CZ303378B6 - Zpusob identifikace osob se zvýšeným genetickým rizikem výskytu infarktu myokardu - Google Patents

Abstract

Rešení popisuje zpusob identifikace osob se zvýšeným genetickým rizikem výskytu akutního infarktu myokardu, se zretelem k prípadným fatálním následkum v dusledku kardiovaskulárních komplikací v casovém horizontu do 6 mesícu od okamžiku výskytu srdecní príhody, spocívající v tom, že se v biologickém vzorku odebraném z tela pacienta stanoví intenzita exprese genu a genetických lokusu ECHDC3, IL18RAP, PFKFB2, IRS2, PHACTR1, ERLIN1, VNN3, ADORA3, CLEC4E, ASPRV1, PFKFB2, CPD, FKBP5, PRKDC, NPM1 a SAMSN1. Logaritmovaná hodnota intenzity exprese pri základu 2 se následne srovná s referencní hodnotou intenzity exprese, pricemž odchylka od referencní hodnoty rovná alespon minimální odchylce u všech uvedených genu a genetických lokusu znací zvýšené riziko.

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká způsobu identifikace osob v české populaci, které vykazují zvýšené genetické riziko výskytu akutního infarktu myokardu, se zřetelem k jejich přežití v krátkodobém Časovém horizontu od doby výskytu srdeční události. Identifikace je prováděna na základě stanovení profilu genové exprese vybraných genů lidského genomu.

Dosavadní stav techniky

Infarkt myokardu a cévní mozková příhoda jsou dvěma nejzávažnějšími klinickými projevy ate15 rosklerózy. Riziko rozvoje těchto onemocnění se odhaduje na základě známých rizikových faktorů. Rozsah onemocnění je v současnosti zjišťován řadou vyšetření, jakými jsou např. scintigrafie, magnetická rezonance, katetrizační vyšetření. Každé z těchto vyšetření má však i svá omezení, např. radiační zátěž nebo invazivitu vyšetření. Aterosklerotické pláty jsou zkoumány na buněčné i molekulární úrovni, včetně sledování buněk v cirkulaci jako odpovědi na zánětlivý proces

2o v cévách.

Identifikace genů pomocí molekulárně biologických metod znamenala v posledních letech výrazný posun nejen v odhalení příčin některých závažných, život ohrožujících, onemocnění člověka (např. některé onkologické diagnózy, závažné dědičné poruchy metabolismu člověka či další poruchy neuromuskulámího gastrointestinálního a oběhového systému, včetně aterosklerózy atd.), ale v neposlední řadě také významně rozšířila naše znalosti o vzniku a rozvoji akutního infarktu myokardu (A1M) (Yukihiro Hojo, Uichi lkeda, Yun Zhu, Motoi Okada, Shuichi Ueno, Hiroschi Arakawa, Hideyuki Fujikawa, Taka-aki Katsuki, and Kazuyuki Shimada. Expression of vascular endothelial growth factor in patients with acute myocardial infarction. J Am Coll Car30 diol, 35(4):968-973, March 2000; Merry L. Lindsey. MMP Induction and Inhibition in Myocardial Infarction. Heart Failure Reviews, 9(1):7-19, January 2004). Detailnějším pochopením jednotlivých stádií IM se dostávají do popředí i otázky možnosti prevence a účinnější léčby onemocnění. S rozvojem moderních technologií se molekulárně biologický výzkum obecně posouvá od klasického modelu odhalování konkrétních genetických lokusů, resp. genetických polymor35 fismů, působících poruchu jednoho genu ke snaze monitorovat polygenní a multifaktoriální poruchy člověka pomocí genomických a expresních čipů, jejichž analýza v současnosti poskytuje komplexnější obraz onemocnění (Joseph S. Verducci, Vincent F. Melfí, Shili Lín, Zailong Wang, Saschwati Roy, and Chandan K. Sen. Microarray analysis of gene expression: considerations in data mining and statistical treatment. Physiological Genomics, 25(3):355-363, May 2006). Pře40 devším studium tzv. expresních čipů zažívá v lékařských vědách velký rozvoj, protože umožňuje posoudit mnoho genových transkriptů a jejich expresních variant najednou v kritickém stádiu onemocnění (multivarianční analýza, randomizační studie) (Lawrence W. Stanton, Lisa J. Garrard, Deborah Damm, Brett L. Garrick, Andrew Lam, Ann M. Kapoun, Qiang Zheng, Andrew A. Protter, George F, Schreiner, and R. Tyler White. Altered Pattems of Gene

Expression in Response to Myocardial Infarction. Circ Res, 86(9):939-945, May 2000; Matthew B. Lanktree and Robert A. Hegele. Gene-gene and gene-envíronment interactions: new insights into the preventin, detection and management of coronary artery disease. Genome medicine, 1(2):28, February 2009),

Recentní práce posledních 5 let se intenzivně zabývají z mnoha úhlů pohledu nejen expresními profily osob s aterosklerózou, ale také osob s ischemickou chorobou srdeční ve vztahu ke vznikajícím zánětlivým procesům v cévách (Gemma Satterthwaite, Sheila E. Francis, Kim Suvama, Stephen Blakemore, Chantelle Ward, Don Wallace, Martin Braddock, and David Crossman. Differential gene expression in coronary arteries from patients presenting with ischemic heart disease: further evidence for the inflammatory basis of atherosclerosis. American heart Journal,

- 1 CZ 303378 B6

150(3):488-499, September 2005), osob s ischemickou a neischemiekou kardiomy opati í při srdečním selhání (Michelle M. Kittleson, Khalid M. Minhas, Rafael A. Irizarry, Shui Q. Ye, Gina Edness, Elayne Breton, John V. Conte, Gordon Tomaselli, Joe G. Garcia, and Joshua M. Hare. Gene expression analysis of ischemic and nonischemic cardiomyopathy: shared and dístinct genes in the development of heart failure. Physiological genomics, 21(3):299-307, May 2005; Michelle M. Kittleson, Shui Q. Ye, Rafael, A. Irizarry, Khalid M. Minhas, Gina Edness, John V. Conte, Giovanni Parmigiani, Leslie W. Miller, Yingjie Chen, Jennifer L. Halí, Joe G. Garcia, and Joshua M. Hare. Identification of a gene expression profile that differentiates between ischemic and nonischemic cardiomyopathy. Circulation, 110(22):3444-3451, November 2004) a dále také io osob s poškozením koronárních cév (James A. Wingrove, Susan E. Daniels, Amy J. Sehnert, Whíttemore Tingley, Michael R. Elashoff, Steven Rosenberg, Lutz Buellesfeld, Eberhard Grube, L. Kristin Newby, Geofírey S. Ginsburg, and William E. Kraus. Correlation of Peripheral-Btood Gene Expression With the Extent of Coronary Artery Stenosis i CLINICAL PERSPECTIVE. Circulation: Cardiovascular Genetics, 1(1):31-38, October 2008; Ramachandran S, Vasan and

Calum A. MacRae. A dream, a joumey, and a promise: the inauguration of Circulation: Cardiovasculare Genetics. Circulation. Cardiovascular genetics, 1(1):1-2, October 2008; Daphne, Maroeska M. Rovers, Diederick E. Grobbee, Joannes, J. Marx, Jill Waalen, Christina Ellervik, Borge G, Nordestgaard, John K. Olynyk, Peter R. Mills, James Shepherd, Bernard Grandchamp, Jolanda M. Boer, Calogero Caruso, Marcello Area, Beat J. Meyer, and Yvonne T. van der

Schouw. Mutations in the HFE gene and cardiovasculars disease risk: an individual patient data meta-analysis of 53 880 subjects. Circulation Cardiovascular genetics, 1(1):43-50, October 2008).

Nárůst četnosti vědeckých prací v roce 2009, zabývajících se akutním infarktem myokardu, uka25 zuje nejen narůstající zájem o tuto problematiku, ale také závažnost studovaného tématu (Kahraman Tanriverdi and Jane E. Freedman. Blood and Cardiovascular Disease. Circulation: Cardiovascular Genetics, 1(1):7-9, October 2008). Také další vědecké práce hledají v poslední době příčinné vztahy mezi projevy některých genů a vznikem akutního infarktu myokardu (AIM). To, že se jedná o komplexní proces, zahrnující celou řadu genů či pouze jejich částí (polymorfní místa), je všeobecně znám. Jsou popsány polymorfismy ve struktuře endoteliálního růstového faktoru, diskriminující pacienty s AiM, u nichž se vyvinulo srdeční selhání (Panagiotis Douvaras, Dionisios G., Antonatos, Kiriaki Kekou, Sotirios Patsilinakos, George Chouliaras, Apostolos Christou, Anastasios Andrikou, and Emmanuel Kanavakis. Association of VEGF gene polymorphisms with the development of heart failure in patients after myocardial infaretion. Cardiology,

114(1):11-18,2009).

Je popsán vliv akutní koronární okluze na uvolňování ateriálního natřiuretického peptidu, který působí na vasodilatacj, natriurézu a zánětlivou odpověď, čímž zvyšuje rozsah infarktu myokardu a mortalitu (Aiilyan K. Houng, Ráchel A. McNamee, Attila Kemer, Pallavi Sharma, Almois

Mohamed, Jonathan Tronolone, and Guy L. Reed. Atrial natři u ret i c peptide ínereases inflammation, infaret size, and mortality after experimental coronary occlusion. American Journal of physiology. Heart and circulatory physiology, 296(3):H655-H661, March 2009). Popisována je rovněž exprese kininových a jiných receptorů (June Yun, Michael J. Zuscik, Pedro GonzalesCabrrea, Dan F. McCune, Sean A. Ross, Robert Gaivin, Michael T. Piascik, and Dianne M.

Perez. Gene expression profiling of alpha( 1 b)-adrenergic receptor-induced cardiac hypertrophy by oligonucleotide arrays. Cardiovascular research, 57(2):443-455, February 2003), které podporují aktivaci cirkulujících mononukleárů u pacientů s akutním koronárním syndromem (AKS).

Změny založené v extracelulámí matrix jsou určující pro myokardiální remodelaci po IM. Mohou být významným faktorem pro zánětlivou odpověď a mohou přispívat ke stabilizaci a kompenzatomím mechanizmům pro udržení srdečního výdeje. Ovlivňují též angiogenezi, proliferací a diferenciaci buněk (Fabio D'Aguiar D. Mataveli, Sang Won W. Han, Helena Bonciani B, Ňader, Afině Mendes, Rose Kanishiro, Paulo Tucci, Antonio Carlos C. Lopes, Jose Carlos Costa C. Baptista-Silva, Ana Paula Cleto P. MaroIIa, Leonardo Pinto P. de Carvalho, Priscila Martins

Andrade M. Denapoli, and Maria Aparecida de Silva A. Pinhal. Long-term effects for acute

-2CZ 303378 B6 phase myocardial infarct VEGF165 gene transfer cardiac extracellular matrix remodeling. Growihfactors (Chur, Switzerhmd). 27(1):22-31, February 2009). Objevují se i studie zaměřené na hledání konkrétních polymorfismů ve struktuře DNA, které by mohly mít přímou souvislost s vývojem ischemické choroby srdeční (C. Federici, N. Botto, S. Manfredi, A. Rizza, M. Fiandra, and M. Andreassi, Relation of Increased Chromosomal Damage to Future Adverse Cardiac Events in Patients With Known Coronary Artery Diease. The American Journal of Cardiology, 102(10):1296-1300, November 2008). Recentní molekulárně genetické (expresní) studie jsou prováděny např. na desítkách osob s chronickým srdečním selháním (Cappuzzello C., Napolitano M., Arcellí D., Melillo G., Melchionna R., DiVito L., Karlini D., Silvestři L., Brugaletta S., io Liuzzo G., Crea F., Capogrosso M. C.: Gene expression profiles in peripheral blood mononuclear cells of chronic heart failure patients, Physiol. Genomics, 2009, 38:233-240), na pacientech s onemocněním koronárních artérií (Meier P., Antonov J., Zbinden R., Kun A., Zbinden S., Gloekler S., Delorenzi M., Maggi R., Seiler C.: Non-invasive geen-expression-based detection of well-developed collateral function in individuals with and without coronary artery disease,

Heart, 2009, 95:900-908; Erdmann J., Grosshennig A., Braund P. S., et al.: New susceptibility locus for coronaiy artery disease on chromosome 3q22.3, Nat. Genet., 2009, D01:10.1038/ng.307; Tregouet D. A., Konig 1. R., Erdmann J., et al.: Genome-wide haplotype association study identifies the SLC22A3-LPAL2—LP A gene cíuster as a risk locus for coronary artery disease, Nat Genet, 2009, DOI: l0.l038/ng.3l4) či na sekreČním materiálu osob s chronickou ischémií (Józefa Dabek, Aleksander Owczarek, Zbigniew Gasior, Rafal Ulczok, Mariusz Skowerski, Andrzej Kulách, Urszula Mazurek, and Andrzej Bochenek. Oligonucleotide microarray analysis of genes regulating apoptosis in chronically ischemic and postinfarction myocardium, Biochemical genetics, 46(5-6):241-247, June 2008).

