CZ22758U1 - Oligonuldeotidový čip pro identifikaci osob se zvýšeným genetickým rizikem výskytu infarktu myokardu - Google Patents

Description

Oblast techniky

Předkládané technické řešení se týká oligonukleotidového čipu pro identifikaci osob v české populaci, které vykazují zvýšené genetické riziko výskytu akutního infarktu myokardu, se zřetelem k jejich přežití v krátkodobém časovém horizontu od doby výskytu srdeční události. Identifikace je prováděna na základě stanovení profilu genové exprese vybraných genů lidského genomu.

Dosavadní stav techniky

Infarkt myokardu a cévní mozková příhoda jsou dvěma nej závažnějším i klinickými projevy aterosklerózy. Riziko rozvoje těchto onemocnění se odhaduje na základě známých rizikových faktorů. Rozsah onemocnění je v současnosti zjišťován řadou vyšetření, jakými jsou např. scintigrafíe, magnetická rezonance, katetrizačni vyšetření. Každé z těchto vyšetření má však i svá omezení, např. radiační zátěž nebo invazivítu vyšetření. Aterosklerotické pláty jsou zkoumány na buněčné i molekulární úrovni, včetně sledování buněk v cirkulaci jako odpovědi na zánětlivý proces v cévách.

Identifikace genů pomocí molekulárně biologických metod znamenala v posledních letech výrazný posun nejen v odhalení příčin některých závažných, život ohrožujících, onemocnění člověka (např. některé onkologické diagnózy, závažné dědičné poruchy metabolismu člověka či další poruchy neuromuskulamího, gastrointestinálního a oběhového systému, včetně aterosklerózy atd.), ale v neposlední radě také významně rozšířila naše znalosti o vzniku a rozvoji akutního infarktu myokardu (AIM) (Yukihiro Hojo, Uichi Ikeda, Yun Zhu, Motoi Okada, Shuichi Ueno, Hiroshi Arakawa, Hideyuki Fujikawa, Taka-aki Katsuki, and Kazuyuki Shimada. Expression of vascular endothelial growth factor in patíents with acute myocardial infarction. J Am Coll Cardiol, 35(4):968-973, March 2000; Merry L. Lindsey. MMP Induction and ínhibition in Myocardial Infarction. Heart Failure Reviews, 9(1):7-19, January 2004). Detailnějším pochopením jednotlivých stádií IM se dostávají do popředí i otázky možnosti prevence a účinnější léčby onemocnění. S rozvojem moderních technologií se molekulárně biologický výzkum obecně posouvá od klasického modelu odhalování konkrétních genetických lokusů, resp. genetických polymorfismů, působících poruchu jednoho genu ke snaze monitorovat polygenní a multifaktoriální poruchy člověka pomocí genomických a expresních čipů, jejichž analýza v současnosti poskytuje komplexnější obraz onemocnění (Joseph S. Verducci, Vincent F. Melfi, Shili Lín, Zailong Wang, Sashwati Roy, and Chandan K. Sen. Microarray analysis of gene expression: considerations in data mining and statistical treatment. Physiological Genomics, 25(3):355-363, May 2006). Především studium tzv. expresních čipů zažívá v lékařských vědách velký rozvoj, protože umožňuje posoudit mnoho genových transkriptů a jejich expresních variant najednou v kritickém stádiu onemocnění (multívarianční analýza, randomizační studie) (Lawrence W. Stanton, Lísá J. Garrard, Deborah Damm, Brett L. Garrick, Andrew Lam, Ann M. Kapoun, Qiang Zheng, Andrew A. Protter, George F. Schreiner, and R. Tyler White. Altered Pattems of Gene Expression in Response to Myocardial Infarction. Circ Res, 86(9):939-945, May 2000; Matthew B. Lanktree and Robert A. Hegele. Gene-gene and gene-environment interactions: new insights into the prevention, detection and management of coronary artery disease. Genome medicine, 1 (2):28, February 2009).

