CZ303458B6 - Zpusob identifikace osob se zvýšeným genetickým rizikem úmrtí po infarktu myokardu - Google Patents

Abstract

Rešení popisuje zpusob identifikace osob se zvýšeným genetickým rizikem úmrtí v dusledku kardiovaskulárních komplikací do 6 mesícu od okamžiku výskytu akutního infarktu myokardu, spocívající v tom, že se v biologickém vzorku odebraném z tela pacienta stanoví intenzita exprese genu a genetických lokusu ADORA3, (M97723), ERLIN1, CLYBL, TCEA3, (BC070337), HSD17B8, FLT3, AXIN2 a (CR596519). Logaritmovaná hodnota intenzity exprese pri základu 2 se následne srovná s referencní hodnotou intenzity exprese, pricemž odchylka od referencní hodnoty rovná alespon minimální odchylce u všech uvedených genu a genetických lokusu znací zvýšené riziko.

Description

Způsob identifikace osob se zvýšeným genetickým rizikem úmrtí po infarktu myokardu

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká způsobu identifikace osob v České populaci, které vykazují zvýšené genetické riziko úmrtí v důsledku kardiovaskulárních komplikací do 6 měsíců od okamžiku výskytu akutního infarktu myokardu. Identifikace je prováděna na základě stanovení profilu genové exprese vybraných genů lidského genomu.

io

Dosavadní stav techniky

Infarkt myokardu a cévní mozková příhoda jsou dvěma nej závažnějšími klinickými projevy aterosklerózy. Riziko rozvoje těchto onemocnění se odhaduje na základě známých rizikových faktorů. Rozsah onemocnění je v současnosti zjišťován řadou vyšetření, jakými jsou např. scintigrafie, magnetická rezonance, katetrizační vyšetření. Každé z těchto vyšetření má však i svá omezení, např. radiační zátěž nebo invazivitu vyšetření. Aterosklerotické pláty jsou zkoumány na buněčné i molekulární úrovni, včetně sledování buněk v cirkulaci jako odpovědi na zánětlivý proces v cévách.

Identifikace genů pomocí molekulárně biologických metod znamenala v posledních letech výrazný posun nejen v odhalení příčin některých závažných, život ohrožujících, onemocnění člověka (např. některé onkologické diagnózy, závažné dědičné poruchy metabolismu člověka či další poruchy neuromuskulámího, gastrointestinálního a oběhového systému, včetně aterosklerózy atd.), ale v neposlední řadě také významně rozšířila naše znalosti o vzniku a rozvoji akutního infarktu myokardu (AIM) (Yukihiro Hojo, Uich Ikeda, Yun Zhu, Motoi Okada, Shuichi Ueno, Hiroshi Arakawa, Hideyuki Fujikawa, Taka-aki Katsuki, and Kazuyuki Shimada, Expression of vascular endothelial growth factor in patients with acute myocardial infarction. JAm. Coli

Cardiol, 35(4): 968 až 973, March 2000; Merry L. Lindsey, NMP Induction and Inhibition in Myocardial Infarction. Heart Failure Reviews, 9(1):7 až 19, January 2004). Detailnějším pochopením jednotlivých stádií IM se dostávají do popředí i otázky možnosti prevence a účinnější léčby onemocnění. S rozvojem moderních technologií se molekulárně biologický výzkum obecně posouvá od klasického modelu odhalování konkrétních genetických lokusů, resp. genetických polymorfismů, působících poruchu jednoho genu ke snaze monitorovat polygenní a multifaktoriální poruchy člověka pomocí genomických a expresních čipů, jejichž analýza v současnosti poskytuje komplexnější obraz onemocnění (Joseph S. Verducc, Vincent F. Melfi, Shili Lin, Zailong Wang, Sashwati Roy, and Chandan K. Sen. Microarray analysis of gene expression: considerations in data mining and statistical treatment. Physiological Genomics, 25(3):355 až

363, May 2006). Především studium tzv. expresních čipů zažívá v lékařských vědách velký rozvoj, protože umožňuje posoudit mnoho genových transkriptů a jejich expresních variant najednou v kritickém stádiu onemocnění (multivarianční analýza, randomízační studie) (Lawrence W. Stanton, Lisa J. Garrard, Deborah Damm, Brett L. Garrick, Andrew Lam, Ann M. Kapoun, Qiang Zheng, Andrew A. Protter, George F. Schreiner, and R. Tyler White. Altered Patterns of Gene

Expression in Response to Myocardial Infarction. Circ Res, 86(9):939 až 945, May 2000; Matthew B. Lanktree and Robert A. Hegele, Gene-gene and gen e-env iron ment interactions: new insights into the prevention, detection and management ofcoronary artery disease. Genome medicine, 1(2):28, February 2009),

Recentní práce posledních 5 let se intenzivně zabývají z mnoha úhlů pohledu nejen expresními profily osob s aterosklerózou, ale také osob s ischemickou chorobou srdeční ve vztahu ke vznikajícím zánětlivým procesům v cévách (Gemma Satterthwaite, Sheila E. Francis, Kim Suvarna, Stephen Blakemore, Chantelle Ward, Don Wallace, Martin Braddock, and David Crossman. Differential gene expression in coronary arteries from patients presenting with íschemic heart disease: further evidence for the inflammatory basis of atherosclerosis. American heart Journal,

- 1 CZ 303458 B6

150(3):488 až 499, September 2005), osob s ischemickou a neischemickou kardiomyopatií při srdečním selhání (Michelle M. Kittleson, Khalid M. Minhas, Rafael A. Irizarry, Shui Q. Ye, Gina Edness, Elayne Breton, John V. Conte, Gordon Tomaselli, Joe G. Garcia, and Joshua M. Hare. Gene expression analysis of ischemic and nonischemic cardiomyopathy: shared and distinct genes in the development of heart failure. Physiological genomics, 21(3):299 až 307, May 2005; Michelle M. Kittleson, Shui Q. Ye, Rafael A: Irizarry, Khalid M. Minhas, Gina Edness, John V. Conte, Giovanni Parmigiani, Leslie W. Miller, Yingie Chen, Jennifer L. Halí, Joe G. Garcia, and Joshua M. Hare. Identification of a gene expression profile that differentiates between ischemic and nonischemic cardiomyopathy. Circulation, 110(22):3444 až 3451, November 2004) a dále io také osob s poškozením koronárních cév (James A. Wingrove, Susan E. Daniels, Amy J. Sehnert, Whittemore Tingley, Michael R. Elashoff, Steven Rosenberg, Lutz Buellesfeld, Eberhard Grube, L. Kristin Newby, Geoffrey S. Ginsberg, and William E. Kraus. Correlation of Peripheral-Blood Gene Expression With the Extent of Coronary Artery Stenosis / CLINICAL PERSPECTIVE, Circulation: Cardiovascular Genetics, 1(1):31 až 38, October 2008; Ramachandran S. Vasan and

Calum A. MacRae. Adream, ajoumey, and a promise: the inauguration of Circulation: Cardiovascular Genetics. Circulation. Cardiovascular genetics, 1(1):1-2, October 2008; Daphne, Maroeska M. Rovers, Diederick E, Grobbee, Joannes J. Marx, Jill Waalen, Cristina Ellervik, Borge G. Nordestgaard, John K. Olynyk, Peter R. Mills, James Shepherd, Bernard Grandchamp, Jolanda M. Boer, Calogero Caruso, Marcello Area, Beta J. Meyer, and Yvonné T. van der

Schopuw. Mutations in the HFE gene and cardiovascular disease risk: an individual patient data meta-analysis of 53 880 subjects. Circulation. Cardiovascular genetics, 1(1):43 až 50, October 2008).

Nárůst četnosti vědeckých prací v roce 2009, zabývajících se akutním infarktem myokardu, uka25 zuje nejen narůstající zájem o toto problematiku, ale také závažnost studovaného tématu (Kahraman Tanriverdi and Jane E. Freedman. Blood and Cardiovascular Disease. Circulation: Cardiovascular Genetics, 1(1):7 až 9, October 2008). Také další vědecké práce hledají v poslední době příčinné vztahy mezi projevy některých genů a vznikem akutního infarktu myokardu (AIM). To, že se jedná o komplexní proces, zahrnující celou řadu genů či pouze jejich částí (polymorfní místa), je všeobecně známo. Jsou popsány polymorfísmy ve struktuře endoteliálního růstového faktoru, diskriminující pacienty s AIM, u nichž se vyvinulo srdeční selhání (Panagiotis Douvaras, Dionisios G. Antonatos, Kiriaki Kekou, Sotirios Patsillinakos, George Chouliaras, Apostolos Christou, Anastasios Andrikou, and Emmanuel Kanavakis. Association of VEGF gene polymorphisms with the development of heart failure in patients after myocardial infarction.

Cardiology, 114( I): 11 až 18, 2009).

Je popsán vliv akutní koronární okluze na uvolňování arteriálního natřiuretického peptidu, který působí na vasodilataci, natriurézu a zánětlivou odpověď, čímž zvyšuje rozsah infarktu myokardu a mortalitu (Aiilyan K. Houng, Ráchel A. McNamee, Attila Kerner, Pallawi Sharma, Almois

Mohamad, Jonathan Tronolone, and Guy L. Reed. Atrial natřiurétic peptide inereases inflammation, infaret size, and mortality after experimental coronary occlusion. American Journal of physiology. Heart and circulatory physiology, 296(3): H65 5 až H661, March 2009). Popisována je rovněž exprese kin i no vých a jiných receptoru (June Yun, Michael J. Z use i k, Pedro Gonzalez-Cabrera, Dan F. McCune, Sean A. Ross, Robert Gaivin, Michael T. Piascik, and

Dianne M. Perez. Gene expression profíling of alpha(lb)-adrenergic receptor-induced cardiac hypertrophy by oligonucleotide arrays. Cardiovascular research, 57(2):443 až 455, February 2003), které podporují aktivaci cirkulujících mononukleárů u pacientů s akutním koronárním syndromem (AKS).

Změny nalézané v extracelulámí matrix jsou určující pro myokardiálni remodelaci po IM. Mohou být významným faktorem pro zánětlivou odpověď a mohou přispívat ke stabilizaci a kompenzátoru ím mechanizmům pro udržení srdečního výdeje. Ovlivňuji též angiogenezi, proliferaci a diferenciaci buněk (Fabio D'Aguiar D. Mataveli, Sang Won W. Han, Helena Bnciani B. Ňader, Aline Mendes, rose Kanishiro, Paulo Tucci, Antonio Carlos C. Lopes, Jose Carlos Costa C. Baptista55 Silva, Ana Paula Cleto P. Marolla, Leonardo Pinto P. de Carvalho, Priscila Martins Andrade M.

-2 CZ 303458 B6

Denapoli, and Maria Aparecida da Silva A. Pinhal. Long-term effects for acute phase myocardial infarct VEGF165 gene transfer cardiac extracellular matrix remodeling. Growth factors (Chur, Switzerland), 27(1):22 až 31, February 2009). Objevují se i studie zaměřené na hledání konkrétních polymorfismů ve struktuře DNA, které by mohly mít přímou souvislost s vývojem ischemické choroby srdeční (C. Federici, N. Botto, S. Manfredi, A. Rizza, M. Fiandra, and M. Andreassi. Re lat i on of Increased Chromosomal Damage to Future Adverse Cardiac Events in Patients With Known Coronary Artery Disease. The American Journal of Cardiology, 102(10):1269 až 1300, November 2008). Recentní molekulárně genetické (expresní) studie jsou prováděny např. na desítkách osob s chronickým srdečním selháním (Cappuzzello C., Napolitano ίο M., Arcelli D., Melillo G., Melchionna R., DiVito L., Karlini D., Silvestři L., Brugaletta S., Liuzzo G., Crea F., Capogrosso M. C.: Gene expression profíles in peripheral blood mononueclar cells of chronic heart failure patients, Physiol. Genomics, 2009, 38:233 až 240), na pacientech s onemocněním koronárních artérií (Meier P., Antonov J., Zbinden, R., Kun A., Zbinden S., Glekler S., Delorenzi M., Maggi R., Seiler C,: Non-inasive gene-expression-based detection of well-developed collateral funcion in individuals with and without coronary artery disease, Heart, 2009, 95:900 až 908; Erdmann J., Grosshenníg A., Braund P. S., et al: New susceptibility locus for coronary artery disease on chromosome 3q22.3, Nat. Genet., 2009, D01:10.1038/ng.307; Tregouet D. A., Koning I. R., Erdmann J., et al.: Genome-wide haplotype association study identifies the SLC22A3-LPAL2-LPA gene cluster as a risk locus for coronary artery disease,

Nat Genet, 2009, DOI:l0.1038/ng.314) či na sekrečním materiálu osob s chronickou ischémií (Józefa Dabek, Aleksander Owczarek, Zbigniew Gasior, Rafal Ulczok, Mariusz Skowerski, Adnrzej Kulách, Urszula Mazurek, and Andrzej Bochenek. Oligonucleotide microarray analysis of genes regulating apoptosis in chronically ischemic and postinfarction myocardium. Biochemical genetics, 45(5 až 6):241 až 247, June 2008).

