
| Ser | Asp | Ile | Arg | Ser | Ser | Leu | Val | Ser | Leu | Asp | Leu | Glu | Gly | Tyr |
| AUA | AGC | UUC | GAC | GAU | GUC | CAC | AAU | GUG | GCC | AAG | GAC | UUU | GGC | AAC |
| Ile | Ser | Phe | Asp | Asp | Val | His | Asn | Val | Ala | Lys | Asp | Phe | Gly | Asn |
| AGA | UAC | CAG | UUA | CCA | CCU | UUG | GCA | AUU | CUA | CAU | CCA | AGG | UCA | GUU |
| Arg | Tyr | Gin | Leu | Pro | Pro | Leu | Ala | Ile | Leu | His | Pro | Arg | Ser | Val |
| UUU | GAU | AUU | UCA | UCG | AUG | AUG | AAG | CAU | AUA | GUA | CAU | CUG | GGC | UCC |
| Phe | Asp | Ile | Ser | Ser | Met | Met | Lys | His | Ile | Val | His | Leu | Gly | Ser |
| ACC | UCA | AAU | CUU | ACA | GUA | GCA | GCU | AGA | GGC | CAU | GGU | CAC | UCG | CUU |
| Thr | Ser | Asn | Leu | Thr | Val | Ala | Ala | Arg | Gly | His | Gly | His | Ser | Leu |
| CAA | GGA | CAA | GCU | CUA | GCU | CAU | CAA | GGU | GUU | GUC | AUC | AAA | AUG | GAG |
| Gin | Gly | Gin | Ala | Leu | Ala | His | Gin | Gly | Val | Val | Ile | Lys | Met | Glu |
·. t
| UCA | CUA | CGA | AGU | CCU | GAU | AUU | AGG | AUU | UAU | AAG | GGG | AAG | CAA | CCA |
| Ser | Leu | Arg | Ser | Pro | Asp | Ile | Arg | Ile | Tyr | Lys | Gly | Lys | Gin | Pro |
| UAU | GUU | GAU | GUC | UCA | GGU | GGU | GAA | AUA | UGG | AUA | AAC | AUU | CUA | CGC |
| Tyr | Val | Asp | Val | Ser | Gly | Gly | Glu | Ile | Trp | Ile | Asn | Ile | Leu | Arg |
| GAG | ACU | CUA | AAA | UAC | GGU | CUU | UCA | CCA | AAG | UCC | UGG | ACA | GAC | UAC |
| Glu | Thr | Leu | Lys | Tyr | Gly | Leu | Ser | Pro | Lys | Ser | Trp | Thr | Asp | Tyr |
| cuu | CAU | UUG | ACC | GUU | GGA | GGU | ACA | CUA | UCU | AAU | GCU | GGA | AUC | AGC |
| Leu | His | Leu | Thr | Val | Gly | Gly | Thr | Leu | Ser | Asn | Ala | Gly | Ile | Ser |
| GGU | CAA | GCA | UUC | AAG | CAU | GGA | CCC | CAA | AUC | AAC | AAC | GUC | UAC | CAG |
| Gly | Gin | Ala | Phe | Lys | His | Gly | Pro | Gin | Ile | Asn | Asn | Val | Tyr | Gin |
| CUA | GAG | AUU | GUU | ACA | GGG | AAA | GGA | GAA | GUC | GUA | ACC | UGU | UCU | GAG |
| Leu | Glu | Ile | Val | Thr | Gly | Lys | Gly | Glu | Val | Val | Thr | Cys | Ser | Glu |
| AAG | CGG | AAC | UCU | GAA | CUU | UUC | UUC | AGU | GUU | CUU | GGC | GGG | CUU | GGA |
| Lys | Arg | Asn | Ser | Glu | Leu | Phe | Phe | Ser | Val | Leu | Gly | Gly | Leu | Gly |
| CAG | UUU | GGC | AUA | AUC | ACC | CGG | GCA | CGG | AUC | UCU | CUU | GAA | CCA | GCA |
| Gin | Phe | Gly | Ile | Ile | Thr | Arg | Ala | Arg | Ile | Ser | Leu | Glu | Pro | Ala |
| CCG | CAU | AUG | GUU | AAA | UGG | AUC | AGG | GUA | CUC | UAC | UCU | GAC | UUU | UCU |
| Pro | His | Met | Val | Lys | Trp | Ile | Arg | Val | Leu | Tyr | Ser | Asp | Phe | Ser |
| GCA | UUU | UCA | AGG | GAC | CAA | GAA | UAU | CUG | AUU | UCA | AAG | GAG | AAA | ACU |
| Ala | Phe | Ser | Arg | Asp | Gin | Glu | Tyr | Leu | Ile | Ser | Lys | Glu | Lys | Thr |
| UUU | GAU | UAC | GUU | GAA | GGA | UUU | GUG | AUA | AUC | AAU | AGA | ACA | GAC | CUU |
| Phe | Asp | Tyr | Val | Glu | Gly | Phe | Val | Ile | Ile | Asn | Arg | Thr | Asp | Leu |
| CUC | AAU | AAU | UGG | CGA | UCG | UCA | UUC | AGU | CCC | AAC | GAU | UCC | ACA | CAG |
| Leu | Asn | Asn | Trp | Arg | Ser | Ser | Phe | Ser | Pro | Asn | Asp | Ser | Thr | Gin |
| GCA | AGC | AGA | UUC | AAG | UCA | GAU | GGG | AAA | ACU | CUU | UAU | UGC | CUA | GAA |
| Ala | Ser | Arg | Phe | Lys | Ser | Asp | Gly | Lys | Thr | Leu | Tyr | Cys | Leu | Glu |
| GUG | GUC | AAA | UAU | UUC | AAC | CCA | GAA | GAA | GCU | AGC | UCU | AUG | GAU | CAG |
| Val | Val | Lys | Tyr | Phe | Asn | Pro | Glu | Glu | Ala | Ser | Ser | Met | Asp | Gin |
| GAA | ACU | GGC | AAG | UUA | CUU | UCA | GAG | UUA | AAU | UAU | AUU | CCA | UCC | ACU |
| Glu | Thr | Gly | Lys | Leu | Leu | Ser | Glu | Leu | Asn | Tyr | Ile | Pro | Ser | Thr |
• 19
| UUG | uuu | UCA | UCU | GAA | GUG | CCA | UAU | AUC | GAG | UUU | CUG | GAU | CGC | GUG |
| Leu | Phe | Ser | Ser | Glu | Val | Pro | Tyr | Ile | Glu | Phe | Leu | Asp | Arg | Val |
| CAU | AUC | GCA | GAG | AGA | AAA | CUA | AGA | GCA | AAG | GGU | UUA | UGG | GAG | GUU |
| His | Ile | Ala | Glu | Arg | Lys | Leu | Arg | Ala | Lys | Gly | Leu | Trp | Glu | Val |
| CCA | CAU | CCC | UGG | CUG | AAU | CUC | CUG | AUU | CCU | AAG | AGC | AGC | AUA | UAC |
| Pro | His | Pro | Trp | Leu | Asn | Leu | Leu | Ile | Pro | Lys | Ser | Ser | Ile | Tyr |
| CAA | UUU | GCU | ACA | GAA | GUU | UUC | AAC | AAC | AUU | CUC | ACA | AGC | AAC | AAC |
| Gin | Phe | Ala | Thr | Glu | Val | Phe | Asn | Asn | Ile | Leu | Thr | Ser | Asn | Asn |
| AAC | GGU | CCU | AUC | CUU | AUU | UAU | CCA | GUC | AAU | CAA | UCC | AAG | UGG | AAG |
| Asn | Gly | Pro | Ile | Leu | Ile | Tyr | Pro | Val | Asn | Gin | Ser | Lys | Trp | Lys |
| AAA | CAU | ACA | UCU | UUG | AUA | ACU | CCA | AAU | GAA | GAU | AUA | UUC | UAU | CUC |
| Lys | His | Thr | Ser | Leu | Ile | Thr | Pro | Asn | Glu | Asp | Ile | Phe | Tyr | Leu |
| GUA | GCC | UUU | CUC | CCC | UCU | GCA | GUG | CCA | AAU | UCC | UCA | GGG | AAA | AAC |
| Val | Ala | Phe | Leu | Pro | Ser | Ala | Val | Pro | Asn | Ser | Ser | Gly | Lys | Asn |
| GAU | CUU | GAG | UAC | CUU | UUG | AAA | CAA | AAC | CAA | AGA | GUU | AUG | AAC | UUC |
| Asp | Leu | Glu | Tyr | Leu | Leu | Lys | Gin | Asn | Gin | Arg | Val | Met | Asn | Phe |
| UGC | GCA | GCA | GCA | AAC | CUC | AAC | GUG | AAG | CAG | UAU | UUG | CCC | CAU | UAU |
| Cys | Ala | Ala | Ala | Asn | Leu | Asn | Val | Lys | Gin | Tyr | Leu | Pro | His | Tyr |
| GAA | ACU | CAA | AAA | GAG | UGG | AAA | UCA | CAC | UUU | GGC | AAA | AGA | UGG | GAA |
| Glu | Thr | Gin | Lys | Glu | Trp | Lys | Ser | His | Phe | Gly | Lys | Arg | Trp | Glu |
| ACA | UUU | GCA | CAG | AGG | AAA | CAA | GCC | UAC | GAC | CCU | CUA | GCG | AUU | CUA |
| Thr | Phe | Ala | Gin | Arg | Lys | Gin | Ala | Tyr | Asp | Pro | Leu | Ala | Ile | Leu |
| GCA | CCU | GGC | CAA | AGA | AUA | UUC | CAA | AAG | ACA | ACA | GGA | AAA | UUA | UCU |
| Ala | Pro | Gly | Gin | Arg | Ile | Phe | Gin | Lys | Thr | Thr | Gly | Lys | Leu | Ser |
| CCC | AUC | CAA | CUC | GCA | AAG | UCA | AAG | GCA | ACA | GGA | AGU | CCU | CAA | AGG |
| Pro | Ile | Gin | Leu | Ala | Lys | Ser | Lys | Ala | Thr | Gly | Ser | Pro | Gin | Arg |
| UAU | CAU | UAC | GCA | UCA | AUA | CUG | CCG | AAA | CCU | AGA | ACU | GUA | UAA | |
| Tyr | His | Tyr | Ala | Ser | Ile | Leu | Pro | Lys | Pro | Arg | Thr | Val | End |
Předmětem předkládaného vynálezu je dále použití uvedených expresních kazet pro přípravu rostlin ječmene vykazujících odolnost vůči suchu.
• 20
Přehled obrázků na výkresech
Obr. 1: Fenotyp rostlin s nadprodukci ZmCKXl pod β-glukosidasovým promotorem.
1. kontrolní WT ječmen, 2., 3. a 4. geneticky modifikované linie ječmene.