Několik vědeckých týmů v čele s mezinárodním konsorciem pro genetiku infarktu myokardu (Myocardial Infarction Genetics Consortium, http://www.nature.com/ng; David Seo, Geoffrey S. Gainsburg, and Pascal J. Goldschmidt-Clermont. Gene Expression Analysis of Cardiovascular Diseases: Novel Insights Into Biology and Clinical Applications. J. Am. Coli Cardiol, 48(2):227235, July 2006; David Seo, Tao Wang, Holly Dressman, Edward E. Herderick, Edwin S. Iversen,

Chunming Dong, Korkut Vata, Carmelo A. Milano, Fabio Rigat, Jennifer Pittman, Joseph R. Nevins, Míke West, and Pascal J. Goldschmidt-Clermont. Gene Expression Phenotypes of Atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vose Biol, 24(10):1922-1927, October 2004) se zabývá genetickými asociačními studiemi ve vztahu k infarktu myokardu (Iris M. Heid, Eva Boes, Martina Miiller, Barbara Kollerits, Claudia Lamina, Stefan Coassin, Christian Gieger, Angela Dóring,

Norman Klopp, Ruth Frikke-Schmidt, Anně Tybjaerg-Hansen, Anita Brandstátter, Andreas Luchner, Thomas Meitinger, Wichmann, and Florian Kronenberg. Genome-Wide Association Analysis of Htgh-Density Lipoprotein Cholesterol in the Popu lat ion-Based KORÁ Study Sheds New Light on Intergenic Regions i CLINICAL PERSPECTIVE. Circulation: Cardiovascular Genetics, 1(1):10-20, October 2008; Gudbjartsson D. F., Bjomsdittir U.S., Halapi E., et al.:

•to Sequence variants afTecting eosinophil numbers associate with astma and myocardial infarction, Nat. Genet. 2009, DOI: 10.l038/ng.323; Ozaki K., Sáto H., Inoue K., et al.: SNPs in BRAP associated with risk of myocardial infarction in Asian population, Nat Genet., 2009, DOI:10.1038/ng.326).

Snaha včas predikovat nastupující příznaky infarktu myokardu (postupně nastupující stres vyvíjející se až do šoku) je dnes řešena klinickou diferenciální diagnostikou, funkčními testy, resp. statimovým měřením základních biochemických markérů pro AIM. Toto užívané schéma diagnostiky je používáno (u pacienta při první události) bez jakékoliv možnosti monitorovat (predikovat) celkový stav organismu v období před AIM. Přesnějším charakterizováním základního expresního profilu pacienta přežívajícího i nepřežívajícího akutní stadium infarktu myokardu a jeho porovnáním s vybranými osobami kontrolního souboru české populace, se otevírá do budoucna reálná možnost průběžného, ekonomicky dostupného sledování osob přežívajících infarkt myokardu a jeho porovnáním s vybranými osobami kontrolního souboru české populace, se otevírá do budoucna reálná možnost průběžného, ekonomicky dostupného sledování osob přežívajících infarkt myokardu (období do 3-6 měsíců po první a další události).

-3CZ 303378 B6

Pokusy o expresní analýzu a průběžné monitorování nej různějších, především ale nádorových, onemocnění člověka byly již učiněny. Jsou dnes připravovány nejrůznější selektivní expresní sady genů, které charakterizují nejen aktuální stav organismu, ale také mohou monitorovat úspěšnost a adekvátnost léčby (David T. Miller, Paul M. Ridker, Peter Libby, and David J. Kwiatkowski. Atherosclerosis: The Path From Genomics to Therapeutics. ./ Am Coli Cardiol, 49(15):1589-1599, Apríl 2007). Tyto snahy jsou zřejmé v posledních letech i v oblasti diagnostiky některých kardiovaskulárních poruch člověka (P. Meier, J. Antonov, R. Zbinden, A. Kuhn, S. Zbinden, S. Gíoekler, M. Delorenzi, R. Jaggi, and C. Seiler. Non-invasive gene-expression— io based detection of well-developed colateral function in individuals with and without coronary artery disease, Heart, 95(11):900-908, June 2009; Józefa Dabek, Aleksander Owczarek, Zbigniew Gasior, Rafal Ulczok, Maríusz Skowerski, Andrzej Kulách, Urszula Mazurek, and Andrzej Bochenek. Oligonucleotide microarray analysis of genes regulating apoptosis in chronically ischemic and postinfarction myocardium. Biochemical genetics, 46(5-6):241-247, June 2008;

Claudia Cappuzzello, Monica Napolitano, Diego Arcelli, Guido Melíllo, Roberta Melchionna, Luca Di Vito, Daniele Carlini, Lorena Silvestři, Salvátore Brugaletta, Giovanna Liuzzo, Filippo Crea, and Maurizio C, Capogrossi. Gene expression profíles in peripheral blood mononuclear celíš of chronic heart failure patients. Physiological genomics, 38(3):233-240, August 2009), dosud však není známa studie snažící se predikovat prognózu pacienta s AIM.

V posledních letech celosvětově vzrůstající prevalence kardiovaskulárních chorob člověka motivuje stále intenzivněji vědeckou veřejnost k hledání nových strategií diagnostiky a léčby (James A. Wingrove, Susan E. Daniels, Amy J. Sehnert, Whittemore Tingley, Michael R. Elashoff, Steven Rosenberg, Lutz Buellesfeld, Eberhard Grube, L. Kristin Newby, Geoffrey S. Ginsburg, and

William E. Kraus. Correlation of Peripheral-Blood Gene Expression With the Extent of Coronary Artery Stenosis / CLINICAL PERSPECTIVE. Circulation: Cardiovascular Genetics, 1(1):3138, October 2008; Peter R. Sinnaeve, Mark P. Donahue, Peter Grass, David Seo, Jacky Vonderscher, Salah-Dine D. Chibout, William E. Kraus, Michael Sketch, Charlotte Nelson, Geoffrey S. Ginsburg, Pascal J. Goldschmidt-Clermont, and Christopher B. Granger. Gene expression pattems in peripheral blood correlate with the extent of coronary artery disease. PloS one, 4(9), 2009; Ruby C. Y. Lin, Kate L. Weeks, Xiao-Ming Gao, Rohan B. H. Williams, Bianca C. Bemardo, Helen Kiriazis, Vance B. Matthews, Elizabeth A. Woodcock, Russell D. Bouwman, Janelle P. Mollica, Helen J. Speirs, lan W. Dawes, Roger J. Daly, Tetsuo Shioi, Seigo Izumo, Mark A, Febbraio, Xiao-Jun Du, and Julie R. McMullen. Pi3k(pl lOalpha) protects against myo35 cardial infarction-induced heart failure: Identification of pi3k-regulated mima and mma. Arterioscler Thromb Vose Biol, 30(4):724-732, Apríl 2010; Orfeas Liangos, Sophie Domhan, Christian Schwager, Martin Zeier, Peter E. Huber, Francesco Addabbo, Michael S. Goligorsky, Lynn Hlatky, Bertrand L. Jaber, and Amir Abdollahi. Whole blood transeriptions in cardiac surgery identifies a gene regulátory network connecting ischemia reperfusion with systemic inflam40 mation. PloS one, 5(10), 2010) a využívání nových technologií, jakými jsou na příklad metaanalýzy velkých souborů studovaných osob či tzv. GWAS (Genome-wide association studies) studií (John P. A. loannidis. Prediction of Cardiovascular Disease Outcomes and Established Cardiovascular Risk Factors by Genomen-Wide Association Markers / CLINICAL PERSPECTIVE. Circulation: Cardiovascular Genetics, 2(1):7-15, February 2009; Jeanette Erdmann,

Patrick Linsel-Nitschke, and Heribert Schunkert. Genetic causes of myocardial infaretion: new insights from genome-wide association studies. Deutsches Árzteblatt International, 107(40):694699, October 2010).

Výsledky rozsáhlé GWAS studie (Myocardial Infarctin Genetics Consortium, Sekar Kathiresan,

Benjamin F. Voight, Shaun Purcell, Kiran Musunuru et al Genome-wide association of earlyonset myocardial infaretion with single nucleotide polymorphisms and copy number variants. Nátuře genetics, 41(3):334-341, March 2009) potvrdily asociaci několika genů s ranným výskytem akutního infarktu myokardu, z nichž některé byly též potvrzeny analýzami našich dat. Jedná se především o gen PHACTR1 (fosfatáza a regulátor aktinu 1), který se ve srovnání s obecnou českou populací ukazuje na základě našich dat jako prediktivní u pacientů, kteří

-4CZ 303378 B6 z kardiovaskulárních příčin zemřeli v průběhu 6-měsíčního sledování po primární srdeční příhodě, dále též gen MRPS6 (mitochondriální ribozomální protein), jehož varianty MRPL9, MRPL39, MRPL48, MRPS33 a MRPS30 byly statisticky významné také v našich datech, nikoliv však klinicky a neprosadily se do množin genů s prediktivními vlastnostmi. Nejsou proto uvádě5 ny v našich konečných výsledcích. Varianty WDR57, WDR61 a WDR75 genu WDR12 identifikovaného v této publikaci byly podobně statisticky, nikoliv však klinicky významné v našich datech. Naopak geny CDKN2A, CDKN2B identifikované v souvislosti s incidencí akutního infarktu myokardu ve výše zmíněné publikaci a dále např. v publikaci autorů Anna Helgadottir, Gudmar Thorleifsson, Andrei Manolescu, Solveig Gretarsdottir, Thorarinn Blondal, Aslaug

Jonasdottir, Adalbjorg Jonasdottir, Asgeir Sigurdsson, Adam Baker, Amar Palsson, Gisli Masson, Daniel F. Gudbjartsson, Kristinn P. Magnusson, Karl Andersen, Allan 1. Levey, Valgerdur M. Backman, Sigurborg Matthiasdottír, Thorbjorg Jonsdottir, Stefan Palsson, Helga Einarsdottir, Steinunn Gunnarsdottir, Amaldur Gylfason, Viola Vaccarino, W. Craig Hooper, Muredach P. Reilly, Christopher B. Granger, Harland Austin, Daniel J. Rader, Svati H. Shah,

Arshed A. Quyyumi, Jeťfrey R. Gulcher, Gudmundur Thorgeirsson, Unnur Thorsteinsdottir, Augustine Kong, and Kari Stefansson. A common variant on chromosome 9p21 affects the risk of myocardial infaretion. Science (New York, N.Y.), 316(5830):1491-1493, June 2007, nebyly v našich datech v souvislosti s výskytem akutního infarktu myokardu zjištěny.

ό Áecentní publikace z roku 2010 naznačují stoupající zájem o aplikaci moderních metod pro studium kardiovaskulárního systému člověka, mezi něž se zařazuje i technologie celogenomové expresní analýzy. Tato technologie umožňuje získávat informace o okamžité odpovědi organismu la akutní stádia závažných, život ohrožujících, onemocnění, jakými jsou např. mrtvice či infarkt myokardu. Dovoluje nám současně i nový pohled na desetiletí známý proces. Využitím mono25 nukleárních buněk periferní krve jako zkoumaného materiálu se naskýtá reálná možnost získat expresní profily ze snadno a rutinně dostupného biologického materiálu a z těchto profilů poté vytipovat ty signifikantní hladiny genové exprese, které by mohly charakterizovat určitá stádia onemocnění. Takto získaná data se dají v budoucnu použít jako základ pro zlepšení diagnostického komfortu pacienta. Ze studií publikovaných na konci roku 2009 a v průběhu roku 2010 lze zmínit práce, zabývající se úlohou hladin HDL a LDL frakcí cholesterolu či celkového cholesterolu ve vztahu ke genetické predispozici kardiovaskulárních chorob (Anna C. Calkin and Peter Tontonoz. Genome-Wide Association Studies Identity New Targets in Cardiovascular Disease. Science Translational Medícine, 2(48):48-94, 2010; Rong Yang, Lin Li, Sara Bretschger B. Seidelmann, Gong-Qing Q. Shen, Sonia Sharma, Shaoqi Rao, Kalil G. Abdullah, Kenneth G.

Mackinlav, Robert C. Elston, Qiuyun Chen, Eric J. Topol, and Qing Kenneth K. Wang. A genome-wide línkage scan identifies multiple quantitative trait loci for HDL-cholesterol levels in families with premature CAD and MI. Journal of lipid research, 51(6):1442-1451, June 2010), nebo práce snažící se predikovat významné geny exprimující se v akutním stádiu mrtvice (Boryana Stamova, Huichum Xu, Glen Jickling, Cheryl Bushnell, Yingfang Tian, Bradley P.

Ander, Xinhua Zhan, DaZhi Liu, Renee Turner, Peter Adamczyk, Jane C. Khoury, Arthur Pancioli, Edward Jauch, Joseph P. Broderick, and Frank R. Sharp. Gene Expression Profiling of Blood for the Prediction of Ischemic Stroke. Síroke, 41(10):2171-2177, October 2010).