Několik vědeckých týmů v čele s mezinárodním konsorciem pro genetiku infarktu myokardu (Myocardial Infaretion Genetics Consortium, http:/www. nature.com/ng; David Seo, Geoffrey

S. Ginsburg, and Pascal J. Goldschmidt-Clermont. Gene Expression Analysis of Cardiovascular Diseases: Novel Insights Into Biology and CLinical Applications. J. Am Coli Cardiol, 48(2):227 až 235, July 2006; David Seo, Tao Wang, Holly Dressman, Edward E. Herderick, Edwin

S. Iversen, Chunming Dong, Korkut Vata, Carmelo A. Milano, Fabio Rigat, Jennifer Pittman, Joseph R. Nevins, Mike West, and Pascal J. Goldschmidt-Clermont. Gene Expression Phenotypes of Atherosclerosis, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 24(10):1922 až 1927, October 2004) se zabývá genetickými asociačními studiemi ve vztahu k infarktu myokardu (Iris M. Heid,

Eva Boes, Martina Miiller, Barbara Kollerits, Claudia Lamina, Stefan Coassin, Christian Gieger, Angela Doring, Norman Klopp, Ruth Frikke-Schmidt, Anně Tybjaerg-Hansen, Anita BrandstMtter, Andreas Luchner, Thomas Meitinger, Wichmann, and Florian Kronenberg. Genome-Wide Association Analysis of High-Densite Lipoprotein Cholesterol in the PopulationBased Korá Study Sheds New Light on Intergenic Regions / CLINICAL PERSPECTIVE.

Circulation: Cardiovascular Genetics, 1(1):10 až 20, October 2008; Gudbjartsson D. F., Bjomsdittir, U.S., Halapi E., et al: Sequence variants affecting eosinophil numbes associate with astma and myo cardial infaretion, Nat. Genet., 2009, DOI: 10.1038/ng.323; Ozaki K., Sáto H„ Inoue K., et al.: SNPs in BRAP associated with risk of myocardial infaretion in Asian population, Nat. Genet., 2009, DOI:10.1038/ng.326).

Snaha včas predikovat nastupující příznaky infarktu myokardu (postupně nastupující stres vyvíjející se až do šoku) je dnes řešena klinickou diferenciální diagnostikou, funkčními testy, resp. statimovým měřením základních biochemických markérů pro AIM. Toto užívané schéma diagnostiky je používáno (u pacienta při první události) bez jakékoliv možnosti monitorovat (prediko50 vat) celkový stav organismu v období před AIM. Přesnějším charakterizováním základního expresního profilu pacienta přežívajícího i nepřežívajícího akutní stadium infarktu myokardu a jeho porovnáním s vybranými osobami kontrolního souboru české populace, se otevírá do budoucna reálná možnost průběžného, ekonomicky dostupného sledování osob přežívajících infarkt myokardu (období do 3 až 6 měsíců po první a další události).

-3 QZ 303458 B6

Pokusy o expresní analýzu a průběžné monitorování nej různějších, především ale nádorových, onemocnění člověka byly již učiněny. Jsou dnes připravovány nej různější selektivní expresní sady genů, které charakterizují nejen aktuální stav organismu, ale také mohou monitorovat úspěšnost a adekvátnost léčby (David T. Miller, Paul M. Ridker, Peter Libby, and David J.

Kwiatkowski. Atherosclersis: The Path From Genomics to Therapeutics. J Am Coli Cardiol, 49(15):1589 až 1599, Apríl 2007). Tyto snahy jsou zřejmé v posledních letech i v oblasti diagnostiky některých kardiovaskulárních poruch člověka (P, Meier, J. Antonov, R. Zbinden,

A. Kuhn, S. Zbinden, S. Gloekler, M. Delorenzi, R. Jaggi, and C. Seiler. Non-invasive gene-expression-based detection of well-developed collateral function in individuals with and io without coronary artery disease. Heart, 95(11):900 až 908, June 2009; Józefa Dabek, Aleksander Owczarek, Zbigniew Gasior, Rafal Ulczok, Mariusz Skowerski, Adnrzej Kulách, Urszula Mazurek, and Andrzej Bochenek. Oligonucleotide microarray analysis of genes regulationg apoptosis in chronically ischemic and postinfarction myocardium. Biochemical genetics, 46(5-6):241 až 247, June 2008; Claudia Cappuzzello, Monica Napolitano, Diego Arcelli, Guido

Melillo, Roberta Melchionna, Luca Di Vitto, Daniele Carlini, Lorena Silvestři, Salvátore Brugaletta, Giovanna Liuzzo, Filippo Crea, and Maurizio C. Capogrossi. Gene expression profiles in peripheral blood mononuclear cells of chronic heart failure patients. Physiological genomics, 38(3):233 až 240, August 2009), dosud však není známa studie snažící se před i kovat prognózu pacienta s AIM.

V posledních letech celosvětově vzrůstající prevalence kardiovaskulárních chorob člověka motivuje stále intenzivněji vědeckou veřejnost k hledání nových strategií diagnostiky a léčby (James A. Wingrove, Susan E. Daniels, Amy J. Sehnert, Whittemore Tingley, Michal R. Elashoff, Steven Rosenberg, Lutz Buellesfeld, Eberhard Grube, L. Kristin Newby, Geoffrey

S. Ginsburg, and William E. Kraus. Correlation of Peripheral-Blood Gene Expression With the Extent of Coronary Artery Stenosis / CLINICAL PERSPECTIVE. Circulation: Cardiovascular Genetics, 1(1):31 až 38, October 2008; Peter R. Sinnaeve, Mark P. Donahue, Peter Grass, David Seo, Jacky Vonderscher, Salah-Dine D. Chibout, William E. Kraus, Michael Sketch, Charlotte Nelson, Geoffrey S. Ginsburg, Pascal J. Goldschmidt-Clermont, and Christopher B. Granger.

Gene expression pattems in perihpheral blood correlate with the extent of coronaiy artery disease. PloS one, 4(9), 2009; Ruby C. Y. Lin, Kate L. Weeks, Xiao-Ming Gao, Rohan

B. H. Williams, Bianca C. Bemardo, Helen Kiriazis, Vance B. Matthews, Elizabeth A. Woodcock, Russel D. Bouwman, Janelle P. Mollica, Helen J. Speirs, lan W. Dawes, Roger J. Daly, Tetsuo Shioi, Seigo Izumo, Mark A. Febbraio, Xiao-Jun Du, and Julier R. McMullen.

Pi3k(pl lOalpha) protects against myocardial infarction-induced heart failure: Identification of pi3k-regulated mima and mma. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 30(4):724 až 732, Apríl 2010; Orfeas Liangos, Sophie Domhan, Christian Schwager, Martin Zeier, Peter E. Huber, Francesco Addabbo, Michael S. Goligorsky, Lynn Hlátky, Bertrand L. Jaber, and Amir Abdollahi. Whole blood transcriptions in cardiac surgery identifies a gene regulátory network connecting ischemia reperfusion with systemic inflammation. PloS one, 5(10), 2010) a využívání nových technologií, jakými jsou například meta-analýzy velkých souborů studovaných osob či tzv. GWAS (Genome-wide association studies) studií (John P. A. loannidis. Prediction of Cardiovascular Disease Outcomes and Established Cardiovascular Risk Factors by Genome-Wide Association Markers / CLINICAL PERSPECTIVE. Circulation: Cardiovascular Genetics, 2(1): 7 až 15,

February 2009; Jeanette Erdmann, Patrick Linsel-Nitschke, and Heribert Schunkert. Genetic causes of myocardial infaretion: new insight from genome-wide association studies. Deutsches Arztablatt International, 107(40): 694 až 699, October 2010).

Výsledky rozsáhlé GWAS studie (Myocardial Infaretion Genetics Consortium, Sekar Kathiresan,

Benjamin F. Voight, Shaun Purcell, Kiran Musunuru et al. Genome-wide association of early-Onset myocardial infaretion with single nucleatide polymorphisms and copy number variants. Nátuře genetics, 41(3): 334 až 341, March 2009) potvrdily asociaci několika genů s ranným výskytem akutního infarktu myokardu, z nichž některé byly též potvrzeny analýzami našich dat. Jedná se především o gen PHACTR1 (fosfatáza a regulátor aktinu 1), který se ve srovnání s obecnou českou populací ukazuje na základě našich dat jako prediktivní u pacientů,

-4 CZ 303458 B6 kteří z kardiovaskulárních příčin zemřeli v průběhu 6 -měsíčního sledování po primární srdeční příhodě, dále též gen MRPS6T (mitochondriální ribozomální protein), jehož varianty MRPL9, MRPL39, MRPL48, MRPL48, MRPS33 a MRPS30 byly statisticky významné také v našich datech, nikoliv však klinicky a neprosadily se do množin genů s prediktivními vlastnostmi.

Nejsou proto uváděny v našich konečných výsledcích. Varianty WDR57, WDR61 a WDR75 genu WDR12 identifikovaného v této publikaci byly podobně statisticky, nikoliv však klinicky významné v našich datech. Naopak geny CDKN2A, CDKN2B identifikované v souvislosti s incidencí akutního infarktu myokardu ve výše zmíněné publikaci a dále např. v publikaci autorů Anna Helgadottir, Gudmar Thorleifsson, Andrei Manolescu, Solveig Gretarsdottir, Thorarinn io Blondal, Aslaug Jonasdottir, Adalbjorg Jonasdottir, Asgeir Sigurdsson, Adam Baker, Amar Pallson, Gisli Masson, Daniel F. Gudbjartsson, Kristinn P. Magnusson, Karl Andersen, Allan I. Levey, Valgerdur M. Backman, Sigurborg Matthiasdottir, Thorbjorg Jonsdottir, Stefan Palsson, Helga Einarsdottir, Steinunn Gunnarsdottir, Amaldur Gylfason, Viola Vaccarino, W. Craíg Hooper, Muredach P. Reilly, Christopher B. Granger, Harland Austin, Daniel J. Rader, Svati H.

Shah, Arshed A. Quyyumi, Jeffrey R. Gulcher, Gudmundur Thorgeirsson, Unnur Thorsteinsdottir, Augustine Kong, and Kari Stefansson. A common variant on chromosome 9p21 affects the risk of myocardial infarction. Science (New York, N.Y.), 316 (5830): 1491 až 1493, June 2007, Nebyly v našich datech v souvislosti s výskytem akutního infarktu myokardu zjištěny.

Recentní publikace z roku 2010 naznačují stoupající zájem o aplikaci moderních metod pro studium kardiovaskulárního systému člověka, mezi něž se zařazuje i technologie celogenomové expresní analýzy. Tato technologie umožňuje získání informace o okamžité odpovědi organismu na akutní stádia závažných, život ohrožujících, onemocnění, jakými jsou např. mrtvice čí infarkt myokardu. Dovoluje nám současně i nový pohled na desetiletí známý proces. Využitím mono25 nukleárních buněk periferní krve jako zkoumaného materiálu se naskýtá reálná možnost získat expresní profily ze snadno a rutinně dostupného biologického materiálu a z těchto profilů poté vytipovat ty signifikantní hladiny genové exprese, které by mohly charakterizovat určitá stádia onemocnění. Takto získaná data se dají v budoucnu použít jako základ pro zlepšení diagnostického komfortu pacienta. Ze studií publikovaných na konci roku 2009 a v průběhu roku 2010 lze zmínit práce, zabývající se úlohou hladin HDL a LDL frakcí cholesterolu či celkového cholesterolu ve vztahu ke genetické predispozici kardiovaskulárních chorob (Anna C. Calkin and Peter Tontonoz. Genome-Wide Association Studie Identify New Targets in Carciovascular Disease. Science Translational Medicine 2(48):48 až 94, 2010; Rong Yang, Lin Li, Sara Bretschger B. Seidelmann, GongQing Q. Shen, Soni Sharma, Shaoqi Rao, Kalil G, Abdullah, Kenneth G.