Obr. 2: Počet transkriptů AtCKXl v 1 ng RNA u 1, 2, 5, 8 a 14 týdnů starých transgenních rostlin.
Obr. 3: Stanovení relativního obsahu vody v listech u 3 měsíce starých rostlin ječmene, z nichž byla polovina rostlin 2 měsíce stresovaná suchem. Transgenní rostliny obsahují vakuolámí formu AtCKXl. Praporcové listy byly odebrány z pěti rostlin z nej staršího stébla po vystavení suchu min. po dobu 24 hodin.
Obr. 4: Fotodokumentace působení stresu suchem na transgenní a kontrolní WT rostliny ječmene. A) WT ječmen, B) transgenní ječmen s vakuolámí AtCKXl.
Obr. 5: Fotodokumentace působení stresu suchem na transgenní a kontrolní WT rostliny ječmene. A) WT ječmen, B) transgenní ječmen s apoplastickou AtCKXl.
Obr. 6: Fotodokumentace působení stresu suchem na transgenní a kontrolní WT rostliny ječmene. A) WT ječmen, B) transgenní ječmen s cytosolickou AtCKXl.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1: Příprava geneticky modifikovaného ječmene
1. Příprava binárního konstruktu pro vnesení cizorodé DNA do ječmene
Byly připraveny 3 konstrukty obsahující vakuolámí, cytosolickou a apoplastickou formu AtCKXl (původem z rostliny Arabidopsis thaliand). Každý konstrukt obsahuje regulační sekvence - promotor genu pro β-glukosidasu a NOS terminátor. Převaha funkčních úseků byla nasyntetizována komerční firmou Mr. Gene GmbH (Regensburg, Německo). Jedná se o sekvenci promotoru genu pro β-glukosidasu (Gu et al. (2006), Plant Cell Rep. 25:1157-65), gen AtCKXl (Kowalska et al. (2010), Phytochemistry. 71:1970-8) s uměle vytvořeným restrikčním místem pro odštěpení signální sekvence, signální sekreční sekvenci genu AtCKX2 (Werner et al. (2003), Plant Cell. 15:2532-50) a NOS terminátor (Bevan M, Bames WM, Chilton MD. (1983), Nucleic Acids Res. 11:369-85). Další úseky DNA vnášené do ječmene byly získány zakoupením binárního T-DNA plazminu pBRACT209 (John Innes Centre,
Norwich, Velká Británie) a poskytnutím plazmidového konstruktu s přirozenou formou AtCKXl Dr. T. Wernerem (Freie Universitát Berlin, Německo), jehož připravuje uvedena ve Werner et al. (2001), Proč Nati Acad Sci USA. 98:10487-92.
Funkční úseky byly pomocí restrikčních endonukleas a T4-DNA ligasy (Sambrook J, Russell DW Molecular cloning: A Laboratory Manual (third ed.), 3:A2.2, Cold Spring Harbor, New York 2001) vneseny do vektoru pENTRl A (zakoupen od firmy Invitrogen, Life Technologies Czech Republic s.r.o., Praha), který slouží jako donorový vektor pro vnesení požadovaného úseku DNA do cílového vektoru pBRACT209 pomocí tzv. Gateway klonování (provedeno dle návodu firmy Invitrogen). Výsledné konstrukty byly ověřeny komerční sekvenací a sloužily k transformaci bakterie Agrobacterium tumefaciens (kmen AGL1), jež byla získána od Plant Breeding and Acclimatization Institute (Blonie, Polsko). Transformace A. tumefaciens probíhala dle protokolu uvedeného v Sambrook J, Russell DW Molecular cloning: A Laboratory Manual (third ed.), 3:A2.2, Cold Spring Harbor, New York 2001.
2. Transformace ječmene prostřednictvím Agrobacteria tumefaciens
Transformace ječmene prostřednictvím Agrobacteria tumefaciens probíhala dle publikovaného protokolu uvedeného v Harwood et al. (2009), In Methods in Molecular Biology, Vol. 478 Transgenic Wheat, Barley and Oats (Jones H. D, Shewry P. R. ed.), pp. 137-147, Humana Press, New York, USA. Jediné modifikace spočívaly v užití 0,2 mM acetosyringonu v agrobakteriální suspenzi před vlastní infekcí donorového materiálu, jímž byly štítky ječmene. Další modifikací byl přídavek 6-benzylaminopurinu do regeneračního média (0,4 mg/1 média) pro zajištění dostatečné hladiny cytokininů v regenerujících rostlinách.
3. Pěstování transgenního ječmene
Přibližně po třiceti dnech růstu v základním médiu (Harwood et al. (2009), ln Methods in Molecular Biology, Vol. 478 Transgenic Wheat, Barley and Oats (Jones H. D, Shewry P. R. ed.), pp. 137-147, Humana Press, New York, USA) byly rostliny přemístěny do rašelinových disků a pěstovány týden ve fytotronu (16 hodin den - 15 °C / 8 hodin noc - 12 °C; osvětlení 300 pM/m2/s na úrovni pěstební nádoby). Nakonec byly rostliny přesazeny do směsi hlína:komerční substrátperlit (poměr 1:1:1) a pěstovány ve fytokomoře za stejných podmínek až do stadia zralosti.
V TI generaci transgenního ječmene byly selektovány linie s jednou integrací T-DNA, u kterých byla na úrovni gDNA, RNA a proteinové úrovni potvrzena a ověřena přítomnost funkčního transgenu. V T2 generaci byly vyselektovány homozygotní linie transgenního ječmene, které byly dále charakterizovány a studovány.
4. Studium exprese AtCKXl řízené β-glukosidasovým promotorem a studium exprese 35S::hpt
Počet transkriptů AtCKXl byl detekován v 1 ng RNA u 1, 2, 5, 8 a 14 týdnů starých transgenních rostlin ječmene s AtCKXl vakuolámí. Počet transkriptů hpt byl detekován v 1 ng RNA u 1, 2, 5 a 8 týdnů starých transgenních rostlin ječmene s AtCKXl vakuolámí. Kvantifikace proběhla za pomoci kalibračních křivek k jejichž přípravě byly použity čisté plasmidy s příslušnými geny o známé koncentraci pomocí Sybr green qPCR (StepOnePlus™ Real-Time PCR Systém, Life Technologies Czech Republic s.r.o., Praha). Primery byly navrženy pomocí program Primer Express 3.0. Jako endogenní kontrola sloužily geny pro βaktin, ječmenný cyklofilin a elongační faktor 1.
Kvalitní RNA byla izolována za užití kitu RNAqueous® (Ambion, Life Technologies Czech Republic s.r.o., Praha), ošetřena Turbo DNAsou (Life Technologies Czech Republic s.r.o., Praha) a vyčištěna užitím magnetických kuliček (Agencourt RNA-CLEAN XP, Beckman Coulter, Praha). Následoval přepis do cDNA pomocí reverzní transkriptázy RevertAid H Minus M-MULV (ThermoFischer SCIENTIFIC, Pardubice).
Pro potvrzení integrace požadované funkční kazety do genomu ječmene a tím i pro potvrzení genetické modifikace rostlin byl sledován selekční gen hpt na genomové úrovni i na úrovni RNA. U všech transgenních rostlin byla potvrzena přítomnost i transkripce sledovaného genu hpt (Tab. 1), která je řízena 35S promotorem (součást binárního vektoru pBRACT209).
Tabulka 1: Počet transkriptů hpt v 1 ng RNA u 1, 2, 5 a 8 týdnů starých transgenních rostlin.
| 1. týden | Počet transkriptů hpt na ng RNA | 8. týden | ||
| 2. týden | 5. týden | |||
| nadzemní část | 124511 | 265359 | 274358 | 68685 |
| kořenech | 158255 | 373909 | 400937 | 287502 |
Pro kvantifikaci exprese AtCKXl řízené β-glukosidasovým promotorem byl stanoven počet transkriptů AtCKXl v 1 ng RNA v nadzemní části a v kořenech u 1, 2, 5, 8, a 14/16 týdnů ' 23 starých transgenních rostlin ječmene (Obr. 2). Exprese AtCKXl je nejsilnější u 4 týdny starých rostlin, a to v kořenech ječmene. V porovnání s expresí řízenou 35S promotorem (Tab. 1), který je považován za středně silný promotor pro použití v obilovinách, můžeme βglukosidasový promotor považovat za slabý promotor pro expresi cílového genu v jednoděložných rostlinách.
Příklad 2: Aplikace stresu suchem
A. Stres byl aplikován na tři měsíce staré rostliny, které byly pěstovány ve skleníku v 1 kg homogenní směsi hlíny a perlitu v poměru 2:1. Hlína se nechala v pravidelných intervalech vyschnout, což odpovídalo 1 až 3 zálivkám po 200 ml na 1 kg hlíny za týden v závislosti na stáří rostliny a teplotních podmínkách. Nestresované rostliny byly zalévány denně. Bylo stresováno 30 transgenních rostlin ječmene s vakuolámí formou AtCKXl a 30 kontrolních WT. U 3 měsíce starých rostlin byl stanoven relativní obsah vody (RWC) v šesti nejmladších, ale plně vyvinutých listech pro testovanou linii (Turner NC, Abbo S, Berger JD, Chaturvedi SK, French RJ, Ludwig C, Mannur DM, Singh SJ, Yadava HS. (2007) J Exp Bot. 58:187-94).
B. Studium působení stresu na 4 týdny staré, hydroponicky pěstované rostliny ječmene rostoucí ve fytotronu (16 hodin den - 23 °C / 8 hodin noc - 20 °C; osvětlení 100 pM/m2/s na úrovni pěstební nádoby, 300 μΜ/m /s na úrovni růstového vrcholu 6 týdnů starých rostlin). Stres byl aplikován odlitím živného media z pěstební nádoby (Hoagland DR and Amon Dl. (1950), Califomia Agricultural Experiment Station Circular 347:1-32), mírným okapáním a vrácením rostlin do nádoby, kde byly dále pěstovány 24 hodin. Během této doby probíhal v časových intervalech odběr listů (vždy 5 na linii ječmene) pro stanovení relativního obsahu vody a dále probíhala fotodokumentace stresovaných rostlin.
C. Studium působení stresu na 4 týdny staré rostliny ječmene, které byly pěstované v minimálním množství hlíny ve fytotronu (16 hodin den - 22 °C / 8 hodin noc - 20 °C; osvětlení 150 pM/m2/s) pro posouzení schopnosti revitalizace geneticky modifikovaných rostlin. Rostliny byly ponechány 2 dny bez zálivky a pomocí stanovaní relativního obsahu vody v listech byl potvrzen silný stress suchem. Kontrola revitalizace probíhala 24 hodin od obnovení zálivky a to odběrem listů (vždy 5 na linii ječmene) pro stanovení relativního obsahu vody.
A. Zvýšená odolnost transgenních rostlin ječmene pěstovaných v 1 kg pěstebního substrátu a dlouhodobě stresovaných suchem.
