CZ303405B6 - Zpusob identifikace osob se zvýšeným genetickým rizikem výskytu infarktu myokardu - Google Patents

Abstract

Rešení popisuje zpusob identifikace osob se zvýšeným genetickým rizikem výskytu akutního infarktu myokardu, a s nízkým rizikem následného úmrtí v dusledku kardiovaskulárních komplikací v casovém horizontu do 6 mesícu od okamžiku výskytu srdecní príhody, spocívající v tom, že se v biologickém vzorku odebraném z tela pacienta stanoví intenzita exprese genu a genetických lokusu OLIG2, VNN3, MS4A3, CEBPE, FOS, LIPA, LOC645649, (M97723), EPAS1, CLINT1, MYCT1, VPS29 a LOC130951. Logaritmovaná hodnota intenzity exprese pri základu 2 se následne srovná s referencní hodnotou intenzity exprese, pricemž odchylka od referencní hodnoty rovná alespon minimální odchylce u všech uvedených genu a genetických lokusu znací zvýšené riziko.

Description

Předkládaný vynález se týká způsobu identifikace osob v české populaci, které vykazují zvýšené genetické riziko výskytu akutního infarktu myokardu, se zřetelem k jejich přežití v krátkodobém časovém horizontu od doby výskytu srdeční události. Identifikace je prováděna na základě stanovení profilu genové exprese vybraných genů lidského genomu.

io

Dosavadní stav techniky

Infarkt myokardu a cévní mozková příhoda jsou dvěma nejzávažnějšími klinickými projevy t5 aterosklerózy. Riziko rozvoje těchto onemocnění se odhaduje na základě známých rizikových faktorů. Rozsah onemocnění je v současnosti zjišťován řadou vyšetření, jakými jsou např. scintigrafie, magnetická rezonance, katetrizační vyšetření. Každé z těchto vyšetření má však i svá omezení, např. radiační zátěž nebo invazivitu vyšetření. Aterosklerotické pláty jsou zkoumány na buněčné i molekulární úrovni, včetně sledování buněk v cirkulaci jako odpovědi na zánětlivý pro20 ces v cévách.

Identifikace genů pomocí molekulárně biologických metod znamenala v posledních letech výrazný posun nejen v odhalení příčin některých závažných, život ohrožujících, onemocnění člověka (např. některé onkologické diagnózy, závažné dědičné poruchy metabolismu člověka či další po25 ruchy neuromuskulámího gastrointestinálního a oběhového systému, včetně aterosklerózy atd.), ale v neposlední řadě také významně rozšířila naše znalosti o vzniku a rozvoji akutního infarktu myokardu (AIM) (Yukihiro Hojo, Uichi Ikeda, Yun Zhu, Motoi Okada, Shuichi Ueno, Hiroschí Arakawa, Hideyuki Fujikawa, Taka-aki Katsuki, and Kazuyuki Shimada. Expression of vascular endothelial growth factor in patients with acute myocardial infarction. J Ám Coll Cardiol,

35(4):968-973, March 2000; Merry L. Lindsey. MMP Induction and Inhibition in Myocardial

Infarction. Heart Failure Reviews, 9(1):7-19, January 2004). Detailnějším pochopením jednotlivých stadií IM se dostávají do popředí i otázky možnosti prevence a účinnější léčby onemocnění. S rozvojem moderních technologií se molekulárně biologický výzkum obecně posouvá od klasického modelu odhalování konkrétních genetických lokusů, resp. genetických polymorfismů, působících poruchu jednoho genu ke snaze monitorovat polygenní a multifaktoriální poruchy Člověka pomocí genomických a expresních čipů, jejichž analýza v současnosti poskytuje komplexnější obraz onemocnění (Joseph S. Verducci, Vincent F. Melfi, Shili Lin, Zailong Wang, Saschwati Roy, and Chandan K. Sen. Microarray analysis of gene expression: considerations in data mining and statistical treatment. Physiological Genomics, 25(3):355 až 363, May 2006). Prede40 vším studium tzv. expresních čipů zažívá v lékařských vědách velký rozvoj, protože umožňuje posoudit mnoho genových transkriptů a jejich expresních variant najednou v kritickém stadiu onemocnění (multivarianční analýza, randomizační studie) (Lawrence W. Stanton, Lisa J. Garrard, Deborah Damm, Brett L. Garrick, Andrew Lam, Ann M. Kapoun, Qiang Zheng, Andrew A. Protter, George F. Schreiner, and R. Tyler White. Altered Pattems of Gene Expression in

Response to Myocardial Infarction. Circ Res, 86(9):939 až 945, May 2000; Matthew B. Lanktree and Robert A. Hegele. Gene-gene and gene-environment interactions: new insights into the preventin, detection and management of coronary artery disease. Genome medicine, 1(2):28, February 2009).

Recentní práce posledních 5 let se intenzivně zabývají z mnoha úhlů pohledu nejen expresními profily osob s aterosklerózou, ale také osob s ischemickou chorobou srdeční ve vztahu ke vznikajícím zánětlivým procesům v cévách (Gemma Satterthwaite, Sheila E. Francis, Kim Suvama, Stephen Blakemore, Chantelle Ward, Don Wallace, Martin Braddock, and David Crossman. Differential gene expression in coronary arteries fřom patients presenting with ischemic heart disease: further evidence fcr the inflammatory basis of atherosclerosis. American heart Journal,

- 1 CZ 303405 B6

150(3):488 až 499, September 2005), osob s ischemickou a neischemickou kardiomyopatií při srdečním selhání (Michelle M. Kittleson, Khalid M. Minhas, Rafael A, Irizarry, Shui Q. Ye, Gina Edness, Elayne Breton, John V. Conte, Gordon Tomaselli, Joe G. Garcia, and Joshua M. Hare. Gene expression analysis of ischemic and nonischemic cardiomyopathy: shared and distínct genes in the development of heart failure. Physiological genomics, 21(3):299 až 307, May 2005; Michelle M. Kittleson, Shui Q. Ye, Rafael, A. Irizarry, Khalid M. Minhas, Gina Edness, John V. Conte, Giovanní Parmigiani, Leslie W. Miller, Yingjie Chen, Jennifer L. Halí, Joe G. Garcia, and Joshua M, Hare. Identification of a gene expression profile that differentiates between ischemic and nonischemic cardiomyopathy. Circulation, 110(22):3444 až 3451, November 2004) a dále io také osob s poškozením koronárních cév (James A. Wingrove, Susan E. Daniels, Amy J. Sehnert, Whittemore Tingley, Michael R. Elashoff, Steven Rosenberg, Lutz Buellesfeld, Eberhard Grube, L. Kristin Newby, Geoffrey S. Ginsburg, and William E. Kraus. Correlation of Peripheral-Blood Gene Expression With the Extent of Coronary Artery Stenosis / CLINICAL PERSPECTIVE. Circulation: Cardiovascular Genetics, 1(1):31 až 38, October 2008; Ramachandran S. Vasan and

Calum A. MacRae. A dream, a joumey, and a promise: the inauguration of Circulation: Cardiovasculare Genetics. Circulation. Cardiovascular genetics, 1(1):1 až 2, October 2008; Daphne, Maroeska M. Rovers, Diederick E. Grobbee, Joannes, J. Marx, Jill Waalen, Christina Ellervik, Berge G. Nordestgaard, John K. Olynyk, Peter R. Mills, James Shepherd, Bernard Grandchamp, Jolanda M. Boer, Calogero Caruso, Marcello Area, Beat J. Meyer, and Yvonne T. van der

Schouw. Mutations in the HFE gene and cardiovasculars disease risk: an individual patient data meta-analysis of 53 880 subjects. Circulation Cardiovascular genetics, 1(1):43 až 50, October 2008).

Nárůst četnosti vědeckých prací v roce 2009, zabývajících se akutním infarktem myokardu, uka25 zuje nejen narůstající zájem o tuto problematiku, ale také závažnost studovaného tématu (Kahraman Tanriverdi and Jane E. Freedman. Blood and Cardiovascular Disease. Circulation: Cardiovascular Genetics, 1(1):7-9, October 2008). Také další vědecké práce hledají v poslední době příčinné vztahy mezi projevy některých genů a vznikem akutního infarktu myokardu (AIM). To, že se jedná o komplexní proces, zahrnující celou řadu genů či pouze jejich Částí (polymorfhí mís30 ta), je všeobecně znám. Jsou popsány polymorfismy ve struktuře endoteliálního růstového faktoru, diskriminující pacienty s AIM, u nichž se vyvinulo srdeční selhání (Panagiotis Douvaras, Dionisios G., Antonatos, Kiriaki Kekou, Sotirios Patsilinakos, George Chouliaras, Apostolos Christou, Anastasios Andrikou, and Emmanuel Kanavakis. Association of VEGF gene polymorphisms with the development of heart failure in patients after myocardíal infaretion. Cardio35 logy, 114(1):11 až 18, 2009).

Je popsán vliv akutní koronární okluze na uvolňování ateriálního natriuretického peptidu, který působí na vasodílataci, natriurézu a zánětlivou odpověď, čímž zvyšuje rozsah infarktu myokardu a mortalitu (Aiilyan K. Houng, Ráchel A. McNamee, Attila Kemer, Pallavi Sharma, Almois

Mohamed, Jonathan Tronolone, and Guy L. Reed. Atrial natriuretic peptide inereases inflammation, infaret size, and mortality after experimental coronary occlusion. American Journal of physiology. Heart and circulatory physiology, 296(3):H655 až H661, March 2009). Popisována je rovněž exprese kininových a jiných receptorů (June Yun, Michael J. Zuscik, Pedro GonzalesCabrrea, Dan F. McCune, Sean A. Ross, Robert Gaivin, Michael T. Piascik, and Dianne M.

Perez. Gene expression profiling of alpha( 1 b)-adrenergic receptor-induced cardiac hypertrophy by oligonucleotide arrays, Cardiovascular research, 57(2):443 až 455, February 2003), které podporují aktivaci cirkulujících mononukleárů u pacientů s akutním koronárním syndromem (AKS).

Zmčny nalézané v extracelulámí matrix jsou určující pro myokardiální remodelaci po IM. Mohou být významným faktorem pro zánětlivou odpověď a mohou přispívat ke stabilizaci a kompenzatomím mechanizmům pro udržení srdečního výdeje. Ovlivňují též angiogenezi, proliferaci a diferenciaci buněk (Fabio D'Aguiar D. Mataveli, Sang Won W. Han, Helena Bonciani B. Ňader, Aline Mendes, Rose Kanishiro, Paulo Tucci, Antonio Carlos C. Lopes, Jose Carlos Costa C.

Baptista-Silva, Ana Paula Cleto P. Marolla, Leonardo Pinto P. de Carvalho, Priscila Martins

-2CZ 303405 B6

Andrade M. Denapoli, and Maria Aparecida de Silva A. Pinhal. Long-term effects for acute phase myocardial infarct VEGF 165 gene transfer cardiac extracellular matrix remodeling. Growth factors (Chur, Switzerland), 27(1):22-31, February 2009). Objevují se i studie zaměřené na hledání konkrétních polymorfismů ve struktuře DNA, které by mohly mít přímou souvislost s vývojem ischemické choroby srdeční (C. Federici, N. Botto, S. Manfředi, A. Rizza, M. Fiandra, and M. Andreassi, Relation of Increased Chromosomal Damage to Future Adverse Cardiac Events in Patients With Known Coronary Artery Diease. The American Journal of Cardiology, 102(10):1296 až 1300, November 2008).

io Recentní molekulárně genetické (expresní) studie jsou prováděny např. na desítkách osob s chronickým srdečním selháním (Cappuzzello C., Napolitano M., Arcelli D., Melillo G., Melchionna R., DiVito L., Karlini D., Silvestři L., Brugaletta S., Liuzzo G., Crea F., Capogrosso M. C.: Gene expression profiles in peripheral blood mononuclear cells of chronic heart failure patients, Physiol. Genomics, 2009, 38:233 až 240), na pacientech s onemocněním koronárních artérií (Meier P., Antonov J., Zbinden R., Kun A., Zbinden S., Gloekler S., Delorenzi M., Maggi R., Seiler C.: Non-invasive geen-expression-based detection of well-developed collateral function in individuals with and without coronary artery disease, Heart, 2009, 95:900 až 908; Erdmann J., Grosshennig A., Braund P. S., et al.: New susceptibility locus for coronary artery disease on chromosome 3q22.3, Nat. Genet., 2009, D01:10.1038/ng.307; Tregouet D. A., Konig I. R.,

Erdmann J., et al.: Genome-wide haplotype association study identifies the SLC22A3-LPAL2LPA gene cluster as a risk locus for coronary artery disease, Nat Genet, 2009, DOI:10.1038/ng.314) či na sekrečním materiálu osob s chronickou ischémií (Józefa Dabek, Aleksander Owczarek, Zbigniew Gasior, Rafal Ulczok, Mariusz Skowerski, Andrzej Kulách, Urszula Mazurek, and Andrzej Bochenek. Oligonucleotide microarray analysis of genes regulating apoptosís in chronically ischemic and postinfarctíon myocardium. Biochemical genetics, 46(56):241 až 247, June 2008).