Mackinlay, Robert C, Elston, Qiuyun Chen, Eric J. Topol, and Qing Kenneth K. Wang. A genome-wide linkage scan identifies multiple quantitative train loci for HDL-cholesterol levels in families with premature CAD and MI. Journal of lipid research, 51(6):1442 až 1451, june 2010), nebo práce snažící se predikovat významné geny exprimující se v akutním stádiu mrtvice (Boryana Stamova, Huichun Yu, Glen Jickling, Chryl Bushnell, Yingfang Tian, Bradley P.

Ander, Xinhua Zhan, DaZhi Liu, Renee Turner, Peter Adamczyk, Jane C. Khoury, Arthur Pancioli, Edward Jauch, Joseph P. Broderick, and Frank R. Sharp. Gene Expression Profiling of Blood for the prediction of Ischemic Stroke. Sirotce, 41 (10): 2171 a 2177, October 2010).

Několik prací se v roce 2010 zabývalo hledáním genetických příčin či nejrůznějších nových biomarkerů ventrikulámí fibrilace, která bývá pozorována v akutním stádiu infarktu myokardu a může mít vliv na přežití pacienta (Connie R. Bezzína, Raha Pazoki, Abdennasser Bardai, Roos F. Marsman, Jonas S, de Jong, Marieke T. Blom, Brendon P. Scicluna, J. Wouter Jukema, Návin R. Bindraban, Peter Lichtner, Ame Pfeufer, Nanette H. Bishopric, Dan M. Roden, Thomas Meitinger, Summet S. Chugh, Robert J. Myerburg, Xavier Jouven, Stefan Kááb, Lukas

R. Dekker, Hanno L. Tan, Michael W. Tanck, and Arthur A. Wilde. Genome-wide association study identifies a susceptibility lucus and 21 q21 for ventricular fibrillation in acute myocardial infarction. Nátuře genetics, 42(8): 688 až 691, August 2010; Feng Dong, Mazen Khalil, Matt Kiedrowski, Caitlín 0⁴Connor, Erin Petrovic, Xiaorong Zhou, and Marc S. Penn, Critícal role for leukocyte hypoxia inducible factor-1 alpha expression in post-myocardial infarction left ventricular remodeling, Circulation research, 106(3):601 až 610, February 2010 Yvan Devaux,

- 5 CZ 303458 B6

Francisco Azuaje, Mélaníe Vausort, Céline Yvorra, and Daniel R. Wagner. Integrated protein network and microarray analysis to identity potential biomarker after myocardial infarction. Functional & integrative genomics, 10(3): 329 až 337, August 2010).

Do popředí zájmu se v posledním roce dostává i otázka, zda celkový stres organismu při akutní fázi infarktu myokardu nezhoršuje vlastní prognózu přežití (Jessica M. Berthiaume, Molly

S. Bray, Tracy A. McElfřesh, Xioaqin Chen, Salman Azam, Martin E. Young, Brian D. Hoit, and Margaret P. Chandler. The myocardial contractive response to physiological stress improves with high saturated fat feeding in heart failure. American Journal ofphysiology. Heart and circulatory io physiology, 299(2), August 2010). Jsou hledány souvislosti mezi genetickými příčinami myokardu a chronickým onemocněním ledvin (Tetsuo Fujimaki, Kimihiko Kato, Kiyoshi Yokoi, Mitsutoshi Oguri, Tetsuro Yoshida, Sachiro Watanabe, Norifumi Metoki, Hidemi Youshida, Kei Satoh, Yukitoshi Aoyagi, Yoshinori Nozawa, Genjiro Kimura, and Yoshiji Yamada. Association of genetic variants in SEMA3F, CLEC16A, LAMA3, and PCSK2 with myocardial infarction in

Japanese individuals. Atherosclerosis, 210 (2): 468 až 473, June 2010) či atherotrombózou (Luca Andrea A. Lotta. Genome-wide association studie in atherothrombosis. European Journal ofinternal medicine, 21(2): 74 až 78, Apríl 2010).

Studován byl rovněž vliv microRNA-modul, které jsou popisovány jako negativní regulátory genové exprese a recentní studie naznačují, že mohou hrát významnou roli nejen v rozvoji infarktu myokardu, ale i u dalších kardiovaskulárních poruch člověka (Emanuella Bostjancic, Nina Zidar, and Damjan Glavac. MicroRNA microarray expression profiling tn human myocardial infarction. Disease markers, 27 (6):255 až 268, 2009). Stále je diskutována biologická role interleukinu 1 ve vztahu k dislipidémii a riziku vzniku infarktu myokardu (Bernard Keavney. The interleukin-1 cíuster, Cyslipidaemia and risk of myocardial infarction. BMC medicine, 8(1):6+, January 2010).

Populačně charakteristický obraz rizikových genetických markérů je diskutován v řadě recentních publikací (Paul M. Ridker, Guillaume Paré, Alex N. Parker, Robert Y. Zee, Joseph

P. Miletich, and Daniel I. Chasman. Polymorphism in the CETP gene region, HDL cholesterol, and risk of future myocardial infarction: Genomewide analysis among 18 245 initially healthy women from the Women‘s Genome Health Study. Circulation. Cardiovascular genetics, 2(1): 26 až 33, Fervuary 2009; Tetsuo Fujimaki et al. Association of genetic variants in SEMA3F, CLECI6A, LAMA3, and PCSK2 with myocardial infarction in Japanese individual, Athero35 sclerosis, 210 (2): 468 až 473, June 2010). Jsou studovány i další typy genetických variací (SNP-single nucleotide polymorphisms a CNV-copy number variantions) ve vztahu ke vzniku a rozvoji infarktu myokardu (Myocardial Infarction Genetics Consortium, Sekar Kathiresan, Benjamin F. Voight, Shaun Purcell, Kiran Musunuru et al. genome-wide association of early—onset myocardial infarction with single nuclatide polymorphisms and copy number variant.

Nátuře genetics, 41(3):334 až 341, March 2009).

V neposlední řadě je nutné zmínit také práce zabývající se infarktem myokardu na experimentálním zvířeti (Jessica M. Berthiaume et al. The myocardical eontractile response to physiologicyl stres improves with high saturated fat feeding in heart failure. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology, 299(2), Augusts 2010; Dongshend Hong, Xíoawei Zeng, Wei Xu, Jing Ma, Yinghui Tong, and Yan Chen. Altered profiles of gene expression in curcumin-treated rats with experimentally induced myocardial infarction. Pharmacological Research, 61(2); 142 až 148, February 2010; Zongjín Li, Kitchener D. Wilson Bryan, Smith, Daniel L. Kraft, Fungjun Jia, Mei Huang, Xiaoyan Xie, Robert C. Robbins, Sanjiv $, Gambhi,

Irving L. Weissman, and Joseph C. Wu. Functional and transcriptional characterization of human embryonic stem cell-derived endothelial cells for treatment of myocardial infarction. PloS one, 4(12):e8443+, December 2009; Lisheng Zhang, Jessica J. Connelty, Karsten Peppel, Leigh Brian, Svati H. Shah, Sarah Nelson, David R. Crosslin, Tianyuan Wang, Andrew Allen, Williams E. Kraus, Simon G. Gregory, Elizabeth R. Hauser, and Neil J. Freedman. Aging-related athero55 sclerosis id exacerbated by arterial expression of tumor necrosis factor receptor-1: evidence from

-6CZ 303458 B6 mouše models and human assocíation studies Human Molecular Genetics, 19(14): 2754 až 2766, July 2010; Lars Bochmann, Padmini Sarathchandra, Federica Moři, Enrique Lara-Pezzi, Domcnico Lazzaro, and Nadia Rosenthal. Revealing new mouše epicardial cell markers through transcriptomics. PloS one 5(6), 2010. Přihláška vynálezu PV 2009-872 navrhuje stanovení prognózy pacientů v akutním stadiu primárního infarktu myokardu stanovením exprese alespoň jednoho či genetického lokusu vybraného ze skupiny zahrnující TCRA, LOC650751, LOC650761, PRR6 a TMEM98 ve vzorku periferní krve.

Níže popsaný vynález poskytuje sadu genů, která umožňuje stanovení prognózy s vyšší přesností ío a lepší klinickou shodou.

Podstata vynálezu

Předmětem předkládaného vynálezu je způsob identifikace osob v české populaci se zvýšeným genetickým rizikem úmrtí v důsledku kardiovaskulárních komplikací do 6 měsíců od okamžiku výskytu akutního infarktu myokardu.

Podstata vynálezu spočívá vtom, že se v biologickém vzorku odebraném z těla pacienta, do

24 hodin od výskytu akutního infarktu myokardu, stanoví intenzita exprese sady genů a genetických lokusů.

Název / Lokus genu	RefSeqlD	SEQ ID No.	Referenční hodnota intenzity exprese (nízké riziko) stanovená na celogenomovém / oligonukleotidovém čipu	Min. odchylka od ref. hodnoty exprese, značící zvýšené riziko
ADORA3	NM 020683.5	1	6,30	+1
(M97723)	M97723	2	7,26	-1
ERLIN1	NM 006459.2	3	6,81	+1
TCEA3	NM 003196.1	5	7,08	-1
(BC070337)	BC070337	6	10,87	-1
CLYBL	NM 206808.1	4	6,55	-1
HSD17B8	NM 014234.3	7	7,31	-I
FLT3	NM 004119.1	8	5,99	-H
AXIN2	NM 004655.2	9	7,15	-1
(CR596519)	CR596519	10	11,57	-I

Postup stanovení míry genetického rizika spočívá v tom, že se změří genové exprese v biologickém vzorku a její logaritmovaná hodnota při základu 2 se srovná s referenční hodnotou intenzity exprese uvedenou pro jednotlivé geny a genetické lokusy. V posledním sloupci tabulky je pro každý gen/lokus uvedena minimální odchylka od referenční hodnoty exprese, značící zvýšené riziko. Je třeba mít na paměti, že vypovídací hodnotu má sada jako celek, nikoliv jednotlivé geny/lokusy, a tedy pro naplnění kritéria zvýšeného genetického rizika je nutné, aby se u sledovaného pacienta hodnoty genové exprese lišily od hodnot referenčních alespoň o požadovanou hodnotu u všech genů/lokusů v sadě.

Biologickým vzorkem odebraným z těla pacientů mohou být například buňky periferní krve, které jsou výhodné především pro minimální invazivitu získání potřebného materiálu.

V případě všech zde uváděných genů a genetických lokusů jsou míněny geny a genetické lokusy hybridizující s odpovídajícími sondami na celogenomových čipech Illumina. Sekvence DNA kódující mRNA uváděné v předkládané přihlášce jsou uváděny podle dostupných katalogů pouze pro informaci.

‘-7CZ 303458 B6

Exprese genů a genetických lokusů může být stanovena jakýmkoliv způsobem známým odborníkovi v daném oboru, například na celogenomovém nebo oligonukleotidovém čipu (čipová microarray analýza, např. i tiling čipy), RT-PCR a qPCR, Northern blot, RNA-Seq (RNA sekvenční zpracování, Whole Transcriptome Shothgun Sequencing), SAGE (mnohonásobná analýza genové exprese, seriál analysis of gene expression), FISH (fluorescenční in-situ hybridizace), využitím reportérových genů, analýzou ribonukleázové ochrany (Ribonuclease Protection Assay) či na úrovni exprese translatovaných proteinů metodou western blot, ELISA (enzymová imunoanalýza, enzyme-linked immunosorbent assay), využitím GFP (zelený fluorescenční protein, green io fluorescent protein), průtokovou cytometrií či imunohistologicky.

Předmětem předkládaného vynálezu je dále oligonukleotidový čip pro identifikaci osob se zvýšeným genetickým rizikem úmrtí v důsledku kardiovaskulárních komplikací do 6 měsíců od okamžiku výskytu akutního infarktu myokardu, obsahující právě sondy hybridizující s DNA či RNA uvedené sady genů či genetických lokusů. Oligonukletidový čip může být připraven např. spotováním či jakýmkoliv jiným způsobem známým odborníkovi v daném oboru.

Předkládaný vynález přináší možnost identifikovat v české populaci jedince, kteří mají zvýšené genetické riziko úmrtí v důsledku kardiovaskulárních komplikací do 6 měsíců od okamžiku výskytu akutního infarktu myokardu, což umožní efektivní využití lůžkových kapacit a prevenčních a sledovacích programů.

Vynález je dále osvětlen na následujících příkladech provedení, aniž jejími jeho rozsah jakkoliv omezen.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 ukazuje teplotní mapu genů identifikovaných v rámci experimentu genové exprese pro kontrast AIMD6 vs AIM.