Recentní práce posledních 5 let se intenzivně zabývají z mnoha úhlů pohledu nejen expresními profily osob s aterosklerózou, ale také osob s ischemickou chorobou srdeční ve vztahu ke vznikajícím zanětlivým procesům v cévách (Gemma Satterthwaite, Sheila E. Francis, Kim Suvama, Stephen Blakemore, Chantelle Ward, Don Wallace, Martin Braddock, and David Crossman. Differential gene expression in coronary arteries from patíents presenting with ischemic heart disease: further evidence for the inflammatory basis of atherosclerosis. American heart Journal,

- 1 CZ 22758 Ul

150(3):488-499, September 2005), osob s isehemickou a neischemickou kardiomyopatií při srdečním selhání (Michelle M. Kittleson, Khalid M. Mínhas, Rafael A. Irizarry, Shui Q. Ye, Gina Edness, Elayne Breton, John V. Conte, Gordon Tomaselli, Joe G. Garcia, and Joshua M. Hare. Gene expressíon analysis of ischemic and nonischemic cardiomyopathy: shared and distinct ge5 nes in the development oť heart ťailure. Physiological genomics, 21(3):299-307, May 2005; Michelle M. Kittleson, Shui Q. Ye, Rafael A. Irizarry, Khalid M. Minhas, Gina Edness, John V. Conte, Gtovanni Parmigiani, Leslie W. Miller, Yingjie Chen, Jennifer L. Halí, Joe G. Garcia, and Joshua M. Hare. Identification of a gene expressíon profile that differentiates between ischemic and nonischemic cardiomyopathy. Circulation, 110(22):3444-3451, November 2004) a io dále také osob s poškozením koronárních cév (James A. Wingrove, Susan E. Daniels, Amy J. Sehnert, Whittemore Tingley, Michael R. Elashoťf, Steven Rosenberg, Lutz Buellesfeld, Eberhard Grube, L. Kristin New by, Geoffrey S. Ginsburg, and William E. Kraus. Correlation of Peripheral-Blood Gene Expressíon With the Extent of Coronary Artery Stenosis / CLINICAL PERSPECTIVE. Circulation: Cardiovascular Genetics, 1(1):31-38, October 2008;

Ramachandran S. Vasan and Calum A. MacRae. A dream, a joumey, and a promise: the inauguration oť Circulation: Cardiovascular Genetics. Circulation. Cardiovascular genetics, 1(1):1-2, October 2008; Daphne, Maroeska M. Rovers, Diederick E. Grobbee, Joannes J. Marx, Jill Waalen, Christina Ellervik, Borge G. Nordestgaard, John K. Olynyk, Peter R. Mills, James Shepherd, Bernard Grandchamp, Jolanda M. Boer, Calogero Caruso, Marceilo Area, Beat J.

Meyer, and Yvonne T. van der Schouw. Mutations in the HFE gene and cardiovascular disease risk: an individual patient data meta-analysis of 53 880 subjects. Circulation. Cardiovascular genetics, 1(1):43-50, October 2008).

Nárůst četnosti vědeckých prací v roce 2009, zabývajících se akutním infarktem myokardu, ukazuje nejen narůstající zájem o tuto problematiku, ale také závažnost studovaného tématu (Kahraman Tanriverdi and Jane E. Freedman. Blood and Cardiovascular Disease. Circulation: Cardiovascular Genetics, 1(1):7-9, October 2008). Také další vědecké práce hledají v poslední době příčinné vztahy mezi projevy některých genů a vznikem akutního infarktu myokardu (AIM). To, že se jedná o komplexní proces, zahrnující celou řadu genů či pouze jejich částí (polymorfní místa), je všeobecně známo. Jsou popsány polymorfismy ve struktuře endoteliálního růstového faktoru, diskriminující pacienty s AIM, u nichž se vyvinulo srdeční selhání (Panagiotis Douvaras, Dionisios G. Antonatos, Kiriaki Kekou, Sotirios Patsilinakos, George Chouliaras, Apostolos Christou, Anastasios Andrikou, and Emmanuel Kanavakis. Association of VEGF gene polymorphisms with the development of heart failure in patients after myocardial infaretion. Cardiology, 114(1): 11-18, 2009).

Je popsán vliv akutní koronární o kluže na uvolňování ateriálního natriuretického peptidu, který působí na vasodilataci, natriurézu a zánětlivou odpověď, čímž zvyšuje rozsah infarktu myokardu a mortalitu (Aiilyan K. Houng, Ráchel A. McNamee, Attila Kemer, Pallavi Sharma, Almois Mohamad, Jonathan Tronolone, and Guy L. Reed. Atrial natriuretic peptide inereases inflammation, infaret size, and mortality after experimental coronary occlusion. American Journal of physiology. Heart and circulatory physiology, 296(3): H655-H661, March 2009). Popisována je rovněž exprese kininových a jiných receptorů (June Yun, Michael J. Zuscik, Pedro GonzalezCabrera, Dan F. McCune, Sean A. Ross, Robert Gaivin, Michael T. Piascik, and Dianne M. Perez. Gene expressíon profiling of alpha(lb)-adrenergic receptor-induced cardiac hypertrophy by oligonucleotide arrays. Cardiovascular research, 57(2):443-455, February 2003), které pod45 pórují aktivaci cirkulujících mononukleárů u pacientů s akutním koronárním syndromem (AKS).