Transgenní rostliny s vakuolámí formou AtCKXl byly pěstovány v 1 kg pěstebního substrátu ve skleníku. Po dvou měsících sucha byly odebrány praporcové listy pěstovaných rostlin pro stanovení relativního obsahu vody. Bylo zjištěno, že v porovnání s kontrolními WT rostlinami mají transgenní rostliny o více než 1Q% vyšší obsah vody během aplikace dlouhotrvajícího stresu (Obr. 3). V porovnání s kontrolními podmínkami (tj. bez aplikace stresu) je patrné, že u geneticky modifikovaných rostlin, na rozdíl od WT ječmene, nedošlo během stresu k výraznému poklesu vody v listech (Obr. 3).
B. Zvýšená odolnost při stresu suchem u hydroponicky pěstovaných rostlin
Rostliny ječmene (transgenní linie a WT ječmen) byly hydroponicky pěstovány v Hoaglandově živném roztoku pro zajištění optimálního příjmu živin a vody kořeny, což je ideální pro stanovení studovaných parametrů (RWC, celková suchá hmota listů a kořenů po dvoutýdenní regeneraci rostlin) během stresu suchem a revitalizace. Během experimentu byl sledován fenotyp rostlin. Vzhledem k odlišnému místu působení ektopicky produkované CKX byly získány odlišné výsledky pro transgenní rostliny s vakuolámí, cytosolickou nebo apoplastickou CKX.
Ječmen s AtCKXl vakuolámí
Během stresu a revitalizace hydroponicky pěstovaných rostlin nebylo pozorováno zvýšení ν'
RWC oproti WT ječmeni. Po dvoutýdenní regeneraci měly transgenní rostliny o 32;% zvětšenou hmotu nadzemní části než WT, což bylo dáno větším množstvím odnoží. Z hlediska fenotypu je u transgenních rostlin patrná rychlejší regenerace již po 4 hodinách revitalizace (Obr. 4).
Ječmen s AtCKXl apoplastickou
Během stresu hydroponicky pěstovaných rostlin byl po 20 hodinách bez růstového média detekován nárůst RWC až o 19% v porovnání s kontrolními WT rostlinami, po 24 hodinách stresu až o 12% vyšší RWC oproti WT ječmeni. Hmota nadzemní části nebo kořenů nebyla po aplikaci stresu vyšší než u stejně stresovaných WT rostlin. Z hlediska fenotypu je jasně viditelná odolnost transgenních rostlin během stresu i rychlejší regenerace těchto rostlin ve srovnání s WT ječmenem (Obr. 5).
Ječmen s AtCKXl cytosolickou
Během dvouhodinové revitalizace hydroponicky pěstovaných rostlin byl detekován o 1&% větší relativní obsah vody v listech než u kontrolních WT rostlin. Po dvoutýdenní regeneraci rostlin měly transgenní rostliny o 17 % zvětšenou hmotu nadzemní části a o 17% větší hmotu kořenů než WT. Počet odnoží byl srovnatelný s WT ječmenem, rostliny byly většího vzrůstu. Z hlediska fenotypu je patrná větší odolnost transgenních rostlin vůči stresu během celých 24 hodin a rychlá revitalizace již za 2 hodiny po přidání živného media k rostlinám (Obr. 6).
C. Zvýšená schopnost revitalizace transgenních rostlin ječmene pěstovaných v minimálním množství pěstebního substrátu
Transgenní rostliny svakuolámí, cytosolickou nebo apoplastickou formou AtCKXl byly pěstovány v minimálním množství pěstebního substrátu ve fytotronu. Po aplikaci sucha (ukončení zálivky) a během revitalizace (obnovení zálivky) byly odebrány nej mladší, ale již plně vyvinuté listy pěstovaných rostlin pro stanovení relativního obsahu vody. Vzhledem k tomu, že rostliny rostly pouze v omezeném množství zeminy a byly tudíž značně prostorově a nutričně omezeny, nemohlLběhem stresu využít plně svého potenciálu. Tento experiment byl tedy zaměřen na schopnost revitalizace geneticky modifikovaných rostlin po předchozí aplikaci a potvrzení stresu suchem. Po obnovení zálivky byla u transgenních rostlin pozorována, ve srovnání s WT ječmenem, výrazně rychlejší revitalizace nadzemní části rostlin (Tab. 3). U linie s cytosolickou AtCKXl byl potvrzen o 25% větší obsah vody v listech než u WT ječmene. U rostlin s apolastickou AtCKXl byl RWC o 17% větší, u linie svakuolámí AtCKXl byla hodnota RWC o 15% vyšší než u WT ječmene. Transgenní ,-V rostliny s ektopicky nadprodukovanou AtCKXl tedy měly v prostředí s dostatečným množstvím zálivky větší schopnost dodat rychle potřebné množství vody do nadzemní části rostliny.
Tabulka 3: Stanovení relativního obsahu vody v listech (RWC) během revitalizace transgenních a WT rostlin ječmene po aplikaci stresu suchem.
| Linie ječmene | RWC v % během 24 hodinové revitalizace |
| WT | 78 |
| AtCKXl cytosolická | 98 |
| AtCKXl apoplastická | 92 |
| AtCKXl vakuolární | 90 |
Sequence Listing_ST25
SEQUENCE LISTING <110> univerzita Palackeho v Olomouci <120> ZPŮSOB PRIPRAVY JEČMENE SE ZVÝŠENOU ODOLNOSTI VUCI SUCHU <130> P <160> 9 <170> Patentin versi on 3.5 <210> 1 <211> 1728 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana
| <400> 1 atgggattga | cctcatcctt | acggttccat | agacaaaaca | acaagacttt | cctcggaatc | 60 |
| ttcatgatct | tagttctaag | ctgtatacca | ggtagaacca | atctttgttc | caatcattct | 120 |
| gttagtaccc | caaaagaatt | accttcttca | aatccttcag | atattcgttc | ctcattagtt | 180 |
| tcactagatt | tggagggtta | tataagcttc | gacgatgtcc | acaatgtggc | caaggacttt | 240 |
| ggcaacagat | accagttacc | acctttggca | attctacatc | caaggtcagt | ttttgatatt | 300 |
| tcatcgatga | tgaagcatat | agtacatctg | ggctccacct | caaatcttac | agtagcagct | 360 |
| agaggccatg | gtcactcgct | tcaaggacaa | gctctagctc | atcaaggtgt | tgtcatcaaa | 420 |
| atggagtcac | ttcgaagtcc | tgatatcagg | atttataagg | ggaagcaacc | atatgttgat | 480 |
| gtctcaggtg | gtgaaatatg | gataaacatt | ctacgcgaga | ctctaaaata | cggtctttca | 540 |
| ccaaagtcct | ggacagacta | ccttcatttg | accgttggag | gtacactatc | taatgctgga | 600 |
| atcagcggtc | aagcattcaa | gcatggaccc | caaatcaaca | acgtctacca | gctagagatt | 660 |
| gttacaggga | aaggagaagt | cgtaacctgt | tctgagaagc | ggaattctga | acttttcttc | 720 |
| agtgttcttg | gcgggcttgg | acagtttggc | ataatcaccc | gggcacggat | ctctcttgaa | 780 |
| ccagcaccgc | atatggttaa | atggatcagg | gtactctact | ctgacttttc | tgcattttca | 840 |
| agggaccaag | aatatctgat | ttcgaaggag | aaaacttttg | attacgttga | aggatttgtg | 900 |
| ataatcaata | gaacagacct | tctcaataat | tggcgatcgt | cattcagtcc | caacgattcc | 960 |
| acacaggcaa | gcagattcaa | gtcagatggg | aaaactcttt | attgcctaga | agtggtcaaa | 1020 |
| tatttcaacc | cagaagaagc | tagctctatg | gatcaggaaa | ctggcaagtt | actttcagag | 1080 |
| ttaaattata | ttccatccac | tttgttttca | tctgaagtgc | catatatcga | gtttctggat | 1140 |
| cgcgtgcata | tcgcagagag | aaaactaaga | gcaaagggtt | tatgggaggt | tccacatccc | 1200 |
| tggctgaatc | tcctgattcc | taagagcagc | atataccaat | ttgctacaga | agttttcaac | 1260 |
| aacattctca | caagcaacaa | caacggtcct | atccttattt | atccagtcaa | tcaatccaag | 1320 |
| tggaagaaac | atacatcttt | gataactcca | aatgaagata | tattctatct | cgtagccttt | 1380 |
| ctcccctctg | cagtgccaaa | ttcctcaggg | aaaaacgatc | tagagtacct | tttgaaacaa | 1440 |
| aaccaaagag | ttatgaactt | ctgcgcagca | gcaaacctca | acgtgaagca | gtatttgccc | 1500 |
Stránka—1—
Sequence Listing_ST25 cattatgaaa ctcaaaaaga gtggaaatca cactttggca aaagatggga aacatttgca 1560 cagaggaaac aagcctacga ccctctagcg attctagcac ctggccaaag aatattccaa 1620 aagacaacag gaaaattatc tcccatccaa ctcgcaaagt caaaggcaac aggaagtcct 1680 caaaggtacc attacgcatc aatactgccg aaacctagaa ctgtataa
1728 <210> 2 <211> 1686 <212> DNA <213> Artificial <220>
<223> Sekvence AtCKXl (bez signálního peptidu) z Arabidopsis thaliana spojená se sekvencí apoplastického signálního peptidu z Arabidopsis thaliana
| <400> 2 aatcttcgtt | taatgatcac | tttaatcacg | gttttaatga | tcaccaaatc | atcaaacggc | 60 |
| atgctttcga | atcattctgt | tagtacccca | aaagaattac | cttcttcaaa | tccttcagat | 120 |
| attcgttcct | cattagtttc | actagatttg | gagggttata | taagcttcga | cgatgtccac | 180 |
| aatgtggcca | aggactttgg | caacagatac | cagttaccac | ctttggcaat | tctacatcca | 240 |
| aggtcagttt | ttgatatttc | atcgatgatg | aagcatatag | tacatctggg | ctccacctca | 300 |
| aatcttacag | tagcagctag | aggccatggt | cactcgcttc | aaggacaagc | tctagctcat | 360 |
| caaggtgttg | tcatcaaaat | ggagtcacta | cgaagtcctg | atattaggat | ttataagggg | 420 |
| aagcaaccat | atgttgatgt | ctcaggtggt | gaaatatgga | taaacattct | acgcgagact | 480 |
| ctaaaatacg | gtctttcacc | aaagtcctgg | acagactacc | ttcatttgac | cgttggaggt | 540 |
| acactatcta | atgctggaat | cagcggtcaa | gcattcaagc | atggacccca | aatcaacaac | 600 |
| gtctaccagc | tagagattgt | tacagggaaa | ggagaagtcg | taacctgttc | tgagaagcgg | 660 |
| aactctgaac | ttttcttcag | tgttcttggc | gggcttggac | agtttggcat | aatcacccgg | 720 |
| gcacggatct | ctcttgaacc | agcaccgcat | atggttaaat | ggatcagggt | actctactct | 780 |
| gacttttctg | cattttcaag | ggaccaagaa | tatctgattt | caaaggagaa | aacttttgat | 840 |
| tacgttgaag | gatttgtgat | aatcaataga | acagaccttc | tcaataattg | gcgatcgtca | 900 |
| ttcagtccca | acgattccac | acaggcaagc | agattcaagt | cagatgggaa | aactctttat | 960 |
| tgcctagaag | tggtcaaata | tttcaaccca | gaagaagcta | gctctatgga | tcaggaaact | 1020 |
| ggcaagttac | tttcagagtt | aaattatatt | ccatccactt | tgttttcatc | tgaagtgcca | 1080 |
| tatatcgagt | ttctggatcg | cgtgcatatc | gcagagagaa | aactaagagc | aaagggttta | 1140 |
| tgggaggttc | cacatccctg | gctgaatctc | ctgattccta | agagcagcat | ataccaattt | 1200 |
| gctacagaag | ttttcaacaa | cattctcaca | agcaacaaca | acggtcctat | ccttatttat | 1260 |
| ccagtcaatc | aatccaagtg | gaagaaacat | acatctttga | taactccaaa | tgaagatata | 1320 |
| ttctatctcg | tagcctttct | cccctctgca | gtgccaaatt | cctcagggaa | aaacgatctt | 1380 |
| gagtaccttt | tgaaacaaaa | ccaaagagtt | atgaacttct | gcgcagcagc | aaacctcaac | 1440 |
Stránka—?