Několik vědeckých týmů v čele s mezinárodním konsorciem pro genetiku infarktu myokardu (Myocardial Infarction Genetics Consortium, http://www.nature.com/ng; David Seo, Geoffřey S.

Gainsburg, and Pascal J. Goldschmidt-Clermont. Gene Expression Analysis of Cardiovascular Diseases: Novel Insights Into Biology and Clinical Applications. J. Am. Coll Cardiol, 48(2):227 až 235, July 2006; David Seo, Tao Wang, Holly Dressman, Edward E. Herderick, Edwin S. Iversen, Chunming Dong, Korkut Vata, Carmelo A. Milano, Fabio Rigat, Jennifer Pittman, Joseph R. Nevins, Mike West, and Pascal J. Goldschmidt-Clermont. Gene Expression Pheno35 types of Atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vose Biol, 24(10):1922 až 1927, October 2004) se zabývá genetickými asociačními studiemi ve vztahu k infarktu myokardu (Iris M. Heid, Eva Boes, Martina Mtiller, Barbara Kollerits, Claudia Lamina, Stefan Coassin, Christian Gieger, Angela Dóring, Norman Klopp, Ruth Frikke-Schmidt, Anně Tybjasrg-Hansen, Anita Brandstátter, Andreas Luchner, Thomas Meitinger, Wichmann, and Florian Kronenberg. Genome40 Wide Association Analysis of High-Density Lipoprotein Cholesterol in the Population-Based KORÁ Study Sheds New Light on Intergenic Regions / CLINICAL PERSPECTIVE. Circulation: Cardiovascular Genetics, 1(1):10 až 20, October 2008; Gudbjartsson D. F., Bjomsdittir U.S., Halapi E., et al.: Sequence variants affecting eosinophil numbers associate with astma and myocardial infarction, Nat. Genet. 2009, DOI: 10.1038/ng.323; Ozaki K., Sáto H., Inoue K., et al.; SNPs in BRAP associated with risk of myocardial infarction in Asian population, Nat. Genet., 2009, DOI.T0.1038/ng.326).

Snaha včas predikovat nastupující příznaky infarktu myokardu (postupně nastupující stres vyvíjející se až do šoku) je dnes řešena klinickou diferenciální diagnostikou, funkčními testy, resp. staso drnovým měřením základních biochemických markérů pro AIM. Toto užívané schéma diagnostiky je používáno (u pacienta při první události) bez jakékoliv možnosti monitorovat (predikovat) celkový stav organismu v období před AIM. Přesnějším charakterizováním základního expresního profilu pacienta přežívajícího i nepřežívajícího akutní stadium infarktu myokardu a jeho porovnáním s vybranými osobami kontrolního souboru české populace, se otevírá do budoucna reálná možnost průběžného, ekonomicky dostupného sledování osob přežívajících infarkt myo-3CZ 303405 Β6 kardu a jeho porovnáním s vybranými osobami kontrolního souboru české populace, se otevírá do budoucna reálná možnost průběžného, ekonomicky dostupného sledování osob přežívajících infarkt myokardu (období do 3-6 měsíců po první a další události).

Pokusy o expresní analýzu a průběžné monitorování nejrůznějších, především ale nádorových, onemocnění člověka byly již učiněny. Jsou dnes připravovány nejrůznější selektivní expresní sady genů, které charakterizují nejen aktuální stav organismu, ale také mohou monitorovat úspěšnost a adekvátnost léčby (David T. Miller, Paul M. Ridker, Peter Libby, and David J. Kwiatkowski. Atherosclerosis: The Path From Genomics to Therapeutics. J Am Coll Cardiol, 49( 15): 1589 až 1599, Apríl 2007). Tyto snahy jsou zřejmé v posledních letech i v oblasti diagnostiky některých kardiovaskulárních poruch člověka (P. Meier, J. Antonov, R. Zbinden, A. Kuhn, S. Zbinden, S. Gloekler, M, Delorenzi, R. Jaggi, and C. Seiler. Non-invasive geneexpression-based detection of well-developed colateraí function in individuals with and without coronary artery disease. Heart, 95(11):900 až 908, June 2009; Józefa Dabek, Aleksander Owczarek, Zbigniew Gasior, Rafal Ulczok, Mariusz Skowerski, Andrzej Kulách, Urszula Mazurek, and Andrzej Bochenek. Oligonucleotide microarray analysis of genes regulating apoptosis in chronically ischemic and postinfarction myocardium. Biochemical genetics, 46(5-6):241 až 247, June 2008; Claudia Cappuzzello, Monica Napolitano, Diego Arcelli, Guido Melillo, Roberta Melchionna, Luca Di Vito, Daniele Carlini, Lorena Silvestři, Salvátore Brugaletta, Giovanna Liuzzo, Filippo Crea, and Maurizio C. Capogrossi. Gene expression profiles in peripheral blood mononuclear cells of chronic heart failure patients. Physiological genomics, 38(3):233 až 240, August 2009), dosud však není známa studie snažící se predikovat prognózu pacienta s AIM.

V posledních letech celosvětově vzrůstající prevalence kardiovaskulárních chorob člověka motivuje stále intenzivněji vědeckou veřejnost k hledání nových strategií diagnostiky a léčby (James A. Wingrove, Susan E. Daniels, Amy J. Sehnert, Whittemore Tingley, Michael R. Elashoff, Steven Rosenberg, Lutz Buellesfeld, Eberhard Grube, L. Kristin Newby, Geoffrey S. Ginsburg, and William E. Kraus. Correlation of Peripheral-Blood Gene Expression With the Extent of Coronary Artery Stenosis / CLINICAL PERSPECTIVE. Circulation: Cardiovascular Genetics, 1(1):31 až 38, October 2008; Peter R. Sinnaeve, Mark P. Donahue, Peter Grass, David Seo, Jacky Vonderscher, Salah-Dine D. Chibout, William E. Kraus, Michael Sketch, Charlotte Nelson, Geoffrey S. Ginsburg, Pascal J. Goldschmidt-Clermont, and Christopher B. Granger. Gene expression pattems in peripheral blood correlate with the extent of coronary artery disease. PloS orte, 4(9), 2009; Ruby C. Y. Lin, Kate L. Weeks, Xiao-Ming Gao, Rohan Β. H. Williams, Bianca C. Bemardo, Helen Kiriazis, Vance B. Matthews, Elizabeth A. Woodcock, Russell D. Bouwman, Janelle P. Mollica, Helen J. Speirs, lan W. Dawes, Roger J. Daly, Tetsuo Shioi, Seigo Izumo, Mark A, Febbraio, Xiao-Jun Du, and Julie R. McMullen. Pi3k(pl lOalpha) protects against myocardial infarction-induced heart failure: Identification of pi3k-regulated mima and mma. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 30(4):724 až 732, Apríl 2010; Orfeas Liangos, Sophie Domhan, Christian Schwager, Martin Zeier, Peter E. Huber, Francesco Addabbo, Michael S. Goligorsky, Lynn Hlatky, Bertrand L. Jaber, and Amir Abdollahi. Whole blood transcriptions in cardiac surgery identifies a gene regulátory network connecting ischemia reperfusion with systemic inflammation. PloS orte, 5(10), 2010) a využívání nových technologií, jakými jsou na příklad meta-analýzy velkých souborů studovaných osob či tzv. GWAS (Genome-wide association studies) studii (John P. A. Ioannidis. Prediction of Cardiovascular Disease Outcomes and Established Cardiovascular Risk Factors by Genome-Wide Association Markers / CLINICAL PERSPECTIVE, Circulation: Cardiovascular Genetics, 2(1):7 až 15, February 2009; Jeanette Erdmann, Patrick Linsel-Nitschke, and Heribert Schunkert. Genetic causes of myocardial infarction: new insights from genome-wide association studies. Deutsches Árzteblatt International, 107(40):694 až 699, October 2010).

Výsledky rozsáhlé GWAS studie (Myocardial Infarctin Genetics Consortium, Sekar Kathiresan, Benjamin F. Voight, Shaun Purcell, Kiran Musunuru et al. Genome-wide association of earlyonset myocardial infarction with single nucleotíde polymorphisms and copy number variants.

-4CZ 303405 B6

Nátuře genetics, 41(3):334 až 341, March 2009) potvrdily asociaci několika genů s ranným výskytem akutního infarktu myokardu, z nichž některé byly též potvrzeny analýzami našich dat. Jedná se především o gen PHACTR1 (fosfatáza a regulátor aktinu 1), který se ve srovnání s obecnou českou populací ukazuje na základě našich dat jako prediktivní u pacientů, kteří z kardio5 vaskulámích příčin zemřeli v průběhu 6-měsíčního sledování po primární srdeční příhodě, dále též gen MRPS6 (mitochondriální ribozomální protein), jehož varianty MRPL9, MRPL39, MRPL48, MRPS33 a MRPS30 byly statisticky významné také v našich datech, nikoliv však klinicky a neprosadily se do množin genů s prediktivními vlastnostmi. Nejsou proto uváděny v našich konečných výsledcích. Varianty WDR57, WDR61 a WDR75 genu WDR12 identifikovanéio ho v této publikaci byly podobně statisticky, nikoliv však klinicky významné v našich datech. Naopak geny CDKN2A, CDKN2B identifikované v souvislosti s incidencí akutního infarktu myokardu ve výše zmíněné publikaci a dále např. v publikaci autorů Anna Helgadottir, Gudmar Thorleifsson, Andrei Manolescu, Solveig Gretarsdottir, Thorarinn Blondal, Aslaug Jonasdottir, Adalbjorg Jonasdottir, Asgeir Sigurdsson, Adam Baker, Amar Palsson, Gisli Masson, Daniel F.

Gudbjartsson, Kristinn P. Magnusson, Karl Andersen, Allan I. Levey, Valgerdur M. Backman, Sigurborg Matthiasdottír, Thorbjorg Jonsdottir, Stefan Palsson, Helga Einarsdottir, Steinunn Gunnarsdottir, Amaldur Gylfason, Viola Vaccarino, W. Craig Hooper, Muredach P. Reilly, Christopher B. Granger, Harland Austin, Daniel J. Rader, Svati H. Shah, Arshed A. Quyyumi, Jeffrey R, Gulcher, Gudmundur Thorgeirsson, Unnur Thorsteinsdottir, Augustine Kong, and Kari

Stefansson. A common variant on chromosome 9p21 affects the risk of myocardial infaretion. Science (New York, N Y), 316(5830):1491-1493, June 2007, nebyly v našich datech v souvislosti s výskytem akutního infarktu myokardu zjištěny.

Recentní publikace z roku 2010 naznačují stoupající zájem o aplikaci moderních metod pro stu25 dium kardiovaskulárního systému člověka, mezi něž se zařazuje i technologie celogenomové expresní analýzy. Tato technologie umožňuje získávat informace o okamžité odpovědi organismu na akutní stadia závažných, život ohrožujících, onemocnění, jakými jsou např. mrtvice či infarkt myokardu. Dovoluje nám současně i nový pohled na desetiletí známý proces. Využitím mononukleámích buněk periferní krve jako zkoumaného materiálu se naskýtá reálná možnost získat expresní profily ze snadno a rutinně dostupného biologického materiálu a z těchto profilů poté vytipovat ty signifikantní hladiny genové exprese, které by mohly charakterizovat určitá stadia onemocnění. Takto získaná data se dají v budoucnu použít jako základ pro zlepšení diagnostického komfortu pacienta. Ze studií publikovaných na konci roku 2009 a v průběhu roku 2010 lze zmínit práce, zabývající se úlohou hladin HDL a LDL frakcí cholesterolu či celkového choles35 terolu ve vztahu ke genetické predispozici kardiovaskulárních chorob (Anna C. Calkin and Peter Tontonoz. Genome-Wide Association Studies Identify New Targets in Cardiovascular Disease. Science Translational Medícine, 2(48):48 až 94, 2010; Rong Yang, Lin Li, Sara Bretschger B. Seidelmann, Gong-Qing Q. Shen, Sonia Sharma, Shaoqi Rao, Kalil G. Abdullah, Kenneth G. Mackinlav, Robert C. Elston, Qiuyun Chen, Eric J. Topol, and Qing Kenneth K. Wang. A geno40 me-wide linkage scan identifies multiple quantitative trait loci for HDL-cholesterol levels in families with premature CAD and MI. Journal of lipid research, 51(6): 1442 až 1451, June 2010), nebo práce snažící se predikovat významné geny exprimující se v akutním stadiu mrtvice (Boryana Stamova, Huichum Xu, Glen Jickling, Cheryl Bushnell, Yingfang Tian, Bradley P. Ander, Xinhua Zhan, DaZhi Liu, Renee Turner, Peter Adamczyk, Jane C. Khoury, Arthur Pancioli,

Edward Jauch, Joseph P. Broderick, and Frank R. Sharp. Gene Expression Profiling of Blood for the Prediction of Ischemic Stroke. Stroke, 41(10):2171 až 2177, October 2010).