Změny nalézané v extracelulámí matrix jsou určující pro myokardiální remodelaci po IM. Mohou být významným faktorem pro zánětlivou odpověď a mohou přispívat ke stabilizaci a kompenzatomím mechanizmům pro udržení srdečního výdeje. Ovlivňují též angiogenezi, proliferaci a diferenciaci buněk (Fabio D'Aguiar D. Mataveli, Sang Won W. Han, Helena Bonciani B.

Ňader, Aline Mendes, Rose Kanishiro, Paulo Tucci, Antonio Carlos C. Lopes, Jose Carlos Costa C. Baptista-Silva, Ana Paula Cleto P. Maroíla, Leonardo Pinto P. de Carvalho, Priscila Martins Andrade M. Denapoli, and Maria Aparecida da Silva A. Pinhal. Long-term effects for acute

-2CZ 22758 Ul phase myocardial inťarct VEGF165 gene transfer cardiac extracellular matrix remodeling. Growth factors (Chur, Switzerland), 27(1):22-31, February 2009). Objevují se i studie zaměřené na hledání konkrétních polymorfismů ve struktuře DNA, které by mohly mít přímou souvislost s vývojem ischemické choroby srdeční (C. Federici, N. Botto, S. Manfredi, A. Rizza, M. Fiandra, and M. Andreassi. Relation of Increased Chromosomal Damage to Future Adverse Cardiac Fvents in Patients With Known Coronary Artery Disease, The American Journal of Cardiology,

102( 10): 1296-1300, November 2008).

Recentní molekulárně genetické (expresní) studie jsou prováděny např. na desítkách osob s chronickým srdečním selháním (Cappuzzello C., Napolitano M., Arcelli D., Melillo G., Melchionna R., DiVito L., Karlini D., Silvestři L., Brugaletta S., Liuzzo G., Crea F., Capogrosso M. C.: Gene expression profiles in peripheral blood mononuclear cells of chronic heart failure patients, Physiol. Genomics, 2009, 38:233-240), na pacientech s onemocněním koronárních artérií (Meier P., Antonov J„ Zbinden R., Kun A., Zbinden S., Gloekler S., Delorenzi M., Maggi R., Seiler C.: Non-invasive gene-expression-based detection of welldeveloped coilateral function in individuals with and without coronary artery disease. Heart, 2009, 95:900-908; Erdmann J., Grosshennig A., Braund P. S., et al. : New susceptibility locus for coronary artery disease on chromosome 3q22.3, Hat. Genet., 2009, D01:10.1038/ng.307; Tregouet D. A., Konig I. R., Erdmann J., et al.: Genome-wide haplotype association study identifies the SLC22A3-LPAL2LPA gene cluster as a risk locus for coronary artery disease. Nat Genet, 2009, DOI:l0.1038/ng.314) či na sekrečním materiálu osob s chronickou ischémií (Józefa Dabek, Aleksander Owczarek, Zbigniew Gasior, Rafal Ulczok, Mariusz Skowerski, Andrzej Kulách, Urszula Mazurek, and Andrzej Bochenek. Oligonucleotide microarray analysis of genes regulating apoptosis in chronically ischemic and postinfarction myocardium. Biochemical genetics, 46(5-6):241-247, June 2008).