Několik prací se v roce 2010 zabývalo hledáním genetických příčin či nejrůznějších nových bio45 markérů ventrikulámí fibrilace, která bývá pozorována v akutním stádiu infarktu myokardu a může mít vliv na přežití pacienta (Connie R. Bezzina, Raha Pazoki, Abdennasser Bardai, Roos F. Marsman, Jonas S. de Jong, Marieke T. Blom, Brendon P. Scicluna, J. Wouter Jukema, Návin R. Bindrabam, Peter Lichtner, Ame Pfeufer, Nanette H. Bishopric, Dan M. Roden, Thomas Meitinger, Sumeet S. Chugh, Robert J. Myerburg, Xavier Jouven, Stefan Kaab, Lukas R. Dekker,

Hanno L. Tan, Michael W. Tanck, and Arthur A. Wilde. Genome-wide association study identifies a susceptibility locus at 2 lq21 for ventricular fibrillation in acute myocardial infaretion. Naiure genetics, 42(8):688-691, August 2010; Feng Dong, Mazen Khalil, Matt Kiedrowski, Caitlin 0'Connor, Erin Petrovic, Xiaorong Zhou, and Maře S. Penn. Critical role for leukocyte hypoxia inducible factor-lalpha expression in post-myocardial infaretion left ventricular remo55 deling. Circulation research, 106(3):601-610, February 2010; Yvan Devaux, Francisco Azuaje,

-5CZ 303378 B6

Mélan ie Bausort, Céline Yvorra, and Daniel R. Wagner. Integrated protein network and microarray analysis to identity potential biomarkers after myocardial infarction. Functianal & Integrative genomics, 10(3):329-337, August 2010).

Do popředí zájmu se v posledním roce dostává i otázka, zda celkový stres organismu při akutní fází infarktu myokardu nezhoršuje vlastní prognózu přežití (Jessica M. Berthíaume, Molly S. Bray, Tracy A. McElfresh, Xiaoqin Chen, Salman Azam, Martin E. Young, Brian D. Hoit, and Margaret P. Chandler. The myocardial contractile response to physiological stress improves with high saturated fat feeding in heart failure. American Journal of physiology. Heart and circulatory physiology, 299(2), August 2010). Jsou hledány souvislosti mezi genetickými příčinami infarktu myokardu a chronickým onemocněním ledvin (Tetsuo Fujimaki, Kimihiko Kato, Kiyoshi Yokoi, Mitsutoshi Oguri, Tetsuro Yoshida, Sachiro Watanabe, Norifumi Metoki, Hidemi Yoshida, Keí Satoh, Yukitoshi Aoyagi, Yoshinori Nozawa, Genjiro Kimura, and Yoshiji Yamada. Association of genetic variants in SEMA3F, CLEC16A, LAMA3, and PCSK2 with myocardial infarction in Japanese individuals. Atherosclerosis, 210(2):468-473, June 2010) či atherotrombózou (Luca Andrea A. Lotta. Genome-wide association studies in atherothrombosis. European Journal of internal mediáne. 21(2):74-78, April 2010).

Studován byl rovněž vliv microRNA-molekul, které jsou popisovány jako negativní regulátory genové exprese a recentní studie naznačují, že mohou hrát významnou roli nejen v rozvoji infarktu myokardu, ale i u dalších kardiovaskulárních poruch člověka (Emanuela Bostjancic, Nina Zidar, and Damjan Glavac. MicroRNA microarray expression profiling in human myocardial infarction. Disease markers, 27(6):255-268, 2009). Stále je diskutována biologická role interleukinu l ve vztahu k dyslipidémii a riziku vzniku infarktu myokardu (Bernard Keavney. The Ínterleukin-1 cluster, dyslipidaemia and risk of myocardial infarction. BMC medicine, 8( 1 ):6+, January 2010).

Populačně charakteristický obraz rizikových genetických markérů je diskutován v řadě recentních publikací (Paul M. Ridker, Guillaume Paré, Alex N. Parker, Robert Y. Zee, Joseph P. Miletich, and Daniel I. Chasman. Polymorphism in the CETP gene region, HDL cholesterol, and risk of fiiture myocardial infarction: Genomewide analysis among 18 245 initially healthy women from the Women's Genome Health Study. Circulation. Cardivascular genetics, 2(1):26-33, February 2009; Tetsuo Fujimaki et al Association of genetic variants in SEMA3F, CLEC16A, LAMA3, and PCSK2 with myocardial infarction in Japanese individuals, Atherosclerosis, 210(2):468-473, June 2010). Jsou studovány i další typy genetických variací (SNP-single nucleotide polymorphisms a CNV-copy number variations) ve vztahu ke vzniku a rozvoji infarktu myokardu (Myocardial Infarction Genetics Consortium, Sekar Kathiresan, Benjamin F. Voight, Shaun Purcell, Kiran Musunuru et al. Genome-wide association of early—onset myocardial infarction with single nucleotide polymorphisms and copy number variants. Nátuře genetics, 41(3):334-341, March 2009).

V neposlední řadě je nutno zmínit také práce zabývající se infarktem myokardu na experimentálním zvířeti (Jessica M. Berthiaume et al. The myocardial contractile response to physiological stress improves with high saturated fat feeding in heart failure. American Journal of physilogy. Heart and circulatory physiology, 299(2), August 2010; Dongsheng Hong, Xiaowei Zeng, Wei Xu, Jing Ma, Yinghui Tong and Yan Chen. Altered profiles of gene expression in curcumintreated rats with experimentally induced myocardial infarction. Pharmacological Research, 61(2):142-148, February 2010; Zongjin Li, Kitchener D. Wilson, Bryan Smith, Daniel L. Kraft, Fangjun Jia, Mei Huang, Xiaoyan Xie, Robert C. Robbins, Sanjiv S. Gambhir, Irving L. Weissman, and Joseph C. Wu. Functional and transcriptional characterization of human embryonic stem cell-derived endothelial celíš for treatment of myocardial infarction. PloS one, 4(12):e8443+, December 2009; Lisheng Zhang, Jessica J. Connelly, Karsten Peppel, Leigh Brian, Svati H, Shah, Sarah Nelson, David R. Crosslin, Tianyuan Wang, Andrew Allen, William E. Kraus, Simon G. Gregory, Elizabeth R. Hauser, and Neil J. Freedman. Anging-related atherosclerosis is exacerbated by arterial expression of tumor necrosis factor receptor-1: evidence

-6CZ 303378 B6 from mouše models and human association studies. Human Molecular Genetics, 19(14):27542766, July 2010; Lars Bochmann, Padmini Sarathchandra, Federica Moři, Enrique Lara-Pezzi, Domenico Lazzaro, and Nadia Rosenthal. Revealiing new mouše epicardial cell markers through transeriptimics. PloS one, 5(6), 2010), Přihláška vynálezu PV 2009-872 navrhuje stanovení prog5 nózy pacientu v akutním stadiu primárního infarktu myokardu stanovením exprese alespoň jednoho genu či genetického lokusu vybraného ze skupiny zahrnující TCRA, LOC650751. LOC650761, PRR6 a TMEM98 ve vzorku periferní krve.

Níže popsaný vynález poskytuje sadu genů, která umožňuje stanovení prognózy s vyšší přesností io a lepší klinickou shodou.

Podstata vynálezu

Předmětem předkládaného vynálezu je způsob identifikace osob v české populaci se zvýšeným genetickým rizikem výskytu akutního infarktu myokardu a popřípadě se zvýšeným rizikem následného úmrtí v důsledku kardiovaskulárních komplikací do 6 měsíců od okamžiku výskytu akutního infarktu myokardu.

Podstata vynálezu spočívá v tom, že se v biologickém vzorku odebraném z těla pacienta stanoví intenzita exprese sady genů a genetických lokusů;

Název / Lokus genu	RefSeqlD	SEQ ID No.	Referenční hodnota intenzity exprese (nízké riziko) stanovená na celogenomovém / ol igon u kleotidovém čipu	Min. odchylka od ref. hodnoty exprese, značící zvýšené riziko
ECHDC3	NM 024693.2	1	6,89	+ 1
IL18RAP	NMJ5O3853.2	2	11,46	+ 1
PFKFB2	NM 006212.2	3	7,60	+1
IRS2	NM 003749.2	4	9,57	+ 1
PHACTR1	NM 030948.1	5	5,94	+1
ERLIN1	NM 006459.2	6	6,70	+ 1
VNN3	NM 001024460.1	7	9,69	+1
ADORA3	NM 020683.5	8	6,29	+ 1
CLEC4E	NM 014358.1	9	7,72	+1
ASPRV1	NM 152792.1	10	7,72	+ 1
PFKFB2	NM 001018053.1	11	6,29	+ 1
CPD	ΝΜ 001304.3	12	9,82	+ 1
FKBP5	NM 004117.2	13	9,44	+ 1
PRKDC	NM 006904.6	14	8,68	+ 1
NPM1	NM 199185.1	15	11,64	-1
SAMSN1	NM 022136.3	16	9,04	+ 1

Postup stanov v biologickém intenzity expo je pro každý gšené riziko. Je geny/lokusy, a váného pacien hodnotu u vše u míry genetického rizika spočívá v tom, že se změří intenzita genové exprese íorku a její logaritmovaná hodnota při základu 2 se srovná s referenční hodnotou 2 uvedenou pro jednotlivé geny a genetické lokusy. V posledním sloupci tabulky :/lokus uvedena minimální odchylka od referenční hodnoty exprese, značící zvýeba mít na paměti, že vypovídací hodnotu má sada jako celek, nikoliv jednotlivé dy pro naplnění kritéria zvýšeného genetického rizika je nutné, aby se u sledohodnoty genové exprese lišily od hodnot referenčních alespoň o požadovanou genů/lokusů v sadě.

-7CZ 303378 B6

Biologickým vzorkem odebraným z těla pacienta mohou být například buňky periferní krve, které jsou výhodné především pro minimální invazivitu získání potřebného materiálu.

V případě všech zde uváděných genů a genetických lokusů jsou míněny geny a genetické lokusy hybridízující s odpovídajícími sondami na celogenomových čipech Illumina. Sekvence DNA kódující mRNA uváděné v předkládané přihlášce jsou uváděny podle dostupných katalogů pouze pro informaci.

Exprese genů a genetických lokusů může být stanovena jakýmkoliv způsobem známým odborníkovi v daném oboru, například na celogenomovém nebo oligonukleotidovém čipu (čipová microarray analýza, např. i tiling čipy), RT-PCR a qPCR, Northem blot, RNA-Seq (RNA sekvenční zpracování, Whole Transcriptome Shotgun Sequencíng), SAGE (mnohonásobná analýza genové exprese, seriál analysis of gene expression), FISH (fluorescenční ín-situ hybridizace), využitím reportérových genů, analýzou ribonukleázové ochrany (Ribonuclease Protection Assay) čí na úrovni exprese translatovaných proteinů metodou western blot, ELISA (enzymová imunoanalýza, enzyme-línked immunosorbent assay), využitím GFP (zelený fluorescenční protein, green fluorescent protein), průtokovou cytometríí či imunohistologicky.

Předmětem předkládaného vynálezu je dále oligonukleotidový čip pro identifikaci osob se zvýšeným genetickým rizikem výskytu infarktu myokardu, obsahující právě sondy hybridízující s DNA či RNA uvedené sady genů čí genetických lokusů. Oligonukleotidový čip může být připraven např. spotováním či jakýmkoliv jiným způsobem známým odborníkovi v daném oboru.

Předkládaný vynález přináší identifikovat v české populací jedince, kteří mají zvýšené genetické riziko výskytu akutního infarktu myokardu, což umožní zacílit prevenční a sledovací programy na jedince, kterým to přinese největší benefit, a možnost identifikovat jedince se zvýšeným rizikem úmrtí v důsledku kardiovaskulárních komplikací v krátkodobém horizontu po výskytu akutního infarktu myokardu umožní efektivní využití lůžkových kapacit.

Vynález je dále osvětlen na následujících příkladech provedení, aniž je jimi jeho rozsah jakkoliv omezen.

Přehled vyobrazení

Obr. 1 ukazuje teplotní mapu genů identifikovaných v rámci experimentu genové exprese pro kontrast AIMD6 vs Kontroly,

Obr. 2 ukazuje kvantilovou diagnostiku lineárního modelu pro logaritmovaná data intenzit genové exprese při základu 2 (Q-Q grafy) a dále vulkánové grafy, které charakterizují data na základě logaritmu podílů intenzit genové exprese ve studované a srovnávací populaci (viz daný kontrast) a na základě logaritmu šance na diferenciální expresi pro daný gen či transkript. Dává komplexní představu o povaze diferenciální exprese pro daný kontrast.