Několik prací se v roce 2010 zabývalo hledáním genetických příčin či nejrůznějších nových biomarkerů ventrikulámí fibrilace, která bývá pozorována v akutním stadiu infarktu myokardu a může mít vliv na přežití pacienta (Connie R. Bezzina, Raha Pazoki, Abdennasser Bardai, Roos F. Marsman, Jonas S. de Jong, Marieke T. Blom, Brendon P. Scicluna, J. Wouter Jukema, Návin R. Bindrabam, Peter Lichtner, Ame Pfeufer, Nanette H. Bishopric, Dan M. Roden, Thomas Meitinger, Sumeet S. Chugh, Robert J. Myerburg, Xavier Jouven, Stefan Káab, Lukas R. Dekker, Hanno L. Tan, Michael W. Tanck, and Arthur A. Wilde. Genome-wide association study identi55 fies a susceptibility locus at 21q21 for ventricular fibrillation in acute myocardial infaretion.

-5CZ 303405 B6

Nátuře genetics, 42(8):688 až 691, August 2010; Feng Dong, Mazen Khalil, Matt Kiedrowski, Caitlin O'Connor, Erin Petrovic, Xiaorong Zhou, and Marc S. Penn. Critical role for leukocyte hypoxia inducible factor-lalpha expression in post-myocardial infaretion left ventricular remodeling. Circulation research, 106(3):601 až 610, February 2010; Yvan Devaux, Francisco Azuaje, Mélan ie Bausort, Céline Yvorra, and Daniel R. Wagner. Integrated protein network and microarray analysis to identity potential biomarkers after myocardial infaretion. Functional & Integrative genomics, 10(3):329 až 337, August 2010).

Do popředí zájmu se v posledním roce dostává i otázka, zda celkový stres organismu při akutní fázi infarktu myokardu nezhoršuje vlastní prognózu přežití (Jessica M. Berthiaume, Molly S. Bray, Tracy A. McElfřesh, Xiaoqin Chen, Salman Azam, Martin E. Young, Brian D. Hoit, and Margaret P. Chandler. The myocardial contractile response to physiological stress improves with high saturated fat feeding in heart failure. American Journal of physiology. Heart and circulatory physiology, 299(2), August 2010). Jsou hledány souvislosti mezi genetickými příčinami infarktu myokardu a chronickým onemocněním ledvin (Tetsuo Fujimaki, Kimihiko Kato, Kiyoshi Yokoi, Mitsutoshi Oguri, Tetsuro Yoshida, Sachiro Watanabe, Norifumi Metoki, Hidemi Yoshida, Kei Satoh, Yukitoshi Aoyagi, Yoshinori Nozawa, Genjiro Kimura, and Yoshiji Yamada. Association of genetic variants in SEMA3F, CLEC16A, LAMA3, and PCSK2 with myocardial infaretion in Japanese individuals. Atherosclerosis, 210(2):468 až 473, June 2010) či atherotrombózou (Luca Andrea A. Lotta. Genome-wide association studies in atherothrombosis. European Journal of internal medicine, 21(2):74 až 78, Apríl 2010).

Studován byl rovněž vliv microRNA-molekul, které jsou popisovány jako negativní regulátory genové exprese a recentní studie naznačují, že mohou hrát významnou roli nejen v rozvoji infarktu myokardu, ale i u dalších kardiovaskulárních poruch člověka (Emanuela Bostjancic, Nina Zidar, and Damjan Glavac. MicroRNA microarray expression profiling in human myocardial infaretion. Disease markers, 27(6):255 až 268, 2009). Stále je diskutována biologická role interleukinu 1 ve vztahu k dyslipidémii a riziku vzniku infarktu myokardu (Bernard Keavney. The interleukin-1 cluster, dyslipidaemia and risk of myocardial infaretion. BMC medicine, 8(1):6+, January 2010).

Populačně charakteristický obraz rizikových genetických markérů je diskutován v řadě recentních publikací (Paul M. Ridker, Guillaume Pare, Alex N. Parker, Robert Y. Zee, Joseph P. Miletich, and Daniel· I. Chasman. Polymorphism in the CETP gene region, HDL cholesterol, and risk of future myocardial infaretion: Genomewide analysis among 18 245 initially healthy women from the Women's Genome Health Study. Circulation. Cardivascular genetics, 2(1):26 až 33, February 2009; Tetsuo Fujimaki et al. Association of genetic variants in SEMA3F, CLEC16A, LAMA3, and PCSK2 with myocardial infaretion in Japanese individuals, Atherosclerosis, 210(2):468 až 473, June 2010). Jsou studovány i další typy genetických variací (SNP-single nucleotide polymorphísms a CNV-copy number variations) ve vztahu ke vzniku a rozvoji infarktu myokardu (Myocardial Infaretion Genetics Consortium, Sekar Kathiresan, Benjamin F. Voight, Shaun Purcell, Kiran Musunuru et al. Genome-wide association of early-onset myocardial infaretion with single nucleotide polymorphísms and copy number variants. Nátuře genetics, 41 (3):334 až 341, March 2009).

V neposlední řadě je nutno zmínit také práce zabývající se infarktem myokardu na experimentálním zvířeti (Jessica M. Berthiaume et al. The myocardial contractile response to physiological stress improves with high saturated fat feeding in heart failure. American Journal of physilogy. Heart and circulatory physiology, 299(2), August 2010; Dongsheng Hong, Xiaowei Zeng, Wei Xu, Jing Ma, Yinghui Tong and Yan Chen. Altered profiles of gene expression in curcumintreated rats with experimentally induced myocardial infaretion. Pharmacological Research, 61(2):142 až 148, February 2010; Zongjin Li, Kitchener D. Wilson, Bryan Smith, Daniel L. Kraft, Fangjun Jia, Mei Huang, Xiaoyan Xie, Robert C. Robbins, Sanjiv S, Gambhir, Irving L. Weissman, and Joseph C. Wu. Functional and transcriptional characterization of human embryonic stem cell-derived endothelial cells for treatment of myocardial infaretion. PloS one,

-6CZ 303405 B6

4(12):e8443+, December 2009; Lisheng Zhang, Jessica J. Connelly, Karsten Peppel, Leigh Brian, Svati H, Shah, Sarah Nelson, David R. Crosslin, Tianyuan Wang, Andrew Allen, William E. Kraus, Simon G. Gregory, Elizabeth R. Hauser, and Neil J. Freedman. Anging-related atherosclerosis is exacerbated by arterial expression of tumor neerosis factor receptor-1: evidence from mouše models and human association studies. Human bíolecular Genetics, 19(14):2754 až 2766, July 2010; Lars Bochmann, Padmini Sarathchandra, Federica Moři, Enrique Lara-Pezzi, Domenico Lazzaro, and Nadía Rosenthal. Revealiing new mouše epicardial cell markers through transcriptimics. PloS one, 5(6), 2010). Přihláška vynálezu PV 2009-872 navrhuje stanovení prognózy pacientů v akutním stadiu primárního infarktu myokardu stanovením exprese alespoň jednoho ío genu Či genetického lokusu vybraného ze skupiny zahrnující TCRA, LOC650751, LOC650761,

PRR6 a TMEM98 ve vzorku periferní krve.

Níže popsaný vynález poskytuje sadu genů, která umožňuje stanovení prognózy s vyšší přesností a lepší klinickou shodou.

Podstata vynálezu

Předmětem předkládaného vynálezu je způsob identifikace osob v české populaci se zvýšeným 20 genetickým rizikem výskytu akutního infarktu myokardu a popřípadě se zvýšeným rizikem následného úmrtí v důsledku kardiovaskulárních komplikací do 6 měsíců od okamžiku výskytu akutního infarktu myokardu.

Podstata vynálezu spočívá v tom, že se v biologickém vzorku odebraném z těla pacienta stanoví 25 intenzita exprese sady genů a genetických lokusů:

Název / Lokus genu	RefSeq_lD	SEQ ID No.	Referenční hodnota intenzity exprese (nízké riziko výskytu AIM) stanovená na celogenomovém / oligonukleotidovém čipu	Min. odchylka od ref. hodnoty exprese, značící zvýšené riziko
OLIG2	NM 005806.2	1	6,88	-0,891
VNN3	NM 001024460.1	2	9,69	0,498
MS4A3	NM 006138.4	3	8,17	-0,635
CEBPE	NM 001805.2	4	7,13	-0,447
FOS	NM 005252.2	5	10,04	0,388
UPA	NM 000235.2	6	10,35	-0,373
LOC645649	XM 928663.1	7	7,85	0,286
(M97723)	M97723	8	6,92	0,382
EPAS1	NM 001430.3	9	6,75	-0,314
CLINT1	NM 014666.2	10	9,52	-0,246
MYCT1	NM 025107.1	11	5,43	-0,150
VPS29	NM 016226.2	12	10,64	-0,145
LOC130951	NMJ38804.2	13	5,20	-0,125

Postup stanovení míry genetického rizika spočívá v tom, že se změří intenzita genové exprese 30 v biologickém vzorku ajejí logaritmovaná hodnota při základu 2 se srovná s referenční hodnotou intenzity exprese uvedenou pro jednotlivé geny a genetické lokusy. V posledním sloupci tabulky je pro každý gen/lokus uvedena minimální odchylka od referenční hodnoty exprese, značící zvýšené riziko. Je třeba mít na paměti, že vypovídací hodnotu má sada jako celek, nikoliv jednotlivé geny/lokusy, a tedy pro naplnění kritéria zvýšeného genetického rizika je nutné, aby se u sledova-7CZ 303405 B6 ného pacienta hodnoty genové exprese lišily od hodnot referenčních alespoň o požadovanou hodnotu u všech genů/lokusů v sadě.

Biologickým vzorkem odebraným z těla pacienta mohou být například buňky periferní krve, kte5 ré jsou výhodné především pro minimální invazivitu získání potřebného materiálu.

V případě všech zde uváděných genů a genetických lokusů jsou míněny geny a genetické lokusy hybridizující s odpovídajícími sondami na celogenomových čipech Illumina. Sekvence DNA kódující mRNA uváděné v předkládané přihlášce jsou uváděny podle dostupných katalogů pouze pro informaci.

Exprese genů a genetických lokusů může být stanovena jakýmkoliv způsobem známým odborníkovi v daném oboru, například na celogenomovém nebo oligonukleotidovém čipu (čipová microarray analýza, např. i tiling čipy), RT-PCR a qPCR, Northern blot, RNA-Seq (RNA sekvenční zpracování, Whole Transcriptome Shotgun Sequencing), SAGE (mnohonásobná analýza genové exprese, seriál analysis of gene expression), FISH (fluorescenční in-situ hybridizace), využitím reportérových genů, analýzou ribonukleasové ochrany (Ribonuclease Protection Assay) či na úrovni exprese translatovaných proteinů metodou western blot, ELISA (enzymová imunoanalýza, enzyme-linked immunosorbent assay), využitím GFP (zelený fluorescenční protein, green fluorescent protein), průtokovou cytometrií či imunohistologicky.

Předmětem předkládaného vynálezu je dále oligonukleotidový čip pro identifikaci osob se zvýšeným genetickým rizikem výskytu infarktu myokardu, obsahující právě sondy hybridizující s DNA či RNA uvedené sady genů či genetických lokusů. Oligonukleotidový čip může být připraven např. spotováním či jakýmkoliv jiným způsobem známým odborníkovi v daném oboru.

Předkládaný vynález přináší identifikovat v České populaci jedince, kteří mají zvýšené genetické riziko výskytu akutního infarktu myokardu, což umožní zacílit prevenční a sledovací programy na jedince, kterým to přinese největší benefit, a možnost identifikovat jedince se zvýšeným rizi30 kem úmrtí v důsledku kardiovaskulárních komplikací v krátkodobém horizontu po výskytu akutního infarktu myokardu umožní efektivní využití lůžkových kapacit.

Vynález je dále osvětlen na následujících příkladech provedení, aniž je jimi jeho rozsah jakkoliv omezen.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 ukazuje teplotní mapu genů identifikovaných v rámci experimentu genové exprese pro kontrast AIMD6 vs Kontroly.

Obr. 2 ukazuje kvantilovou diagnostiku lineárního modelu pro logaritmovaná data intenzit genové exprese při základu 2 (Q-Q grafy) a dále vulkánové grafy, které charakterizují data na základě logaritmu podílů intenzit genové exprese ve studované a srovnávací populaci (viz daný kontrast) a na základě logaritmu šance na diferenciální expresi pro daný gen či transkript. Dává komplexní představu o povaze diferenciální exprese pro daný kontrast.