Několik vědeckých týmů v čele s mezinárodním konsorciem pro genetiku infarktu myokardu (Myocardial Infarction Genetics Consortium, http://www.nature.com/ng; David Seo, Geoffrey S. Ginsburg, and Pascal J. Goldschmidt-Clermont. Gene Expression Analysis of Cardiovascular Dtseases: Novel Insights Into Biology and Clinical Applications. J Am Coil Cardiol, 48(2):227235, July 2006; David Seo, Tao Wang, Holly Dressman, Edward E. Herderick, Edwin S. Iversen, Chunming Dong, Korkut Vata, Carmelo A. Milano, Fabio Rigat, Jennifer Pittman, Joseph R. Nevins, Mike West, and Pascal J. Goldschmidt-Clermont. Gene Expression Phenotypes of Atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 24(10):1922-1927, October 2004) se zabývá genetickými asociačními studiemi ve vztahu k infarktu myokardu (Iris M. Heid, Eva Boes, Martina Muller, Barbara Kollerits, Claudia Lamina, Stefan Coassin, Christian Gieger, Angela DÓring, Norman Klopp, Ruth Frikke-Schmidt, Anně Tybjaerg-Hansen, Anita Brandstátter, Andreas Luchner, Thomas Meitinger, Wichmann, and Florian Kronenberg. Genome-Wide Association Analysis of High-Density Lipoprotein Cholesterol in the Population-Based KORÁ Study Sheds New Light on Intergenic Regions / CLINICAL PERSPECTIVE. Circulation: Cardiovascular Genetics, 1(1):10-20, October 2008; Gudbjartsson D. F., Bjomsdittir U. S., Halapi E., et al.: Sequence variants affecting eosinophil numbers associate with astma and myocardial infarction, Nat. Genet., 2009, DOI:10.1038/ng.323; Ozaki K., Sáto H., Inoue K., et al.: SNPs in BRAP associated with risk of myocardial infarction in Asian population, Nat. Genet., 2009, DOI:10,1038/ng.326).

Snaha včas predikovat nastupující příznaky infarktu myokardu (postupně nastupující stres vyvíjející se až do šoku) je dnes řešena klinickou diferenciální diagnostikou, funkčními testy, resp. statimovým měřením základních biochemických markérů pro AIM. Toto užívané schéma diagnostiky je používáno (u pacienta pri první události) bez jakékoliv možnosti monitorovat (predikovat) celkový stav organismu v období před AIM. Přesnějším charakterizováním základního expresního profilu pacienta přežívajícího i nepřežívajícího akutní stadium infarktu myokardu a jeho porovnáním s vybranými osobami kontrolního souboru české populace, se otevírá do budoucna reálná možnost průběžného, ekonomicky dostupného sledování osob přežívajících infarkt myokardu (období do 3-6 měsíců po první a další události).

-3 CZ 22758 Ul

Pokusy o expresní analýzu a průběžné monitorování nej různějších, především ale nádorových, onemocnění člověka byly již učiněny. Jsou dnes připravovány nejrůznější selektivní expresní sady genů, které charakterizují nejen aktuální stav organismu, ale také mohou monitorovat úspěšnost a adekvátnost léčby (David T. Miller, Paul M. Rídker, Peter Libby, and David J. Kwiatkowskí. Atherosclerosis: The Path From Genomics to Therapeutics. J Am Coll Cardiol, 49(15):1589-1599, Apríl 2007). Tyto snahy jsou zřejmé v posledních letech i v oblastí diagnostiky některých kardiovaskulárních poruch člověka (P. Meier, J. Antonov, R. Zbinden. A. Kuhn,

S. Zbinden, S. Gloekler, M. Delorenzi, R. Jaggi, and C. Seiler. Non-invasive gene-expressionbased detection of well-developed collateral function in individuals with and without coronary artery disease. Heart, 95( 11 ):900-908, June 2009; Józeťa Dabek, Aleksander Owczarek, Zbigniew Gasior, Rafal Ulczok, Mariusz Skowerski, Andrzej Kulách, Urszula Mazurek, and Andrzej Bochenek. Oligonucleotide microarray analysis of genes regulating apoptosis in chronically ischemic and postinfarction myocardium. Biochemical genetics, 46(5-6):241-247, June 2008; Claudia Cappuzzello, Monica Napolitano, Diego Arcelli, Guido Melillo, Roberta Melchionna, Luca Di Vito, Daniele Carlíni, Lorena Silvestři, Salvátore Brugaletta, Giovanna Liuzzo, Filippo Crea, and Maurizío C. Capogrossi. Gene expression proťiles in peripheral blood mononuclear cells of chroníc heart failure patients. Physiological genomics, 38(3):233-240, August 2009), dosud však není známa studie snažící se predikovat prognózu pacienta s AIM.