Seznam sekvencí

SEQ ID No. 1: sekvence DNA kódující mRNA genu ECHDC3

SEQ ID No, 2: sekvence DNA kódující mRNA genu IL18RAP

SEQ ID No. 3: sekvence DNA kódující mRNA genu PFKFB2

SEQ ID No. 4: sekvence DNA kódující mRNA genu IRS2

SEQ ID No. 5: sekvence DNA kódující mRNA genu PHACTR1

SEQ ID No. 6: sekvence DNA kódující mRNA genu ERLIN1

SEQ ID No. 7: sekvence DNA kódující mRNA genu VNN3

-8CZ 303378 B6

SEQ ID No. 8: sekvence DNA kódující mRNA genu ADORA3 SEQ ID No. 9: sekvence DNA kódující mRNA genu CLEC4E SEQ ID No. 10: sekvence DNA kódující mRNA genu ASPRV1 SEQ ID No 11: sekvence DNA kódující mRNA genu PFKFB2

SEQ ID No. 12: sekvence DNA kódující mRNA genu CPD SEQ ID No. 13: sekvence DNA kódující mRNA genu FKBP5 SEQ ID No. 14: sekvence DNA kódující mRNA genu PRKDC SEQ ID No. 15: sekvence DNA kódující mRNA genuNPMl SEQ ID No. 16: sekvence DNA kódující mRNA genu SAMSNl io

Příklady provedení vynálezu i5 Příklad 1: Čipová analýza buněk periferní krve pacientů smíchané s RNA later na lidském celogenomovém čipu Human WG6-v2 Expression BeadChip firmy Itlumina

Pozn. Kurzívou jsou označeny přesné obchodní názvy produktů či specifické komponenty produktů, které nemají odpovídající jednoznačné české ekvivalenty.

Sběr vzorků plné krve do RNAlateř* (kat. č. AM7024, Ambion, Applied Biosystems) byl prováděn tak, že vzorek nesrážlivé plné krve (2,4 ml) byl nejpozději do 15 min. od odběru smíchán s RNAlateř* Tissue Collectin: RNA Stabilization Solution (7,6 ml). Vzorek byl řádně promíchán a poté přesunut do mrazicího boxu -70 °C k dlouhodobému skladování.

Izolace RNA pomocí kitu RiboPitre™ - Blood, Ambion lne. (kat č. AM1928, Ambion, Applied

Biosystems) byla prováděna tak, že vzorky byly vyndány z mrazicího boxu a ponechány na ledu rozmrazit. Snažili jsme se vždy šestice vzorků jdoucí najeden čip připravovat najednou. Pro izolaci RNA bylo pipetováno 1,8 ml vzorku krve s RNAlater* do 2ml zkumavky bez RNase. Vzorek krve v roztoku RNAlater* byl centrifugován na 16 100 g (13 200 rpm) 1 min. Supematant byl odstraněn včetně bílé fáze těsně nad peletem. Buňky byly lyžovány v 800 μΐ lyzačního roztoku a

50 μΐ roztoku acetátu sodného. Směs byla řádně promíchána na vortexu. Lyzát buněk byl extrahován s 500 μΐ kyselého fenol:chloroformu. Směs byla promíchána 30 s na vortexu a ponechána stát 5 min. při laboratorní teplotě. Směs byla centrifugována na 16 100 g 1 min. Celá vodná fáze, které bylo kolem 1,2 ml, byla přenesena do nové 2ml zkumavky bez RNase, znovu centrifugována a vodná fáze bez jakékoli pelety odebrána do čisté zkumavky bez RNase. Bylo přidáno 600 μΐ

100% etanolu a promícháno na vortexu.

700 μΐ vzorku bylo přeneseno na dodanou kolonku umístěnou v kolekční zkumavce a 5-10 s centrifugováno na 16 100 g. Kolekční zkumavky byly vyprázdněny a z novu do nich byly nasazeny kolonky. Do kolonek bylo naneseno dalších 700 μΐ a poté zbytek vzorku a vždy 5-10 s centrifugováno na 16 100 g. Na filtry kolonek bylo naneseno 700 μΐ promývacího roztoku 1 a 5-10 s centrifugováno na 16 100 g. Kolekční zkumavky byly vyprázdněny a znovu do nich byly vsazeny kolonky. Do kolonek bylo 2x naneseno 700 μΐ promývacího roztoku 2/3 (láhev musí být doplněna o 56 ml 100% etanolu) a 5-10 s centrifugováno na 16 100 g. Kolekční zkumavky byly vyprázdněny a znovu do nich byly vsazeny kolonky, centrifugovány, aby byla odstraněna veškerá kapalina. Kolonky byly přeneseny na označenou kolekční zkumavku a naneseno 50 μΐ elučního roztoku (předehřátého na 75 °C). 20 s ponecháno stát při laboratorní teplotě a 20 až 30 s centrifugováno na maximum. Při druhé eluci dalšími 50 μΐ elučního roztoku centrifugováno 1 min.

K RNA ve 100 μΐ elučního pufru bylo přidáno 5 μΐ DNase pufru a 1 μΐ DNase I a ponecháno 30 min. inkubovat při 37 °C. K RNA po odstranění DNA bylo přidáno 20 μΐ DNase inaktivační

-9CZ 303378 B6 reagencie. Směs byla jemně promíchána na vortexu a ponechána 2 min. stát při laboratorní teplotě. Během této doby ještě byla směs dvakrát promíchána.

Vzorek byl centrifugován 1 m in na 16 000 g. V peletě byla DNase inaktivační reagencie. Roztok RNA byl přenesen do nové zkumavky bez RNase.

Byla změřena koncentrace RNA na Nanodropu, Thermo Scientific (1 μΙ), případně ponechán alikvot pro analýzu na Bioanalyzeru 2100, Agilent Technologies.

Po provedení čipové analýzy s takto ošetřenými vzorky RNA bylo zjištěno, že díky použití plné krve dochází k preferenční amplifikaci globinových RNA a nedostatečné intenzitě signálu ostatních genů. Proto byly vzorky RNA přečištěny pomocí GLOBINclear* Kitu firmy Ambion (kat, č. AM1980, Applied Biosystems):

Kecá 110 μΙ vzorku RNA izolované pomocí RiboPure* Blood Kit, Ambion z plné krve s RNAlater* bylo přidáno 11 μΙ octanu sodného (RiboPure \ případně 0,35 μΙ GlycoBlue (AM9515, Ambion, Applied Biosystems) a 300 μΐ 100% ethanolu, vše bylo řádně promícháno. Vzorky byly uskladněny na 1 hod v mrazicím boxu při teplotě -20 °C. Pak byly centrifugovány při 16 100 g 30 min., 4 °C, a supematant byl opatrně odstraněn. Bylo přidáno 0,7 ml ledového 70% ethanolu, vzorek vortexován, centrifugován 10 min. při 4°C a supematant opatrně odstraněn. Peleta byla rozpuštěna ve 14 μΐ vody bez nukleáz (v 15 μΐ pokud chceme v tomto kroku měřit koncentraci na Nanodropu).

V průběhu točení byly připraveny potřebné roztoky:

RNA vazebný pufr: Byly přidány 2 ml 100% isopropanolu do koncentrátu vazebného pufru, promícháno a skladováno při laboratorní teplotě.

RNA promývací roztok: Byly přidány 4 ml 100% etanolu do koncentrátu promývacího roztoku, promícháno a skladováno při laboratorní teplotě.

Kuličky resuspendující směs (1 reakce / 6 reakcí): 10 μΙ/60 μΐ RNA vazebné kuličky, 4 μΙ/24 μΐ pufru pro RNA kuličky, 6 μΙ/36 μΐ 100% isopropanolu. Směs byla homogenizována a skladována při laboratorní teplotě.

Streptavidínové magnetické kuličky (30 μΙ/vzorek): do inkubátoru (50 °C) byly vloženy zkumavky s 2x hybridizačním pufrem a pufrem pro streptavidínové kuličky minimálně na 15 min., před použitím řádně vortexovány. 6x 30 μΐ (180 μΐ) homogenizovaných streptavidinových magnetických kuliček bylo pipetováno do čisté 1,5 ml zkumavky, centrifugováno cca 2 sna méně než 1000 g a zkumavka byla umístěna do magnetického stojánku na dobu 3 až 5 min. (dokud není roztok průsvitný). Supematant byl opatrně odstraněn a přidáno 6 x 30 μΐ (180 μΐ) pufru pro streptavidínové kuličky předehřátého na 50 °C, řádně vortexováno a ponecháno inkubovat po dobu nejméně 15 min. při 50 °C před dalším použitím. Ke vzorkům RNA ve 14 μΙ (1 až Í0 μg) byl přidán 1 μΐ Capture Oligo Mix. Ke směsi bylo přidáno 15 μΐ 2x hybridizačního pufru předehřátého na 50 °C. Vzorky byly krátce vortexovány a rychle centrifugovány při max. 1000 g a ponechány inkubovat při 50 °C po dobu 15 min. (dojde k hybridizaci s globinovou mRNA).

Připravené streptavidínové magnetické kuličky umístěné v inkubátoru byly jemně vortexovány a centrifugovány méně než 2 s na max. 1000 g. Ke každému vzorku RNA bylo přidáno 30 μΐ připravených streptavidinových magnetických kuliček, směsi řádně promíchány vortexováním, stočeny cca 2 s na 1000 g a ponechány inkubovat 30 min. při teplotě 50 °C. Po vyjmutí z inkubátoru jemně vortexovány, centrifugovány cca 2 s na max. 1000 g a zkumavky umístěny do magnetického stojánku na 3 až 5 min. (dokud není roztok průsvitný). Supematanty obsahující celkovou RNA bez globinové mRNA opatrně odstraněny a přeneseny do čistých 1,5 ml zkumavek.

- 10CZ 303378 B6

Byl předehřát eluční pufr na 58 °C. Ke každému RNA vzorku bylo přidáno 100 μΙ RNA vazebného pufru. Kuličky resuspendující směs řádně homogenizována vortexováním a následně přidáno 20 μΐ směsi ke každému vzorku. Směs 10 s řádně vortexována, aby došlo k navázání RNA na kuličky, centr:fugcvána cca 2 s na 1000 g. Zkumavky byly umístěny do magnetického stojánku na 3 až 5 min. (dokud není roztok průsvitný). Opatrně byly odstraněny veškeré supematanty. Zkumavky byly vyjmuty z magnetického stojánku. Až poté bylo ke každému vzorku přidáno 200 μΐ RNA promývacího roztoku, řádně 10 s vortexováno, krátce a jemně stočeno (viz výše). Zkumavky se vzorky umístěny do magnetického stojánku na 3 až 5 min. než došlo k usazení magnelo tických kuliček s navázanou RNA, opatrně byl odstraněn veškerý supematant a zkumavky vyjmuty ze stojánku. Zkumavky krátce a jemně stočeny, umístěny zpět do magnetického stojánku a malou špičkou byla odstraněna veškerá kapalina. Zkumavky se vzorky vyndány z magnetického stojánku a otevřeně nechány 5 min. na vzduchu oschnout. Ke každému vzorku přidáno 30 μΐ elučního pufru předehřátého na 58 °C, řádně 10 s vortexováno a směs inkubována 5 min. při

58 °C. Rádně 10 s vortexováno a krátce a jemně centrifugováno (cca 2 s na 1000 g). Vzorky byly umístěny do magnetického stojánku na 3 až 5 min, než došlo k usazení magnetických kuliček. Supematant obsahující přečištěnou celkovou RNA byl opatrně odebrán do čistých l,5ml zkumavek.

:o Kritickým parametrem se stal poměr absorbancí u 260 nm ku 230 nm, který má být pro čipovou analýzu vyšší než 1,5. Pro zajištění dostatečné kvality musela být prováděna finální etanolová precipitace. K cca 30 μΐ vzorku RNA isolované pomocí RiboPure Blood Kit, Ambion z plné krve s RNAlater*' přečištěné kitem GLOBINclear™ Whole Blood Kit byly přidány 3 μΙ octanu sodného (RiboPur™) a 85 μΐ 100% etanolu. Řádně promícháno a vzorky uskladněny přes noc v mrazicím boxu při teplotě -20 °C. Ráno centrifugováno při 16 100 g 30 min., 4 °C, supematant opatrně odstraněn, peleta promyta 0,7 ml vychlazeného 70% etanolu, vzorek vortexován, centrifugován 15 min. při 4 °C a poté veškerý supematant opatrně odstraněn. Pelety rozpuštěny ve 14 μΐ vody bez nukleáz či dle velikosti pelety a vstupní koncentrace ve větším objemu. Byla změřena koncentrace přečištěné a přesrážené RNA na Nanodropu (1 μΐ), integrita stanovena pomocí

Bioanalyzeru 2100, Agilent Technologies (1 μΐ) - Agilent RNA 6000 Nano/Pico Kit (kat. č. 5067—1511/5067-1513).

Pokud to bylo z hlediska výchozího materiálu možné, aby kvantitativní i kvalitativní parametry byly v pořádku (RIN > 7; A₂6o/28Onm > ΙΛ A₂₆o/23Onm > 1,5), byla připravená RNA dále amplifiko35 vána pomocí IllummcT TotalPrep RNA Amplification Kit, Ambion (kat. č. IL1791). Systém biotinem označí amplifikovanou RNA k hybridizaci na čipech. Protokol se skládá z reversní transkripce s využitím oligo(dT) primeru pro syntézu cDNA obsahující T7 promotorovou sekvenci. K získané cDNA je syntetizován druhý řetězec při využití DNA polymerázy a RNasy H. Přečištěný cDNA produkt vstupuje do in-vitro transkripce s T7 RNA polymerázou. Výsledná cRNA je následně přečištěna od neinkorporováných nukleotidů, solí, enzymů a anorganického fosfátu. Vstupní množství RNA, které jsme využívali pro amplifikaci, bylo 150 ng v maximálně 11 μΐ. Pro jednotlivé kroky byl použit DNA Engine Dyad Peltier Thermal Cycler, Bio-Rad Laboratories.