Sequence Listing_ST25 caaaaagagt ctttggcaaa
1500 gtgaagcagt atttgcccca ttatgaaact ggaaatcaca agatgggaaa catttgcaca gaggaaacaa gcctacgacc ctctagcgat tctagcacct
1560 ggccaaagaa tattccaaaa gacaacagga aaattatctc ccatccaact cgcaaagtca
1620 aaggcaacag gaagtcctca aaggtatcat tacgcatcaa tactgccgaa acctagaact
1680 gtataa
1686 <210> 3 <211> 1617 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 3
| aatcattctg | ttagtacccc | aaaagaatta | ccttcttcaa | atccttcaga | tattcgttcc | 60 |
| tcattagttt | cactagattt | ggagggttat | ataagcttcg | acgatgtcca | caatgtggcc | 120 |
| aaggactttg | gcaacagata | ccagttacca | cctttggcaa | ttctacatcc | aaggtcagtt | 180 |
| tttgatattt | catcgatgat | gaagcatata | gtacatctgg | gctccacctc | aaatcttaca | 240 |
| gtagcagcta | gaggccatgg | tcactcgctt | caaggacaag | ctctagctca | tcaaggtgtt | 300 |
| gtcatcaaaa | tggagtcact | acgaagtcct | gatattagga | tttataaggg | gaagcaacca | 360 |
| tatgttgatg | tctcaggtgg | tgaaatatgg | ataaacattc | tacgcgagac | tctaaaatac | 420 |
| ggtctttcac | caaagtcctg | gacagactac | cttcatttga | ccgttggagg | tacactatct | 480 |
| aatgctggaa | tcagcggtca | agcattcaag | catggacccc | aaatcaacaa | cgtctaccag | 540 |
| ctagagattg | ttacagggaa | aggagaagtc | gtaacctgtt | ctgagaagcg | gaactctgaa | 600 |
| cttttcttca | gtgttcttgg | cgggcttgga | cagtttggca | taatcacccg | ggcacggatc | 660 |
| tctcttgaac | cagcaccgca | tatggttaaa | tggatcaggg | tactctactc | tgacttttct | 720 |
| gcattttcaa | gggaccaaga | atatctgatt | tcaaaggaga | aaacttttga | ttacgttgaa | 780 |
| ggatttgtga | taatcaatag | aacagacctt | ctcaataatt | ggcgatcgtc | attcagtccc | 840 |
| aacgattcca | cacaggcaag | cagattcaag | tcagatggga | aaactcttta | ttgcctagaa | 900 |
| gtggtcaaat | atttcaaccc | agaagaagct | agctctatgg | atcaggaaac | tggcaagtta | 960 |
| ctttcagagt | taaattatat | tccatccact | ttgttttcat | ctgaagtgcc | atatatcgag | 1020 |
| tttctggatc | gcgtgcatat | cgcagagaga | aaactaagag | caaagggttt | atgggaggtt | 1080 |
| ccacatccct | ggctgaatct | cctgattcct | aagagcagca | tataccaatt | tgctacagaa | 1140 |
| gttttcaaca | acattctcac | aagcaacaac | aacggtccta | tccttattta | tccagtcaat | 1200 |
| caatccaagt | ggaagaaaca | tacatctttg | ataactccaa | atgaagatat | attctatctc | 1260 |
| gtagcctttc | tcccctctgc | agtgccaaat | tcctcaggga | aaaacgatct | tgagtacctt | 1320 |
| ttgaaacaaa | accaaagagt | tatgaacttc | tgcgcagcag | caaacctcaa | cgtgaagcag | 1380 |
| tatttgcccc | attatgaaac | tcaaaaagag | tggaaatcac | actttggcaa | aagatgggaa | 1440 |
| acatttgcac | agaggaaaca | agcctacgac | cctctagcga | ttctagcacc | tggccaaaga | 1500 |
| atattccaaa | agacaacagg | aaaattatct | cccatccaac | tcgcaaagtc | aaaggcaaca | 1560 |
..Stránka-3-—* ' * » ) ·ί »
Sequence Lísting_ST25 ggaagtcctc aaaggtatca ttacgcatca atactgccga aacctagaac tgtataa
1617 <210> 4 <211> 3123 <212> DNA <213> Artificíal <22O>
<223> Expresní kazeta beta-glúkosídasový promotor::AtCKXl vakuolámí::nos terminátor
| <400> 4 acaagtttgt | acaaaaaagc | aggctttaaa | ggaaccaatt | caagaattcc | aaagctgccg | 60 |
| cattcggcaa | agcctgcaat | tccggtagtg | ttttaccacg | ttgacaaaaa | aaatgaagaa | 120 |
| atccgatatt | ttagtcatta | tggatatggc | gcggtgtcaa | atcggtatag | tcataatcct | 180 |
| ttccatagga | ttgtcccatg | ctcgacacat | taacactaag | tttatccctg | aataacacgg | 240 |
| ctacctccat | cctaatcttt | tctattgatc | aattgcctat | ttttaaggcg | cagttgttct | 300 |
| tggccgtatc | tgtggagatg | atttttttaa | agacgtccaa | ctctagctag | ctagtccgtg | 360 |
| tatgtgaacg | gtgttaggta | gtcattggat | ccgttgacta | tatttgtaaa | ggtggtagcc | 420 |
| gttcttttta | attttaacgc | cgctgggaag | aaattaaacg | tggtacatct | atgtatcgtt | 480 |
| ttcttaacag | tgatataata | atatactatc | attgcaagcg | tccgcaattg | ctctctcgcg | 540 |
| gctcgttcta | ccgtgggaag | aagagctgac | ccgtcgccgc | cccacatgca | tacgatgcgt | 600 |
| ccttatctgt | cgcggctcgt | gcaaacgcgg | ggcgggctga | gcgccccagc | ccáccacttg | 660 |
| caccacttgc | atttacttaa | ttagttcata | acacatcaca | tctgtatctt | acattatctt | 720 |
| taaaaaaatg | attcacacat | tatttatata | tgagatataa | taagtttcca | ggaagcatct | 780 |
| ttggcgactt | acgtacgtgt | atcagagaca | tggagtgata | aactattggg | caaccattta | 840 |
| gcaatcctag | ctagccagct | cgtctataaa | tagatgcatc | agctccactt | ggtctacaca | 900 |
| cttcacaagc | agctcaaagc | tctagttcta | gctagctagc | aaaggggggg | aaaggtaccg | 960 |
| tcgacatggg | attgacctca | tccttacggt | tccatagaca | aaacaacaag | actttcctcg | 1020 |
| gaatcttcat | gatcttagtt | ctaagctgta | taccaggtag | aaccaatctt | tgttccaatc | 1080 |
| attctgttag | taccccaaaa | gaattacctt | cttcaaatcc | ttcagatatt | cgttcctcat | 1140 |
| tagtttcact | agatttggag | ggttatataa | gcttcgacga | tgtccacaat | gtggccaagg | 1200 |
| actttggcaa | cagataccag | ttaccacctt | tggcaattct | acatccaagg | tcagtttttg | 1260 |
| atatttcatc | gatgatgaag | catatagtac | atctgggctc | cacctcaaat | cttacagtag | 1320 |
| cagctagagg | ccatggtcac | tcgcttcaag | gacaagctct | agctcatcaa | ggtgttgtca | 1380 |
| tcaaaatgga | gtcacttcga | agtcctgata | tcaggattta | taaggggaag | caaccatatg | 1440 |
| ttgatgtctc | aggtggtgaa | atatggataa | acattctacg | cgagactcta | aaatacggtc | 1500 |
| tttcaccaaa | gtcctggaca | gactaccttc | atttgaccgt | tggaggtaca | ctatctaatg | 1560 |
| ctggaatcag | cggtcaagca | ttcaagcatg | gaccccaaat | caacaacgtc | taccagctag | 1620 |
-Stránka-4— ·' t
Sequence Listing_ST25 agattgttac agggaaagga gaagtcgtaa cctgttctga gaagcggaat tctgaacttt 1680 tcttcagtgt tcttggcggg cttggacagt ttggcataat cacccgggca cggatctctc 1740 ttgaaccagc accgcatatg gttaaatgga tcagggtact ctactctgac ttttctgcat 1800 tttcaaggga ccaagaatat ctgatttcga aggagaaaac ttttgattac gttgaaggat 1860 ttgtgataat caatagaaca gaccttctca ataattggcg atcgtcattc agtcccaacg 1920 attccacaca ggcaagcaga ttcaagtcag atgggaaaac tctttattgc ctagaagtgg 1980 tcaaatattt caacccagaa gaagctagct ctatggatca ggaaactggc aagttacttt 2040 cagagttaaa ttatattcca tccactttgt tttcatctga agtgccatat atcgagtttc 2100 tggatcgcgt gcatatcgca gagagaaaac taagagcaaa gggtttatgg gaggttccac 2160 atccctggct gaatctcctg attcctaaga gcagcatata ccaatttgct acagaagttt 2220 tcaacaacat tctcacaagc aacaacaacg gtcctatcct tatttatcca gtcaatcaat 2280 ccaagtggaa gaaacataca tctttgataa ctccaaatga agatatattc tatctcgtag 2340 cctttctccc ctctgcagtg ccaaattcct cagggaaaaa cgatctagag taccttttga 2400 aacaaaacca aagagttatg aacttctgcg cagcagcaaa cctcaacgtg aagcagtatt 2460 tgccccatta tgaaactcaa aaagagtgga aatcacactt tggcaaaaga tgggaaacat 2520 ttgcacagag gaaacaagcc tacgaccctc tagcgattct agcacctggc caaagaatat 2580 tccaaaagac aacaggaaaa ttatctccca tccaactcgc aaagtcaaag gcaacaggaa 2640 gtcctcaaag gtaccattac gcatcaatac tgccgaaacc tagaactgta taagtcgact 2700 cgagtctaga agtcgaagca gatcgttcaa acatttggca ataaagtttc ttaagattga 2760 atcctgttgc cggtcttgcg atgattatca tataatttct gttgaattac gttaagcatg 2820 taataattaa catgtaatgc atgacgttat ttatgagatg ggtttttatg attagagtcc 2880 cgcaattata catttaatac gcgatagaaa acaaaatata gcgcgcaaac taggataaat 2940 tatcgcgcgc ggtgtcatct atgttactag atcgaccggc aagcaagctg atatgcggcc 3000 gcactcgaga tatctagacc cagctttctt gtacaaagtg gttgatgggc tgcaggaatt 3060 cgatatcaag cttatcgata ccgtcgacct cgagggggat caccactttg tacaagaaag 3120 ctg 3123 <210> 5 <211> 3114 <212> DNA <213> Artificial <22O>
<223> Expresní kazeta obsahující beta-glúkosídasový promotor::AtCKXl apoplastí ckou::NOS termínátor <400>5 acaagtttgt acaaaaaagc aggctttaaa ggaaccaatt cagtcgactg gatccggtac60 cgaattccaa agctgccgca ttcggcaaag cctgcaattc cggtagtgtt ttaccacgtt120 gacaaaaaaa atgaagaaat ccgatatttt agtcattatg gatatggcgc ggtgtcaaat 180