V posledních letech celosvětově vzrůstající prevalence kardiovaskulárních chorob člověka motivuje stále intenzivněji vědeckou veřejnost k hledání nových strategií diagnostiky a léčby (James A. Wingrove, Susan E. Daniels, Amy J. Sehnert, Whittemore Tingley, Michael R. Elashoff, Steven Rosenberg, Lutz Buellesťeld, Eberhard Grube, L. Kristin Newby, Geoffrey S. Ginsburg, and Wiltiam E. Kraus. Correlation of Peripheral-Blood Gene Expression With the Extern of Coronary Artery Stenosis / CLINICAL PERSPECTIVE. Circulation: Cardiovascular Genetics, 1(1):31-38, October 2008; Peter R. Sinnaeve, Mark P. Donahue, Peter Grass, David Seo, Jacky Vonderscher, Salah-Dine D. Chibout, William E. Kraus, Michael Sketch, Charlotte Nelson, Geoffrey S. Ginsburg, Pascal J. Goldschmidt-Clermont, and Christopher B. Granger. Gene expression pattems in peripheral blood correlate with the extent of coronary artery disease. PloS one, 4(9), 2009; Ruby C. Y. Lin, Kate L. Weeks, Xiao-Ming Gao, Rohan B. H. Williams, Bianca C. Bemardo, Helen Kiriazis, Vance B. Matthews, Elizabeth A. Woodcock, Russell D. Bouwman, Janelle P. Mollica, Helen J. Speirs, lan W. Dawes, Roger J. Daly, Tetsuo Shioi, Seigo Izumo, Mark A. Febbraio, Xiao-Jun Du, and Julie R. McMullen. Pi3k(pl lOalpha) protects against myocardial infarctionínduced heart failure: Identification of pi3k-regulated mima and mma. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 30(4):724-732, Apríl 2010; Orfeas Liangos, Sophie Domhan, Christian Schwager, Martin Zeier, Peter E. Huber, Francesco Addabbo, Michael S. Goligorsky, Lynn Hlatky, Bertrand L. Jaber, and Amir Abdollahi. Whole blood transcriptomics in cardiac surgery identifies a gene regulátory network connecting ischemia reperfusion with systemic inflammation. PloS one, 5(10), 2010) a využívání nových technologií, jakými jsou na příklad meta-analýzy velkých souborů studovaných osob či tzv. GWAS (Genome-wide association studies) studií (John P. A. Ioannidis. Prediction of Cardiovascular Disease Outcomes and Established Cardiovascular Risk Factors by Genome-Wide Association Markers / CLINICAL PERSPECTIVE. Circulation: Cardiovascular Genetics, 2(1):7-15, February 2009; Jeanette Erdmann, Patrick Linsel-Nitschke, and Heribert Schunkert. Genetic causes of myocardial infarction: new insights from genome-wide association studies. Deutsches Árzteblatt International, 107(40):694-699, October 2010).

Výsledky rozsáhlé GWAS studie (Myocardial Infarction Genetics Consortíum, Sekar Kathiresan, Benjamin F. Voight, Shaun Purcell, Kiran Musunuru et al. Genome-wide association of earlyonset myocardial infarction with single nucleotide polymorphisms and copy number variants. Nátuře genetics, 41(3):334-341, March 2009) potvrdily asociaci několika genů s ranným výskytem akutního infarktu myokardu, z nichž některé byly též potvrzeny analýzami našich dat. Jedná se především o gen PHACTR1 (fosfatáza a regulátor aktinu 1), který se ve srovnání s obecnou českou populací ukazuje na základě našich dat jako prediktívní u pacientů, kteří z kardiovaskulárních příčin zemřeli v průběhu 6-městcního sledování po primární srdeční příhodě, dále též gen