Seznam sekvencí

SEQ ID No. 1: sekvence DNA kódující mRNA genu OLIG2 SEQ ID No. 2; sekvence DNA kódující mRNA genu VNN3 SEQ ID No. 3: sekvence DNA kódující mRNA genu MS4A3 SEQ ID No. 4: sekvence DNA kódující mRNA genu CEBPE

-8CZ 303405 B6

SEQ ID No. 5: sekvence DNA kódující mRNA genu FOS

SEQ ID No. 6: sekvence DNA kódující mRNA genu LÍPA

SEQ ID No. 7: sekvence DNA kódující mRNA genového lokusu LOC645694

SEQ ID No. 8: sekvence DNA kódující RefSeq_ID M97723

SEQ ID No. 9: sekvence DNA kódující mRNA genu EPAS1 SEQ ID No. 10: sekvence DNA kódující mRNA genu CLINT1 SEQ ID No. 11: sekvence DNA kódující mRNA genu MYCT1 SEQ ID No. 12: sekvence DNA kódující mRNA genu VPS29 SEQ ID No. 13: sekvence DNA kódující mRNA genového lokusu LOC130951

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Čipová analýza buněk periferní krve pacientů smíchané s RNA later na lidském celogenomovém čipu Human WG6-v2 Expression BeadChip firmy Illumina

Pozn. Kurzívou jsou označeny přesně obchodní názvy produktů či specifické komponenty produktů, které nemají odpovídající jednoznačné české ekvivalenty.

Sběr vzorků plné krve do RNAlater* (kat. Č. AM7024, Ambion, Applied Biosystems) byl prováděn tak, že vzorek nesrážlivé plné krve (2,4 ml) byl nejpozději do 15 min od odběru smíchán s RNAlater^ Tissue Collectin: RNA Stabilization Solution (7,6 ml). Vzorek byl řádně promíchán a poté přesunut do mrazicího boxu -70 °C k dlouhodobému skladování.

Izolace RNA pomocí kitu RiboPure™ - Blood, Ambion Inc. (kat č. AM1928, Ambion, Applied Biosystems) byla prováděna tak, že vzorky byly vyndány z mrazicího boxu a ponechány na ledu rozmrazit. Snažili jsme se vždy šestice vzorků jdoucí najeden čip připravovat najednou. Pro izolaci RNA bylo pipetováno 1,8 ml vzorku krve s RNAlater^ do 2ml zkumavky bez RNase. Vzorek krve v roztoku RNAlateř* byl centrifugován na 16 100 g (13 200 rpm) 1 min. Supematant byl odstraněn včetně bílé fáze těsně nad peletem. Buňky byly lyžovány v 800 μί lyzačního roztoku a 50 μΐ roztoku acetátu sodného. Směs byla řádně promíchána na vortexu. Lyzát buněk byl extrahován s 500 μΐ kyselého fenol:chloroformu. Směs byla promíchána 30 s na vortexu a ponechána stát 5 min při laboratorní teplotě. Směs byla centrifugována na 16 100 g 1 min. Celá vodná fáze, které bylo kolem 1,2 ml, byla přenesena do nové 2ml zkumavky bez RNase, znovu centrifugována a vodná fáze bez jakékoli pelety odebrána do čisté zkumavky bez RNase. Bylo přidáno 600 μΐ 100% etanolu a promícháno na vortexu.

700 μί vzorku bylo přeneseno na dodanou kolonku umístěnou v kolekČní zkumavce a 5 až

10 s centrifugováno na 16 100 g. Kolekční zkumavky byly vyprázdněny a z novu do nich byly nasazeny kolonky. Do kolonek bylo naneseno dalších 700 μί a poté zbytek vzorku a vždy 5 až 10 s centrifugováno na 16 100 g. Na filtry kolonek bylo naneseno 700 μΐ promývacího roztoku 1 a 5 až 10 s centrifugováno na 16 100 g. Kolekční zkumavky byly vyprázdněny a znovu do nich byly vsazeny kolonky. Do kolonek bylo 2x naneseno 700 μΐ promývacího roztoku 2/3 (láhev musí být doplněna o 56 ml 100% etanolu) a 5 až 10 s centrifugováno na 16 100 g. Kolekční zkumavky byly vyprázdněny a znovu do nich byly vsazeny kolonky, centrifugovány, aby byla odstraněna veškerá kapalina. Kolonky byly přeneseny na označenou kolekční zkumavku a naneseno 50 μί elučního roztoku (předehřátého na 75 °C). 20 s ponecháno stát při laboratorní teplotě a 20 až 30 s centrifugováno na maximum. Pri druhé eluci dalšími 50 μΐ elučního roztoku centri50 fugováno 1 min.

-9CZ 303405 B6

K RNA ve 100 μΐ elučního pufru bylo přidáno 5 μΐ DNase pufru a 1 μΙ DNase I a ponecháno 30 min inkubovat při 37 °C. K RNA po odstranění DNA bylo přidáno 20 μΙ DNase inaktivační reagencie. Směs byla jemně promíchána na vortexu a ponechána 2 min stát při laboratorní teplotě. Během této doby ještě byla směs dvakrát promíchána.

Vzorek byl centrifugován 1 m in na 16 000 g. V peletě byla DNase inaktivační reagencie. Roztok RNA byl přenesen do nové zkumavky bez RNase.

Byla změřena koncentrace RNA na Nanodropu, Thermo Scíentific (1 μΙ), případně ponechán alikvot pro analýzu na Bioanalyzeru 2100, Agilent Technologies.

Po provedení čipové analýzy s takto ošetřenými vzorky RNA bylo zjištěno, že díky použití plné krve dochází k preferenční amplifikaci globinových RNA a nedostatečné intenzitě signálu ostatních genů. Proto byly vzorky RNA přečištěny pomocí GLOBINclear* Kitu firmy Ambion (kat. č. AM1980, Applied Biosystems):

Kcca 110 μΐ vzorku RNA izolované pomocí RiboPure* Blood Kit, Ambion z plné krve s RNAlater® bylo přidáno 11 μΐ octanu sodného (RiboPure*), případně 0,35 μΐ GlycoBlue (AM9515, Ambion, Applied Biosystems) a 300 μΐ 100% ethanolu, vše bylo řádně promícháno. Vzorky byly uskladněny na l hod v mrazicím boxu při teplotě -20 °C. Pak byly centrifiigovány při 16 100 g 30 min, 4 °C, a supematant byl opatrně odstraněn. Bylo přidáno 0,7 ml ledového 70% ethanolu, vzorek vortexován, centrifugován 10 min při 4°C a supematant opatrně odstraněn, Peleta byla rozpuštěna ve 14 μΐ vody bez nukleas (v 15 μΐ pokud chceme v tomto kroku měřit koncentraci na Nanodropu).

V průběhu točení byly připraveny potřebné roztoky:

RNA vazebný pufr: Byly přidány 2 ml 100% isopropanolu do koncentrátu vazebného pufru, promícháno a skladováno při laboratorní teplotě.

RNA promývací roztok: Byly přidány 4 ml 100% etanolu do koncentrátu promývacího roztoku, promícháno a skladováno při laboratorní teplotě.

Kuličky resuspendující směs (1 reakce / 6 reakcí): 10 μΐ / 60 μΐ RNA vazebné kuličky, 4 μΐ / 24 μΐ pufru pro RNA kuličky, 6 μΐ / 36 μΐ 100% isopropanolu. Směs byla homogenizována a skladována při laboratorní teplotě.

Streptavidinové magnetické kuličky (30 μΐ / vzorek): do inkubátoru (50 °C) byly vloženy zkumavky s 2x hybridizaěním pufrem a pufrem pro streptavidinové kuličky minimálně na 15 min, před použitím řádně vortexovány. 6x 30 μΐ (180 μΐ) homogenizovaných streptavidinových magnetických kuliček bylo pipetováno do čisté 1,5 ml zkumavky, centrifugováno cca 2 sna méně než 1000 g a zkumavka byla umístěna do magnetického stojánku na dobu 3 až 5 minut (dokud není roztok průsvitný). Supematant byl opatrně odstraněn a přidáno 6 x 30 μΐ (180 μΐ) pufru pro streptavidinové kuličky předehřátého na 50 °C, řádně vortexováno a ponecháno inkubovat po dobu nejméně 15 min při 50 °C před dalším použitím. Ke vzorkům RNA ve 14 μΐ (1 až 10 pg) byl přidán 1 μΐ Capture Oligo Mix. Ke směsi bylo přidáno 15 μΙ 2x hybridizačního pufru předehřátého na 50 °C. Vzorky byly krátce vortexovány a rychle centrifugovány při max. 1000 g a ponechány inkubovat při 50 °C po dobu 15 minut (dojde k hybridizaci s globinovou mRNA).

Připravené streptavidinové magnetické kuličky umístěné v inkubátoru byly jemně vortexovány a centrifugovány méně než 2 sna max. 1000 g. Ke každému vzorku RNA bylo přidáno 30 μΐ připravených streptavidinových magnetických kuliček, směsi řádně promíchány vortexováním, stočeny cca 2 s na 1000 g a ponechány inkubovat 30 min při teplotě 50 °C. Po vyjmutí z inkubátoru jemně vortexovány, centrifugovány cca 2 s na max. 1000 g a zkumavky umístěny do magne- 10CZ 303405 B6 tického stojánku na 3 až 5 min (dokud není roztok průsvitný). Supematanty obsahující celkovou RNA bez globinové mRNA opatrně odstraněny a přeneseny do čistých l,5ml zkumavek.

Byl předehřát eluční pufr na 58 °C. Ke každému RNA vzorku bylo přidáno 100 μΐ RNA vazeb5 něho pufru. Kuličky resuspendující směs řádně homogenizována vortexováním a následně přidáno 20 μΐ směsi ke každému vzorku. Směs 10 s řádně vortexována, aby došlo k navázání RNA na kuličky, centrifugována cca 2 s na 1000 g. Zkumavky byly umístěny do magnetického stojánku na 3 až 5 minut (dokud není roztok průsvitný). Opatrně byly odstraněny veškeré supematanty. Zkumavky byly vyjmuty z magnetického stojánku. Až poté bylo ke každému vzorku přidáno io 200 μΐ RNA promývacího roztoku, řádně 10 s vortexováno, krátce a jemně stočeno (viz výše). Zkumavky se vzorky umístěny do magnetického stojánku na 3 až 5 minut než došlo k usazení magnetických kuliček s navázanou RNA, opatrně byl odstraněn veškerý supematant a zkumavky vyjmuty ze stojánku. Zkumavky krátce a jemně stočeny, umístěny zpět do magnetického stojánku a malou špičkou byla odstraněna veškerá kapalina. Zkumavky se vzorky vyndány z magnetické15 ho stojánku a otevřeně nechány 5 min na vzduchu oschnout. Ke každému vzorku přidáno 30 μΐ elučního pufru předehřátého na 58 °C, řádně 10 s vortexováno a směs inkubována 5 min při 58 °C. Řádně 10 s vortexováno a krátce a jemně centrifiigováno (cca 2 s na 1000 g). Vzorky byly umístěny do magnetického stojánku na 3 až 5 minut než došlo k usazení magnetických kuliček. Supematant obsahující přečištěnou celkovou RNA byl opatrně odebrán do čistých l,5ml zkuma20 vek.

Kritickým parametrem se stal poměr absorbancí u 260 nm ku 230 nm, který má být pro čipovou analýzu vyšší než 1,5, Pro zajištění dostatečné kvality musela být prováděna finální etanolová precipitace. K cca 30 μΐ vzorku RNA isolované pomocí RiboPitre™ Blood Kit, Ambion z plné krve s RNAlater® přečištěné kitem GLOBINclear™ Whole Blood Kit byly přidány 3 μΐ octanu sodného (RiboPur™) a 85 μΐ 100% etanolu. Řádně promícháno a vzorky uskladněny přes noc v mrazicím boxu při teplotě -20 °C. Ráno centrifiigováno při 16 100 g 30 min, 4 °C, supematant opatrně odstraněn, peleta promyta 0,7 ml vychlazeného 70% etanolu, vzorek vortexován, centrifugován 15 min při 4 °C a poté veškerý supematant opatrně odstraněn. Pelety rozpuštěny ve

14 μΐ vody bez nukleas či dle velikosti pelety a vstupní koncentrace ve větším objemu. Byla změřena koncentrace přečištěné a přesrážené RNA na Nanodropu (1 μϊ), integrita stanovena pomocí Bioanalyzeru 2100, Agilent Technologies (1 μϊ) - Agilent RNA 6000 Nano/Pico Kit (kat. č. 5067-1511/5067-1513).