Obr. 2 ukazuje kvantilovou diagnostiku lineárního modelu pro logaritmovaná data intenzit genové exprese při základu 2 (Q -Q grafy) a dále vulkánové grafy které charakterizují data na základě logaritmu podílů intenzit genové exprese ve studované a srovnávací populaci (viz daný kontrast) a na základě logaritmu šance na diferenciální expresi pro daný gen či transkript. Dává komplexní představu o povaze diferenciální exprese pro daný kontrast.

Seznam sekvencí

SEQ ID No. 1: sekvence DNA kódující mRNA genu ADORA3 SEQ ID No. 2: sekvence DNA odpovídající RefSeq-ID M97723 SEQ TDNo. 3: sekvence DNA kódující mRNA genu ERLIN1 SEQ ID No. 4: sekvence DNA kódující mRNA genu CLYBL

SEQ ID No. 5: sekvence DNA kódující mRNA genu TCEA3

SEQ ID No. 6: sekvence DNA odpovídající RefSeq-ID BC070337 SEQ ID No. 7: sekvence DNA kódující m RNA genu HSD17B8 SEQ ID No. 8: sekvence DNA kódující mRNA genu FLT3 SEQ ID No. 9: sekvence DNA kódující mRNA genu AXIN2

SEQ ID No. 10: sekvence DNA odpovídající RefSeq-ID CR596519

-8 CZ 303458 B6

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1 Čipová analýza buněk periferní krve pacientů smíchané s RNA later na lidském celogenomovém čipu Human WG6 v2 Expression BeadChip firmy Illumina

Pozn. Kurzívou jsou označeny přesné obchodní názvy produktů či specifické komponenty produktů, které nemají odpovídajícíjednoznačné české ekvivalenty.

io Sběr vzorků plné kver do RNAlater^(li) (kat. ě. AM7024, Ambion, Appl i e Biosystems) byl prováděn tak, že vzorek nesrážlivé plné krve (2,4 ml) byl nejpozději do 15 min od odběru smíchán s RNAlater^K) Tissue Collection: RNA Stabilization Solution (7,6 ml). Vzorek byl řádně promíchán a poté přesunut do mrazicího boxu -70 °C k dlouhodobému skladování. Izolace RNA pomocí kitu RiboPure^ÍM - Blood, Ambion lne. (kat. č. AM1928, Ambion, Applied Biosystems) byla prováděna tak, že vzorky byly vyndány z mrazicího boxu a ponechány na ledu rozmrazit. Snažili jsme se vždy šestice vzorků jdoucí najeden čip připravit najednou . Pro izolaci RNA bylo pipetováno 1,8 ml vzorku krve s RNAlater^(R} do 2ml zkumavky bez RNase. Vzorek krve v roztoku RNAiater^R> byl centrifugován na 16 100 g (13 200 rpm) 1 min. Supematant byl odstraněn včetně bílé fáze těsně nad teletem. Buňky byly lyžovány v 800 μΐ lyzačního roztoku a 50 μϊ roz20 toku acetátu sodného. Směs byla rádně promíchána na vortexu. Lyzát buněk byl extrahován s 500 μϊ kyselého fenolxhloroformu. Směs byla promíchána 30 s na vortexu a ponechána stát 5 min při laboratorní teplotě. Směs byla centrifugována na 16 100 g 1 min. Celá vodná fáze, které bylo kolem 1,2 ml, byla přenesena do nové 2ml zkumavky bez RNase, znovu centrifugována a vodná fáze bez jakékoli pelety odebrána do čisté zkumavky bez RNase. Bylo přidáno 600 μϊ

100% etanolu a promícháno na vortexu.

700 μϊ vzorku byl přeneseno na dodanou kolonku umístěnou v kolekční zkumavce a 5 až 10 s centrifugováno na 16 100 g. Kolekční zkumavky byly vyprázdněny a znovu do nich byly naneseny kolonky. Do kolonek bylo naneseno dalších 700 μϊ a poté zbytky vzorku a vždy 5 až

10 s centrifugováno na 16 100 g. Kolekční zkumavky byly vyprázdněny a znovu do nich byly vsazeny kolonky. Do kolonek bylo 2x naneseno 700 μΐ promývacího roztoku 2/3 (láhve musí být doplněna o 56 ml 100% etanolu) a 5 až 10 s centrifugováno na 16 100 g. Kolekční zkumavky byly vyprázdněny a znovu do nich byly vsazeny kolonky, centrifugovány, aby byla odstraněna veškerá kapalina. Kolonky byly přeneseny na označenou kolekční zkumavku a naneseno 50 μϊ elučního roztoku (předehřátého na 75 °C). 20 s ponecháno stát při laboratorní teplotě a 20 až 30 s centrifugováno na maximum. Při druhé eluci dalšími 50 μϊ elučního roztoku centrifugováno 1 min.

K RNA ve 100 μΐ elučního pufru bylo přidáno 5μ1 DNase pufru a 1 μϊ DNase I a ponecháno

3 0 min inkubovat při 37 °C. K RNA po odstranění DNA bylo přidáno 20 μϊ DNase inaktivační reagencie. Směs byla jemně promíchána na vortexu a ponechána 2 min stát při laboratorní teplotě. Během této doby byla směs dvakrát promíchána.

Vzorek byl centrifugován l min na 16 100 g. V peletěbyla DNase inaktivační reagencie. Roztok

RNA byl přenesen do nové zkumavky bez RNase.

Byla změřena koncentrace RNA na Nanodropu, Thermo Scientific (1 μϊ), případně ponechán alikvot pro analýzu na Bioanalyzeru 2100, Agilent Technologies.

Po provedení čipové analýzy s takto ošetřenými vzorky RNA bylo zjištěno, že díky použití plné krve dochází k preferenční aplikaci globinových RNA a nedostatečné intenzitě signálu ostatních genů. Proto byly vzorky RNA přečištěny pomocí GLOBINclean™ Kitu firmy Ambion (kat. č. AM1980, Applied Biosystems):

-9CZ 303458 B6

K cca ΙΙΟμΙ vzorku RNA isolované pomocí RiboPure¹™ Blood Kit, Ambion z plné krve s RNAlater'’ bylo přidáno 11 μΐ octanu sodného (RiboPure‘^M), případně 0,35 μΐ GlycoBlue (AM9616, Ambion, Applied Biosystems) a 300 μΐ 100% ethanolu, vše bylo řádně promícháno. Vzorky byly uskladněny na 1 h v mrazicím boxu při teplotě -20 °C. Pak byly centrifugovány při

16 100 g 30 min, 4 °C, a supematant byl opatrně odstraněn. Bylo přidáno 0,7 ml ledového 70% ethanolu, vzorek vortexován, centrifugován 10 min při 4 °C a supematant opatrně odstraněn. Peleta byla rozpuštěna ve 14 μΐ vody bez nukleáz (v 15 μΙ pokud chceme v tomto kroku měřit koncentraci na Nanodropu).

ίο V průběhu točení byly připraveny potřebné roztoky:

RNA vazebný pufr. Byly přidány 2 ml 100% isopropanolu do koncentrátu vazebného pufru, promícháno a skladováno při laboratorní teplotě.

RNA promývací roztok: Byly přidány 4 ml 100% etanolu do koncentrátu promývacího roztoku, promícháno a skladováno při laboratorní teplotě.

Kuličky resuspendující směs (1 reakce / 6 reakcí): 10 μ1/60 μΙ RNA vazebné kuličky, 4 μΙ/24 μΐ pufru pro RNA kuličky, 6 μ1/36 μΐ 100% isopropanolu. Směs byla homogenizována a skladována při laboratorní teplotě.

Streptavidinové magnetické kuličky (30 pl/vzorek):do inkubátoru (50 °C) byly vloženy zkumavky s 2x hybridizačním pufrem a pufrem pro streptavidinové kuličky minimálně na 15 min, před použitím řádně vortexovány. 6x 30 μΙ (180 μΐ) homogenizovaných streptavidinových magnetic25 kých kuliček bylo pipetováno do čisté 1,5 ml zkumavky, centrifugováno cca 2 s na méně než 1000 g a zkumavka byla umístěna do magnetického stojánku na dobu 3 až 5 minut (dokud není roztok průsvitný). Supematant byl opatrně odstraněn a přidáno 6x 30 μΐ (180 μΐ) pufru pro streptavidinové kuličky předehřátého na 50 °C, řádně vortexováno a ponecháno ínkubovat po dobu nejméně 15 min při 50 °C před dalším použitím. Ke vzorkům RNA ve 14 μΐ (1 až 10 pg) byl přidán 1 μΐ Capture Oligo Mix. Ke směsi bylo přidáno 15 μΙ 2x hybridačního pufru předehřátého na 50 °C. Vzorky byly krátce vortexovány a rychle centrifugovány při max. 1000 g a ponechány ínkubovat při 50 °C po dobu 15 minut (dojde k hybridizaci s globinovou mRNA).

Připravené streptavidinové magnetické kuličky umístěné v inkubátoru byly jemně vortexovány a centrifugovány méně než 2 s na max. 1000 g. Ke každému vzorku RNA bylo přidáno 30 μΐ připravených streptavidinových magnetických kuliček, směsi řádně promíchány vortexováním, stočeny cca 2 s na lOOOg a ponechány ínkubovat 30 min při teplotě 50 °C. Po vyjmutí z inkubátoru jemně vortexovány, centrifugovány cca 2 s na max. 1000 g a zkumavky umístěny do magnetického stojánku na 3 až 5 min (dokud není roztok průsvitný). Supernatanty obsahující celkovou RNA bez globinové mRNA opatrně odstraněny a přeneseny do čistých 1,5 ml zkumavek.

Byl předehřát eluční pufr na 58 °C. Ke každému RNA vzorku bylo přidáno 100 μΐ RNA vazebného pufru. Kuličky resuspendující směs řádně homogenizovány vortexováním a následně přidáno 20 μΐ směsi ke každému vzorku. Směs 10 s řádně vortexována, aby došlo k navázání RNA na kuličky, centrifugovány cca 2 s na lOOOg. Zkumavky byly umístěny do magnetického stojánku na 3 až 5 min (dokud není roztok průsvitný). Opatrně byly odstraněny veškeré supernatanty. Zkumavky byly vyjmuty z magnetického stojánku. Až poté bylo ke každému vzorku přidáno 200 μΙ RNA promývacího roztoku, řádně 10 s vortexováno, krátce a jemně stočeno (viz výše). Zkumavky se vzorky umístěny do magnetického stojánku na 3 až 5 minut než došlo k usazení magnetických kuliček s navázanou RNA, opatrně byl odstraněn veškerý supematant a zkumavky vyjmuty ze stojánku. Zkumavky krátce a jemně stočeny, umístěny zpět do magnetického stojánku a malou špičkou byla odstraněna veškerá kapalina. Zkumavky se vzorky vyndány z magnetického stojánku a otevřené nechány 5 min na vzduchu oschnout. Ke každému vzorku

- 10CZ 303458 B6 přidáno 30 μΐ elučního pufru předehřátého na 58 °C, řádně 10 s vortexováno a směs inkubována 5 minut při 58 °C. Řádně 10 s vortexováno a krátce a jemně centrifugováno (cca 2 s na 1000 g). Vzorky byly umístěny do magnetického stojánku na 3 až 5 minut než došlo k usazení magnetických kuliček. Supematant obsahující přečištěnou celkovou RNA byl opatrně odebrán do čistých l,5ml zkumavek.

Kritickým parametrem se stal poměr absorbancí u 260 nm ku 230 nm, který má být pro čipovou analýzu vyšší než 1,5. Pro zajištění dostatečné kvality musela být prováděna finální etanolová precipitace. Kecá 30 μΐ vzorku RNA isolované pomocí RiboPure^rM Blood Kit, Ambion z plné io krve s RNAlater^(!i) přečištěné kitem GLOBINclear‘^M Whole Blood Kit byly přidány 3 μΐ octanu sodného (RiboPure^!M) a 85 μΐ 100% etanolu. Řádně promícháno a vzorky uskladněny přes noc v mrazicím boxu při teplotě -20 °C. Ráno centrifugováno při 16 100 g 30 min, 4 °C, supematant opatrně odstraněn, peleta promyta 0,7 ml vychlazeného 70% etanolu, vzorek vortexován, centrifugován 15 min při 4 °C, a poté veškerý supematant opatrně odstraněn. Pelety rozpuštěny ve

14 μΐ vody bez nukleáz či dle velikosti pelety a vstupní koncentrace ve větším objemu. Byla změřena koncentrace přečištěné a přesrážené RNA na Nanodropu (1 μΐ), integrita stanovena pomocí Bioanalyzeru 2100, Agilent Technologies (1 μΐ) Agilent RNA 6000 Nano/Pico Kit (kat. č. 5067 až 1511/5067 až 1513).