-4CZ 22758 Ul

MRPS6 (mitochondriální ribozomální protein), jehož varianty MRPL9, MRPL39, MRPL48, MRPS33 a MRPS30 byly statisticky významné také v našich datech, nikoliv však klinicky a neprosadily se do množin genů s prediktivními vlastnostmi. Nejsou proto uváděny v našich konečných výsledcích. Varianty WDR57, WDR61 a WDR75 genu WDR12 identifikovaného v této publikaci byly podobně statisticky, nikoliv však klinicky významné v našich datech. Naopak geny CDKN2A, CDKN2B identifikované v souvislosti s incidencí akutního infarktu myokardu ve výše zmíněné publikaci a dále např. v publikaci autorů Anna Helgadottir, Gudmar Thorleifsson, Andrei Manolescu, Solveig Gretarsdottir, Thorarinn Blondal, Aslaug Jonasdottir, Adalbjorg Jonasdottir, Asgeir Sigurdsson, Adam Baker, Amar Palsson, Gisli Masson, Daniel F. Gudbjartsson, Kristinn P. Magnusson, Karl Andersen, Allan I. Levey, Valgerdur M. Backman, Sigurborg Matthíasdottir, Thorbjorg Jonsdottir, Stefan Palsson, Helga Einarsdottir, Steinunn Gunnarsdottir, Amaldur Gylfason, Viola Vaccarino, W. Craig Hooper, Muredach P. Reilly, Christopher B. Granger, Harland Austin, Daniel J. Rader, Svati H. Shah, Arshed A. Quyyumi, Jeffrey R. Gulcher, Gudmundur Thorgeirsson, Unnur Thorsteinsdottir, Augustine Kong, and Kari Steťansson. A common variant on chromosome 9p21 affects the risk of myocardial infarction. Science (New York, N Y.), 316(5830):1491-1493, June 2007, nebyly v našich datech v souvislosti s výskytem akutního infarktu myokardu zjištěny.

Recentní publikace z roku 2010 naznačují stoupající zájem o aplikaci moderních metod pro studium kardiovaskulárního systému člověka, mezi něž se zařazuje i technologie celogenomové expresní analýzy. Tato technologie umožňuje získávat informace o okamžité odpovědi organismu na akutní stádia závažných, život ohrožujících, onemocnění, jakými jsou např. mrtvice či infarkt myokardu. Dovoluje nám současně i nový pohled na desetiletí známý proces. Využitím mononukleámích buněk periferní krve jako zkoumaného materiálu se naskýtá reálná možnost získat expresní profily ze snadno a rutinně dostupného biologického materiálu a z těchto profilů poté vytipovat ty signifikantní hladiny genové exprese, které by mohly charakterizovat určitá stádia onemocnění. Takto získaná data se dají v budoucnu použít jako základ pro zlepšení diagnostického komfortu pacienta. Ze studií publikovaných na konci roku 2009 a v průběhu roku 2010 lze zmínit práce, zabývající se úlohou hladin HDL a LDL frakcí cholesterolu či celkového cholesterolu ve vztahu ke genetické predispozici kardiovaskulárních chorob (Anna C. Calkin and Peter Tontonoz. Genome-Wide Association Studies Identify New Targets in Cardiovascular Disease. Science Translational Medicine, 2(48):48-94, 2010; Rong Yang, Lin Li, Sara Bretschger B. Seidelmann, Gong-Qing Q. Shen, Sonia Sharma, Shaoqi Rao, Kalil G. Abdullah, Kenneth G. Mackinlay, Robert C. Elston, Qiuyun Chen, Eric J. Topol, and Qing Kenneth K. Wang. A genome-wide linkage scan identifies multiple quantitative trait loci for HDL-cholesterol levels in families with premature CAD and MI. Journal oflipid research, 51(6):1442-1451, June 2010), nebo práce snažící se predikovat významné geny exprimující se v aktuním stádiu mrtvice (Boryana Stamova, Huichun Xu, Glen Jickling, Cheryi Bushnell, Yingfang Tian, Bradley P. Ander, Xinhua Zhan, DaZhi Liu, Renee Turner, Peter Adamczyk, Jane C. Khoury, Arthur Pancioli, Edward Jauch, Joseph P. Broderick, and Frank R. Sharp. Gene Expression Profiling of Blood for the Prediction of Ischemic Stroke. Stroke, 41(10):2171-2177, October 2010).

Několik prací se v roce 2010 zabývalo hledáním genetických příčin či nejrůznějších nových biomarkerů ventrikulámí fibrilace, která bývá pozorována v akutním stádiu infarktu myokardu a může mít vliv na přežití pacienta (Connie R. Bezzina, Raha Pazoki, Abdennasser Bardai, Roos F. Marsman, Jonas S. de Jong, Marieke T. Blom, Brendon P. Scicluna, J. Wouter Jukema, Návin R. Bindraban, Peter Lichtner, Ame Pfeufer, Nanette H. Bishopric, Dan M. Roden, Thomas Meitinger, Sumeet S, Chugh, Robert J. Myerburg, Xavier Jouven, Stefan Kááb, Lukas R. Dekker, Hanno L. Tan, Michael W. Tanck, and Arthur A. Wilde. Genome-wide association study identifies a susceptibility locus at 21q21 for ventricular fibrillation in acute myocardial infarction. Nátuře genetics, 42(8):688-691, August 2010; Feng Dong, Mazen Khalil, Matt Kiedrowski, Caitlin O' Connor, Erin Petrovic, Xiaorong Zhou, and Maře S. Penn. Critical role for leukocyte hypoxia inducible factor-lalpha expression in post-myocardial infarction left ventricular remodeling. Circulation research, 106(3):601-610, February 2010; Yvan Devaux, Francisco Azuaje, Mélanie Vausort, Céline Yvorra, and Daniel R. Wagner. Integrated protein