Pokud to bylo z hlediska výchozího materiálu možné, aby kvantitativní i kvalitativní parametry byly v pořádku (RIN > 7; A₂₆₀/280nm > 1,8; A_260/230nm > 1,5), byla připravená RNA dále amplifikována pomocí Illumincf TotalPrep RNA Amplification Kit, Ambion (kat. Č. IL1791). Systém biotinem označí amplifikovanou RNA khybridizaci na Čipech. Protokol se skládá z reversní transkripce s využitím oligo(dT) primerů pro syntézu cDNA obsahující T7 promotorovou sek40 věnci. K získané cDNA je syntetizován druhý řetězec při využití DNA polymerasy a RNasy H. Přečištěný cDNA produkt vstupuje do in-vitro transkripce s T7 RNA poíymerasou. Výsledná cRNA je následně přečištěna od neinkorporovaných nukleotidů, solí, enzymů a anorganického fosfátu. Vstupní množství RNA, které jsme využívali pro amplifikací, bylo 150 ng v maximálně 11 μϊ. Pro jednotlivé kroky byl použit DNA Engine Dyad Peltier Thermal Cycler, Βίο-Rad Labo45 ratories.

RNA vzorky o objemu 11 μΐ (150 ng RNA) byly umístěny do sterilních 0,2ml zkumavek bez RNas, Případně byly do daného objemu naředěny vodou bez nukleas. Při laboratorní teplotě byl připraven master mix pro reversní transkripci - syntézu jednořetězcové DNA:

μϊ T7 oligo(dT)primer μΐ lOx pufr pro první řetězec (objemy jsou udány na jednu 20 μϊ reakci) μϊ směs dNTP (složky byly přidávány v daném pořadí)

- 11 CZ 303405 B6 l μΐ inhibitor RNas μΐ ArrayScript(enzym).

Master mix byl jemně vortexován a krátce centrifugován (5s). Bylo přidáno 9 μΐ master mixu do každého vzorku RNA, důkladně promícháno pipetováním (2 až 3x) a 3 až 4x cvmknut do zkumavek. Krátce centrifugováno a umístěno do bloku cykleru (42 °C). Reakce byly inkubovány h při 42 °C, poté krátce stočeny a dány na led (4 °C).

Na ledu byl připraven master mix pro syntézu druhého řetězce cDNA: io μΙ voda bez nukleas μΐ 1 Οχ pufr pro druhý řetězec (objemy jsou udány na jednu 100 μΐ reakcí) μΐ směs dNTP (složky byly přidávány v daném pořadí) μΙ DNA polymerasy

1 μΐ RNasyH.

Master mix byl jemně vortexován a krátce stočen (5s). Bylo přidáno 80 μΐ master mixu ke každému vzorku, důkladně promícháno pipetováním (2 až 3x) a 3 až 4x cvmknuto do zkumavek. Krátce centrifugováno, umístěno do předem vychlazeného bloku cykleru na 16 °C. Reakce byly inkubovány 2 h při 16 °C, poté 4 °C.

Získaná cDNA byla přečištěna. Centrifugace byly prováděny při 10 000 g a laboratorní teplotě (otáčky nesmí překročit 16 000 g, došlo by k poškození skleněného filtru a vlákna filtru by mohla kontaminovat eluát). Bylo předehřálo dostatečné množství vody bez nukleas pro eluci na 55 °C (při teplotě £ 58 °C dochází k částečné denaturaci cDNA) nejméně 10 min před použitím. Do promývacího pufru bylo přidáno 24 ml etanolu.

Ke vzorkům cDNA bylo přidáno 250 μΐ cDNA vazebného pufru, důkladně promícháno pipetováním (2 až 3x), 3 až 4x poklepáno na zkumavky a krátce stočeno. Kolonky byly umístěny do dodaných promývacích zkumavek a na jejich střed naneseny vzorky (cDNA s cDNA vazebným pufrem). Centrifugováno 1 min 10 000 g, eluát byl zlikvidován. Na každou kolonku bylo aplikováno 500 μΐ promývacího pufru, centrifugo váno 1 min 10 000 g a eluát byl zlikvidován. Vzorky na kolonkách byly opětovně 1 min centrifugovány 10 000 g (odstranění veškerého promývacího pufru). Kolony s cDNA byl přendány do elučních zkumavek. Na střed kolonek bylo naneseno

10 μΐ vody bez nukleas vytemperované na 55 °C, necháno 2 min stát při laboratorní teplotě a poté centrifugováno 1,5 min 10 000 g. Na střed kolonek byl nanesen druhý alikvot předehřáté vody bez nukleas - 9 μΙ, centrifugováno 2 min 10 000 g.

Získaná dvouřetězcová DNA v cca 17,5 μΐ vody z výsledného eluátu byla použita pro in—vitro transkripci. Při laboratorní teplotě byl připraven master mix pro syntézu cRNA:

2,5 μΐ T7 lOx reakční pufr (objemy jsou udány na jednu 25μ1 reakci)

2,5 μΐ směs T7 enzymu (složky byly přidávány v daném pořadí)

2,5 μΐ směs biotinem značených NTP.

Master mix byl jemně vortexován a krátce stočen (5s). Bylo přidáno 7,5 μΐ master mixu ke každému vzorku cDNA, důkladně promícháno pipetováním (2 až 3x) a 3 až 4x cvmknuto do zkumavek. Vzorky krátce centrifugovány a umístěny do bloku cykleru, kde byly inkubovány při 37 °C po dobu 14 h, poté 4 °C. Reakce byly ukončeny přidáním 75 μΐ vody bez nukleas ke kaž50 dému vzorku cRNA a důkladně, ale jemně, vortexovány.

- 12CZ 303405 B6

Při následném přečištění došlo k odstranění enzymů, solí a neinkorporovaných nukleotidů. Centrifugace byly prováděny při 10 000 g při laboratorní teplotě (otáčky nesmí překročit 16 000 g. došlo by k poškození skleněného filtru a vlákna filtru by mohla kontaminovat eluát). Bylo předehřáto dostatečné množství vody bez nukleas pro eluci na 60 °C nejméně 10 min před použitím a byly připraveny kolonky do sběrných zkumavek. Ke každému vzorku ve 100 μΐ bylo přidáno 350 μΐ cRNA vazebného pufru. Ihned bylo přidáno 250 μΐ 100% etanolu, vzorky 3x promíchány pipetováním, ale nevortexovány a necentrifugovány. Po smísení etanolu se vzorkem byla směs přenesena na střed připravených kolonek, centrifugováno 1 min 10 000 g, eluát byl zlikvidován. Na střed každé cRNA kolonky bylo aplikováno 650 μΐ promývacího pufru, centrifugováno 1 m in 10 000 g a eluát byl zlikvidován.

Zkumavky s kolonkami byly centrifugovány další 1 min 10 000 g (odstranění veškerého promývacího pufru) a kolony poté byly umístěny do nových sběrných zkumavek. Na střed kolonky bylo naneseno 100 μΐ vody bez nukleas vytemperované na 60 °C, necháno 2 min stát při laboratorní teplotě a centrifugováno 1,5 min 10 000 g.

Byla změřena koncentrace amplifikované cRNA na Nanodropu (1 μΐ). Pokud byla nižší než 150 ng/μΐ či byl nízký poměr absorbancí u 260 nm ku 230 nm, tak byly vzorky precipitovány. Ke vzorku přečištěné cRNA byla přidána 1/10 objemu 3M CPhCOONa, pH 5,2, RiboPure (10 μΐ) a

2,5 násobek objemu 100% etanolu (275 μΐ), důkladně promícháno a ponecháno 60 min v mrazicím boxu při -20 °C. Vzorky byly centrifugovány na 16 100 g po dobu 30 až 60 min při 4 °C a opatrně byl odstraněn supematant. Pelety byly promyty 500 μΐ 70% etanolu, zkumavky centrifugovány na 16 100 g po dobu 15 min při 4 °C, supematant opatrně odstraněn, případně byly znovu rychle centrifugovány a odstraněny i zbytky etanolu. Pelety cRNA byly ponechány cca 2 min na vzduchu, aby oschly. Poté byly suspendovány v požadovaném objemu vody bez nukleas (> 12 μΐ).

Výtěžek závisel na množství a kvalitě poly(A)RNA v celkové RNA. Byla změřena koncentrace na NanoDropu (1 μΐ) a stanoven profil délek cRNA pomocí Bioanalyzeru 2100, Agilent (1 μΙ), který má být mezi 250 až 5500 nt s většinou cRNA mezi 1000 až 1500 nt.

Pokud byla finální koncentrace cRNA > 150 ng/μΐ a profil v pořádku, byly vzorky použity pro hybridizací na Human WG6-v2 Expression BeadChip firmy Illumina.

Byla předehřátá hybridizační pec s výkyvnou plošinou na 58 °C alespoň 1 h před použitím. Vzorky byly připraveny tak, aby vstupní množství cRNA do hybridizace bylo 1,5 pg. Maximální možný objem je 10 μΐ, případně vzorky na tento objem byly doplněny vodou bez nukleas a promíchány. Po dobu 10 min nechány stát při laboratorní teplotě, aby došlo k řádnému rozpuštění. Do hybridizační pece vytemperované na 58 °C byly na 10 min vloženy zkumavky s GEX-HYB a GEX-HCB (pro rozpuštění skladováním precipitovaných solí). Ke každému vzorku 1,5 pg cRNA v 10 μΐ vody bez nukleas bylo přidáno 20 μΐ GEX-HYB, byly jemně vortexovány a rychle centrifugovány.

Illumina Hyb Chamber Basket byl umístěn do BeadChip Hyb Chamber. Bylo pipetováno 200 μΐ GEX-HCB do každého ze dvou reservoárů pro zvlhčující pufr v každé Hyb Chamber. Pufr byl dáván pouze do komor, které byly použity. Hyb Chamber byl utěsněn víkem a nechán při laboratorní teplotě (-22 °C) než byly čipy dány do Hyb Chamber. Na laboratorní teplotu vytemperované čipy byly vyndány z jejich obalů {Human WG6-v2 Expression BeadChip). Byly používány výhradně rukavice bez pudru. Čipy byly pinzetou drženy za krycí folií v oblasti barkódu, vloženy do Hyb Chamber Insert tak, aby jejich směr souhlasil se symbolem barkódu na Insertu.

Analyzované vzorky cRNA smíchané s GEX-HYB byly zahřátý na 65 °C po dobu 5 min. Jemně vortexovány a rychle centrifugovány, aby byla kapalina shromážděna na dně zkumavky. Před

-13CZ 303405 B6 dalším použitím vzorky ponechány pri laboratorní teplotě vychladnout a ihned poté byly pípetovány na čipy.

Hyb Chamber Inserts obsahující čipy byly umístěny do Hyb Chamber a bylo pipetováno 30 μΐ analyzovaného vzorku na vstupní otvor každého pole. Hyb Chamber opatrně uzavřen víkem a inkubován v hybridizační peci při 58 °C po dobu 16 hodin s rychlostí kyvů plošiny nastavenou na 5. Před ukončením práce v daný den byl ještě připraven lx vysokoteplotní promývací pufr přidáním 50 ml 1 Ox koncentrovaného zásobního roztoku ke 450 ml vody bez RNas. Teplota zahřívacího bloku naplněného 500 ml lx vysokoteplotního promývacího pufru byla nastavena na 55 °C, víko bylo zavřeno a ponecháno hřát přes noc.

Další den byl připraven promývací roztok E1BC přidáním 3 ml E1BC pufru do 1 1 vody bez RNas. Na laboratorní teplotu byl předehřát blokovací pufr El (4 ml/čip). Bylo připraveno odpovídající množství blokovacího pufru El (2 ml/čip) se streptavidin-Cy3 (2 μΐ zásobního roztoku o koncentraci 1 mg/ml najeden čip). Byla použita jedna kónická zkumavka pro všechny aktuálně zpracovávané čipy a před detekcí byl tento roztok uchováván v temnu.