Pokud to bylo z hlediska výchozího materiálu možné, aby kvantitativní i kvalitativní parametry byly v pořádku (RIN > 7; A₂₆o/28_Onn, > 1,8; A₂6o/23onm > 1,5), byla připravená RNA dále amplifikována pomocí Illwnina^(R) Total Prep RNA Amplification Kit, Ambion (kat. č. IL1791). Systém biotinem označí amplifikovanou ŘNA k hybridizaci na čipech. Protokol se skládá z reversní transkripce s využitím oligo(dT) primerů pro syntésu cDNA obsahující T7 promotorovou sekvenci. K získané cDNA je syntetizován druhý řetězec při využití DNA polymerázy a RNasy

H. Přečištěný cDNA produkt vstupuje do in-vitro transkripce s T7 RNA polymerázou. Výsledná cRNA je následně přečištěna od neinkorporovaných nukleotidů, solí, enzymů a anorganického fosfátu. Vstupní množství RNA, které jsme využívali pro amplifikaci, bylo 150 ng v maximálně 11 μΐ. Pro jednotlivé kroky byl využit DNA EngineDyad Peltier Thermal Cycler, Bio-Rad

Laboratories.

RNA vzorky o objemu 11 μΐ (150 ng RNA) byly umístěny do sterilních 0,2ml zkumavek bez RNas. Případně byly do daného objemu naředěny vodou bez nukleáz. Při laboratorní teplotě byl připraven master mix pro reversní transkripci - syntézu jednořetězcové DNA:

μ! T7 oligo (dT) primer μΐ lOx pufru pro první řetězec (objemy jsou udány na jednu 20 μΐ reakci) μΐ směs dNTP (složky byly přidávány v daném pořadí) μΙ inhibitor RNas

1 μΙ ArrayScnpt (enzym).

Master mix byl jemně vortexován a krátce centrifugován (5a). Bylo přidáno 9 μΙ master mixu do každého vzorku RNA, důkladně promícháno pipetováním (2 až 3x) a 3 až 4x cvrnknuto do zkumavek. Krátce centrifugováno a umístěno do bloku cykleru (42 °C). Reakce byly inkubovány

2 h při 42 °C, poté krátce stočeny a dány na led (4 °C).

Na ledu byl připraven master mix pro syntézu druhého řetězce cDNA:

μΙ voda bez nukleáz

10 μΐ 10x pufr pro druhý řetězec (objemy jsou udány na jednu 100 μΐ reakci) μΐ směs dNTP (složky byly přidávány v daném pořadí) μΐ DNA polymerázy μΙ RNasy H.

Master mix byl jemně vortexován a krátce stočen (5s). Bylo přidáno 80 μΙ master mixu ke každému vzorku, důkladně promícháno pipetováním (2 až 3x) a 3 až 4x cvmknuto do zkumavek. Krátce centrifugováno, umístěno do předem vychlazeného bloku cykleru na 16 °C. Reakce byly inkubovány 2 h při 16 °C, poté 4 °C.

Získaná cDNA byla přečištěna. Centrifugace byly prováděny při 10 000 g a laboratorní teplotě (otáčky nesmí překročit 16 000 g, došlo by k poškození skleněného filtru a vlákna filtru by mohla kontaminovat eluát). Bylo předehřáto dostatečné množství vody bez nukleáz pro eluci na 55 °C (při teplotě > 58 °C dochází k částečné denaturaci dDNA) nejméně 10 min před použitím. Do ío promývacího pufru bylo přidáno 24 ml etanolu.

Ke vzorkům cDNA bylo přidáno 250μΙ cDNA vazebného pufru, důkladně promícháno pipetováním (2 až 3x) 3 až 4x poklepáno na zkumavky a krátce stočeno. Kolonky byly umístěny do dodaných promývacích zkumavek a na jejich střed naneseny vzorky (cDNA s cDNA vazebným pufrem). Centrifugováno 1 min 10 000 g, eluát byl zlikvidován. Každou kolonku bylo aplikováno 500 μ! promývacího pufru centrifugováno 1 min 10 000 g a eluát byl zlikvidován. Vzorky na kolonkách byly opětovně 1 min centrifugo vány 10 000 g (odstranění veškerého promývacího pufru). Kolonky s cDNA byly přendány do eluěních zkumavek. Na střed kolonek bylo naneseno 10 μΐ vody bez nukleáz vytemperované na 55 °C, necháno 2 min stát pri laboratorní teplotě a poté centrifugováno 1,5 min 10 000 g. Na střed kolonek byl nanesen druhý alikvot předehřáté vody bez nukleáz - 9 μΙ, centrifugováno 2 min 10 000 g.

Získaná dvouřetězcová DNA v cca 17,5 μΐ vody z výsledného eluátu byla použita pro in~vitro transkripci. Při laboratorní teplotě byl připraven master mix pro syntézu cRNA.

2,5 μΐ T7 lOx reakční pufru (objemy jsou udány na jednu 25μ1 reakci)

2,5 μΐ směs T7 enzymu (složky byly přidávány v daném pořadí)

2,5 μΙ směs biotinem značeným NTP.

Master mix byl jemně vortexován a krátce stočen (5s). Bylo přidáno 7,5 μΐ master mixu ke každému vzorku cDNA, důkladně promícháno pipetováním (2 až 3x) a 3 až 4x cvmknuto do zkumavek. Vzorky krátce centrifugo vány a umístěny do bloku cy klenu, kde byly inkubovány při 37 °C po dobu 14 h, poté 4 °C. Reakce byly ukončeny přidáním 75 μΙ vody bez nukleáz ke každému vzorku cRNA a důkladně, ale jemně, vortexovány.

Při následném přečištění došlo k odstranění enzymů, solí a neinkorporovaných nukleotidů. Centrifugace byly prováděny při 10 000 g při laboratorní teplotě (otáčky nesmí překročit 16 000 g, došlo by k poškození skleněného filtru a vlákna filtru by mohla kontaminovat eluát). Bylo předehřáto dostatečné množství vody bez nukleáz pro eluci na 60 °C nejméně 10 min před použitím a byly připraveny kolonky do sběrných zkumavek. Ke každému vzorku ve 100 μΙ bylo přidáno 350 μ! cRNA vazebného pufru. Ihned bylo přidáno 250 μΐ 100% etanolu, vzorky 3x promíchány pipetováním, ale nevortexovány a necentrifugovány. Po smísení etanolu se vzorkem byla směs přenesena na střed připravených kolonek, centrifugováno 1 min 10 000 g, eluát byl zlikvidován. Na střed každé cRNA kolonky bylo aplikováno 650 μΐ promývacího pufru, centrifu45 gováno 1 min 10 000 g a eluát byl zlikvidován.

Zkumavky s kolonkami byly centrifugovány další 1 min 10 000 g (odstranění veškerého promývacího pufru) a kolonky poté byly umístěny do nových sběrných zkumavek. Na střed kolonky bylo naneseno

100μ1 vody bez nukleáz vytemperované na 60 °C, necháno 2 min stát pri laboratorní teplotě a centrifugováno 1,5 min 10 000 g.

- 12CZ 303458 B6

Byla změřena koncentrace amplifikované cRNA na Nanodropu (1 μΙ). Pokud byla nižší než 150 ng/μΐ či byl nízký poměr absorbancí u260nm ku 230 nm, tak byly vzorky přec i pito vány. Ke vzorku přečištěné cRNA byla přidána 1/10 objemu 3M CH₃COONa, pH 5,2, RiboPure^tM(10 μΐ) a 2,5 násobek objemu 100% etanolu (275 μΐ), důkladně promícháno a ponecháno 60 min v mrazi5 cím boxu při -20 °C. Vzorky byly centrifugovány na 16 100 g po dobu 30 až 60 min při 4 °C a opatrně byl odstraněn supematant. Pelety byly promyty 500 μΐ 70% etanolu, zkumavky centrifugovány na 16 100 g po dobu 15 min při 4 °C, supematant opatrně odstraněn, případně byly znovu rychle centrifugovány a odstraněny i zbytky etanolu. Pelety cRNA byly ponechány cca 2 min na vzduchu, aby oschly. Poté byly suspendovány v požadovaném objemu vody bez nukleáz (> 12 μΐ).

Výtěžek závisel na množství a kvalitě poly(A)RNA) v celkové RNA. Byla změřena koncentrace na NanoDropu (1 μΐ) a stanoven profil délek cRNA pomocí Bioanalyzeru 2100, Agilent (1 μΐ), který má být mezi 250 až 5500 nt s většinou cRNA mezi 1000 až 1500 NT.

Pokud byla finální koncentrace cRNA > 1500 ng/μΐ a profil v pořádku, byly vzorky použity pro hybridizaci na Human WG6-v2 Expression BeadChip firmy Illumina.

Byla předehřátá hybridizační pec s výkyvnou plošinou na 58 °C alespoň 1 h před použitím.

Vzorky byly připraveny tak, aby vstupní množství cRNA do hybridizace bylo 1,5 pg. Maximální možný objem je 10 μΐ, případně vzorky na tento objem byly doplněny vodou bez nukleáz a promíchány. Po dobu 10 min nechány stát při laboratorní teplotě, aby došlo k řádnému rozpuštění. Do hybridizační pece vytemperované na 58 °C byly na 10 min vloženy zkumavky s GEX-HYB a GEXIICB (pro rozpuštění skladováním precipitovaných solí). Ke každému vzorku 1,5 pg a cRNA v 10 μΙ vody bez nukleáz bylo přidáno 20 μΐ GEX-HYB, byly jemně vortexovány a iychle centrifugovány.

Illumina Hyb Chamber Basket byl umístěn do BeadChip Hyb Chamber. Bylo pipetováno 200 μΐ GEX-HCB do každého ze dvou reservoárů pro zvlhčující pufr v každé HybChamber. Pufr byl dáván pouze do komor, které byly použity. Hyb Chamber byl utěsněn víkem a nechán při laboratorní teplotě (-22 °C) než byly čipy dány do Hyb Chamber. Na laboratorní teplotu vytemperované čipy byly vyndány z jejich obalů (Human WG6-V2 Expression BeadChip). Byly používány výhradně rukavice bez pufru. Čipy byly pinzetou drženy za krycí fólii v oblasti barkódu, vloženy do Hyb Chamber Insert tak, aby jejich směr souhlasil se symbolem barkódu na Insertu.

Analyzované vzorky cRNA smíchané s GEX-HYB byly zahřátý na 65 °C po dobu 5 min. Jemně vortexovány a rychle centrifugovány, aby byla kapalina shromážděna na dně zkumavky. Před dalším použitím vzorky ponechány při laboratorní teplotě vychladnout a ihned poté byly pipetovány na čipy.

Hyb Chamber Inserts obsahující čipy byly umístěny do Hyb Chamber a bylo pipetováno 30 μΙ analyzovaného vzorku na vstupní otvor každého pole. Hyb Chamber opatrně uzavřen víkem a inkubován v hybridizační peci při 58 °C po dobu 16 hodin s rychlostí kyvů plošiny nastavenou na 5. Před ukončením práce vdaný den byl ještě připraven lx vysokoteplotní promývací pufr přidáním 50 ml lOx koncentrovaného zásobního roztoku ke 450 ml vody bez RNas. Teplota zahřívacího bloku naplněného 500 ml lx vysokoteplotního promývacího pufru byla nastavena na 55 °C, víko bylo zavřeno a ponecháno hřát přes noc.

Další den byl připraven promývací roztok EIBC přidáním 3 ml E1BC pufru do 1 1 vody bez

RNas. Na laboratorní teplotu byl předehřát blokovací pufr El (4 ml/čip). Bylo přidáno odpovídající množství blokovacího pufru El (2 ml/čip) se streptavidin-Cy3 (2 μΙ zásobního roztoku o koncentraci 1 mg/ml najeden cip). Byla použita jedna kónická zkumavka pro všechny aktuálně zpracovávané čipy a před detekcí byl tento roztok uchováván v temnu.