5CZ 22758 Ul network and microarray analysis to identity potential biomarkers after myocardial infarction. Functional & integrative genotnics, 10(3):329-337, August 2010).

Do popředí zájmu se v posledním roce dostává i otázka, zda celkový stres organismu při akutní fázi infarktu myokardu nezhoršuje vlastní prognózu přežití (Jessica M. Berthiaume, Molly S. Bray, Tracy A. McElfresh, Xiaoqin Chen, Salman Azam, Martin E. Young, Brian D. Hoit, and Margaret P. Chandler. The myocardial contractile response to physiological stress improves with hígh saturated fat ťeeding in heart failure. American Journal ofphysiology. Heart and circulatory physiology, 299(2), August 2010). Jsou hledány souvislosti mezi genetickými příčinami infarktu myokardu a chronickým onemocněním ledvin (Tetsuo Fujimaki, Kimihiko Kato, Kiyoshi Yokoi, Mitsutoshi Oguri, Tetsuro Yoshida, Sachiro Watanabe, Norifumi Metoki, Hidemi Yoshida, Kei Satoh, Yukitoshi Aoyagi, Yoshinori Nozawa, Genjiro Kimura, and Yoshiji Yamada. Association of genetic variants in SEMA3F, CLEC16A, LAMA3, and PCSK2 with myocardial infarction in Japanese individuals. Atherosclerosis, 210(2):468-473, June 2010) ěi atherotrombózou (Luca Andrea A. Lotta. Genome-wide association studies in atherothrombosis. European Journal of internát mediáne, 21(2):74-78, Apríl 2010).

Studován byl rovněž vliv microRNA-molekul, které jsou popisovány jako negativní regulátory genové exprese a recentní studie naznačují, že mohou hrát významnou roli nejen v rozvoji infarktu myokardu, ale i u dalších kardiovaskulárních poruch člověka (Emanuela Bostjancic, Nina Z i dar, and Damjan Glavac. MicroRNA microarray expression profiling in human myocardial infarction. Disease markers, 27(6):255-268, 2009). Stále je diskutována biologická role interleukinu 1 ve vztahu k dyslipidémii a riziku vzniku infarktu myokardu (Bernard Keavney. The interleukin-I cluster, dyslipídaemia and risk of myocardial infarction. BMC mediáne, 8(1):6+, January 2010).

Populačně charakteristický obraz rizikových genetických markérů je diskutován v řadě recentních publikací (Paul M. Ridker, Guillaume Pare, Alex N. Parker, Robert Y. Zee, Joseph P. Miletich, and Daniel I. Chasman. Polymorphism in the CETP gene region. HDL cholesterol, and risk of future myocardial infarction: Genomewide analysis among 18 245 initially healthy women from the Womens Genome Health Study. Circulation. Cardiovascular gene tics, 2(1):2633, February 2009; Tetsuo Fujimaki et al. Association of genetic variants in SEMA3F, CLEC16A, LAMA3, and PCSK2 with myocardial infarction in Japanese individuals. Atherosclerosis, 210(2):468-473, June 2010). Jsou studovány i další typy genetických variací (SNPsingle nucleotide poiymorphisms a CNV-copy number variations) ve vztahu ke vzniku a rozvoji infarktu myokardu (Myocardial Infarction Genetics Consortium, Sekar Kathiresan, Benjamin F. Voight, Shaun Purcell, Kiran Musunuru et al. Genome-wide association of early-onset myocardial infarction with single nucleotide poiymorphisms and copy number variants. Nátuře genetics, 41(3):334-341, March 2009).