Z hybridizační pece byla vyndána Hyb Chamber a rozebrána. Čipy byly ponořeny do 250 ml promývacího roztoku E1BC a byla žních opatrně oddělána krycí folie. Rozebrání a umístění vElBC promývacím roztoku bylo opakováno pro všechny aktuálně zpracovávané čipy. Čipy byly následně umístěny do držáku, který byl za rukojeť přemístěn do Hybex Waterbath Insert obsahujícího lx vysokoteplotní promývací pufr přes noc předehřátý na 55 °C. Se zavřeným víkem byly čipy bez třepání inkubovány 10 min. Během této inkubace bylo připraveno 250 ml promývacího roztoku E1BC v čisté barvící nádobě. Ihned po lOmin inkubaci s vysokoteplotním promývacím pufrem byl držák s čipy přesunut do připraveného čerstvého promývacího roztoku E1BC. Držák krátce a intenzivně v nádobě protřepán pohybem nahoru a dolů, poté na 5 min umístěn na rotační třepačku na maximální rychlost, při které nedocházelo k vyšplíchnutí roztoku z nádoby (120 rpm). Přemístěn do čisté barvící nádoby s 250 ml 100% etanolu. Krátce a důsledně pomocí rukojeti držáku byly čipy proprány a poté 10 min třepány na orbitální třepačce při maximální rychlosti. Čipy byly přemístěny do čisté barvící nádoby s 250 ml promývacího roztoku E1BC, krátce a intenzivně promíchány a třepány na orbitální třepačce po dobu 2 min. Čipy byly přemístěny do připravených Wash Tray se 4 ml blokovacího pufru El, dány na výkyvnou desku (analyzovaná plocha se vzorky musí vždy směřovat nahoru) a kývány na střední rychlost po dobu 10 min. Čipy byly přendány do čisté Wash Tray se 2 ml blokovacího pufru El + streptavidinCy3, přikryty víkem a kývány na střední rychlost dalších 10 min. Čipy byly přesunuty do připravené čisté barvící nádoby s 250 ml promývacího roztoku E1BC, krátce proprány a poté 5 min rotačně třepány pri laboratorní teplotě. Čipy v držáku byly přesunuty do centrifugy s rotorem na mikrodestičky a točeny při laboratorní teplotě na 270 rcf po dobu 4 min. Usušené čipy byly ihned skenovány pomocí Illumina* BeadArray Raderu na skenovací faktor 1,0 a 1,5 a získaná data jsou uchovávána na DVD a webovém úložišti dat.

Příklad 2: Statistické vyhodnocení expresního profilu

Předkládaný vynález je doložen výsledky, které jsme obdrželi na základě celogenomové analýzy vzorků periferní krve získaných od jedinců hospitalizovaných v letech 2006 až 2009 v Městské nemocnici Čáslav či kardíologické klinice v Pardubicích s diagnózou primárního akutního infarktu myokardu a párových kontrolních osob hospitalizovaných v Městské nemocnici v Čáslavi ve stejném období z důvodu komplikací pohybového ústrojí. Věk případů byl omezen hranicí 80 let. Párové kontrolní osoby nesměly mít pozitivní historií výskytu závazných kardiovaskulárních onemocnění a byly k odpovídajícím případům vybírány tak, aby docházelo k podstatné shodě v rizikových faktorech výskytu akutního infarktu myokardu. Zejména byla požadována shora v pohlaví, věku (kontroly mohly být o maximálně 5 let starší než případy) a shodný musel být též status diabetů mellitu a kuřácký status. Vzorky byly analyzovány pomocí technologie firmy Illumina, přičemž byly použity Čipy verze 2 (Human WG6-v2 Expression BeadChip}.

- 14CZ 303405 B6

Ke genetickému vyšetření pacientů s akutním infarktem myokardu byly zařazovány osoby, které byly přijaty či ambulantně ošetřeny s diagnosou akutního infarktu myokardu (AIM) na příjmové ambulanci Interního oddělení MN Čáslav, Do souboru byli rovněž zařazováni pacienti, kteří byli vezeni posádkou rychlé záchranné služby přímo na Kardiologickou kliniku v Pardubicích, kde byl na koronární jednotce proveden odběr krevního vzorku. Odběr byl vždy proveden po podepsání „Informovaného souhlasu“ pacientem. Smíchání vzorků venózní krve s RNAlater\ jejich uskladnění a transport krevních vzorků byly prováděny dle pracovních protokolů v souladu s platnými právními předpisy a veškerá data ke vzorkům jsou uložena v příslušných databázích.

Akutní infarkt myokardu byl diagnostikován na základě anamnestických údajů, EKG křivky a laboratorního průkazu nekrosy myokardu. Byl definován jako bolest na hrudi nebo její ekvivalent trvající alespoň 10 min v posledních 24ti hodinách selevací úseku ST na EKG křivce (STEMI), či bez elevací ST (NONSTEMI). Biochemický průkaz nekrózy byl stanovován v naší laboratoři vyšetřením Troponinu I. Jako pozitivní hodnotu Troponinu I bylo považováno překročení horního limitu normální hodnoty v čáslavské laboratoři, tj. 0,3 pg/l. Jako pomocná diagnostická metoda byla používána echokardiografie k průkazu regionální poruchy kinetiky levé komory v povodí „infarktové tepny“. Jako standardní panel vyšetření pacientů s podezřením na AIM byl vyšetřován Troponin I okamžitě při přijetí a dále ve 4 až 6 hodinovém intervalu v prvních

24 hodinách, AST, ALT, KO, koagulace (QT, APTT), glykétnie, iontogram, urea, kyselina močová, lipidogram, CRP, u diabetiků HBAlc. Vyšetření CK a CK-MB mass a LD bylo prováděno nepravidelně dle uvážení lékaře.

Studie zahrnovala šestiměsíční sledování pacientů s akutním infarktem myokardu od okamžiku jeho výskytu. V návaznosti na zvolený statistický design byla skupina pacientů s výskytem akutního infarktu myokardu rozdělena na osoby, které z kardiovaskulárních příčin zemřely v průběhu šestiměsíčního sledování (AIMD6, 4 osoby) a na osoby, které přežívaly déle (AIM, 41 osob), párové kontroly čítaly dalších 45 osob. Tabulka 1 ukazuje vybraná data osob v analyzovaném souboru a základní data ke zpracovaným vzorkům.

- 15CZ 303405 B6

Tabulka I: Základní data k osobám z analyzovaného souboru a k analyzovaným krevním vzorkům odebraným z těla těchto pacientů

ID	Vzorek	Pohlaví	Ročník	Exitus	Diabetes mellitus	Kouření	c (ng/μΐ) RNA	RIN	με cRNA
C129	AIM	Muž	1948	Ne	Ne	Ano (20)	243,68	7,8	8,522
Cl 84	AIM	Muž	1947	Ne	Ne	Ano (10)	163,76	8,8	8,813
C056	AIM	Muž	1953	Ne	Ne	Ano (15)	109,2	7,4	13,577
P008	AIM	Žena	1949	Ne	Ne	Ne	41,9	8,1	8,752
P009	AIM	Muž	1951	Ne	Ne	Ano (2)	28,6	7,1	5,108
C029	AIM	Muž	1955	Ne	Ne	Ne	43,3	7,1	9,496
C048	AIM	Žena	1960	Ne	Ne	Ne	170,3	8,5	16,748
C099	AIM	Muž	1951	Ne	Ne	Ne	261,2	8,0	10,146
C170	AIM	Žena	1929	Ne	Ne	Ne	404,7	6,1	2,390
072	AIM	Žena	1931	Ne	Ano	Ne	353,0	7,7	8,093
081	AIM	Žena	1934	Ne	Ano	Ne	195,2	8,1	8,633
C069	AIM	Muž	1941	Ne	Ne	Ne	185,3	8,7	6,997
P011	AIM	Muž	1947	Ne	Ne	Ne	245,2	6,9	4,194
047	AIM	Muž	1945	Ne	Ne	Ne	317,5	6,7	5,176
C005	AIMD6	Muž	1939	Ano	Ne	Ne	89,5	8,1	7,351
C053	AIMD6	Žena	1935	Ano	Ne	Ne	327,1	7,7	8,389
P010	AIMD6	Žena	1928	Ano	Ano	Ne	188,3	8,1	8,248
0 85	AIM	Muž	1937	Ne	Ano	Ne	191,54	8,2	7,695
095	AIM	Muž	1946	Ne	Ano	Ne	293,41	8,2	13,269
C284	AIM	Muž	1953	Ne	Ne	Ano (20)	210,06	7,4	8,364
094	AIM	Muž	1933	Ne	Ne	Ne	160,62	8,0	15,856
C238	AIM	Muž	1934	Ne	Ano	Ne	204,88	7,8	8,750
C078	AIMD6	Muž	1937	Ano	Ano	Ne	170,38	8,2	15,901
C016	AIM	Muž	1944	Ne	Ne	Ne	84	7,1	6,802
C074	AIM	Muž	1943	Ne	Ne	Ne	209,2	6,9	7,509
P003	AIM	Žena	1936	Ne	Ne	Ano (10)	113,8	6,8	7,505
C037	AIM	Žena	1933	Ne	Ano	Ne	226,2	8,5	3,76
C036	AIM	Žena	1934	Ne	Ne	Ne	31,4	6,2	2,986
C030	AIM	Muž	1951	Ne	Ne	Ne	152,2	8,7	3,186

- 16CZ 303405 B6

Π)	Vzorek	Pohlaví	Ročník	Exitus	Diabetes mellitus	Kouření	c (ng/pl) RNA	RIN	pg cRNA
Cl 08	AIM	Muž	1955	Ne	Ne	Ano (15)	197,9	7,5	10,566
Cl 19	AIM	Muž	1948	Ne	Ne	Ano (2)	365	7,1	6,499
C065	AIM	Žena	1933	Ne	Ano	Ne	79,7	7,6	2,536
C039	AIM	Žena	1959	Ne	Ano	Ne	434,2	6,5	7,939
C125	AIM	Muž	1928	Ne	Ano	Ne	184,7	8,4	4,120
C139	AIM	Muž	1939	Ne	Ne	Ne	126,5	8,4	7,674
C120	AIM	Muž	1949	Ne	Ne	Ne	103,6	8,7	4,480
C063	AIM	Žena	1941	Ne	Ne	Ne	282,9	8,5	4,526
C205	AIM	Muž	1944	Ne	Ano	Ano (10)	85,7	8,4	7,141
Cl 74	AIM	Muž	1950	Ne	Ne	Ne	127,97	8,0	6,820
Cl 82	AIM	Muž	1954	Ne	Ne	Ano (40)	97,47	8,1	12,236
C289	AIM	Muž	1957	Ne	Ne	Ne	213,42	8,0	9,322
C019	AIM	Žena	1930	Ne	Ne	Ne	36,59	7,7	3,043
C013	AIM	Muž	1939	Ne	Ano	Ne	194,74	7,9	4,813
C269	AIM	Muž	1938	Ne	Ne	Ne	320,41	8,2	4,974
P019	AIM	Žena	1931	Ne	Ano	Ne	86,65	7,9	4,535
C083	CTRL	Muž	1947	Ne	Ne	Ano (5)	186,6	8,4	15,045
C250	CTRL	Muž	1946	Ne	Ne	Ano (25)	10,04	7,7	1,907
C138	CTRL	Muž	1950	Ne	Ne	Ano (15)	290,9	7,1	6,189
C081	CTRL	Žena	1949	Ne	Ne	Ne	58,4	6,7	9,044
C149	CTRL	Muž	1949	Ne	Ne	Ano (20)	47,39	7,6	5,758
C014	CTRL	Muž	1955	Ne	Ne	Ne	51,74	7,2	2,403
033	CTRL	Žena	1960	Ne	Ne	Ne	177,2	8,6	9,447
C101	CTRL	Muž	1951	Ne	Ne	Ne	237,38	8,7	10,019
009	CTRL	Žena	1928	Ne	Ne	Ne	302,8	8,5	9,941
C022	CTRL	Žena	1929	Ne	Ano	Ne	232,48	7,6	8,534
C023	CTRL	Žena	1931	Ne	Ano	Ne	223,54	8,1	4,486
C213	CTRL	Muž	1941	Ne	Ne	Ne	124,24	7,8	7,42
C282	CTRL	Muž	1948	Ne	Ne	Ne	297,68	7,0	3,988
C260	CTRL	Muž	1946	Ne	Ne	Ne	147,18	8,5	8,003
C010	CTRL	Muž	1938	Ne	Ne	Ne	301,91	8,0	7,3
063	CTRL	Žena	1934	Ne	Ne	Ne	112,15	7,9	6,127
C208	CTRL	Žena	1928	Ne	Ano	Ne	246,12	7,8	4,79
C348	CTRL	Muž	1937	Ne	Ano	Ne	94,68	7,8	14,11
C304	CTRL	Muž	1946	Ne	Ano	Ne	213,16	8,5	17,068
C302	CTRL	Muž	1952	Ne	Ne	Ano (10)	80,07	8,2	15,571
C098	CTRL	Muž	1932	Ne	Ne	Ne	200,5	7,3	8,272
C272	CTRL	Muž	1930	Ne	Ano	Ne	91,86	8,3	8,709
C287	CTRL	Muž	1936	Ne	Ano	Ne	145,6	8,3	8,272
098	CTRL	Muž	1944	Ne	Ne	Ne	270,3	7,2	7,32
C204	CTRL	Muž	1943	Ne	Ne	Ne	249,8	6,6	8,982