-Stránka—5— < 4
Sequence Listing_ST25
| cggtatagtc | ataatccttt | ccataggatt | gtcccatgct | cgacacatta | acactaagtt | 240 |
| tatccctgaa | taacacggct | acctccatcc | taatcttttc | tattgatcaa | ttgcctattt | 300 |
| ttaaggcgca | gttgttcttg | gccgtatctg | tggagatgat | ttttttaaag | acgtccaact | 360 |
| ctagctagct | agtccgtgta | tgtgaacggt | gttaggtagt | cattggatcc | gttgactata | 420 |
| tttgtaaagg | tggtagccgt | tctttttaat | tttaacgccg | ctgggaagaa | attaaacgtg | 480 |
| gtacatctat | gtatcgtttt | cttaacagtg | atataataat | atactatcat | tgcaagcgtc | 540 |
| cgcaattgct | ctctcgcggc | tcgttctacc | gtgggaagaa | gagctgaccc | gtcgccgccc | 600 |
| cacatgcata | cgatgcgtcc | ttatctgtcg | cggctcgtgc | aaacgcgggg | cgggctgagc | 660 |
| gccccagccc | accacttgca | ccacttgcat | ttacttaatt | agttcataac | acatcacatc | 720 |
| tgtatcttac | attatcttta | aaaaaatgat | tcacacatta | tttatatatg | agatataata | 780 |
| agtttccagg | aagcatcttt | ggcgacttac | gtacgtgtat | cagagacatg | gagtgataaa | 840 |
| ctattgggca | accatttagc | aatcctagct | agccagctcg | tctataaata | gatgcatcag | 900 |
| ctccacttgg | tctacacact | tcacaagcag | ctcaaagctc | tagttctagc | tagctagcaa | 960 |
| agggggggaa | aggtaccgtc | gacagatcta | tggcttcgaa | tcttcgttta | atgatcactt | 1020 |
| taatcacggt | tttaatgatc | accaaatcat | caaacggcat | gctttcgaat | cattctgtta | 1080 |
| gtaccccaaa | agaattacct | tcttcaaatc | cttcagatat | tcgttcctca | ttagtttcac | 1140 |
| tagatttgga | gggttatata | agcttcgacg | atgtccacaa | tgtggccaag | gactttggca | 1200 |
| acagatacca | gttaccacct | ttggcaattc | tacatccaag | gtcagttttt | gatatttcat | 1260 |
| cgatgatgaa | gcatatagta | catctgggct | ccacctcaaa | tcttacagta | gcagctagag | 1320 |
| gccatggtca | ctcgcttcaa | ggacaagctc | tagctcatca | aggtgttgtc | atcaaaatgg | 1380 |
| agtcactacg | aagtcctgat | attaggattt | ataaggggaa | gcaaccatat | gttgatgtct | 1440 |
| caggtggtga | aatatggata | aacattctac | gcgagactct | aaaatacggt | ctttcaccaa | 1500 |
| agtcctggac | agactacctt | catttgaccg | ttggaggtac | actatctaat | gctggaatca | 1560 |
| gcggtcaagc | attcaagcat | ggaccccaaa | tcaacaacgt | ctaccagcta | gagattgtta | 1620 |
| cagggaaagg | agaagtcgta | acctgttctg | agaagcggaa | ctctgaactt | ttcttcagtg | 1680 |
| ttcttggcgg | gcttggacag | tttggcataa | tcacccgggc | acggatctct | cttgaaccag | 1740 |
| caccgcatat | ggttaaatgg | atcagggtac | tctactctga | cttttctgca | ttttcaaggg | 1800 |
| accaagaata | tctgatttca | aaggagaaaa | cttttgatta | cgttgaagga | tttgtgataa | 1860 |
| tcaatagaac | agaccttctc | aataattggc | gatcgtcatt | cagtcccaac | gattccacac | 1920 |
| aggcaagcag | attcaagtca | gatgggaaaa | ctctttattg | cctagaagtg | gtcaaatatt | 1980 |
| tcaacccaga | agaagctagc | tctatggatc | aggaaactgg | caagttactt | tcagagttaa | 2040 |
| attatattcc | atccactttg | ttttcatctg | aagtgccata | tatcgagttt | ctggatcgcg | 2100 |
| tgcatatcgc | agagagaaaa | ctaagagcaa | agggtttatg | ggaggttcca | catccctggc | 2160 |
| tgaatctcct | gattcctaag | agcagcatat | accaatttgc | tacagaagtt | ttcaacaaca | 2220 |
S-tránka- 6~~ • »
Sequence Listing_ST25
| ttctcacaag caacaacaac ggtcctatcc ttatttatcc agtcaatcaa tccaagtgga | 2280 |
| agaaacatac atctttgata actccaaatg aagatatatt ctatctcgta gcctttctcc | 2340 |
| cctctgcagt gccaaattcc tcagggaaaa acgatcttga gtaccttttg aaacaaaacc | 2400 |
| aaagagttat gaacttctgc gcagcagcaa acctcaacgt gaagcagtat ttgccccatt | 2460 |
| atgaaactca aaaagagtgg aaatcacact ttggcaaaag atgggaaaca tttgcacaga | 2520 |
| ggaaacaagc ctacgaccct ctagcgattc tagcacctgg ccaaagaata ttccaaaaga | 2580 |
| caacaggaaa attatctccc atccaactcg caaagtcaaa ggcaacagga agtcctcaaa | 2640 |
| ggtatcatta cgcatcaata ctgccgaaac ctagaactgt ataagtcgac tcgagtctag | 2700 |
| aagtcgaagc agatcgttca aacatttggc aataaagttt cttaagattg aatcctgttg | 2760 |
| ccggtcttgc gatgattatc atataatttc tgttgaatta cgttaagcat gtaataatta | 2820 |
| acatgtaatg catgacgtta tttatgagat gggtttttat gattagagtc ccgcaattat | 2880 |
| acatttaata cgcgatagaa aacaaaatat agcgcgcaaa ctaggataaa ttatcgcgcg | 2940 |
| cggtgtcatc tatgttacta gatcgaccgg caagcaagct gatatgcggc cgcactcgag | 3000 |
| atatctagac ccagctttct tgtacaaagt ggttgatggg ctgcaggaat tcgatatcaa | 3060 |
| gcttatcgat accgtcgacc tcgaggggga tcaccacttt gtacaagaaa gctg | 3114 |
<210> 6 <211> 3045 <212> DNA <213> Artificial <220>
<223> Expresní kazeta obsahující beta-glúkosídasový promotor::AtCKXl cytosolíckou::NOS terminátor
| <400> 6 acaagtttgt | acaaaaaagc | aggctttaaa | ggaaccaatt | cagtcgactg | gatccggtac | 60 |
| cgaattccaa | agctgccgca | ttcggcaaag | cctgcaattc | cggtagtgtt | ttaccacgtt | 120 |
| gacaaaaaaa | atgaagaaat | ccgatatttt | agtcattatg | gatatggcgc | ggtgtcaaat | 180 |
| cggtatagtc | ataatccttt | ccataggatt | gtcccatgct | cgacacatta | acactaagtt | 240 |
| tatccctgaa | taacacggct | acctccatcc | taatcttttc | tattgatcaa | ttgcctattt | 300 |
| ttaaggcgca | gttgttcttg | gccgtatctg | tggagatgat | ttttttaaag | acgtccaact | 360 |
| ctagctagct | agtccgtgta | tgtgaacggt | gttaggtagt | cattggatcc | gttgactata | 420 |
| tttgtaaagg | tggtagccgt | tctttttaat | tttaacgccg | ctgggaagaa | attaaacgtg | 480 |
| gtacatctat | gtatcgtttt | cttaacagtg | atataataat | atactatcat | tgcaagcgtc | 540 |
| cgcaattgct | ctctcgcggc | tcgttctacc | gtgggaagaa | gagctgaccc | gtcgccgccc | 600 |
| cacatgcata | cgatgcgtcc | ttatctgtcg | cggctcgtgc | aaacgcgggg | cgggctgagc | 660 |
| gccccagccc | accacttgca | ccacttgcat | ttacttaatt | agttcataac | acatcacatc | 720 |
| tgtatcttac | attatcttta | aaaaaatgat | tcacacatta | tttatatatg | agatataata | 780 |
Stránka—?—·
Sequence Listing_ST25
| agtttccagg | aagcatcttt | ggcgacttac | gtacgtgtat | cagagacatg | gagtgataaa | 840 |
| ctattgggca | accatttagc | aatcctagct | agccagctcg | tctataaata | gatgcatcag | 900 |
| ctccacttgg | tctacacact | tcacaagcag | ctcaaagctc | tagttctagc | tagctagcaa | 960 |
| agggggggaa | aggtaccgtc | gacagatcta | tggcttcgaa | tcattctgtt | agtaccccaa | 1020 |
| aagaattacc | ttcttcaaat | ccttcagata | ttcgttcctc | attagtttca | ctagatttgg | 1080 |
| agggttatat | aagcttcgac | gatgtccaca | atgtggccaa | ggactttggc | aacagatacc | 1140 |
| agttaccacc | tttggcaatt | ctacatccaa | ggtcagtttt | tgatatttca | tcgatgatga | 1200 |
| agcatatagt | acatctgggc | tccacctcaa | atcttacagt | agcagctaga | ggccatggtc | 1260 |
| actcgcttca | aggacaagct | ctagctcatc | aaggtgttgt | catcaaaatg | gagtcactac | 1320 |
| gaagtcctga | tattaggatt | tataagggga | agcaaccata | tgttgatgtc | tcaggtggtg | 1380 |
| aaatatggat | aaacattcta | cgcgagactc | taaaatacgg | tctttcacca | aagtcctgga | 1440 |
| cagactacct | tcatttgacc | gttggaggta | cactatctaa | tgctggaatc | agcggtcaag | 1500 |
| cattcaagca | tggaccccaa | atcaacaacg | tctaccagct | agagattgtt | acagggaaag | 1560 |
| gagaagtcgt | aacctgttct | gagaagcgga | actctgaact | tttcttcagt | gttcttggcg | 1620 |
| ggcttggaca | gtttggcata | atcacccggg | cacggatctc | tcttgaacca | gcaccgcata | 1680 |
| tggttaaatg | gatcagggta | ctctactctg | acttttctgc | attttcaagg | gaccaagaat | 1740 |
| atctgatttc | aaaggagaaa | acttttgatt | acgttgaagg | atttgtgata | atcaatagaa | 1800 |
| cagaccttct | caataattgg | cgatcgtcat | tcagtcccaa | cgattccaca | caggcaagca | 1860 |
| gattcaagtc | agatgggaaa | actctttatt | gcctagaagt | ggtcaaatat | ttcaacccag | 1920 |
| aagaagctag | ctctatggat | caggaaactg | gcaagttact | ttcagagtta | aattatattc | 1980 |
| catccacttt | gttttcatct | gaagtgccat | atatcgagtt | tctggatcgc | gtgcatatcg | 2040 |
| cagagagaaa | actaagagca | aagggtttat | gggaggttcc | acatccctgg | ctgaatctcc | 2100 |