-13CZ 303458 B6

Z hybrid izační pece byla vyndána Hyb Chamber a rozebrána. Čipy byly ponořeny do 250 ml promývacího roztoku E1BC a byla z nich opatrně oddělána krycí fólie. Rozebrání a umístění vElBC promývacím roztoku bylo opakováno pro všechny aktuálně zpracovávané čipy. Čipy byly následně umístěny do držáku, který byl za rukojeť přemístěn do Hybex waterbath Insert obsahujícího lx vysokoteplotní promývací pufr přes noc předehřátý na 55 °C. Se zavřeným víkem byly čipy bez třepání inkubovány 10 min. Během této inkubace bylo připraveno 250 ml promývacího roztoku E1BC v čisté barvicí nádobě. Ihned po lOmin inkubaci s vysokoteplotním promývacím pufrem byl držák s čipy přesunut do připraveného čerstvého promývacího roztoku E1BC. Držák krátce a intenzivně v nádobě protřepán pohybem nahoru a dolů, poté na 5 min ío umístěn na rotační třepačku na maximální rychlost, při které nedocházelo k vyšplíchnutí roztoku z nádoby (120 rpm). Přemístěn do čisté barvicí nádoby s 250 ml 100% etanolu. Krátce a důsledně pomocí rukojetí držáku byly čipy proprány a poté lOmin třepány na orbitální třepačce při maximální rychlosti. Čipy byly přemístěny do čisté barvicí nádoby s 250 ml promývacího roztoku E1BC, krátce a intenzivně promíchány a třepány na orbitální třepačce po dobu 2 min. Čipy byly přemístěny do připravených Wash Tray se 4 ml blokovacího pufru El, dány na výkyvnou desku (analyzovaná plocha se vzorky musí vždy směřovat nahoru) a kývány na střední rychlost po dobu 10 min. Čipy byly prendány do čisté Wash Tray se 2 ml blokovacího pufru El + streptavidin-Cy3, přikryty víkem a kývány na střední rychlost dalších 10 min. Čipy byly přesunuty do připravené čisté barvicí nádoby s 250 ml promývacího roztoku E1BC, krátce proprány a poté 5 min roztečně třepány při laboratorní teplotě. Čipy v držáku byly přesunuty do centrifugy s rotorem na mikrodestiČky a točeny při laboratorní teplotě n 270 ref po dobu 4 min. Usušené čipy byl ihned skenovány pomoci Illumina¹'¹ BeadArray Readeru na skenování faktoru 1,0 a 1,5 a získaná data jsou uchovávána na DVD a webovém úložišti dat.

Příklad 2: Statistické vyhodnocení expresního profilu

Předkládaný vynález je doložen výsledky, které jsou obdrženy na základě celogenomové analýzy vzorků periferní krve získaných od jedinců hospitalizovaných v letech 2006 až 2009 a Městské nemocnici Čáslav či kardiologické klinice v Pardubicích s diagnózou primárního akutního infarktu myokardu a párových kontrolních osob hospitalizovaných v Městské nemocnici v Čáslavi ve stejném období z důvodu komplikací pohybového ústrojí. Věk případů byl omezen hranicí 80 let. Párové kontrolní osoby nesměly mít pozitivní historii výskytu závažných kardiovaskulárních onemocnění a byly k odpovídajícím případům vybírány tak, aby docházelo k podstatné shodě v rizikových faktorech výskytu akutního infarktu myokardu. Zejména byla požadována shoda v pohlaví, věku (kontroly mohly být o maximálně 5 let starší než případy) a shodný musel být též status diabetů mellitu a kuřácký status. Vzorky byly analyzovány pomocí technologie firmy II lumina, přičemž byly použity čipy verze 2 {Human WG6-v2 Expression BeadChip}.

Ke genetickému vyšetření pacientů s akutním infarktem myokardu byly zařazovány osoby, které byly přijaty či ambulantně ošetřeny s diagnosou akutního infarktu myokardu (AIM) na příjmové ambulanci Interního oddělení MN Čáslav. Do souboru byli rovněž zařazováni pacienti, kteří byli vezeno posádkou rychlé záchranné služby přímo na Kardiologickou kliniku v Pardubicích, kde byl na koronární jednotce proveden odběr krevního vzorku. Odběr byl vždy proveden po pode45 psáni „Informovaného souhlasu“ pacientem. Smíchání vzorků venózní krve s RNAlater^(R>, jejich uskladnění a transport krevních vzorků byly prováděny dle pracovních protokolů v souladu s platnými právními předpisy a veškerá data ke vzorkům jsou uložena v příslušných databázích.

Akutní infarkt myokardu byl diagnostikován na základě an amnestie kých údajů, EKG křivky laboratorního průkazu nekrosy myokardu. Byl definován jako bolest na hrudi nebo její ekvivalent trvající alespoň lOmin v posledních 24-ti hodinách selevací úseku ST na EKG křivce (STEMI) či bez elevací ST (NONSTEM1). Biologický průkaz nekrózy byl stanovován v naší laboratoři vyšetřením Troponinu I. Jako pozitivní hodnotu Troponinu 1 bylo považováno překročení horního limitu normální hodnoty v čáslavské laboratoři, tj. 0,3 μΙ/l. Jako pomocná diagnos55 tická metoda byla používána echokardiografie k průkazu regionální poruchy kinetiky levé

-14CZ 303458 B6 komory v povodí „infarktové tepny“. Jako standardní panel vyšetření pacientů s podezřením na AIM byl vyšetřován Troponin I okamžitě při přijetí a dále ve 4 až 6 hodinovém intervalu v prvních 24 hodinách, AST, ALT, KO, Koagulace (QT, APTT), glykémie, iontogram, Urea, kyselina močová, lipidogram, CRP, u diabetiků HBAlc. Vyšetření CK a CK-MB mass a LD bylo prováděno nepravidelně dle uvážení lékaře,

Studie zahrnovala šestiměsíční sledování pacientů s akutním infarktem myokardu od okamžiku jeho výskytu. V návaznosti na zvolený statistický design byla skupina pacientů s výskytem akutního infarktu myokardu rozdělena na osoby, které z kardiovaskulárních příčin zemřely v průběhu io šestiměsíčního sledování A(1MD6, 4 osoby) a na osoby, které přežívaly dále (AIM, 41 osob), párové kontroly čítaly dalších 45 osob. Tabulka 1 ukazuje vybraná data osob v analyzovaném souboru a základní data ke zpracovaným vzorkům.

-15CZ 303458 B6

Tabulka 1: Základní data k osobám z analyzovaného souboru a k analyzovaným krevním vzorkům odebraným z těla těchto pacientů

ID	Vzorek	Pohlaví	Ročník	Exitus	Diabetes mellitus	Kouření	c (ng/μΐ) RNA	RIN	lig cRNA
029	AIM	Muž	1948	Ne	Ne	Ano (20)	243.68	7,8	8,522
084	AIM	Muž	1947	Ne	Ne	Ano (10)	163,76	8,8	8,813
C056	AIM	Muž	1953	Ne	Ne	Ano (15)	109,2	7,4	13,577
P008	AIM	Žena	1949	Ne	Ne	Ne	41,9	8,1	8,752
P009	AIM	Muž	1951	Ne	Ne	Ano (2)	28,6	7,1	5,108
C029	AIM	Muž	1955	Ne	Ne	Ne	43,3	7,1	9,496
C048	AIM	Žena	1960	Ne	Ne	Ne	170,3	8,5	16,748
C099	AIM	Muž	1951	Ne	Ne	Ne	261,2	8,0	10,146
070	AIM	Žena	1929	Ne	Ne	Ne	404,7	6,1	2,390
072	AIM	Žena	1931	Ne	Ano	Ne	353,0	7,7	8,093
081	AIM	Žena	1934	Ne	Ano	Ne	195,2	8,1	8,633
C069	aim”	Muž	1941	Ne	Ne	Ne	185,3	8,7	6,997
P011	AIM	Muž	1947	Ne	Ne	Ne	245,2	6,9	4,194
047	AIM	Muž	1945	Ne	Ne	Ne	317,5	6,7	5,176
C005	A1MDÓ	Muž	1939	Ano	Ne	Ne	89,5	8,1	7,351
CO53	AIMD6	Žena	1935	Ano	Ne	Ne	327,1	7,7	8,389
P010	AIMD6	Žena	1928	Ano	Ano	Ne	188,3	8,1	8,248
085	AIM	Muž	1937	Ne	Ano	Ne	191,54	8,2	7,695
095	AIM	Muž	1946	Ne	Ano	Ne	293,41	8,2	13,269
C284	AIM	Muž	1953	Ne	Ne	Ano (20)	210,06	7,4	8,364
094	ΑΓΜ	Muž	1933	Ne	Ne	Ne	160,62	8,0	15,856
C238	AIM	Muž	1934	Ne	Ano	Ne	204,88	7,8	8,750
C078	AIM06	Muž	1937	Ano	Ano	Ne	170,38	8,2	15,901
COló	AIM	Muž	1944	Ne	Ne	Ne	84	7,1	6,802
C074	AIM	Muž	1943	Ne	Ne	Ne	209,2	6,9	7,509
P003	AIM	Žena	1936	Ne	Ne	Ano (10)	113,8	6,8	7,505
C037	AIM	Žena	1933	Ne	Ano	Ne	226,2	8,5	3,76
C036	AIM	Žena	1934	Ne	Ne	Ne	31,4	6,2	2,986
C030	ATM	Muž	1951	Ne	Ne	Ne	152,2	8,7	3,186
008	AIM	Muž	1955	Ne	Ne	Ano (15)	197,9	7,5	10,566_
019	ATM	Muž	1948	Ne	Ne	Ano (2)	365	7,1	6,499
C065	AIM	Žena	1933	Ne	Ano	Ne	79,7	7,6	2,536
C039	AIM	Žena	1959	Ne	Ano	Ne	434,2	6,5	7,939
,025	ATM	Muž	. 1928	Ne	Ano	Ne	184,7	8,4	4,120
039	AIM	Muž	1939	Nc	Ne	Ne	126,5	8,4	7,674
0 20	AIM	Muž	1949	Ne	Ne	Ne	103,6	8,7	4,480
C063	AIM	Žena	1941	Ne	Ne	Ne	282,9	8,5	4,526

- 16 CZ 303458 B6

ID	Vzorek	Pohlaví	Ročník	Exitus	Diabetes mellitus	Kouření	c (ng/μΐ) RNA	RIN	με cRNA
C205	AIM	Muž	1944	Ne	Ano	Ano (10)	85,7	8,4	7,141
074	AIM	Muž	1950	Ne	Ne	Ne	127,97	8,0	6.820
082	AIM	Muž	1954	Ne	Ne	Ano (40)	97,47	8,1	12,236
C289	AIM	Muž	1957	Ne	Ne	Ne	213,42	8,0	9,322
C019	AIM	Žena	1930	'Ne	Ne	Ne	36,59	7,7	3,043
C013	AIM	Muž	1939	Ne	Ano	Ne	194,74	7,9	4,813
C269	AIM	Muž	1938	Ne	Ne	Ne	320,41	8,2	4,974
P019	AIM	Žena	1931	Ne	Ano	Ne	86,65	7,9	4,535
C083	CTRL	Muž	1947	Ne	Ne	Ano (5)	186,6	8,4	15,045
C250	CTRL	Muž	1946	Ne	Ne	Ano (25)	10,04	7,7	1,907
038	CTRL	Muž	1950	Ne	Ne	Ano (15)	290,9	7,1	6,189
C081	CTRL	Žena	1949	Ne	Ne	Ne	58,4	6,7	9,044
049	CTRL	Muž	1949	Ne	Ne	Ano (20)	47,39	7,6	5,758
C014	CTRL	Muž	1955	Ne	Ne	Ne	51,74	7,2	2,403
033	Ctrl	Žena	1960	Ne	Ne	Ne	177,2	8,6	9,447
C101	CTRL	Muž	1951	Ne	Ne	Ne	237,38	8,7	10,019
009	CTRL	Žena	1928	Ne	Ne	Ne	302,8	8,5	9,941
C022	CTRL	Žena	1929	Ne	Ano	Ne	232,48	7,6	8,534
C023	CTRL	Žena	1931	Ne	Ano	Ne	223.54	8,1	4,486
C213	CTRL	Muž	1941	Ne	Ne	Ne	124,24	7,8	7,42
C282	CTRL	Muž	1948	Ne	Ne	Ne	297,68	7,0	3,988
C260	CTRL	Muž	1946	Ne	Ne	Ne	147,18	8,5	8,003
C010	CTRL	Muž	1938	Ne	Ne	Ne	301,91	8,0	7,3
063	CTRL	Žena	1934	Ne	Ne	Ne	112,15	7,9	6,127
C208	CTRL	Žena	1928	Ne	Ano	Ne	246,12	7,8	4,79
C348	CTRL	Muž	1937	Ne	Ano	Ne	94,68	7,8	14,11
C304	CTRL	Muž	1946	Ne	Ano	Ne	213,16	8,5	17,068
C302	CTRL	Muž	1952	Ne	Ne	Ano (10)	80,07	8,2	15,571
C098	CTRL	Muž	1932	Ne	Ne	Ne	200,5	7,3	8,272
C272	CTRL	Muž	1930	Ne	Ano	Ne	91,86	8,3	8,709
C287	CTRL	Muž	1936	Ne	Ano	Ne	145,6	8,3	8.272
098	CTRL	Muž	1944	Ne	Ne	Ne	270,3	7,2	7,32
C204	CTRL	Muž	1943	Ne	Ne	Ne	249,8	6,6	8,982
C209	CTRL	Žena	1937	Ne	Ne	Ano (10)	191	7,4	13,377
024	CTRL	Žena	1933	Ne	Ano	Ne	64,91	8,6	2,198
O 10	CTRL	Žena	1934	Nc	Ne	Ne	207,59	8,0	4,37
050	CTRL	Muž	1952	Ne	Ne	Ne	130,5	8,4	2,566
C058	CTRL	Muž	1954	Ne	Ne	Ano (8)	327,4	9,2	6,875
Č066	CTRL	MuŽ	1947	Nc	Ne	Ano (10)	345,4	6,2	8,219
018	CTRL	Žena	1934	Ne 1	Ano	Ne	79,4	6,0	9,242*
C210	CTRL	Žena	1960	Ne	Ano	Ne	577,3	7,4	3,562