-17CZ 303405 B6

ID	Vzorek	Pohlaví	Ročník	Exitus	Diabetes mellitus	Kouření	c (ng/μΙ) RNA	RIN	Pg cRNA
C209	CTRL	Žena	1937	Ne	Ne	Ano (10)	191	7,4	13,377
C124	CTRL	Žena	1933	Ne	Ano	Ne	64,91	8,6	2,198
Cl 10	CTRL	Žena	1934	Ne	Ne	Ne	207,59	8,0	4,37
C150	CTRL	Muž	1952	Ne	Ne	Ne	130,5	8,4	2,566
C058	CTRL	Muž	1954	Ne	Ne	Ano (8)	327,4	9,2	6,875
C066	CTRL	Muž	1947	Ne	Ne	Ano (10)	345,4	6.2	8,219
C118	CTRL	Žena	1934	Ne	Ano	Ne	79,4	6,0	9,242
C210	CTRL	Žena	1960	Ne	Ano	Ne	577,3	7,4	3,562
C310	CTRL	Muž	1929	Ne	Ano	Ne	127,05	8,5	6,859
C294	CTRL	Muž	1939	Ne	Ne	Ne	120,56	7,0	7,361
C187	CTRL	Muž	1949	Ne	Ne	Ne	123,56	7,5	3,689
C011	CTRL	Žena	1940	Ne	Ne	Ne	28,12	7,3	2,632
016	CTRL	Muž	1941	Ne	Ano	Ano (20)	111,21	7,9	10,515
C274	CTRL	Muž	1950	Ne	Ne	Ne	209,68	7,8	4,306
Cl 68	CTRL	Muž	1953	Ne	Ne	Ano (20)	69,67	8,5	10,008
C061	CTRL	Muž	1955	Ne	Ne	Ne	164,27	8,3	8,27
Cl 06	CTRL	Žena	1928	Ne	Ne	Ne	27,9	8,3	5,31
C207	CTRL	Muž	1937	Ne	Ano	Ne	82,02	8,7	10,79
C206	CTRL	Muž	1934	Ne	Ne	Ne	142,91	7,8	4,888
C221	CTRL	Žena	1929	Ne	Ano	Ne	210,16	8,0	4,3

Tabulky 2 a 3 shrnují popisné charakteristiky relevantních klinických a demografických údajů. Kompletní datový soubor obsahoval záznamy o 45 pacientech s primárním výskytem akutního infarktu, z toho 41 ve skupině AIM a 4 ve skupině AIMD6, a dále záznamy o 45 kontrolních pacientech. V datovém souboru bylo 60 mužů a 30 žen. Ve skupině AIM bylo 13 žen a 28 mužů, ve skupině AIMD6 2 muži a 2 ženy a ve skupině CTRL bylo 15 žen a 30 mužů. Ve skupině AIM bylo 10 kuřáků a 31 nekuřáků, ve skupině AIMD6 byly všechny osoby nekuřáci a ve skupině CTRL bylo 10 kuřáků a 35 nekuřáků. Co se týče diabetů mellitu Π. typu, ve skupině AIM bylo to 12 osob s touto diagnózou a 29 bez ní, ve skupině AIMD6 byly 2 osoby s touto diagnózou a 2 bez ní a konečně ve skupině CTRL (Kontroly) bylo 14 pacientů s touto diagnózou a 31 bez ní.

- 18CZ 303405 B6

Tabulka 2: Počty pacientů a procentuální vyjádření zastoupení popisných charakteristik kategorických veličin

Proměnná	Počty a procentuální údaje
	ve skupinách
AIM	AIMD6	Kontroly
Pohlaví	Muži	28 (68 %)	2 (50 %)	.30 (67 %)
Ženy	13 (32 %)	2 (50 %)	15 (33 %)
Kouření	Kuřáci	10(24%)	0(0%)	10(22%)
Nekuřáci	31(76%)	4(100%)	35 (78 %)
Diabetes mellitus Π. typu	ANO	12 (29 %)	2 (50 %)	14(31%)
NE	29 (71%)	2(50%)	31(69%)

Tabulka 3: Popisné charakteristiky spojitých veličin

Skupina	Věk pacienta
N	Průměrná hodnota	Směrodatná odchylka
AIM	41	63,6	9,18
AIMD6	4	72,3	4,73
Kontroly	45	65,5	9,42

Vzorky venózní krve odebrané od pacientů byly zpracovávány postupem podle příkladu 1. Data genové exprese byla analyzována pomocí lineárních modelů pro analýzu dat z microarray expe15 rimentů „limma“ (Smyth, G. K.: Linear model and empirical Bayes methods for assesing differential expression in microarray experiments, 2004, Stastistical Applications in Genetics and Molecular Biology 3, No. 1, Article 3, doi: 10.2202/1544 až 6115.1027), navržených pro statistický a grafický systém R (http://www.r-project.org) v rámci projektu Bioconductor (http://www.bioconductor.org). Data byla normalizována pomocí kvantilové normalizace (Smyth G. K. and Speed Τ. P.: Normalization of cDNA microarray data, 2003, Methods 31, 265 až 273, doi: 10.1016/j,physletb.2003.10.071). Šum signálu na pozadí Čipu, u kterého se předpokládá normální rozložení, byl odstraněn pomocí konvolučního modelu. Tento model předpokládá, že signál z čipů čtený pomocí skeneru je směsí normálně rozděleného šumu a exponenciálně rozděleného signálu intenzit genové exprese (Ritchie Μ. E., Silver J., Oshlack A., Holmes

M., Diyagama D., Holloway A., Smyth G. K.: A comparison of background correction methods for two-colour microarrays, 2007, Bioinformatics 23, 2700 až 2707, PMID: 17720982).

Medicínská hypotéza předpokládala možnost genetické determinace (predispozice) výskytu akutního infarktu myokardu vzhledem k obecné české populaci jak v populaci pacientů přeží30 vajících období šestiměsíčního sledování (kontrast AIM vs Kontroly), tak též u pacientů v tomto období zemřelých (kontrast AIMD6 vs Kontroly). Podobně byla předpokládána vyšší genetická zátěž u pacientů s výskytem infarktu, kteří zemřeli v období šestiměsíčního sledování, v porovnání s populací pacientů přežívající srdeční příhodu dlouhodoběji (kontrast AIMD6 vs AIM). Páro- 19CZ 303405 B6 vý statistický design byl zvolen s cílem snížit počty odhadovaných parametrů, které by jinak bylo nutné zohlednit jako možné zavádějící faktory (pohlaví, věk, výskyt kouření a diabetů mellitu) a dále odlišit klinickou a genetickou komponentu komplexního rizika výskytu akutní srdeční příhody. Síla statistických testů je navíc v párovém designu v porovnání s dvou- a vícevýběrovými plány statistických studií typicky vyšší.

Vzhledem k tomu, že o Illumina čipech je známo, že aktuální naměřené hodnoty intenzit genové exprese bývají na jednotlivých čipech plošně posunuty o neznámou konstantu, je tuto skutečnost nutné zohlednit v rámci statistické analýzy a odpovídající korekční konstanty je třeba odhadnout v lineárním modelu. Z tohoto důvodu také není vhodné uvažovat o korelacích mezi naměřenými hodnotami intenzit genové exprese a hodnotami klinických proměnných. Relevantní závěry proto nutně vycházejí pouze z výsledků obdržených z lineárního modelu, kde jsou lineární efekty jednotlivých čipů na hodnoty intenzit genové exprese adjustovány. Lineární statistický model (limma) zohledňoval vliv použitého čipu na hodnoty intenzit genové exprese. Intenzity genové exprese vstupovaly do lineárního modelu jako dvojkové logaritmy původních hodnot. Obrázky 2a a 2b ukazují diagnostiku lineárního modelu pro logaritmovaná data intenzit genové exprese při základu 2 pro všechny tři uvažované konstanty pomocí Q-Q kvantilových grafů. Ideální kvantilový Q-Q graf by měl mít shodné empirické a teoretické hodnoty kvantilů, takže všechny zobrazené hodnoty by ležely na přímce. Q-Q grafy shodně potvrzují, že použití lineárního modeluje ve všech třech případech adekvátní. Lineární model můžeme schematicky popsat následovně: log₂(intenzita) ~ pár + skupina, přičemž proměnná „pár“ identifikuje dvojici případu a odpovídající párové kontroly, která byla vždy umístěna na stejném Illuminu čipu. Proměnná „skupina“ kóduje příslušnost k populacím AIM, AIMD6 a Kontrol. Tento model je zobecněnou verzí párového testu.

Množiny genů identifikované na základě výsledků z lineárního limma modelu byly dále analyzovány pomocí PAM modelu, s jehož pomocí byla pro každý kontrast zjištěna podmnožina genů s prediktivními vlastnostmi v nezávislých výběrech. Lineárním modelem dříve zjištěné množiny genů mohou až „příliš dobře“ vysvětlovat konkrétní data, ze kterých jsou výsledky odvozeny (tzv. „over-fitting“), ovšem na úkor prediktivity v nezávislých výběrech. K tomuto účelu byl využit PAM model („Predictive Analysis for Microarrays“), který pomocí křížové validace a využití „shrinkage“ principu identifikuje podmnožinu genů, která by měla mít optimální vlastnosti z hlediska určování pravděpodobné příslušnosti sledovaných jedinců k některé ze sledovaných populací (AIMD6, AIM a Kontroly).

Za diferenciálně exprimované byly obecně považovány geny, které splňovaly jak podmínku statistické významnosti na hladině 5%, tak též klinické významnosti, která předpokládá, že dvojkový logaritmus podílu hodnot intenzit genové exprese je v absolutní hodnotě větší nebo roven jedné. Statistická analýza prokázala statisticky i klinicky významnou asociaci mezi krátkodobou úmrtností subjektů (v horizontu 6 měsíců po primární akutní srdeční příhodě) a jejich expresním genovým profilem u 15 genů v případě diagnostického kontrastu AIMD6 vs Kontroly a u 10 genů v případě prognostického kontrastu AIMD6 vs AIM. Prediktivní diagnostická množina genů pro kontrast AIM vs Kontroly čísla 13 genů a v limma modelu byla pouze statisticky signifikantní na hladině statistické významnosti a = 0,10. Tuto množinu již nebylo možné dále redukovat pomocí PAM modelu.

Popis výsledků

Geny resp. transkripty uvedené v následujících tabulkách specifikují prediktivní diagnostickou a prognostickou množinu genů pro kontrast AIM vs. kontroly, které byly získány následujícím postupem: nejprve byla pomocí limma modelu („Linear Models for Microarray Data“, http://bioinf.wehi.edu.au/limma/) na úrovni celého lidského genomu (na Illumina čipech verze 2 bylo zmapováno celkem 25036 genů) identifikována množina statisticky (q-hodnota<0,05) i kli-20CZ 303405 B6 nicky významných genů (| logr-fold change | >1, tj. alespoň dvojnásobná změna intenzity genové exprese směrem nahoru nebo dolů). Tato množina byla následně redukována aplikací prediktivního PAM modelu (Prediction Analysis for Microarrays, http://wwwstat.stanford.edu/~tibs/PAM/), navrženého k vyhledávání množin genů s prediktivními vlastnostmi v nezávislých výběrech. Výskyt opakovaných pozorování (tj. technických replikátů) u 7 pacientů byl na úrovni limma modelu ošetřen použitím smíšeného lineárního modelu pro korelovaná data. Sekvence sond jsou uvedeny v tabulce 5.

V Tabulce 4 je uvedena prediktivní množina genů identifikovaná v rámci vynálezu, která se vzhledem k obecné české populaci jeví z hlediska genové exprese jako diagnostická ve smyslu zvýšeného rizika výskytu akutního infarktu myokardu, bez fatálních následků v krátkodobém horizontu. Jedná se o sestavu genů, jejichž expresní intenzity, se ve skupinách pacientů s výskytem akutního infarktu myokardu bez fatálních následků do 6 měsíců od doby výskytu srdeční příhody (AIM) a pacientů kontrolních (Kontroly) odlišovaly statisticky významně na hladině statistické významnosti a-0,10. Tuto množinu již nebylo možné pomocí prediktivního modelu PAM dále redukovat.

Množina 13 genů resp. lokusů a transkriptů byla stanovena na základě celogenomové analýzy genové exprese vzorků lidské venózní krve odebrané z těla pacientů s primárních výskytem infarktu myokardu. Průměrné hodnoty logaritmované genové exprese při příkladu 2 v populacích AIM a Kontrol jsou uvedeny v Tabulce 6. Simultánně zvýšené hodnoty intenzit genové exprese 9 genů/lokusů uvedených v tabulkách (OLIG2, MS4A3, CEBPE, LÍPA, EPAS1, CLINT1, MYCT1, VPS29 a LOC 130951) a současně naopak hodnoty genové exprese u genů VNN3, FOS, LOC645649 a lidského T-buněčného receptoru (RefSeq_ID „M97723“) vzhledem ke kontrolní obecné české populaci, indikují příslušnost pacienta k rizikové populaci AIM. Obecně naznačují zvýšené riziko výskytu akutního infarktu myokardu bez fatálních následků v krátkodobém Časovém horizontu. Diagnóza na základě exprese genů, stanovené jak je popsáno v tomto vynálezu, by měla implikovat zvýšenou pozornost klinickým rizikovým faktorům výskytu akutního infarktu myokardu (např. výskyt diabetů mel litu, kouření, nadváha) a jejich cílené zvýšené prevenci.