RNA vzorky o objemu ll μΙ (150 ng RNA) byly umístěny do sterilních 0,2ml zkumavek bez RNas. Případně byly do daného objemu naředěny vodou bez nukleáz. Při laboratorní teplotě byl připraven master mix pro reversní transkripci - syntézu jednořetězcové DNA:

μΐ T7 oIigo(dT)primer μΐ lOx pufr pro první řetězec (objemy jsou udány na jednu 20 μΐ reakci)

4 μΐ směs dNTP (složky byly přidávány v daném pořadí) μΐ inhibitor RNas μΐ ArrayScript(enzym).

- 11 CZ 303378 B6

Master mix byl jemně vortexován a krátce centrifugován (5s). Bylo přidáno 9 μΐ master mixu do každého vzorku RNA, důkladně promícháno pipetováním (2 až 3x) a 3 až 4x cvrnknut do zkumavek. Krátce centrifugováno a umístěno do bloku cykleru (42 °C). Reakce byly inkubovány 2 hod při 42 °C, poté krátce stočeny a dány na led (4 °C).

Na ledu byl připraven master mix pro syntézu druhého řetězce cDNA:

μΙ voda bez nukleáz μΙ lOx pufr pro druhý řetězec (objemy jsou udány na jednu 100 μΙ reakci) μΐ směs dNTP (složky byly přidávány v daném pořadí) io 2 μΐ DNA polymerázy μΐ RNasy H.

Master mix byl jemně vortexován a krátce stočen (5s). Bylo přidáno 80 μΐ master mixu ke každému vzorku, důkladně promícháno pipetováním (2 až 3x) a 3 až 4x cvmknuto do zkumavek.

Krátce centrifugováno, umístěno do předem vychlazeného bloku cykleru na 16 °C. Reakce byly inkubovány 2 hod při 16 °C, poté 4 °C.

Získaná cDNA byla přečištěna. Centrifugace byly prováděny při 10 000 g a laboratorní teplotě (otáčky nesmí překročit 16 000 g, došlo by k poškození skleněného filtru a vlákna filtru by mohla kontaminovat eluát). Bylo předehřáto dostatečné množství vody bez nukleáz pro eluci na 55 °C (při teplotě > 58 °C dochází k částečné denaturaci cDNA) nejméně 10 min. před použitím. Do promývacího pufru bylo přidáno 24 ml etanolu.

Ke vzorkům cDNA bylo přidáno 250 μΙ cDNA vazebného pufru, důkladně promícháno pipeto25 váním (2 až 3x), 3 až 4x poklepáno na zkumavky a krátce stočeno. Kolonky byly umístěny do dodaných promývacích zkumavek a na jejich střed naneseny vzorky (cDNA s cDNA vazebným pufrem). Centrifugováno 1 min. 10 000 g, eluát byl zlikvidován. Na každou kolonku bylo aplikováno 500 μΐ promývacího pufru, centrifugo váno 1 min. 10 000 g a eluát byl zlikvidován. Vzorky na kolonkách byly opětovně 1 min. centrifugovány 10 000 g (odstranění veškerého promývacího jo pufru). Kolony s cDNA byl přendány do elučních zkumavek. Na střed kolonek bylo naneseno 10 μΐ vody bez nukleáz vytemperované na 55 °C, necháno 2 min. stát při laboratorní teplotě a poté centrifugováno 1,5 min. 10 000 g. Na střed kolonek byl nanesen druhý alikvot předehřáté vody bez nukleáz - 9 μΐ, centrifugováno 2 min. 10 000 g.

Získaná dvouřetězcová DNA v cca 17,5 μΐ vody z výsledného eluátu byla použita pro in-vitro transkripci. Při laboratorní teplotě byl připraven master mix pro syntézu cRNA:

2,5 μΐ T7 ΙΟχ reakční pufr (objemy jsou udány na jednu 25μ1 reakci)

2,5 μΐ směs T7 enzymu (složky byly přidávány v daném pořadí)

2,5 μΐ směs biotinem značených NTP.

Master mix byl jemně vortexován a krátce stočen (5s). Bylo přidáno 7,5 μΙ master mixu ke každému vzorku cDNA, důkladně promícháno pipetováním (2 až 3x) a 3 až 4x cvmknuto do zkumavek. Vzorky krátce centrifugovány a umístěny do bloku cykleru, kde byly inkubovány při 37 °C po dobu 14 hod, poté 4 °C. Reakce byly ukončeny přidáním 75 μΐ vody bez nukleáz ke každému vzorku cRNA a důkladně, ale jemně, vortexovány.

Při následném přečištění došlo k odstranění enzymů, solí a neínkorporovaných nukleotidů. Centrifugace byly prováděny při 10 000 g při laboratorní teplotě (otáčky nesmí překročit 16 000 g, došlo by k poškození skleněného filtru a vlákna filtru by mohla kontaminovat eluát). Bylo přede50 hřáto dostatečné množství vody bez nukleáz pro eluci na 60 °C nejméně 10 min. před použitím a byly připraveny kolonky do sběrných zkumavek. Ke každému vzorku ve 100 μΐ bylo přidáno 350 μΐ cRNA vazebného pufru. Ihned bylo přidáno 250 μΐ 100% etanolu, vzorky 3x promíchány

- 12CZ 303378 B6 p i pelováním, ale nevortexovány a necentrifugovány. Po smísení etanolu se vzorkem byla směs přenesena na střed připravených kolonek, centrifugováno 1 min. 10 000 g, eluát byl zlikvidován. Na střed každé cRNA kolonky bylo aplikováno 650 μΐ promývacího pufru, centrifugováno 1 min. 10 000 g a eluát byl zlikvidován.

Zkumavky s kolonkami byly centrifugovány další 1 min. 10 000 g (odstranění veškerého promývacího pufru) a kolony poté byly umístěny do nových sběrných zkumavek. Na střed kolonky bylo naneseno 100 μΐ vody bez nukleáz vytemperované na 60 °C, necháno 2 min. stát při laboratorní teplotě a centrifugováno 1,5 min. 10 000 g.

Byla změřena koncentrace amplifikované cRNA na Nanodropu (1 μΐ). Pokud byla nižší než 150 ng/μΐ či byl nízký poměr absorbancí u 260 nm ku 230 nm, tak byly vzorky precipitovány. Ke vzorku přečištěné cRNA byla přidána 1/10 objemu 3M CH₃COONa, pH 5,2, RiboPure ^M (10 μΐ) a

2,5 násobek objemu 100% etanolu (275 μΙ), důkladně promícháno a ponecháno 60 min. v mra15 zicím boxu při -20 °C. Vzorky byly centrifugovány na 16 100 g po dobu 30 až 60 min. při 4 °C a opatrně byl odstraněn supematant. Pelety byly promyty 500 μΐ 70% etanolu, zkumavky centrifugovány na 16 100 g po dobu 15 min. při 4 °C, supematant opatrně odstraněn, případně byly znovu rychle centrifugovány a odstraněny i zbytky etanolu. Pelety cRNA byly ponechány cca 2 min. na vzduchu, aby oschly. Poté byly suspendovány v požadovaném objemu vody bez nukleáz (^ 12 μΐ).

Výtěžek závisel na množství a kvalitě poly(A)RNA v celkové RNA. Byla změřena koncentrace na NanoDropu (1 μΐ) a stanoven profil délek cRNA pomocí Bioanalyzeru 2100, Agilent (1 μΐ), který má být mezi 250 až 5500 nt s většinou cRNA mezi 1000 až 1500 nt.

Pokud byla finální koncentrace cRNA > 150 ng/μΙ a profil v pořádku, byly vzorky použity pro hybridizaci na Human WG6v2 Expression BeadChip firmy Illumina.

Byla předehřátá hybridizační pec s výkyvnou plošinou na 58 °C alespoň 1 hod před použitím.

Vzorky byly připraveny tak, aby vstupní množství cRNA do hybridizace bylo 1,5 μg. Maximální možný objem je 10 μΙ, případně vzorky na tento objem byly doplněny vodou bez nukleáz a promíchány. Po dobu 10 min. nechány stát při laboratorní teplotě, aby došlo k řádnému rozpuštění. Do hybridizační pece vytemperované na 58 °C byly na 10 min. vloženy zkumavky s GEX-HYB a GEX-HCB (pro rozpuštění skladováním precipitovaných solí). Ke každému vzorku 1,5 pg cRNA v 10 μΐ vody bez nukleáz bylo přidáno 20 μ! GEX-HYB, byly jemně vortexovány a rychle centrifugovány.

Illumina Hyb Chamber Basket byl umístěn do BeadChip Hyb Chamber. Bylo pipetováno 200 μΐ GEX-HCB do každého ze dvou reservoárů pro zvlhčující pufr v každé Hyb Chamber. Pufr byl dáván pouze do komor, které byly použity. Hyb Chamber byl utěsněn víkem a nechán při laboratorní teplotě (~22 °C) než byly čipy dány do Hyb Chamber. Na laboratorní teplotu vytemperované čipy byly vyndány z jejich obalů {Human WG6-v2 Expression BeadChip). Byly používány výhradně rukavice bez pudru. Čipy byly pinzetou drženy za krycí folii v oblasti barkódu, vloženy do Hyb Chamber Insert tak, aby jejich směr souhlasil se symbolem barkódu na Insertu.

Analyzované vzorky cRNA smíchané s GEX-HYB byly zahřátý na 65 °C po dobu 5 min. Jemně vortexovány a rychle centrifugovány, aby byla kapalina shromážděna na dně zkumavky. Před dalším použitím vzorky ponechány při laboratorní teplotě vychladnout a ihned poté byly pipetovány na čipy.

Hyb Chamber Inserts obsahující čipy byly umístěny do Hyb Chamber a bylo pipetováno 30 μΐ analyzovaného vzorku na vstupní otvor každého pole. Hyb Chamber opatrně uzavřen víkem a inkubován v hybridizační peci při 58 °C po dobu 16 hodin s rychlostí kyvů plošiny nastavenou na 5. Před ukončením práce v daný den byl ještě připraven lx vysokoteplotní promývací pufr přidá- 13 CZ 303378 ΙΪ6 ním 50 m! lOx koncentrovaného zásobního roztoku ke 450 ml vody bez RNas. Teplota zahřívacího bloku naplněného 500 ml Ix vysokoteplotního promývacího pufru byla nastavena na 55 °C, víko bylo zavřeno a ponecháno hřát přes noc,

Další den byl připraven promývací roztok EIBC přidáním 3 ml EIBC pufru do 1 I vody bez RNas. Na laboratorní teplotu byl předehřát blokovací pufr El (4 ml/čip). Bylo připraveno odpovídající množství blokovacího pufru El (2 ml/čip) se streptavidin-Cy3 (2 μΙ zásobního roztoku o koncentraci 1 mg/ml najeden čip). Byla použita jedna kónická zkumavka pro všechny aktuálně zpracovávané čipy a před detekcí byl tento roztok uchováván v temnu.

Z hybridizační pece byla vyndána Hyb Chamber a rozebrána. Čipy byly ponořeny do 250 ml promývacího roztoku EIBC a byla z nich opatrně oddělána krycí folie. Rozebrání a umístění v EIBC promývacím roztoku bylo opakováno pro všechny aktuálně zpracovávané čipy. Čipy byly následně umístěny do držáku, který byl za rukojeť přemístěn do Hybex Waterbath insert obsahujícího Ix vysokoteplotní promývací pufr pres noc předehřátý na 55 °C. Se zavřeným víkem byly čipy bez třepání inkubovány 10 min. Během této inkubace bylo připraveno 250 ml promývacího roztoku EIBC v čisté barvící nádobě. Ihned po lOmin. inkubaci s vysokoteplotním promývacím pufrem byl držák s čipy přesunut do připraveného čerstvého promývacího roztoku EIBC. Držák krátce a intenzivně v nádobě protřepán pohybem nahoru a dolů, poté na 5 min. umístěn na rotační třepačku na maximální rychlost, při které nedocházelo k vyšplíchnutí roztoku z nádoby (120 rpm). Přemístěn do čisté barvící nádoby s 250 ml 100% etanolu. Krátce a důsledně pomocí rukojeti držáku byly čipy proprány a poté 10 min. třepány na orbitální třepačce při maximální rychlosti. Čipy byly přemístěny do čisté barvící nádoby s 250 ml promývacího roztoku EIBC, krátce a intenzivně promíchány a třepány na orbitální třepačce po dobu 2 min. Čipy byly přemístěny do připravených Wash Tray se 4 ml blokovacího pufru El, dány na výkyvnou desku (analyzovaná plocha se vzorky musí vždy směrovat nahoru) a kývány na střední rychlost po dobu 10 min. Čipy byly přendány do čisté Wash Tray se 2 ml b lokovacího pufru El + streptavidin-Cy3, přikryty víkem a kývány na střední rychlost dalších 10 min. Čipy byly přesunuty do připravené čisté barvící nádoby s 250 ml promývacího roztoku EIBC, krátce proprány a poté 5 min. rotačně třepány při laboratorní teplotě. Čipy v držáku byly přesunuty do centrifugy s rotorem na mikrodestičky a točeny při laboratorní teplotě na 270 ref po dobu 4 min. Usušené čipy byly ihned skenovány pomocí Illumina* BeadArray Raderu na skenovací faktor 1,0 a

1,5 a získaná data jsou uchovávána na DVD a webovém úložišti dat.