QZ 303458 B6

ID	Vzorek	Pohlaví	Ročník	Exitus	Diabetes mellitus	Kouření	c (ng/μΙ) RNA	RIN	Pg cRNA
C310	CTRL	Muž	1929	Ne	Ano	Ne	127,05	8,5	6,859
C294	CTRL	Muž	1939	Ne	Ne	Ne	120,56	7,0	7,361
C187	CTRL	Muž	1949	Ne	Ne	Ne	123,56	7,5	3,689
C011	CTRL	Žena	1940	Ne	Ne	Ne	28,12	7,3	2,632
Cl 16	CTRL	Muž	1941	Ne	Ano	Ano (20)	111,21	7,9	10,515
C274	CTRL	Muž	1950	Ne	Ne	Ne	209,68	7,8	4,306
068	CTRL	Muž	1953	Ne	Ne	Ano (20)	69,67	8,5	10,008
C061	CTRL	Muž	1955	Ne	Ne	Ne	164,27	8,3	8,27
006	CTRL	Žena	1928	Ne	Ne	Ne	27,9	8,3	5,31
C207	CTRL	Muž	1937	Ne	Ano	Ne	82,02	8,7	10,79
C206	CTRL	Muž	1934	Ne	Ne	Ne	142,91	Λ8	4,888
C221	CTRL	Žena	1929	Ne	Ano	Ne	210,16	8,0	4,3

Tabulky 2 a 3 shrnují popisné charakteristiky relevantních klinických a demografických údajů. Kompletní datový soubor obsahoval záznamy o 45 pacientech s primárním výskytem akutního infarktu, z toho 41 ve skupině AIM a 4 ve skupině AIMD6, a dále záznamy od 45 kontrolních pacientech. V datovém souboru bylo 60 můžu a 30 žen. Ve skupině AIM bylo 13 žen a 28 mužů, ve skupině AIMD6 bylo 10 kuřáků a 31 nekuřáků, ve skupině AIMD6 byly všechny osoby nekuřáci a ve skupině CTRL bylo 10 kuřáků a 35 nekuřáků. Co se týče diabetů mellitu II. typu, ve skupině AIM bylo 12 osob s touto diagnózou a 29 bez ní, ve skupině AIMD6 byly 2 osoby s touto diagnózou a 2 bez ní a konečně ve skupině CTRL (Kontroly) bylo 14 pacientů s touto ío diagnózou a 31 bez ní.

Tabulka 2: Počty pacientů a procentuální vyjádření zastoupení popisných charakteristik kategorických veličin

Proměnná	Počty a procentuální údaje ve skupinách
AIM	AIMD6	Kontroly
Pohlaví	Muži	28 (68 %>	2 (50 %)	30 (67 %)
Ženy	13(32%)	2 (50 %)	15(33%)
Kouření	Kuřáci	10 (24 %)	0 (0 %)	10(22%)
Nekuřáci	31 (76%)	4(100%)	35 (78 %)
Diabetes mellitus II. typu	ANO	12(29%)	2 (50 %)	14(31 %)
NE	29 (71 %)	2 (50 %)	31 (69%)

-18CZ 303458 B6

Tabulka 3: Popisné charakteristiky spojitých veličin

Skupina	Věk pacienta
N	Průměrná hodnota	Směrodatná odchylka
AIM	41	63,6	9,18
AIMD6	4	72,3	4,73
Kontroly	45	65,5	9,42

Vzorky venózní krve odebrané od pacientů byly zpracovávány postupem podle Příkladu 1. Data genové exprese byla analyzována pomocí lineárních modelů pro analýzu dat z microarray experimentů „limma“ (Smyth, G. K.: Linear models and empirical Bayes methods for assessing differential expression in microarray experiments, 2004, Statistical Applications in Genetics and Molecular Biology 3, No. 1, Article 3, doi: 10.2202/1544 až 6115.1027), navržených pro statistický a grafický systém R (http://www.r-project.org) v rámci projektu Bioconductor (http://www.bioconductor.org). Data byla normalizována pomocí kvantilové normalizace (Smyth G. K. io and Speed T. P.: Normalization of cDNA microarray data, 2003, Methods 31, 265 až 273, doi: 10.1016/j.physletb.2003.10.071). Šum signálu na pozadí čipu, u kterého se předpokládá normální rozložení, byl odstraněn pomocí konvo luční ho modelu. Tento model předpokládá, že signál z čipů čtený pomocí skeneru je směsí normálně rozděleného šumu a exponenciálně rozděleného signálu intenzit genové exprese (Ritchie Μ. E., Silver J., Oshlack A., Holmes M., Diyagama

D., Holloway A., Smyth G. K.: A comparison of background correction methods for two-colour microarrays, 2007, Bioinformatics 23,2700 až 2707, PMID: 17720982).

Medicínská hypotéza předpokládala možnost genetické determinace (predispozice) výskytu akutního infarktu myokardu vzhledem k obecné české populaci jak v populaci pacientů přežívají20 cích období šestiměsíčního sledování (kontrast AIM vs Kontroly), tak též u pacientů v tomto období zemřelých (kontrast AIMD6 vs Kontroly). Podobně byla předpokládána vyšší genetická zátěž u pacientů s výskytem infarktu, kteří zemřeli v období šestiměsíčního sledování, v porovnání s populací pacientů přežívající srdeční příhodu dlouhodoběji (kontrast AIMD6 vs AIM). Párový statistický design byl zvolen s cílem snížit počty odhadovaných parametrů, které by jinak bylo nutné zohlednit jako možné zavádějící faktory (pohlaví, věk, výskyt kouření a diabetů mel litu) a dále odlišit klinickou a genetickou komponentu komplexního rizika výskytu akutní srdeční příhody. Síla statistických testuje navíc v párovém designu v porovnání s dvou- a vícevýběrovými plány statistických studií typicky vyšší.

Vzhledem k tomu, že o Illumina čipech je známo, že aktuální naměřené hodnoty intenzit genové exprese bývají na jednotlivých čipech plošně posunuty o neznámou konstantu, je tuto skutečnost nutné zohlednit v rámci statistické analýzy a odpovídající korekční konstanty je třeba odhadnout v lineárním modelu. Z tohoto důvodu také není vhodné uvažovat o korelacích mezi naměřenými hodnotami intenzit genové exprese a hodnotami klinických proměnných. Relevantní závěry proto nutně vycházejí pouze z výsledků obdržených z lineárního modelu, kde jsou lineární efekty jednotlivých čipů na hodnoty intenzit genové exprese adjustovány. Lineární statistický model (limma) zohledňoval vliv použitého čipu na hodnoty intenzit genové exprese. Intenzity genové exprese vstupovaly do lineárního modelu jako dvojkové logaritmy původních hodnot. Obrázky 2a a 2b ukazují diagnostiku lineárního modelu pro logaritmovaná data intenzit genové exprese při základu 2 pro všechny tři uvažované kontrasty pomocí Q-Q kvanti lových grafů. Ideální kvant i lový Q-Q graf by měl mít shodné empirické a teoretické hodnoty kvantilů, takže všechny zobrazené hodnoty by ležely na přímce, Q-Q grafy shodně potvrzují, že použití lineárního modelu je všech třech případech adekvátní. Lineární model můžeme schematicky popsat následovně:

-19CZ 303458 B6 log₂(intenzita) - pár + skupina, přičemž proměnná „pár“ identifikuje dvojici případu a odpovídající párové kontroly, která byla vždy umístěna na stejném Illumina čipu. Proměnná „skupina“ kóduje příslušnost k populacím AIM, AIMD6 a Kontrol. Tento model je zobecněnou verzí párového testu.

Množiny genů identifikované na základě výsledků z lineárního limma modelu byly dále analyzovány pomocí PAM modelu, s jehož pomocí byla pro každý kontrast zjištěna podmnožina genů s prediktivními vlastnostmi v nezávislých výběrech. Lineárním modelem dříve zjištěné množiny genů mohou až „příliš dobře“ vysvětlovat konkrétní data, ze kterých jsou výsledky odvozeny (tzv. „over-fítting“), ovšem na úkor prediktivity v nezávislých výběrech. K tomuto účelu byl využit PAM model („Predictive Analysis for Microarrays“), který pomocí křížové validace a využití „shronkage“ principu identifikuje podmnožinu genů, která by měla mít optimální vlastnosti z hlediska určování pravděpodobné příslušnosti sledovaných jedinců k některé ze sledova15 ných populací (AIMD6, AIM a Kontroly).

Za diferenciálně exprimované byly obecně považovány geny, které splňovaly jak podmínku statistické významnosti na hladině 5%, tak též klinické významnosti, která předpokládá, že dvojkový logaritmus podílu hodnot intenzit genové exprese je v absolutní hodnotě větší nebo roven jedné. Statistická analýza prokázala statisticky i klinicky významnou asociaci mezi krátkodobou úmrtností subjektů (v horizontu 6 měsíců po primární akutní srdeční příhodě) ajejich expresním genovým profilem u 15 genů v případě diagnostického kontrastu AIMD6 vs Kontroly a u 10 genů v případě prognostického kontrastu AIMD6 vs AIM. Prediktivní diagnostická množina genů pro kontrast AIM vs Kontroly čítala 13 genů a v limma modelu byla pouze statisticky signifikantní na hladině statistické významnosti a = 0,10. Tuto množinu již nebylo možné dále redukovat pomocí PAM modelu.

Popis výsledků

Geny resp. transkripty uvedené v následujících tabulkách specifikují prediktivní diagnostickou a prognostickou množinu genů pro kontrast AIMD6 vs. AIM, které byly získány následujícím postupem: nejprve byla pomocí limma modelu („Linear Models for Microarray Data“, http://bioinf.wehi.edu.au/limma/) na úrovni celého lidského genomu (na Illumina čipech verze 2 bylo zmapováno celkem 25036 genů) identifikována množina statisticky (q-hodnota<0,05) i klinicky významných genů (|log₂-fold change|>l, tj. alespoň dvojnásobná změna intenzity genové exprese směrem nahoru nebo dolů). Tato množina byla následně redukována aplikací prediktivního PAM modelu (Prediction Analysis for Microarrays, http://www-stat.stanford.edu/-tibs/PAM/), navrženého k vyhledávání množin genů s prediktivními vlastnostmi v nezávislých výběrech. Výskyt opakovaných pozorování (tj. technických replikátů) u 7 pacientů byl na úrovni limma modelu ošetřen použitím smíšeného lineárního modelu pro korelovaná data. Sekvence sond jsou uvedeny v tabulce 5.

V Tabulce 4 je uvedena prediktivní množina genů identifikovaná v rámo i vynálezu, která se u pacientů s výskytem akutního infarktu myokardu jeví z hlediska genové exprese jako prognos45 tická ve smyslu zvýšeného rizika úmrtí v důsledku kardiovaskulárních komplikací, a to v krátkodobém časovém horizontu (tj. do 6 měsíců od okamžiku výskytu srdeční příhody). Jedná se o sestavu 10 genů (gen CLYBL byl identifikován ve dvou transkriptech, Illumina ID 3180392 a 6550437), jejichž expresní intenzity, stanovené do čtyřiadvaceti hodin od okamžiku primárního výskytu akutní srdeční události, se ve skupinách pacientů zemřelých v období 6 měsíců po srdeční příhodě (AIMD6) a skupině pacientů přežívající výskyt srdeční události po dobu sledování 6 měsíců (AIM) statisticky i klinicky významně odlišovaly. Tato množina exprimovaných genů charakterizuje zvýšenou stresovou zátěž organismu, která měla za následek úmrtí pacienta v průběhu šestiměsíčního sledování od okamžiku výskytu akutního infarktu myokardu v důsledku kardiovaskulárních komplikací.