| tgattcctaa | gagcagcata | taccaatttg | ctacagaagt | tttcaacaac | attctcacaa | 2160 |
| gcaacaacaa | cggtcctatc | cttatttatc | cagtcaatca | atccaagtgg | aagaaacata | 2220 |
| catctttgat | aactccaaat | gaagatatat | tctatctcgt | agcctttctc | ccctctgcag | 2280 |
| tgccaaattc | ctcagggaaa | aacgatcttg | agtacctttt | gaaacaaaac | caaagagtta | 2340 |
| tgaacttctg | cgcagcagca | aacctcaacg | tgaagcagta | tttgccccat | tatgaaactc | 2400 |
| aaaaagagtg | gaaatcacac | tttggcaaaa | gatgggaaac | atttgcacag | aggaaacaag | 2460 |
| cctacgaccc | tctagcgatt | ctagcacctg | gccaaagaat | attccaaaag | acaacaggaa | 2520 |
| aattatctcc | catccaactc | gcaaagtcaa | aggcaacagg | aagtcctcaa | aggtatcatt | 2580 |
| acgcatcaat | actgccgaaa | cctagaactg | tataagtcga | ctcgagtcta | gaagtcgaag | 2640 |
| cagatcgttc | aaacatttgg | caataaagtt | tcttaagatt | gaatcctgtt | gccggtcttg | 2700 |
| cgatgattat | catataattt | ctgttgaatt | acgttaagca | tgtaataatt | aacatgtaat | 2760 |
| gcatgacgtt | atttatgaga | tgggttttta | tgattagagt | cccgcaatta | tacatttaat | 2820 |
Strárrka-8-Sequence Listing_ST25 acgcgataga aaacaaaata tagcgcgcaa actaggataa attatcgcgc gcggtgtcat ctatgttact agatcgaccg gcaagcaagc tgatatgcgg ccgcactcga gatatctaga cccagctttc ttgtacaaag tggttgatgg gctgcaggaa ttcgatatca agcttatcga taccgtcgac ctcgaggggg atcaccactt tgtacaagaa agctg
2880
2940
3000
3045 <210>7 <211>575 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400>7
| Met 1 | Gly Leu Thr | ser 5 | Ser Leu | Arg Phe | His 10 | Arg Gin Asn | Asn | Lys 15 | Thr | ||||||
| Phe | Leu | Gly | 11 e | Phe | Met | Ile | Leu | val | Leu | Ser | cys | ile | Pro | Gly | Arg |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Thr | Asn | Leu | Cys | Ser | Asn | His | Ser | val | Ser | Thr | Pro | Lys | Glu | Leu | Pro |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Ser | Ser | Asn | Pro | Ser | Asp | Ile | Arg | Ser | Ser | Leu | val | Ser | Leu | Asp | Leu |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| Glu | Gly | Tyr | 11 e | Ser | Phe | Asp | Asp | val | Hi s | Asn | val | Ala | Lys | Asp | Phe |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| Gly | Asn | Arg | Tyr | Gin | Leu | Pro | Pro | Leu | Ala | Ile | Leu | His | Pro | Arg | ser |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| val | Phe | Asp | 11 e | Ser | Ser | Met | Met | Lys | His | ile | val | His | Leu | Gly | Ser |
| 100 | 105 | 110 | |||||||||||||
| Thr | ser | Asn | Leu | Thr | val | Ala | Ala | Arg | Gly | His | Gly | Hi S | Ser | Leu | Gin |
| 115 | 120 | 125 | |||||||||||||
| Gly | Gin | Ala | Leu | Ala | His | Gin | Gly | val | val | ile | Lys | Met | Glu | ser | Leu |
| 130 | 135 | 140 | |||||||||||||
| Arg | Ser | Pro | Asp | ile | Arg | Ile | Tyr | Lys | Gly | Lys | Gin | Pro | Tyr | Val | Asp |
| 145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
| val | Ser | Gly Gly | Glu | ile | Trp | ile | Asn | ile | Leu | Arg | Glu | Thr | Leu | Lys | |
| 165 | 170 | 175 | |||||||||||||
| Tyr | Gly | Leu | Ser | Pro | Lys | Ser | Trp | Thr | Asp | Tyr | Leu | Hi s | Leu | Thr | Val |
| 180 | 185 | 190 | |||||||||||||
| Gly Gly | Thr | Leu | ser | Asn | Ala | Gly | Ile | ser | Gly | Gin | Ala | Phe | Lys | His | |
| 195 | 200 | 205 |
Stránka-θ'
| Gly | Pro Gin 210 | Ile | Asn | Asn | val 215 | Sequence Listi Tyr Gin Leu Glu | ng_ST25 | Thr | Gly | Lys | |||||
| ile 220 | val | ||||||||||||||
| Gly | Glu | val | val | Thr | Cys | Ser | Glu | Lys | Arg | Asn | Ser | Glu | Leu | Phe | Phe |
| 225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
| Ser | val | Leu | Gly | Gly | Leu | Gly | Gin | Phe | Gly | Ile | Ile | Thr | Arg | Ala | Arg |
| 245 | 250 | 255 | |||||||||||||
| Ile | ser | Leu | Glu | Pro | Ala | Pro | His | Met | Val | Lys | Trp | Ile | Arg | Val | Leu |
| 260 | 265 | 270 | |||||||||||||
| Tyr | Ser | Asp | Phe | Ser | Ala | Phe | Ser | Arg | Asp | Gin | Glu | Tyr | Leu | ile | ser |
| 275 | 280 | 285 | |||||||||||||
| Lys | Glu | Lys | Thr | Phe | Asp | Tyr | val | Glu | Gly | Phe | val | ile | ile | Asn | Arg |
| 290 | 295 | 300 | |||||||||||||
| Thr | Asp | Leu | Leu | Asn | Asn | Trp | Arg | Ser | Ser | Phe | ser | Pro | Asn | Asp | Ser |
| 305 | 310 | 315 | 320 | ||||||||||||
| Thr | Gin | Ala | Ser | Arg | Phe | Lys | Ser | Asp | Gly | Lys | Thr | Leu | Tyr | cys | Leu |
| 325 | 330 | 335 | |||||||||||||
| Glu | val | val | Lys | Tyr | Phe | Asn | Pro | Glu | Glu | Ala | Ser | Ser | Met | Asp | Gin |
| 340 | 345 | 350 | |||||||||||||
| Glu | Thr | Gly | Lys | Leu | Leu | Ser | Glu | Leu | Asn | Tyr | Ile | Pro | Ser | Thr | Leu |
| 355 | 360 | 365 | |||||||||||||
| Phe | ser | Ser | Glu | val | Pro | Tyr | Ile | Glu | Phe | Leu | Asp | Arg | val | H1 s | ile |
| 370 | 375 | 380 | |||||||||||||
| Ala | Glu | Arg | Lys | Leu | Arg | Ala | Lys | Gly | Leu | Trp | Glu | val | Pro | His | pro |
| 385 | 390 | 395 | 400 | ||||||||||||
| Trp | Leu | Asn | Leu | Leu | ile | Pro | Lys | Ser | Ser | ile | Tyr | Gin | phe | Ala | Thr |
| 405 | 410 | 415 | |||||||||||||
| Glu | val | Phe | Asn | Asn | Ile | Leu | Thr | Ser | Asn | Asn | Asn | Gly | Pro | Ile | Leu |
| 420 | 425 | 430 | |||||||||||||
| Ile | Tyr | Pro | val | Asn | Gin | Ser | Lys | Trp | Lys | Lys | Hi S | Thr | Ser | Leu | ile |
| 435 | 440 | 445 | |||||||||||||
| Thr | pro | Asn | Glu | Asp | Ile | Phe | Tyr | Leu | Val | Ala | Phe | Leu | ΡΓΟ | Ser | Ala |
| 450 | 455 | 460 | |||||||||||||
| Val | Pro | Asn | Ser | ser | Gly | Lys | Asn | Asp | Leu | Glu | Tyr | Leu | Leu | Lys | Gin |
| 465 | 470 | 475 | 480 |
stránka—10—
| Asn | Gin Arg val | Met Asn 485 | Phe | Sequence Listi Cys Ala Ala Ala 490 | ng_ST25 | val 495 | Lys | ||||||||
| Asn | Leu | Asn | |||||||||||||
| Gin | Tyr | Leu | pro | His | Tyr | Glu | Thr | Gin | Lys | Glu | Trp | Lys | Ser | HÍ s | Phe |
| 500 | 505 | 510 | |||||||||||||
| Gly | Lys | Arg | Trp | Glu | Thr | Phe | Ala | Gin | Arg | Lys | Gin | Ala | Tyr | Asp | Pro |
| 515 | 520 | 525 | |||||||||||||
| Leu | Ala | ile | Leu | Ala | Pro | Gly | Gin | Arg | Ile | phe | Gin | Lys | Thr | Thr | Gly |
| 530 | 535 | 540 | |||||||||||||
| Lys | Leu | Ser | Pro | Ile | Gin | Leu | Ala | Lys | Ser | Lys | Ala | Thr | Gly | Ser | Pro |
| 545 | 550 | 555 | 560 | ||||||||||||
| Gin | Arg | Tyr | Hl S | Tyr | Ala | Ser | ile | Leu | Pro | Lys | Pro | Arg | Thr | val |
565 570 575 <210> 8 <211> 561 <212> PRT <213> Artificial <22O>
| <223> | Sekvence | AtCKXl | (bez | signálního pepti | du) | z Arabidopsis thaliana | |||||||||
| spoji | ená se sekvencí apoplastického signálního peptidu | 1 z | |||||||||||||
| Arab | idopsis thaliana | ||||||||||||||
| <400> | 8 | ||||||||||||||
| Asn | Leu | Arg | Leu | Met | ile | Thr | Leu | Ile | Thr | Val | Leu | Met | Ile | Thr | Lys |
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
| Ser | Ser | Asn | Gly | Met | Leu | Ser | Asn | Hi s | Ser | Val | ser | Thr | Pro | Lys | Glu |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Leu | Pro | Ser | Ser | Asn | Pro | Ser | Asp | Ile | Arg | Ser | Ser | Leu | Val | Ser | Leu |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Asp | Leu | Glu | Gly | Tyr | ile | ser | Phe | Asp | Asp | val | HÍ S | Asn | val | Ala | Lys |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| Asp | Phe | Gly | Asn | Arg | Tyr | Gin | Leu | Pro | Pro | Leu | Ala | Ile | Leu | His | Pro |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| Arg | ser | val | Phe | Asp | ile | Ser | Ser | Met | Met | Lys | Hi s | Ile | Val | His | Leu |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| Gly | Ser | Thr | Ser | Asn | Leu | Thr | Val | Ala | Ala | Arg | Gly | His | Gly | His | Ser |