Příklad 2: Statistické vyhodnocení expresního profilu

Předkládaný vynález je doložen výsledky, které jsme obdrželi na základě celogenomové analýzy vzorků periferní krve získaných od jedinců hospitalizovaných v letech 2006 až 2009 v Městské nemocnici Čáslav či kardiologické klinice v Pardubicích s diagnózou primárního akutního infarktu myokardu a párových kontrolních osob hospitalizovaných v Městské nemocnici v Čáslavi ve stejném období z důvodu komplikací pohybového ústrojí. Věk případů byl omezen hranicí 80 let. Párové kontrolní osoby nesměly mít pozitivní historií výskytu závažných kardiovaskulárních onemocnění a byly k odpovídajícím případům vybírány tak, aby docházelo k podstatné shodě v rizikových faktorech výskytu akutního infarktu myokardu. Zejména byla požadována shora v pohlaví, věku (kontroly mohly být o maximálně 5 let starší než případy) a shodný musel být též status diabetů mel litu a kuřácký status. Vzorky byly analyzovány pomocí technologie firmy Illumina, přičemž byly použity čipy verze 2 (Human WG6~v2 Expression BeadChip),

Ke genetickému vyšetření pacientů s akutním infarktem myokardu byly zařazovány osoby, které byly přijaty či ambulantně ošetřeny s diagnosou akutního infarktu myokardu (AIM) na příjmové ambulanci Interního oddělení MN Čáslav. Do souboru byli rovněž zařazováni pacienti, kteří byli vezeni posádkou rychlé záchranné služby přímo na Kardiologickou kliniku v Pardubicích, kde byl na koronární jednotce proveden odběr krevního vzorku. Odběr byl vždy proveden po podepsání „Informovaného souhlasu“ pacientem. Smíchání vzorků venózní krve s RNAlater\ jejich

- 14CZ 303378 B6 uskladnění a transport krevních vzorků byly prováděny dle pracovních protokolů v souladu s platnými právními předpisy a veškerá data ke vzorkům jsou uložena v příslušných databázích.

to

Akutní infarkt myokardu byl diagnostikován na základě anamnestických údajů, EKG křivky a laboratorního průkazu nekrosy myokardu. Byl definován jako bclcst na hrudí nebo její ekvivalent trvající alespoň 10 min. v posledních 24ti hodinách s elevací úseku ST na EKG křivce (STEM1), či bez elevací ST (N ON STEM I). Biochemický průkaz nekrózy byl stanovován v naší laboratoři vyšetřením Troponinu I. Jako pozitivní hodnotu Troponinu I bylo považováno překročení horního limitu normální hodnoty v čáslavské laboratoři, tj. 0,3 pg/l. Jako pomocná diagnostická metoda byla používána echokardiografie k průkazu regionální poruchy kinetiky levé komory v povodí „infarktové tepny“. Jako standardní panel vyšetření pacientů s podezřením na AIM byl vyšetřován Troponin I okamžitě při přijetí a dále ve 4-6 hodinovém intervalu v prvních 24 hodinách, AST, ALT, KO, koagulace (QT, APTT), glykémie, iontogram, urea, kyselina močová, lipidogram, CRP, u diabetiků HBAlc. Vyšetření CK a CK-MB mass a LD bylo prováděno nepravidelně dle uvážení lékaře.

Studie zahrnovala šestiměsíční sledování pacientů s akutním infarktem myokardu od okamžiku jeho výskytu. V návaznosti na zvolený statistický design byla skupina pacientů s výskytem akutního infarktu myokardu rozdělena na osoby, které z kardiovaskulárních příčin zemřely v průběhu šestiměsíčního sledování (AIMD6, 4 osoby) a na osoby, které přežívaly déle (AIM, 41 osob), párové kontroly čítaly dalších 45 osob. Tabulka 1 ukazuje vybraná data osob v analyzovaném souboru a základní data ke zpracovaným vzorkům.

- 15CZ 303378 R6

Tabulka 1: Základní data k osobám z analyzovaného souboru a k analyzovaným krevním vzorkům odebraným z těla těchto pacientů

ID	Vzorek	Pohlaví	Ročník	Exitus	Diabetes mellitus	Kouření	c (ng/μΙ) RNA	RIN	Pg cRNA
029	ΑΪΜ	Muž	1948	Ne	Ne	Ano (20)	243,68	7,8	8,522
084	AIM	Muž	1947	Ne	Ne	Ano (10)	163,76	8,8	8,813
C056	AIM	Muž	1953	Ne	Ne	Ano (15)	109,2	7,4	13,577
P008	AIM	Žena	1949	Ne	Ne	Ne	41,9	8,1	8,752
P009	AIM	Muž	1951	Ne	Ne	Ano (2)	28,6	7,1	5,108
C029	AIM	Muž	1955	Ne	Ne	Ne	43,3	7,1	9,496
C048	AIM	Žena	1960	Ne	Ne	Ne	170,3	8,5	16,748
C099	AIM	Muž	1951	Ne	Ne	Ne	261,2	8,0	10,146
070	AIM	Žena	1929	Ne	Ne	Nc	404,7	6,1	2,390
0 72	AIM	Žena	1931	Ne	Ano	Ne	353,0	7,7	8,093
081	AIM	Žena	1934	Ne	Ano	Ne	195,2	8,1	8,633
C069	AIM	Muž	1941	Ne	Ne	Ne	185,3	8,7	6,997
POll	AIM	Muž	1947	Ne	Ne	Ne	245,2	6,9	4,194
047	AIM	Muž	1945	Ne	Ne	Ne	317,5	6,7	5,176
C005	A1MD6	Muž	1939	Ano	Ne	Ne	89,5	8,1	7,351
C053	AIMD6	Žena	1935	Ano	Ne	Ne	327,1	7,7	8,389
P010	AIMD6	Žena	1928	Ano	Ano	Ne	188,3	8,1	8,248
085	AIM	Muž	1937	Ne	Ano	Ne	191,54	8,2	7,695
095	AIM	Muž	1946	Ne	Ano	Ne	293,41	8,2	13,269
C284	AIM	Muž	1953	Ne	Ne	Ano (20)	210,06	7,4	8,364
094	AIM	Muž	1933	Ne	Ne	Ne	160,62	8,0	15,856
C238	AIM	Muž	1934	Ne	Ano	Ne	204,88	7,8	8,750
C078	A1MD6	Muž	1937	Ano	Ano	Ne	170,38	8,2	15,901
C016	AIM	Muž	1944	Ne	Ne	Ne	84	7,1	6,802
C074	AIM	Muž	1943	Ne	Ne	Ne	209,2	6,9	7,509
P003	AIM	Žena	1936	Ne	Ne	Ano (10)	113,8	6,8	7,505

- 16CZ 303378 B6

ID	Vzorek	Pohlaví	Ročník	Exitus	Diabetes inellitus	Kouření	c (ng/μΙ) RNA	RIN	με cRNA
C037	AIM	Žena	1933	Ne	Ano	Ne	226,2	8,5	3.76
C036	AIM	Žena	1934	Ne	Ne	Ne	31,4	6,2	2,986
C030	AIM	Muž	1951	Ne	Ne	Ne	152,2	8,7	3,186
008	AIM	Muž	1955	Ne	Ne	Ano (15)	197,9	7,5	10,566
019	AIM	Muž	1948	Ne	Ne	Ano (2)	365	7.1	6,499
C065	AIM	Zena	1933	Ne	Ano	Ne	79,7	7,6	2,536
C039	AIM	Žena	1959	Ne	Ano	Ne	434.2	6,5	7,939
025	AIM	Muž	1928	Ne	Ano	Ne	184,7	8.4	4,120
039	AIM	Muž	1939	Ne	Ne	Ne	126,5	8,4	7,674
020	AIM	Muž	1949	Ne	Ne	Ne	103,6	8,7	4,480
C063	AIM	Žena	1941	Ne	Ne	Ne	282,9	8,5	4,526
C205	AIM	Muž	1944	Ne	Ano	Ano (10)	85,7	8,4	7,141
074	AIM	Muž	1950	Ne	Ne	Ne	127,97	8,0	6,820
082	AIM	Muž	1954	Ne	Ne	Ano (40)	97,47	8,1	12,236
C289	AIM	Muž	1957	Ne	Ne	Ne	213,42	8,0	9,322
C019	AIM	Žena	1930	Ne	Ne	Ne	36,59	7,7	3,043
C013	AIM	Muž	1939	Ne	Ano	Ne	194,74	7,9	4,813
C269	AIM	Muž	1938	Ne	Ne	Ne	320,41	8,2	4,974
P019	AIM	Žena	1931	Ne	Ano	Ne	86,65	7,9	4,535
C083	CIRL	Muž	1947	Ne	Ne	Ano (5)	186,6	8,4	15,045
C250	CTRL	Muž	1946	Ne	Ne	Ano (25)	10,04	7,7	1,907
038	CTRL	Muž	1950	Ne	Ne	Ano (15)	290,9	7,1	6,189
C081	CTRL	Žena	1949	Ne	Ne	Ne	58,4	6,7	9,044
049	CTRL	Muž	1949	Ne	Ne	Ano (20)	47,39	7,6	5,758
C014	CTRL	Muž	1955	Ne	Ne	Ne	51,74	7,2	2,403
033	CTRL	Žena	1960	Ne	Ne	Ne	177,2	8,6	9,447
OOl	CTRL	Muž	1951	Ne	Ne	Ne	237,38	8,7	10,019
009	CTRL	Žena	1928	Ne	Ne	Ne	302,8	8,5	9,941
C022	CTRL	Žena	1929	Ne	Ano	Ne	232,48	7,6	8,534
C023	CTRL	Žena	1931	Ne	Ano	Ne	223,54	8,1	4,486
C213	CTRL	Muž	1941	Ne	Ne	Ne	124,24	7,8	7,42
C282	CTRL	Muž	1948	Ne	Ne	Ne	297,68	7,0	3,988
C260	CTRL	Muž	1946	Ne	Ne	Ne	147,18	8,5	8,003
C010	CTRL	Muž	1938	Ne	Ne	Ne	301,91	8,0	7,3
063	CTRL	Žena	1934	Ne	Ne	Ne	112,15	7,9	6,127
C208	CTRL	Žena	1928	Ne	Ano	Ne	246,12	7,8	4,79
C348	CTRL	Muž	1937	Ne	Ano	Ne	94,68	7,8	14,11
C304	CTRL	Muž	1946	Ne	Ano	Ne	213,16	8,5	17,068
C302	CTRL	Muž	1952	Ne	Ne	Ano (10)	80,07	8,2	15,571
C098	CTRL	Muž	1932	Ne	Ne	Ne	200,5	7,3	8,272
C272	CTRL	Muž	1930	Ne	Ano	Ne	91,86	8,3	8,709

17CZ 303378 B6

ID	Vzorek	Pohlaví	Ročník	£xitus	Diabetes mellitus	Kouření	c (ng/μθ RNA	RIN	Pg cRNA
C287	CTRL	Muž	1936	Ne	Ano	Ne	145,6	8,3	8.272
098	CTRL	Muž	1944	Ne	Ne	Ne	270,3	7,2	7,32
C204	CTRL	Muž	1943	Ne	Ne	Ne	249,8	6,6	8,982
C209	CTRL	Žena	1937	Ne	Ne	Ano (10)	191	7,4	13,377
024	CTRL	Žena	1933	Ne	Ano	Ne	64,91	8.6	2,198
Cl 10	CTRL	Žena	1934	Ne	Ne	Ne	207,59	8,0	4,37
050	CTRL	Muž	1952	Ne	Ne	Ne	130,5	8.4	2,566
C058	CTRL	Muž	1954	Ne	Ne	Ano (8)	327,4	9,2	6,875
C066	CTRL	Muž	1947	Ne	Ne	Ano (10)	345,4	6,2	8,219
018	CTRL	Žena	1934	Ne	Ano	Ne	79,4	6,0	9,242
C210	CTRL	Žena	1960	Ne	Ano	Ne	577,3	7,4	3,562
C310	CTRL	Muž	1929	Ne	Ano	Ne	127,05	8,5	6,859
C294	CTRL	Muž	1939	Ne	Ne	Ne	120,56	7,0	7,361
087	CTRL	Muž	1949	Ne	Ne	Ne	123,56	7,5	3,689
C011	CTRL	Žena	1940	Ne	Ne	Ne	28,12	7,3	2,632
016	CTRL	Muž	1941	Ne	Ano	Ano (20)	111,21	7,9	10,515
C274	CTRL	Muž	1950	Ne	Ne	Ne	209,68	7,8	4,306
068	CTRL	Muž	1953	Ne	Ne	Ano (20)	69,67	8,5	10,008
C061	CTRL	Muž	1955	Ne	Ne	Ne	164,27	8,3	8,27
006	CTRL	Žena	1928	Ne	Ne	Ne	27,9	8,3	5,31
C207	CTRL	Muž	1937	Ne	Ano	Ne	82,02	8,7	10,79
C206	CTRL	Muž	1934	Ne	Ne	Ne	142,91	7,8	4,888
C22I	CTRL	Žena	1929	Ne	Ano	Ne	210,16	8,0	4,3

Tabulky 2 a 3 shrnují popisné charakteristiky relevantních klinických a demografických údajů. Kompletní datový soubor obsahoval záznamy o 45 pacientech s primárním výskytem akutního infarktu, z toho 41 ve skupině AIM a 4 ve skupině AIMD6, a dále záznamy o 45 kontrolních pacientech. V datovém souboru bylo 60 mužů a 30 žen. Ve skupině AIM bylo 13 žen a 28 mužů, ve skupině AIMD6 2 muži a 2 ženy a ve skupině CTRL bylo 15 žen a 30 mužů. Ve skupině AIM bylo 10 kuřáků a 31 nekuřáků, ve skupině AIMD6 byly všechny osoby nekuřáci a ve skupině CTRL bylo 10 kuřáků a 35 nekuřáků. Co se týče diabetů mellítu II. typu, ve skupině AIM bylo io 12 osob s touto diagnózou a 29 bez ní, ve skupině AIMD6 byly 2 osoby s touto diagnózou a 2 bez ní a konečně ve skupině CTRL (Kontroly) bylo 14 pacientů s touto diagnózou a 31 bez ní.