-20CZ 303458 B6

Uvedená množina 10 genů byla stanovena na základě celogenomové analýzy genové exprese vzorků lidské venózní krve odebrané z těla pacientů s primárním výskytem infarktu myokardu. Průměrné hodnoty logaritmované genové exprese pri základu 2 v populacích AIMD6 a AIM jsou uvedeny v tabulce 4. Simultánně zvýšené hodnoty intenzit genové exprese 3 genů (ADORA3,

ERLÍN1 a FLT3) a současně hodnoty snížené u 7 genů/transkriptů (ReíSeq_ID „M97723“, CLYBL, TCEA3, RefSeqJD „BC070337“, HSD17B8, AXIN2 a RefSeqJD “CR596519“) indikují příslušnost pacienta k rizikové populaci AIMD6. Obecně naznačují zvýšené riziko úmrtí pacienta v krátkodobém časovém horizontu (do 6 měsíců od okamžiku výskytu srdeční příhody) v důsledku výskytu akutního infarktu myokardu. Diagnóza na základě exprese uvedených genů, stanovené jak je popsáno v tomto vynálezu, by měla implikovat zvýšenou post-traumatickou léčebnou péči o tyto pacienty, jejichž prognóza je z hlediska přežití v krátkodobém časovém horizontu od okamžiku výskytu srdeční příhody statisticky i klinicky významně méně příznivá.

Tabulka 4: Prediktivní prognostická množina genů pro kontrast AIMD6 vs AIM

Illumina ID	Název / Lokus genu	RefSeqJD	Průměrná exprese	togjFC	q- hodnota	Pravděpod. Diff. Expr.
4730669	ADORA3	NM 020683.5	6,33	1,78	0,0490	0,852
6940246	(M97723)	M97723	7,05	-1,52	0,0130	0,997
1690309	ERLIN1	NM 006459.2	6,79	1,19	0,0490	0,823
3180392	CLYBL	NM 206808J	6,79	-1,08	0,0234	0,978
5490634	TCEA3	NM 003196.1	7,09	-1,66	0,0381	0,938
6760670	(BC070337)	BC070337	10,81	-1,42	0,0490	0,805
6550437	CLYBL	NM 206808.1	6,53	-1,18	0,0130	0,988
3130019	HSD17B8	NM 014234.3	7,30	-1,06	0,0490	0,818
1230333	FLT3	NM 004119.1	6,04	1,14	0,0490	0,838
5090368	AXIN2	NM 004655.2	7,09	-1,49	0,0388	0,932
670041	(CR596519)	CR596519	11,51	-1,45	0,0490	0,828

Illumina ID... Illumina identifikátor genii

RefSeqJD ... NCB1 Reference Sequence ID (“Accession number”)

Průměrná exprese... Průměrná hodnota intenzit genové exprese ve spojeném souboru log₂FC... Dvojkový logaritmus adjustovaného podílu intenzit ve skupinách AIMD6 a Kontrol q-hodnota ... Storeyho adjustace dosažené hladiny významnosti pro mnohonásobná porovnávání (Storey JD, Tibshirani R, Statistical signifícance for genome wide studies. Proč Nati Acad Scí U S A. 2003 Aug 5; 100(16):9440-5. Epub 2003 Jul 25. PubMed PMID: 12883005; PubMed Central P.VC1D: PMC 170937.) Pravděpod. Diferenciální Exprese... Pravděpodobnost, že sledovaný gen je skutečně diferenciálně exprimován

-2ΓCZ 303458 B6

Tabulka 5: Sekvence sond prediktivní prognostické množiny genů pro kontrast AIMD6 vs AIM

Illumina ID	Sekvence sondy	Definice
4730669	GTAGTCAGAGGAGCTAT GATAGACCACACCCAA GCAAGGCTGCCCTCAAA	Lidský receptor adenosínu A3, transkripČní varianta 1 (Homo sapiens adenosine A3 receptor (ADORA3), transcript variant 1), mRNA.
6940246	GTACCGTCAGCAACCTG GACAGAGCCTGACACTG ATCGCAACTGCAAATC	Lidský T-buněčný receptor (Human T-cell receptor (V beta 4.1-variant, J beta 2J, C beta 2)), mRNA.
1690309	TGTTGCCCCAAAGTGAT GGCCCTGGAGGCGGGG CTGAGGAACAGGGAAA T	Lidský ER lipidový nosič 1 (Homo sapiens ER lipid raft associated 1 (ERLIN1)), mRNA.
3180392	AGGGTATTGAAGCTGCA GAGGGATCAACTTGTGC TTGCCAGAGGACGCCA	Lidská beta-podobná citrátová lyáza (Homo sapiens citráte lyase beta iike (CLYJBJL)), mRNA.
5490634	ACCAGGTGCAGACACG CAGTGCTGATGAGCCCA TGACTACCTTTGTCTTA	Lidský trans kripční prodlužovací faktor A, 3 (Homo sapiens transcription elongation factor A (Sil), 3 (TCEA3)), mRNA.
6760670	AGTAAACCCATATATCC AGAACCCTGACCCTGCC GTGTACCAGCTGAGAG	Lidský T-buněčný receptor, alfa lokus (Homo sapiens T cell receptor alpha locus), mRNA (cDNA cloně MGC:88342 IMAGE:30352166), complete cds.
6550437	ŤCGACATGCCATTACTG AAGCAGGCCCAGAACA CTGTTACGCTTGCCACC	Lidská beta-podobná citrátová lyáza (Homo sapiens citráte íyase beta like (CLYBL)), mRNA.
3130019	CCGATGGGACACTTGGG GGACCCTGAGGATGTGG CAGATGTGGTCGCATT	Lidská hydroxysteroidní (17-bty) dehydrogenáza 8 (Homo sapiens hydroxysteroid (17-beta) dehydrogenase 8 (HSD17B8)), mRNA.
1230333	GGATTTGGGGCTACTCT CTCCGCAGGCTCAGGTC GAAGATTCGTAGAGGA	Lidská fms-příbuzná tyrosinová kináza 3 (Homo sapiens fms-related tyrosine kinase 3 (FLT3)), mRNA.
5090368	ACAGTACCTGTACCTGC ACGGTCACCCGCTCCGT GTGTCGCCCTATATTG	Lidský axin 2 (Homo sapiens axin 2 (conductin, axil) (AXIN2)), mRNA.
670041	AAACCCGTCACCCAGAT CGTCAGCGCCGAGGCCT GGGGTAGAGCAGGTGA	Lidský cDNA klon placentálního lůžka (fulllength cDNA cloně CS0DT056YK21 of Placenta Cot 25-normalized of Homo sapiens (human)).

-22CZ 303458 B6

Tabulka 6: Průměrné hodnoty logaritmovaných genových expresí prediktivní prognostické množiny genů pro kontrast AIMD6 vs AIM

Illumína ID	Název / Lokus Genu	Průměrná Exprese
AIMD6	AIM**’
4730669	AD0RA3	7,66	6,30
6940246	(M97723)	6,13	7,26
1690309	ERLINI	7,89	6,81
3180392	CLYBL	5,93	6,84
5490634	TCEA3	5,97	7,08
6760670	(BC070337)	9,74	10,87
6550437	CLYBL	5,75	6,55
3130019	HSD17B8	6,49	7,31
1230333	FLT3	6,77	5,99
5090368	AXIN2	6,33	7,15
670041	(CR596519)	10,72	11,57

(*) Referenční hladina intenzity genové exprese pro posouzení zvýšeného kardiovaskulárního rizika

Porovnáním hladin genové exprese ve skupinách AIMD6 a ΑΪΜ bylo nalezeno celkem 10 genů, z nichž u 3 byly hladiny genové exprese zvýšeny a u 7 sníženy. Tři z těchto 10 genů lze charakterizovat jako molekuly s enzymatickou aktivitou - CLYBL (citrátová lyáza Beta-like), FLT3 (FMS-příbuzná tyrosinová kináza 3), která může mít vliv na růst hematopoetických kmenových a progenitorových buněk, HSD17B8 (hydroxysteroidová 17-beta dehydrogenáza 8). Na myším io modelu byl demonstrován regulační vliv HSD17B8 na koncentrace biologicky aktivních estrogenů a androgenů. Další 3 geny byly zařazeny do kategorie molekul receptorové povahy. Jedná se o struktury RefSeq-ID M97723.1 (popis viz kontrast AIM vs Kontroly), ADORA3 (popis viz kontrast AIMD6 vs Kontroly), RefSeq-ID BC070337.1, popisovaný jako T-buněěný receptor, alfa lokus. Zbývající 4 geny můžeme charakterizovat jako geny kódující některé regulační proteiny - ERLINI (popis viz kontrast AIMD6 vs Kontroly), TCEA3 (tran skřípění elongační faktor A (Sil) 3). Jedná se o faktor účastnící se transkripce a bývá popisován jako důležitý protein pro vazbu s RNA polymerázou II, dále AXIN2 (AXIN Inhibitor 2), hrající důležitou roli při stabilizaci beta-kateninu. Z dostupných pramenů je v leukocytech modelového organismu AXIS2 inhibitor obtížně detekovatelný RefSeq-IS CR596519.1, mRNA struktura o délce 1284 bp a lokalizovaná na dlouhých raméncích chromosomu 7.

Výsledky bootstrap studie pro ověření prediktivních vlastností vybraných genových sekvencí

Prediktivní vlastnosti transkriptů byly z hlediska nezávislých výběrů posuzovány pomocí bootstrap studie zaměřené na hodnocení senzitivity (SE) a specificity (SP) klasifikace na základě PAM modelu. Bootstrap studie zahrnovala analýzu 1000 náhodných výběrů pořízených sopakováním zodpovídajících populací o témže rozsahu. Výsledky studie jsou uvedeny v Tabulce 7.

Tabulka 7: Výsledky bootstrap studie na posouzení senzitivity a specificity PAM klasifikačního testu v nezávislých výběrech.

Kontrast	Výsledky PAM klasifikace (počet transkriptů použitých pro klasifikaci)
AIMD6 vs AIM	SE- 0,89, SP= 0.95 (11 transkriptů)

Uvedená množina genů se vyznačuje vysokou senzitivitou i specificitou klasifikačního testu na 35 základě PAM modelu.

Claims (3)

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob identifikace osob se zvýšeným genetickým rizikem úmrtí v důsledku kardiovaskulárních komplikací do 6 měsíců od okamžiku výskytu akutního infarktu myokardu, vyznačený tím, že se v biologickém vzorku odebraném z těla pacienta, do 24 hodin od výskytu

5 akutního infarktu myokardu, stanoví intenzita exprese sady genů a genetických lokusů.

Název i Lokus genu SEQ ID No. Referenční hodnota intenzity exprese (nízké riziko) stanovená na celogenomovém / oligonukleotid ovém čipu Min. odchylka od ref. hodnot}' exprese, značící zvýšené riziko ADORA3 1 6,30 + 1 (M97723) 2 7,26 -1 ERLIN1 3 6,81 + 1 TCEA3 5 7,08 -1 (BC070337) 6 10,87 -1 CLYBL 4 6,55 -1 HSD17B8 7 7,31 -1 FLT3 8 5,99 + 1 AXIN2 9 7,15 -1 (CR596519) 10 n,57 -1

a jejich logaritmovaná hodnota při základu 2 se srovná s referenční hodnotou intenzity exprese, přičemž odchylka od referenční hodnoty rovná alespoň minimální odchylce u všech genů a genetických lokusů dané sady značí zvýšené riziko.

2. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, že biologickým vzorkem odebraným z těla pacientajsou buňky periferní krve.

3. Oligonukleotidový čip pro identifikaci osob se zvýšeným genetickým rizikem úmrtí v 15 důsledku kardiovaskulárních komplikací do 6 měsíců od okamžiku výskytu akutního infarktu myokardu, vyznačený tím, že obsahuje právě sondy hybridizující s DNA či RNA sady genů či genetických lokusů:

Název / Lokus genu SEQ ID No. ADORA3 1 (M97723) 2 ERLIN1 3 CLYBL 4 TCEA3 5 (BC070337) 6 CLYBL 4 HSD17B8 7 FLT3 8 AXIN2 9 (CR5965I9) 10

14 stránek sekvencí

20 +

3 výkresy

-24CZ 303458 B6 sequence listing divisional 2.ST25