Tabulka 4: Prediktivní diagnostická množina genů pro kontrast AIM vs Kontroly

Illumina Π)	Název / Lokus genu	RefSeqlD	Průměrná exprese	logiFC	q- hodnota	Pravděpod. Diff. Expr,
1240136	OLIG2	NM 005806.2	6,41	-0,891	0,0756	0,954
2810373	VNN3	NM 001024460.1	9,98	0,498	0,0756	0,966
3400551	MS4A3	NM 006138.4	7,82	-0,635	0,0756	0,908
10332	CEBPE	NM 001805.2	6,91	-0,447	0,0756	0,944
4250379	FOS	NM 005252.2	10,27	0,388	0,0756	0,974
1470070	LÍPA	NM 000235,2	10,17	-0,373	0,0756	0,978
4040148	LOC645649	XM 928663.1	8,01	0,286	0,0906	0,888
6940246	(M97723)	M97723	7,05	0,382	0,0756	0,949
780243	EPAS1	NM 001430,3	6,63	-0,314	0,0756	0,908
6370187	CLINT1	NM 014666.2	9,41	-0,246	0,0756	0,915
6280239	MYCT1	NM 025107.1	5,36	-0,150	0,0756	0,921
3400170	VPS29	NM 016226.2	10,57	-0,145	0,0756	0,912
4730343	LOC130951	NM 138804,2	5,14	-0,125	0,0756	0,920

Illumina ID... Illumina identifikátor genu

RefSeqJD ... NCBI Reference Sequence ID (“Accession number”)

-21 CZ 303405 B6

Průměrná exprese... Průměrná hodnota intenzit genové exprese ve spojeném souboru to&FC... Dvojkový logaritmus adjustovaného podilu intenzit ve skupinách AIMD6 a Kontrol q-hodnota ... Storeyho adjustace dosažené hladiny významnosti pro mnohonásobná porovnáváni (Storey JD, Tibshirani R. Statistical significance for genomewide studies. Proč Nati Acad Sci USA. 2003 Aug 5; 100(16):9440-5. Epub 2003 Jul 25. PubMed PMID: 12883005; PubMed Central PMCID: PMC170937.) Pravdépod. Diferenciální Exprese... Pravděpodobnost, Že sledovaný gen je skutečně diferenciálně exprimován

Tabulka 5: Sekvence sond prediktivní diagnostické množiny genů pro kontrast AIM vs Kontroly

Illumína ID	Sekvence sondy	Definice
1240136	CACAAATGGTAAACTCCTCC ACGTGCTTCCTGCGTTCCGT GCAAGCCGCC	Lidský oligodendrocytový transkripčnl faktor 2 (Homo sapiens oligodendrocyte iineage transcription factor 2 (OUG2)), mRNA.
2810373	GGCCCTGTATGGAAGAGTGT TTGAGAAGGACCCTCCACGC TTAGGGCAGG	Lidský vanín 3, transkripčnl varianta 3 (Homo sapiens vanin 3 (VNN3), transcript variant 3), mRNA.
3400551	GTTGGCGAGTCTGAGAGCA AGCCCAAATGTGTTCTTCAA AGGACAATGGG	Lidské membránové domény 4, podrodina A, člen 3, transkripčnl varianta 1 (Homo sapiens membrane-spanning 4-domains, subfamily A, mernber 3 (hematopoietic celi-specific) (MS4A3), transcript variant 1), mRNA.
10332	AGCAGCTCACCCAGGAGCT AGACACCCTCCGCAACCTCT TCCGCCAGATT	Lidský CAAT/zesilovač vážící protein, epsilon (Homo sapiens CAAT/enhancer binding protein (C/EBP), epsilon (CEBPE)), mRNA.
4250379	CCCAGTGACACTTCAGAGA GCTGGTAGTTAGTAGCATGT TGAGCCAGGCC	Lidský homolog v-fos FBJ myšího onkogenu virového ostaosarkomu (Homo sapiens v-fos FBJ murine osteosarcoma viral oncogene homolog (FOS)), mRNA.
1470070	CCCGCTACTGTCGTTATTGA TCACATCTGTGTGAAGCCAA AGCCCCGTGG	Lidská lipáza A, lysosomální kyselina, cholesterol esteráza, transkripčnl varianta 2 (Homo sapiens lipase A, lysosomai acid, cholesterol esterase (LÍPA), transcript variant 2), mRNA.
4040148	TGCAGGTCCTTTGTATGCTG AGCGCCGGTCCCCTAGGCCC ACTGTTGTTT	Lidský předpokládaný protein LOC 645649 (PREDICTED: Homo sapiens hypothetical protein LOC645649 (LOC645649)), mRNA.
6940246	GTACCGTCAGCAACCTGGAC AGAGCCTGACACTGATCGC AACTGC AAATC	Lidský T-buněČný receptor (Human T-cell receptor (V beta 4.1 -variant, J beta 2.1, C beta 2)) mRNA.
780243	r AGCTGCACGGCATTACCCC A CACAGGGTGGCAGAACTTG AAGGGTTACTG	Lidský endoteliální PAS doménový protein 1 (Homo sapiens endothelial PAS domain protein 1 (EPAS1)), mRNA.
6370187	TGGCAAGGCTTCCTTCCGTG TTTATCCCTGTAGCCATCAT TTAAGTCAGG	Lidský klathrinový interaktor 1 (Homo sapiens clathrin interactor 1 (CLLNTl)), mRNA.
6280239	AGTGGCTGTGAACGTCGAA GCAACCTCAGCCTGGCCAGT CTCACCTTCCA	Lidský cíl myc 1 (Homo sapiens myc target 1 (MYCT1)), mRNA.
3400170	GCCCTGTTGCAGAGGCAATT TGATGTGGACATTCTTATCT CGGGACACAC	Lidský vakuolámí protein 29, transkripčnl varianta 1 (Homo sapiens vacuolar protein sorting 29 (yeast) (VPS29), transcript variant 1),

-22 CZ 303405 B6

		mRNA.
4730343	AATCCAAGCCTCATTTCAGA GCCTGTGCCCTTCCCACTAC ACCACCAGGC	Lidský předpokládaný protein BC014602 (Homo sapiens hypothetical protein BCO14602 (LOC130951)), mRNA.

Tabulka 6: Průměrné hodnoty logaritmovaných genových expresí prediktivní diagnostické 5 množiny genů pro kontrast AIM vs Kontroly

Illumina ID	Název/ Lokus Genu	Průměrná Exprese
AIM	Kontroly^
1240136	OLIG2	5,99	6,88
2810373	VNN3	10,20	9,69
3400551	MS4A3	7,56	8,17
10332	CEBPE	6,68	7,13
4250379	FOS	10,43	10,04
1470070	LÍPA	10,02	10,35
4040148	LOC645649	8,15	7,85
6940246	(M97723)	7,26	6,92
780243	EPAS1	6,45	6,75
6370187	CUNT1	9,29	9,52
6280239	MY CTI	5,28	5,43
3400170	VPS29	10,50	10,64
4730343	LOC130951	5,10	5,20

(*) Referenční hladina intenzity genové exprese pro posouzení zvýšeného kardiovaskulárního rizika

Porovnáním hladin genové exprese ve skupinách AIM a Kontrol bylo zjištěno celkem 13 genů s „up—“ resp. „down-regulovanou“ genovou expresí. Z toho 4 geny vykazovaly zvýšené hladiny (VNN3, podobně jako v případě kontrastu AIMD6 vs Kontroly), a dále FOS, M97723 a LOC645649. Zbývajících 9 genů demonstrovalo snížené hladiny genové exprese (OLIG2,

CEBPE, LÍPA, MS4A3, EPAS1, CLINT1, VPS29, LOC130951 a MYCT1). U dvou ze sedmi uváděných genů lze biologickou funkci popsat jako enzymatickou aktivitu - VNN3 (vanin 3) a LÍPA. Dva zástupce lze popsat jako struktury blízké buněčným receptorům - RefSeq_ID M97723.1, T-buněčný receptor, který je složen z variant podjednotek V, J, C (V, beta 4.1varianta, J, beta 2.1-varianta a C, beta 2-varianta, MS4A3, transmembránový protein spo20 tenciálními fosfory lačním i místy na N- i C-konci, může hrát roli v signální transdukci hematopoetických buněk. Zbylých 9 genů lze popsat jako geny kódující struktury proteinové povahy s regulačními vlastnostmi - MYCT1, up-stream transkripční aktivátor v buňce, OLIG2, transkripční faktor ovlivňující některé fáze buněčného cyklu, FOS, CEBPE, regulační vazebné proteiny, EPAS1, u nějž byla pozorována role v odpovědi na hypoxícké stavy v placentě či plicích a již v roce 1997 byl popsán jako důležitý regulátor vaskularizace, CLINT1, z mála informací o biologické roli tohoto proteinu lze zmínit jeho účast ve zpětném transportu endogenních tzv. „cargo“-proteinů, VPS29, gen kódující tzv. „třídicí“ vakuolámí protein, jehož biologická funkce je lokalizována do lysozomů LOC645649 a LOC130951, oba dva hypotetické proteiny, jejichž funkce dosud popsána nebyla. LOC645649 byl odstraněn z NCBI databáze.

Výsledky bootstrap studie pro ověření prediktivních vlastností vybraných genových sekvencí

-23CZ 303405 B6

Prediktivní vlastnosti transkriptů byly z hlediska nezávislých výběrů posuzovány pomocí bootstrap studie zaměřené na hodnocení senzitivity (SE) a specificity (SP) klasifikace na základě PAM modelu. Bootstrap studie zahrnovala analýzu 1000 náhodných výběrů pořízených s opakováním z odpovídajících populací o témže rozsahu. Výsledky studie jsou shrnuty v Tabulce 7.

Tabulka 7: Výsledky bootstrap studie na posouzení senzitivity a specifity PAM klasifikačního testu v nezávislých výběrech.

Kontrast	Výsledky PAM klasifikace (počet transkriptů použitých pro klasifikaci)
AIM vs Kontroly	SE= 0,73, SP= 0,87 (13 transkriptů)

Pro diagnostiku populace AIM (kontrast AIM vs Kontroly) jsou poněkud nižší hodnoty senzitivity a specificity klasifikačního testu na základě PAM modelu vzhledem k obecné české populaci dány obtížnou rozlišitelností z hlediska klinického, a to zejména nižšími hodnotami log₂FC, které nedosahovaly požadované úrovně klinické významnosti.

Claims (3)

20 PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob identifikace osob se zvýšeným genetickým rizikem výskytu akutního infarktu myokardu, a popřípadě s nízkým rizikem následného úmrtí v důsledku kardiovaskulárních komplikací

25 do 6 měsíců od okamžiku výskytu akutního infarktu myokardu, vyznačený tím, že se v biologickém vzorku odebraném z těla pacienta stanoví intenzita exprese sady genů a genetických lokusů:

Název / Lokus genu SEQ ID No. Referenční hodnota intenzity exprese (nízké riziko) stanovená na celogenomovém / oligon ukleotidovém čipu Min. odchylka od ref. hodnoty exprese, značící zvýšené riziko OLIG2 1 6,88 -0,891 VNN3 2 9,69 0,498 MS4A3 3 8,17 -0,635 CEBPE 4 7,13 -0,447 FOS 5 10,04 0,388 LÍPA 6 10,35 -0,373 LOC645649 7 7,85 0,286 (M97723) 8 6,92 0,382 EPAS1 9 6,75 -0,314 CLINT1 10 Γ 9,52 -0,246 MYCT1 11 5,43 -0,150 VPS29 12 10,64 -0,145 LOC130951 13 5,20 -0,125

-24CZ 303405 B6 a její logaritmovaná hodnota při základu 2 se srovná s referenční hodnotou intenzity exprese, přičemž odchylka od referenční hodnoty rovná alespoň minimální odchylce u všech genů a genetických lokusů dané sady značí zvýšené riziko.

2. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, že biologickým vzorkem odebraným z těla pacienta jsou buňky periferní krve.

3. Oligonukleotidový čip pro identifikaci osob se zvýšeným genetickým rizikem výskytu akutio ního infarktu myokardu a popřípadě s nízkým rizikem následného úmrtí v důsledku kardiovaskulárních komplikací do 6 měsíců od okamžiku výskytu akutního infarktu myokardu, vyznačený tím, že obsahuje právě sondy hybridizující s DNA či RNA sady genů či genetických lokusů:

Název / Lokus genu SEQ ID No. OLIG2 1 VNN3 2 MS4A3 3 CEBPE 4 FOS 5 LDPA 6 LOC645649 7 (M97723) 8 EPAS1 9 CLINT1 10 MYCT1 11 VPS29 12 LOC130951 13