- 18CZ 303378 B6

Tabulka 2: Počty pacientů a procentuální vyjádření zastoupení popisných charakteristik kategorických veličin

Proměnná	Počty a procentuální údaje ve skupinách
AIM	A1MD6	Kontroly
Pohlaví	Muži	28 (68 %)	2(50%)	30 (67 %)
Ženy	13(32%)	2 (50 %)	15(33%)
Kouření	Kuřáci	10 (24 %)	0 (0 %)	10(22%)
Nekuřáci	31 (76%)	4(100%)	35 (78%)
Diabetes mellitus H. typu	ANO	12 (29 %)	2(50%)	14(31 %)
NE	29(71 %)	2(50%)	31 (69%)

Tabulka 3: Popisné charakteristiky spojitých veličin

Skupina	Věk pacienta
N	Průměrná hodnota	Směrodatná odchylka
AIM	41	63,6	9,18
AIMD6	4	72,3	4.73
Kontroly	45	65,5	9,42

Vzorky venózní krve odebrané od pacientů byly zpracovávány postupem podle Příkladu 1. Data genové exprese byla analyzována pomocí lineárních modelů pro analýzu dat z microarray experimentů „limma“ (Smyth, G. K.; Linear modesl and empirical Bayes methods for assesing diffe15 rential expression in microarray experiments, 2004, Stasíistical Applications in Genetics and Molecular Biology 3, No. 1, Article 3, doi: 10.2202/1544-6115.1027), navržených pro statistický a grafický systém R (http://www.r-project.org) v rámci projektu Bioconductor (http://www.bioconductor.org). Data byla normalizována pomocí kvantilové normalizace (Smyth G. K. and Speed T. P.: Normalization of cDNA microarray data, 2003, Methods 31, 265-273, doi: 10.1016/20 j.physletb.2003.10.071). Šum signálu na pozadí čipu, u kterého se předpokládá normální rozložení, byl odstraněn pomocí konvolučního modelu. Tento model předpokládá, že signál z čipů čtený pomocí skeneru je směsí normálně rozděleného šumu a exponenciálně rozděleného signálu intenzit genové exprese (Ritchie Μ. E., Silver J., Oshlack A., Holmes M., Diyagama D., Holloway A., Smyth G. K.: A comparison of background correction methods for two-colour microarrays,

2007, Bioinformatics 23, 2700-2707, PMID: 17720982),

Medicínská hypotéza předpokládala možnost genetické determinace (predispozice) výskytu akutního infarktu myokardu vzhledem k obecné české populaci jak v populaci pacientů přežívajících období šestiměsíčního sledování (kontrast AIM vs Kontroly), tak též u pacientů v tomto období zemřelých (kontrast AIMD6 vs Kontroly). Podobně byla předpokládána vyšší genetická zátěž u pacientů s výskytem infarktu, kteří zemřeli v období šestiměsíčního sledování, v porovnání s populací pacientů přežívající srdeční příhodu dlouhodoběji (kontrast AIMD6 vs AIM). Párový

- 19CZ 303378 B6 statistický design byl zvolen s cílem snížit počty odhadovaných parametrů, které by jinak bylo nutné zohlednit jako možné zavádějící faktory (pohlaví, věk, výskyt kouření a diabetů mellitu) a dále odlišit klinickou a genetickou komponentu komplexního rizika výskytu akutní srdeční příhody. Síla statistických testů je navíc v párovém designu v porovnání s dvou- a vícevýběrovými plány statistických studií typicky vyšší.

Vzhledem k tomu, že o Illumina čipech je známo, že aktuální naměřené hodnoty intenzit genové exprese bývají na jednotlivých čipech plošně posunuty o neznámou konstantu, je tuto skutečnost nutné zohlednit v rámci statistické analýzy a odpovídající korekční konstanty je třeba odhadnout io v lineárním modelu. Z tohoto důvodu také není vhodné uvažovat o korelacích mezi naměřenými hodnotami intenzit genové exprese a hodnotami klinických proměnných. Relevantní závěiy proto nutně vycházejí pouze z výsledků obdržených z lineárního modelu, kde jsou lineami efekty jednotlivých čipů na hodnoty intenzit genové exprese adjustovány. Lineární statistický model (limma) zohledňoval vliv použitého čipu na hodnoty intenzit genové exprese. Intenzity genové exprese vstupovaly do lineárního modelu jako dvojkové logaritmy původních hodnot. Obrázky 2a a 2b ukazují diagnostiku lineárního modelu pro logaritmovaná data intenzit genové exprese při základu 2 pro všechny tři uvažované konstanty pomocí Q-Q kvantilových grafů. Ideální kvantilový Q-Q graf by měl mít shodné empirické a teoretické hodnoty kvantilů, takže všechny zobrazené hodnoty by ležely na přímce. Q-Q grafy shodně potvrzují, že použití lineárního ío modelu je ve všech třech případech adekvátní. Lineární model můžeme schematicky popsat následovně:

log?( intenzita) - pár + skupina, přičemž proměnná „pár“ identifikuje dvojici případu a odpovídající párové kontroly, která byla vždy umístěna na stejném Illuminu čipu. Proměnná „skupina“ kóduje příslušnost k populacím

AIM, AIMD6 a KOntrol. Tento model je zobecněnou verzí párového testu.

Množiny genů identifikované na základě výsledků z lineárního limma modelu byly dále analyzovány pomocí PAM modelu, sjehož pomocí byla pro každý kontrast zjištěna podmnožina genů s prediktivními vlastnostmi v nezávislých výběrech. Lineárním modelem dříve zjištěné množiny

3o genů mohou až „příliš dobře“ vysvětlovat konkrétní data, ze kterých jsou výsledky odvozeny (tzv. „over-fitting“), ovšem na úkor prediktivity v nezávislých výběrech. K tomuto účelu byl využit PAM model („Predictive Analysis for Microarrays“), který pomocí křížové validace a využití „shrinkage“ principu identifikuje podmnožinu genů, která by měla mít optimální vlastnosti z hlediska určování pravděpodobné příslušnosti sledovaných jedinců k některé ze sledova35 ných populací (AIMD6, AIM a Kontroly).

Za diferenciálně exprimované byly obecně považovány geny, které splňovaly jak podmínku statistické významnosti na hladině 5%, tak též klinické významnosti, která předpokládá, že dvojkový logaritmus podílu hodnot intenzit genové exprese je v absolutní hodnotě větší nebo roven jedné. Statistická analýza prokázala statisticky i klinicky významnou asociaci mezi krátkodobou úmrtností subjektů (v horizontu 6 měsíců po primární akutní srdeční příhodě) a jejich expresním genovým profilem u 15 genů v případě diagnostického kontrastu AIMD6 vs Kontroly a u 10 genů v případě prognostického kontrastu AIMD6 vs AIM. Prediktivní diagnostická množina genů pro kontrast AIM vs Kontroly čísla 13 genů a v limma modelu byla pouze statisticky sign i 45 fikantní na hladině statistické významnosti a = 0,10. Tuto množinu již nebylo možné dále redukovat pomocí PAM modelu.

Popis výsledků

Geny resp. transkripty uvedené v následujících tabulkách specifikují prediktivní diagnostickou a prognostickou množinu genů pro kontrast AIMD6 vs. kontroly, které byly získány následujícím postupem: nejprve byla pomocí limma modelu („Linear Models for Microarray Data“, http://bioinf.wehi.edu.au/limma/) na úrovni celého lidského genomu (na Illumina čipech verze 2 bylo zmapováno celkem 25036 genů) identifikována množina statisticky (q-hodnota<0,05) i kli-20CZ 303378 B6 nicky významných genů (| log₂-fold change | >1, tj. alespoň dvojnásobná změna intenzity genové exprese směrem nahoru nebo dolů). Tato množina byla následně redukována aplikací prediktivního PAM modelu (Prediction Analysis for Microarrays, http://www-stat.stanford.edu/~tibs/PAM/), navrženého k vyhledávání množin genů s prediktivními vlastnostmi v nezávislých výběrech. Výskyt opakovaných pozorování (tj. technických replikátů) u 7 pacientů byl na úrovni limma modelu ošetřen použitím smíšeného lineárního modelu pro korelovaná data. Sekvence sond jsou uvedeny v tabulce 5.

V Tabulce 4 je uvedena prediktivní množina genů identifikovaná v rámci vynálezu, která se io vzhledem k obecné české populaci jeví z hlediska genové exprese jako diagnostická ve smyslu zvýšeného rizika výskytu akutního infarktu myokardu s následným úmrtím v krátkodobém Časovém horizontu (do 6 měsíců od okamžiku výskytu srdeční příhody).

Uvedená množina 15 genů (gen PFKB2 se vyskytl ve dvou transkriptech) byla stanovena na základě celogenomové analýzy genové exprese vzorků lidské venózní krve odebrané z těla pacientů s primárních výskytem infarktu myokardu. Průměrné hodnoty logaritmované genové exprese při příkladu 2 v populacích AIMD6 a Kontrol jsou uvedeny v Tabulce 6. Simultánně zvýšené hodnoty intenzit genové exprese 14 genů (ECHDC3, IL8RAP, PFKFB2, IRS2, PHACTR1, ERLIN1, VNN3, ADORA, CLEC4E, ASPRV1, CPD, FKBP5, PRKDC a SAMSN1) a současně naopak hodnoty nižší u genu NPM1 indikují příslušnost pacienta k rizikové populaci AIMD6, obecně naznačují zvýšené riziko výskytu akutního infarktu myokardu s následným úmrtí z kardiovaskulárních příčin v krátkodobém horizontu. Diagnóza na základě exprese genů, stanovené jak je popsáno v tomto vynálezu, by měla implikovat zvýšenou pozornost klinickým rizikovým faktorům výskytu akutního infarktu myokardu (např. výskyt diabetů mellitu, kouření, nad25 váha) a jejich cílené zvýšené prevenci.

Tabulka 4: Prediktivní diagnostická množina genů pro kontrast AIMD6 vs Kontroly

Illumina ID	Název / Lokus genu	RefSeq_lD	Průměrná exprese	log2FC	q- hodnota	Pravdepod. DifT. Expr.
6220204	ECHDC3	NM 024693.2	7,15	2,03	0,04983	0,453
5130475	IL18RAP	NM 003853.2	11,70	1,93	0,00849	0,988
3190326	PFKFB2	NM 006212.2	7,68	1,86	0,03523	0,753
6980095	1RS2	NM 003749.2	9,81	1,77	0,04159	0,622
3800095	PHACTR1	NM 030948.1	6,16	1,43	0,03082	0,842
1690309	ERLIN1	NM 006459.2	6,79	1,28	0,01951	0,959
2810373	VNN3	NM 001024460.1	9,98	1,44	0,02903	0,874
4730669	ADORA3	NM 020683.5	6,33	1,75	0,02878	0,896
940754	CLEC4E	NM 014358.1	7,89	1,69	0,04159	0,639
6290358	ASPRV1	NM 152792.1	7,82	1,31	0,03966	0,692
2650347	PFKFB2	NM 001018053.1	6,37	1,97	0,04055	0,655
6590553	CPD	NM 001304.3	9,93	1,01	0,03523	0,745
650543	FKBP5	NM 004117.2	9,56	2,11	0,04052	0,660
1660026	PRKDC	NM 006904.6	8,89	1,36	0,02612	0,913
2060154	NPM1	NM 199185.1	11,52	-1,15	0,02228	0,939
150632	SAMSN1	NM 022136.3	9,18	1,37	0,04777	0,489

Illumina ID ... Illumina identifikátor genu

RefSeq_ID ... NCBI Reference Sequence ID („Accession number“)

Průměrná exprese ... Průměrná hodnota intenzit genové exprese ve spojeném souboru log₂Fc ... Dvojkový logaritmus adjustovaného podílu intenzit ve skupinách AIMD6 a Kontrol

-21 CZ 303378 B6 q-hodnota ... Storeyho adjustace dosažené hladiny významnosti pro mnohonásobná porovnávání (Storey JD, Tibshiraní R. Statistical significance tor genomewide studies. Proč Nati Acad Sci US A. 2003 Aug 5; 100(16):9440-5. Epub 2003 Jul 25. PubMed PMID: 12883005; PubMed Central PMC1D: PMC170937).