| 100 | 105 | 110 | |||||||||||||
| Leu | Gin | Gly | Gin | Ala | Leu | Ala | His | Gin | Gly | val | val | ile | Lys | Met | Glu |
| 115 | 120 | 125 |
·stránkaJJL
Sequence Listing_ST25
| Ser | Leu | Arg | ser | Pro | Asp | ile | Arg | ile | Tyr | Lys | Gly | Lys | Gin | Pro | Tyr |
| 130 | 135 | 140 | |||||||||||||
| val | Asp | Val | Ser | Gly | Gly | Glu | Ile | Trp | Ile | Asn | Ile | Leu | Arg | Glu | Thr |
| 145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
| Leu | Lys | Tyr | Gly | Leu | Ser | Pro | Lys | Ser | Trp | Thr | Asp | Tyr | Leu | His | Leu |
| 165 | 170 | 175 | |||||||||||||
| Thr | Val | Gly | Gly | Thr | Leu | Ser | Asn | Ala | Gly | ile | Ser | Gly | Gin | Ala | Phe |
| 180 | 185 | 190 | |||||||||||||
| Lys | His | Gly | Pro | Gin | ile | Asn | Asn | Val | Tyr | Gin | Leu | Glu | ile | val | Thr |
| 195 | 200 | 205 | |||||||||||||
| Gly | Lys | Gly | Glu | Val | Val | Thr | Cys | Ser | Glu | Lys | Arg | Asn | Ser | Glu | Leu |
| 210 | 215 | 220 | |||||||||||||
| Phe | Phe | Ser | Val | Leu | Gly | Gly | Leu | Gly | Gin | Phe | Gly | ile | ile | Thr | Arg |
| 225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
| Ala | Arg | Ile | Ser | Leu | Glu | Pro | Ala | Pro | His | Met | Val | Lys | Trp | Ile | Arg |
| 245 | 250 | 255 | |||||||||||||
| val | Leu | Tyr | ser | Asp | Phe | Ser | Ala | Phe | Ser | Arg | Asp | Gin | Glu | Tyr | Leu |
| 260 | 265 | 270 | |||||||||||||
| Ile | Ser | Lys | Glu | Lys | Thr | Phe | Asp | Tyr | val | Glu | Gly | Phe | Val | ile | Ile |
| 275 | 280 | 285 | |||||||||||||
| Asn | Arg | Thr | Asp | Leu | Leu | Asn | Asn | Trp | Arg | Ser | Ser | Phe | Ser | pro | Asn |
| 290 | 295 | 300 | |||||||||||||
| Asp | Ser | Thr | Gin | Ala | Ser | Arg | Phe | Lys | Ser | Asp | Gly | Lys | Thr | Leu | Tyr |
| 305 | 310 | 315 | 320 | ||||||||||||
| Cys | Leu | Glu | val | val | Lys | Tyr | phe | Asn | Pro | Glu | Glu | Ala | Ser | Ser | Met |
| 325 | 330 | 335 | |||||||||||||
| Asp | Gin | Glu | Thr | Gly | Lys | Leu | Leu | Ser | Glu | Leu | Asn | Tyr | Ile | Pro | Ser |
| 340 | 345 | 350 | |||||||||||||
| Thr | Leu | Phe | Ser | Ser | Glu | val | Pro | Tyr | Ile | Glu | Phe | Leu | ASp | Arg | val |
| 355 | 360 | 365 | |||||||||||||
| His | Ile | Ala | Glu | Arg | Lys | Leu | Arg | Ala | Lys | Gly | Leu | Trp | G1U | val | Pro |
| 370 | 375 | 380 | |||||||||||||
| His | Pro | Trp | Leu | Asn | Leu | Leu | Ile | Pro | Lys | Ser | ser | ile | Tyr | Gin | Phe |
| 385 | 390 | 395 | 400 |
•Stránka—12—
| Ala | Thr Glu val | Sequence Listi Phe Asn Asn ile Leu Thr ser | ng_ST25 Asn Asn | Asn | Gly 415 | Pro | |||||||||
| 405 | 410 | ||||||||||||||
| Ile | Leu | ile | Tyr | Pro | val | Asn | Gin | Ser | Lys | Trp | Lys | Lys | His | Thr | Ser |
| 420 | 425 | 430 | |||||||||||||
| Leu | Ile | Thr | pro | Asn | Glu | Asp | ile | Phe | Tyr | Leu | Val | Ala | Phe | Leu | Pro |
| 435 | 440 | 445 | |||||||||||||
| Ser | Ala | Val | Pro | Asn | Ser | Ser | Gly | Lys | Asn | Asp | Leu | Glu | Tyr | Leu | Leu |
| 450 | 455 | 460 | |||||||||||||
| Lys | Gin | Asn | Gin | Arg | Val | Met | Asn | Phe | Cys | Ala | Ala | Ala | Asn | Leu | Asn |
| 465 | 470 | 475 | 480 | ||||||||||||
| val | Lys | Gin | Tyr | Leu | Pro | His | Tyr | Glu | Thr | Gin | Lys | Glu | Trp | Lys | Ser |
| 485 | 490 | 495 | |||||||||||||
| His | Phe | Gly | Lys | Arg | Trp | Glu | Thr | Phe | Ala | Gin | Arg | Lys | Gin | Ala | Tyr |
| 500 | 505 | 510 | |||||||||||||
| Asp | Pro | Leu | Ala | Ile | Leu | Ala | Pro | Gly | Gin | Arg | Ile | Phe | Gin | Lys | Thr |
| 515 | 520 | 525 | |||||||||||||
| Thr | Gly | Lys | Leu | Ser | Pro | ile | Gin | Leu | Ala | Lys | Ser | Lys | Ala | Thr | Gly |
| 530 | 535 | 540 | |||||||||||||
| Ser | Pro | Gin | Arg | Tyr | Hi s | Tyr | Ala | Ser | Ile | Leu | Pro | Lys | Pro | Arg | Thr |
| 545 | 550 | 555 | 560 |
val <210> 9 <211> 538 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana
| <400> 1 | 9 | ||||||||||||||
| Asn | His | Ser | val | Ser | Thr | Pro | Lys | Glu | Leu | Pro | Ser | Ser | Asn | Pro | Ser |
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
| Asp | Ile | Arg | Ser | ser | Leu | Val | ser | Leu | Asp | Leu | Glu | Gly | Tyr | Ile | Ser |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Phe | Asp | Asp | val | His | Asn | val | Ala | Lys | Asp | Phe | Gly | Asn | Arg | Tyr | Gin |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Leu | ΡΓΟ | Pro | Leu | Ala | Ile | Leu | His | pro | Arg | Ser | Val | Phe | Asp | Ile | Ser |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| Ser | Met | Met | Lys | His | ile | val | His | Leu | Gly | Ser | Thr | ser | Asn | Leu | Thr |
S-E-pánka-1-3—
Sequence Listing_ST25
| Val | Ala Ala Arg | Gly 85 | Hi s | Gly | His | Ser Leu Gin 90 | Gly Gin | Ala | Leu Ala 95 | ||||||
| His | Gin | Gly | val | val | Ile | Lys | Met | Glu | Ser | Leu | Arg | Ser | Pro | Asp | ile |
| 100 | 105 | 110 | |||||||||||||
| Arg | Ile | Tyr | Lys | Gly | Lys | Gin | Pro | Tyr | Val | Asp | val | Ser | Gly | Gly | Glu |
| 115 | 120 | 125 | |||||||||||||
| ile | Trp | Ile | Asn | Ile | Leu | Arg | Glu | Thr | Leu | Lys | Tyr | Gly | Leu | ser | Pro |
| 130 | 135 | 140 | |||||||||||||
| Lys | Ser | Trp | Thr | Asp | Tyr | Leu | His | Leu | Thr | val | Gly Gly | Thr | Leu | Ser | |
| 145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
| Asn | Ala | Gly | ile | Ser | Gly | Gin | Ala | Phe | Lys | His | Gly | Pro | Gin | ile | Asn |
| 165 | 170 | 175 | |||||||||||||
| Asn | Val | Tyr | Gin | Leu | Glu | Ile | val | Thr | Gly | Lys | Gly | Glu | Val | Val | Thr |
| 180 | 185 | 190 | |||||||||||||
| cys | Ser | Glu | Lys | Arg | Asn | Ser | Glu | Leu | Phe | phe | Ser | Val | Leu | Gly | Gly |
| 195 | 200 | 205 | |||||||||||||
| Leu | Gly | Gin | Phe | Gly | Ile | ile | Thr | Arg | Ala | Arg | ile | Ser | Leu | Glu | Pro |
| 210 | 215 | 220 | |||||||||||||
| Ala | Pro | His | Met | Val | Lys | Trp | ile | Arg | Val | Leu | Tyr | Ser | Asp | Phe | Ser |
| 225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
| Ala | phe | Ser | Arg | Asp | Gin | Glu | Tyr | Leu | Ile | Ser | Lys | Glu | Lys | Thr | Phe |
| 245 | 250 | 255 | |||||||||||||
| Asp | Tyr | val | Glu | Gly | Phe | val | Ile | ile | Asn | Arg | Thr | Asp | Leu | Leu | Asn |
| 260 | 265 | 270 | |||||||||||||
| Asn | Trp | Arg | Ser | Ser | Phe | Ser | Pro | Asn | Asp | Ser | Thr | Gin | Ala | Ser | Arg |
| 275 | 280 | 285 | |||||||||||||
| Phe | Lys | Ser | Asp | Gly | Lys | Thr | Leu | Tyr | cys | Leu | Glu | Val | val | Lys | Tyr |
| 290 | 295 | 300 | |||||||||||||
| Phe | Asn | Pro | Glu | Glu | Ala | ser | Ser | Met | Asp | Gin | Glu | Thr | Gly | Lys | Leu |
| 305 | 310 | 315 | 320 | ||||||||||||
| Leu | ser | Glu | Leu | Asn | Tyr | ile | Pro | Ser | Thr | Leu | Phe | Ser | Ser | Glu | Val |
| 325 | 330 | 335 | |||||||||||||
| Pro | Tyr | ile | Glu | Phe | Leu | Asp | Arg | val | His | ile | Ala | Glu | Arg | Lys | Leu |
-Stránka-14— i 4 4
| Se | quen | ce L | i sti | ng_S | T25 | ||||||||||
| 340 | 345 | 350 | |||||||||||||
| Arg | Ala | Lys | Gly | Leu | Trp | Glu | Val | pro | His | Pro | Trp | Leu | Asn | Leu | Leu |
| 355 | 360 | 365 | |||||||||||||
| ile | Pro | Lys | Ser | Ser | ile | Tyr | Gin | Phe | Ala | Thr | Glu | val | Phe | Asn | Asn |