Pravděpod. Diferenciální Exprese ... Pravděpodobnost, že sledovaný gen je skutečně diferenciálně exprimován

Tabulka 5: Sekvence sond prediktivní diagnostické množiny genů pro kontrast AIMD6 vs Kont10 roly

Itlumina ID	Sekvence sondy	Definice
6220204	GCCAGCTATGGTGGGAAG CCTGGCATTTGGGGTGCT CCTTGCAACGTCTT	Lidský enoylový koenzym A obsahující hydratázovou doménu (Homo sapiens enoy! Coenzyme A hydratase domain containíng 3 (ECHDC3)), mRNA.
5130475	GGGTACTTTCAGTACACA ACACCCCTAAGATTTCCC AGTGGTCCGAGCAG	Lidský receptorový protein interleukinu 18 (Homo sapiens interleukin 18 receptor accessory protein (IL18RAP)), mRNA.
3190326	GGGCTGAGCACCTCTGGG TTGAATGGGAATGGGTCA GATTGGGAAGCCTA	Lidská 6-fosfofrukto-2-kináza/fniktóza-2,6bifosfatáza 2, transkripční varianta 1 (Homo sapiens 6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6biphosphatase 2 (PFKFB2), transcript variant 1), mRNA.
6980095	GTAACTCCCCCCAGGTAC GATAGGGACTGAATATGG ACCCTGCTGAAAGC	Lidský inzulínový receptor 2 (Homo sapiens insulin receptor substráte 2 (IRS2)), mRNA.
3800095	AGATAAGCCGTGGACCCG CCTCACCGCTGCAGACAA AGCTGCCATCCGAA	Lidský regulátor fbsfatázy a aktinu 1 (Homo sapiens phosphatase and actin regulátor 1 (PHACTR1)), mRNA.
1690309	TGTTGCCCCAAAGTGATG GCCCTGGAGGCGGGGCTG AGGAACAGGGAAAT	Lidský ER lipidový nosič 1 (Homo sapiens ER lipid raft associated 1 (ERLINI)), mRNA,
2810373	GGCCCTGTATGGAAGAGT GTTTGAGAAGGACCCTCC ACGCTTAGGGCAGG	Lidský vanin 3, transkripční varianta 3 (Homo sapiens vanin 3 (VNN3), transcript variant 3), mRNA.
4730669	GTAGTCAGAGGAGCTATG ATAGACCACACCCAAGCA AGGCTGCCCTCAAA	Lidský receptor ad e nos inu A3, transkripční varianta 1 (Homo sapiens adenosine A3 receptor (ADORA3), transcript variant 1), mRNA.
940754	GGCTGTAACCAAGTCCAC CCATCCCTGGGGCTTCCTT TGCTCTGCCTTAT	Lidský lektin C-typu doménové rodiny 4, člen E (Homo sapiens C-type lectin domain family 4, member E (CLEC4E)), mRNA.
6290358	AACTGTGGGACCCCTTCA GATTCCCTGAGGTATGGC TTGGTCACTCTCAG	Lidská aspartyl peptidáza, podobná retrovirové 1 (Homo sapiens aspartíc peptidase, retroviral-like 1 (ASPRV1)), mRNA.
2650347	CAGG ACTCTGTTACC T A A GATGTGATAAGCTGGGCT GCAGGCGGTTCAGC	Lidská 6-fosfofrukto-2-kináza/fruktóza-2,6bifosfatáza 2, transkripční varianta 2 (Homo sapiens 6-phosphofructo-2-kinase/ fructose-2,6biphosphatase 2 (PFKFB2), transcript variant 2), mRNA.
6590553	CTCCČAGTTCTAGAGCAA TCTACAGC TGTTTATGTG AGGTGCCCAACACC	Lidská karboxypeptidáza D (Homo sapiens carboxypeptidase D (CPD)), mRNA.
650543	CTCAGATGATGCCAGCTG TCTCCCACGTGTGTATTAT GGTTCACCAGGGG	Lidský FK506 vážící protein 5 (Homo sapiens FK506 binding protein 5 (FKBP5)), mRNA.

-22CZ 303378 B6

1660026	CCCCCCGCCAGTCCTCCA CACCCAAACTGTTTCTGA TTGGCTTTTAGCTT	Lidská protein kináza, aktivovaná DNA, katalytický polypeptid. transkřípení varianta 1 (Homo sapiens protein kinase, DNA-activated, catalytic poíypeptide (PRKDC), transeript variant 1), mRNA.
2060154	GTTGTCCAGGTTCTATTGC CAAGAATGTGTTGTCCAA A ΑΤηΓΓΤΓ,ΤΤΤΑΓ.	Lidský nukleofosmin, transkripční varianta 2 (Homo sapiens nucleophosmin (nucleolar phosphoprotein B23, nnmatrin) (NPM1), transeript variant 2), mRNA.
150632	CACAGTTAGATGACTGCC CAAGGGACTCTGGTTGCT ATATCTCATCAGGA	Lidská SAM doména, SH3 doména a jaderné lokalizační signály 1 (Homo sapiens SAM domain, SH3 domain and nuclear localization signa!s 1 (SAMSN1)), mRNA.

Tabulka 6: Průměrné hodnoty logaritmovaných genových expresí prediktivní diagnostické mno5 žiny genů pro kontrast AIMD6 vs Kontroly

Illumina ID	Název / Lokus Genu	Průměrná Exprese
AIMD6	Kontroly1*1
6220204	ECHDC3	8,72	6,89
5130475	IL18RAP	13,13	11,46
3190326	PFKFB2	9,20	7,60
6980095	IRS2	11,05	9,57
3800095	PHACTR1	7,32	5,94
1690309	ERLIN1	7,89	6,70
2810373	VNN3	11,04	9,69
4730669	ADORA3	7,66	6,29
940754	CLEC4E	9,15	7,72
6290358	ASPRV1	9,11	7,72
2650347	PFKFB2	7.92	6,29
6590553	CPD	11,00	9,82
650543	FKBP5	10,90	9,44
1660026	PRKDC	10,07	8,68
2060154	NPM1	10,39	11,64
150632	SAMSN1	10,30	9,04

(*) Referenční hladina intenzity genové exprese pro posouzení zvýšeného kardiovaskulárního rizika

Porovnáním hladin genové exprese ve skupinách AIMD6 a Kontrol bylo popsáno 15 genů (gen PFKFB2 se vyskytuje ve dvou transkriptech), z nichž u 14 genů byla hladina genové exprese zvýšena a u jednoho snížena. Jediný gen, u nějž byla genová exprese snížena, je gen NPM1 (nukleofosmin, jaderný fosfoprotein B23), který je významným jaderným proteinem zprostred15 kovávajícím transport mezi jádrem a cytoplasmou buňky. To zahrnuje celou řadu uvažovaných biologických procesů, jakými mohou být např. sestavování a transport ribosomátních proteinů či kontrola centrosomové duplikace. U zbývajících 15 genů byly identifikovány zvýšené hladiny genové exprese. Z těchto 14 up-reguíováných genů bylo 7 genů vybaveno různými enzymatickými aktivitami / ECHDC3 (hydratáza), PRKDC (proteinová kináza), PFKFB2 (6-fosfofrukto20 2-kináza/fruktóza-2,6-bi fosfatáza 2), PHACTR1 (proteinová fosfatáza), VNN3 (vanin3, panteteináza, indukovaná na proteinové a mRNA úrovni prozánětíivými cytokiny), ASPRV1 (aspartyl proteáza, hydroláza) a CPD (Karboxypeptidáza D) patří do rodiny enzymů metalokarboxypeptidáz.

Další 3 geny byly identifikovány jako molekuly, obsahující receptorové domény: IL18RAP (interlcukin receptor), IRS2 (insulin receptor), ADORA3 (adenosin A3 receptor) s možnou kardioprotektivní aktivitou a zbývající 4 geny kódující molekuly s různými regulačními funkcemi: FKPB5 (chaperon) spojovaný s odpovědí na antidepresivní léčbu a označovaný jako rizikový faktor rozvoje posttraumatického šoku s vlivem na kortikosteroidní receptoiy, ERLIN1 (Endoplasmic Reticulum Lipid Raft-Associated Protein 1), kódující protein, v jehož struktuře jsou popisována aktivní místa pro fosforylaci, N-glykosylaci a N-myristoylaci, CLEC4E (C-type Lectin Domain Family 4, Member E), lektin exprimovaný na povrchu makrofágů, jehož jednou z hlavních biologických funkcí jsou mezibuněčné interakce a SAMSN1 (Sam Domain, SH3 Domain, and Nuclear Localization Signals 1), kódující hematopoetický adaptor s popisovanou funkcí v cytoplazmě buňky.

Výsledky bootstrap studie pro ověření prediktivních vlastností vybraných genových sekvencí

Prediktivní vlastnosti transkriptů byly z hlediska nezávislých výběrů posuzovány pomocí bootstrap studie zaměřené na hodnocení senzitivity (SE) a specificity (SP) klasifikace na základě PAM modelu. Bootstrap studie zahrnovala analýzu 1000 náhodných výběrů pořízených s opakováním z odpovídajících populací o témže rozsahu. Výsledky studie jsou uvedeny v Tabulce 7.

Tabulka 7: Výsledky bootstrap studie na posouzení senzitivity a specificity PAM klasifikačního testu v nezávislých výběrech

Kontrast	Výsledky PAM klasifikace (počet transkriptů použitých pro klasifikaci)
AIMD6 vs Kontroly	SE= 0,90, SP= 0,93 (16 transkriptů)

Uvedená množina genů se vyznačuje vysokou senzitívitou i specifickou klasifikačního testu na základě PAM modelu.

Claims (2)

1. 5 1. Způsob identifikace osob se zvýšeným genetickým rizikem výskytu akutního infarktu myokardu a popřípadě se zvýšeným genetickým rizikem následného úmrtí v důsledku kardiovaskulárních komplikací do 6 měsíců od okamžiku výskytu akutního infarktu myokardu, vyznačený tím, že se v biologickém vzorku odebraném z těla pacienta stanoví intenzita exprese sady genů a genetických lokusů:

   Název / Lokus genu SEQ ID No. Referenční hodnota intenzity exprese (nízké riziko) stanovená na celogenomovém / oligonukleotidovém čipu Min. odchylka od ref. hodnoty exprese, značící zvýšené riziko ECHDC3 1 6,89 +1 IL18RAP 2 11,46 +1 PFKFB2 3 7,60 +1 IRS2 4 9,57 +1 PHACTR1 5 5,94 + 1 ERLIN1 6 6,70 + 1 VNN3 7 9,69 +1 ADORA3 8 6,29 + 1 CLEC4E 9 7,72 + 1 ASPRV1 10 7,72 + 1 PFKFB2 11 6,29 + 1 CPD 12 9,82 +1 FKBP5 13 9,44 + 1 PRKDC 14 8,68 +1 NPM1 15 11,64 -1 SAMSN1 16 9,04 +1

   a její logaritmovaná hodnota při základu 2 se srovná s referenční hodnotou intenzity exprese, přičemž odchylka od referenční hodnoty rovná alespoň minimální odchylce u všech genů a genetic15 kých lokusů dané sady značí zvýšené riziko.
2. 2. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, že biologickým vzorkem odebraným z těla pacienta jsou buňky periferní krve.

   20 3. Oligonukleotidový čip pro identifikaci osob se zvýšeným genetickým rizikem výskytu akutního infarktu myokardu a popřípadě se zvýšeným genetickým rizikem následného úmrtí v důsledku kardiovaskulárních komplikací do 6 měsíců od okamžiku výskytu akutního infarktu myokardu, vyznačený tím, že obsahuje právě sondy hybridizující s DNA či RNA sady genů či genetických lokusů:

   C7. 303378 B6

   Název / Lokus genu SEQ ID No. ECHDC3 1 ILI8RAP 2 PFKFB2 3 IRS2 4 PHACTR1 5 ERLIN1 6 VNN3 7 ADORA3 8 CLEC4E 9 ASPRV1 10 PFKFB2 11 CPD 12 FKBP5 13 PRKDC 14 NPM1 15 SAMSN1 16

   35 stránek sekvencí