| 370 | 375 | 380 | |||||||||||||
| ile | Leu | Thr | Ser | Asn | Asn | Asn | Gly | Pro | ile | Leu | Ile | Tyr | Pro | Val | Asn |
| 385 | 390 | 395 | 400 | ||||||||||||
| Gin | Ser | Lys | Trp | Lys | Lys | Hl S | Thr | Ser | Leu | Ile | Thr | Pro | Asn | Glu | Asp |
| 405 | 410 | 415 | |||||||||||||
| Ile | Phe | Tyr | Leu | val | Ala | Phe | Leu | Pro | Ser | Ala | val | Pro | Asn | Ser | Ser |
| 420 | 425 | 430 | |||||||||||||
| Gly | Lys | Asn | Asp | Leu | Glu | Tyr | Leu | Leu | Lys | Gin | Asn | Gin | Arg | val | Met |
| 435 | 440 | 445 | |||||||||||||
| Asn | Phe | cys | Ala | Ala | Ala | Asn | Leu | Asn | val | Lys | Gin | Tyr | Leu | Pro | Hi S |
| 450 | 455 | 460 | |||||||||||||
| Tyr | Glu | Thr | Gin | Lys | Glu | Trp | Lys | Ser | His | Phe | Gly | Lys | Arg | Trp | Glu |
| 465 | 470 | 475 | 480 | ||||||||||||
| Thr | Phe | Ala | Gin | Arg | Lys | Gin | Ala | Tyr | Asp | Pro | Leu | Ala | ile | Leu | Ala |
| 485 | 490 | 495 | |||||||||||||
| Pro | Gly | Gin | Arg | Ile | Phe | Gin | Lys | Thr | Thr | Gly | Lys | Leu | Ser | pro | Ile |
| 500 | 505 | 510 | |||||||||||||
| Gin | Leu | Ala | Lys | ser | Lys | Ala | Thr | Gly | Ser | Pro | Gin | Arg | Tyr | His | Tyr |
| 515 | 520 | 525 | |||||||||||||
| Ala | Ser | Ile | Leu | Pro | Lys | Pro | Arg | Thr | val | ||||||
| 530 | 535 |
./-St-Fánka-15—
Claims (7)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Způsob přípravy rostlin ječmene odolných vůči suchu, vyznačený tím, že se do genomu ječmene vloží nukleotidová sekvence obsahující β-glukosidasový promotor a sekvenci, která kóduje enzym s cytokinindehydrogenázovou aktivitou a která má alespoň 80% identitu k sekvenci genu AtCKXl vybrané ze skupiny zahrnující sekvence SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO.
- 2 a SEQ ID NO. 3, a nebo alespoň 90% identitu k nukleotidové sekvenci kódující polypeptid vybraný ze skupiny zahrnující sekvence SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 9, přičemž sekvence kódující enzym s cytokinindehydrogenázovou aktivitou je řízená β- glukosidasovým promotorem.2. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, že nukleotidová sekvence se vloží pomocí Agrobacteria tumefaciens.
- 3. Expresní kazeta, vyznačená tím, že obsahuje β-glukosidasový promotor-AtCKXl- — terminátor, přičemž AtCKXl je sekvence s alespoň 80% identitou k sekvenci vybrané ze skupiny zahrnující sekvence SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2 a SEQ ID NO. 3, a nebo sekvence s alespoň 90% identitou k nukleotidové sekvenci kódující polypeptid vybraný ze skupiny zahrnující sekvence SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 9, přičemž sekvence kóduje enzym s cytokinindehydrogenázovou aktivitou.
- 4. Expresní kazeta podle nároku 3, vyznačená tím, že obsahuje β-glukosidasový promotor::AtCKXl vakuolámí::NOS terminátor, a má sekvenci s alespoň 80% identitou, s výhodou s alespoň 90% identitou k sekvenci SEQ ID NO. 4.
- 5. Expresní kazeta podle nároku 3, vyznačená tím, že obsahuje β-glukosidasový promotor::AtCKXl apoplastická::NOS terminátor, a má sekvenci s alespoň 80% identitou, s výhodou s alespoň 90% identitou k sekvenci SEQ ID NO. 5.
- 6. Expresní kazeta podle nároku 3, vyznačená tím, že obsahuje β-glukosidasový promotor::AtCKXl cytosolická::NOS terminátor, a má sekvenci s alespoň 80% identitou, s výhodou s alespoň 90% identitou k sekvenci SEQ ID NO. 6.
- 7. Použití expresní kazety podle kteréhokoliv z nároků 3 až 6 pro přípravu rostlin ječmene vykazujících odolnost vůči suchu.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2013-948A CZ304935B6 (cs) | 2013-11-29 | 2013-11-29 | Způsob přípravy ječmene se zvýšenou odolností vůči suchu |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2013-948A CZ304935B6 (cs) | 2013-11-29 | 2013-11-29 | Způsob přípravy ječmene se zvýšenou odolností vůči suchu |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2013948A3 true CZ2013948A3 (cs) | 2015-01-28 |
| CZ304935B6 CZ304935B6 (cs) | 2015-01-28 |
Family
ID=52435034
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ2013-948A CZ304935B6 (cs) | 2013-11-29 | 2013-11-29 | Způsob přípravy ječmene se zvýšenou odolností vůči suchu |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ304935B6 (cs) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2016116072A1 (en) * | 2015-01-19 | 2016-07-28 | Univerzita Palackeho V Olomouci | Method of preparation of barley with an increased drought resistance |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU781721B2 (en) * | 1999-04-16 | 2005-06-09 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Regulated expression of genes in plant seeds |
| US8222483B2 (en) * | 2004-04-02 | 2012-07-17 | Pioneer Hi Bred International Inc | Cytokinin oxidase sequences and methods of use |
-
2013
- 2013-11-29 CZ CZ2013-948A patent/CZ304935B6/cs not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CZ304935B6 (cs) | 2015-01-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Anoop et al. | Transgenic indica Rice cv IR-50 over-expressing Vigna aconitifolia Δ 1-pyrroline-5-carboxylate synthetase cDNA shows tolerance to high salt | |
| AU2016399130B2 (en) | Application of herbicide-tolerant protein | |
| Katayama et al. | Production and characterization of transgenic rice plants carrying a high-affinity nitrate transporter gene (OsNRT2. 1) | |
| Xiao et al. | Overexpression of the gibberellin 2-oxidase gene from Camellia lipoensis induces dwarfism and smaller flowers in Nicotiana tabacum | |
| RU2333245C2 (ru) | Способы получения растений с улучшенным ростом в условиях ограничения уровня азота | |
| Lee et al. | Molecular characterization and expression of a cDNA encoding copper/zinc superoxide dismutase from cultured cells of cassava (Manihot esculenta Crantz) | |
| AU2014333405B2 (en) | A method for production of transgenic cotton plants | |
| US8962920B2 (en) | Use of active cytokinin synthase gene | |
| CN111454963B (zh) | 火龙果耐盐基因HuERF1基因及其应用 | |
| KR20110028719A (ko) | 벼 유래 징크핑거 단백질 오에스지에프투, 오에스지에프투 유전자, 재조합벡터, 형질전환체 및 이의 제조방법 | |
| US7385106B2 (en) | Plants tolerant of environmental stress conditions, methods of generating same and novel polynucleotide sequence utilized thereby | |
| JP6202832B2 (ja) | 高い種子収量性を有する環境ストレス耐性植物及びその作製方法 | |
| CZ2013948A3 (cs) | Způsob přípravy ječmene se zvýšenou odolností vůči suchu | |
| US8569580B2 (en) | Transformed plants or algae with highly expressed chloroplast protein BPG2 | |
| US20090293142A1 (en) | Methods for increasing shoot-to-root ratio, seed production and resistance to diseases | |
| WO2011114920A1 (ja) | 環境ストレス耐性植物及びその作出方法 | |
| KR101824698B1 (ko) | 식물체의 환경 스트레스 내성을 조절하는 고구마 유래의 IbHPPD 유전자 및 이의 용도 | |
| WO2016116072A1 (en) | Method of preparation of barley with an increased drought resistance | |
| JP5833827B2 (ja) | 植物の油脂生産性を増大させる遺伝子及びその利用方法 | |
| US7655837B2 (en) | Glutathione-S-transferase gene from Proposis juliflora confers abiotic stress tolerance in plants | |
| JP2004329210A (ja) | 塩ストレス耐性を付与する遺伝子 | |
| KR101825219B1 (ko) | 담배 유래의 탈메틸화 관련 NtROS2a 유전자 및 이의 용도 | |
| KR101648559B1 (ko) | 스트레스 유래 비정상적 단백질 제거를 통한 식물 스트레스 내성과 관련된 신규 유전자 및 그의 용도 | |
| Muhammad et al. | The over-expression of a glycine-rich rna-binding protein in nicotiana tabacum and its roles in plant stress tolerance | |
| WO2004058975A1 (ja) | 植物の環境ストレス耐性を高める方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20191129 |