V neposlední řadě je nutno zmínit také práce zabývající se infarktem myokardu na experimentálním zvířeti (Jessica M. Berthiaume et al. The myocardial contractile response to physiological stress improves with high saturated fat feeding in heart failure. American Journal ofphysiology. Heart and circulatory physiology, 299(2), August 2010; Dongsheng Hong, Xiaowei Zeng, Wei Xu, Jing Ma, Yinghui Tong, and Yan Chen. Altered profiles of gene expression in curcumintreated rats with experimentally induced myocardial infarction. Pharmacological Research, 61(2):142-148, February 2010; Žongjin Li. Kitchener D, Wilson, Bryan Smith, Daniel L. Kraft, Fangjun Jia, Met Huang, Xiaoyan Xie, Robert C. Robbins, Sanjiv S. Gambhir, Irving L. Weissman, and Joseph C. Wu. Functional and transcriptional characterization of human embryonic stem cell-derived endothelial cells for treatment of myocardial infarction. PloS one, 4(12):e8443+, December 2009; Lisheng Zhang, Jessica J. Connelly, Karsten Peppel, Leigh Brian, Svati H. Shah, Sarah Nelson, David R. Crosslin, Tianyuan Wang, Andrew Allen, William E. Kraus, Simon G. Gregory, Elizabeth R. Hauser, and Neil J. Freedman. Aging-related atherosclerosis is exacerbated by arterial expression of tumor necrosis factor receptor-1: evidence from mouše models and human association studies. Human Molecular Genetics, 19(14):2754-2766, July 2010; Lars Bochmann, Padmini Sarathchandra, Federica Moři, Enrique Lara-Pezzi,

-6CZ 22758 Ul

Domenico Lazzaro, and Nadia Rosenthal. Revealing new mouše epicardial cell markers through transcriptomics. PloS one, 5(6), 2010).

Přihláška vynálezu PV 2009-872 navrhuje stanovení prognózy pacientů v akutním stadiu primárního infarktu myokardu stanovením exprese alespoň jednoho genu či genetického lokusu vybra5 ného ze skupiny zahrnující TCRA, LOC650751, LOC650761, PRR6 a TMEM98 ve vzorku periferní krve.

Níže popsané technické řešení poskytuje oligonukleotidový čip sledující exprese sady genů, která umožňuje stanovení prognózy s vyšší přesností a lepší klinickou shodou.

Podstata technického řešení ío Předmětem předkládaného technického řešení je oligonukleotidový čip pro identifikaci osob se zvýšeným genetickým rizikem výskytu akutního infarktu myokardu se zřetelem k případným fatálním následkům v důsledku kardiovaskulárních komplikací v časovém horizontu do 6 měsíců od okamžiku výskytu srdeční příhody, obsahující právě sondy hybridizující s DNA či RNA sady genů či genetických lokusů vybrané ze skupiny zahrnující sadu A, sadu B a sadu C.

sada A:

Název/ Lokus genu	RefSeq_íD	SEQ ID No,	Referenční hodnota intenzity exprese (nízké riziko)	Min, odchylka od ref, hodnoty exprese, značící zvýšené riziko
ECHDC3	NM 024693.2	1	6*89	+ 1
IL18RAP	NM 003853.2	2	11.46	+ 1
PFKFB2	NM 006212.2	3	7,60	+1
IRS2	NM 003749.2	4	9,57	+1
PHACTR1	NM030948.1	5	5,94	+ 1
ERJLIN1	NM 006459.2	6	6,70	+ 1
VNN3	NMJ01024460.I	7	9,69	+ 1
ADORA3	NM020683.5	8	6,29	+1
CLEC4E	NM 014358.1	9	7,72
ASPRV1	NM 152792.1	Í0	7,72	9-1
PFKFB2	NM 001018053.1	ll	6,29	H
CPD	NM 00l304.3	12	9,82	+1
FKBP5	NM 004117.2	13	9,44	+ 1
PRKDC	NM006904.6	14	8,68	+ 1
NPM1	NM 199185.1	15	11,64	-1
SAMSNI	NM 022136.3	16	9,04

-7CZ 22758 Ul sada B:

Název / Lokus genu	ReCSeqJU)	SEQ ID No.	Referenční hodnota intenzity exprese (nízké riziko)	Min. odchylka od ref. hodnoty exprese, značící zvýšené riziko
OLIG2	NM 005806.2	17	6,88	Ό.891
”vNN3	NM 001024460.1	7	9,69	0,498
MS4A3	NM 006138.4	18	8,17	-0,635
CEBPE	NM 001805,2	19	7,13	-0,447
FOS	NM 005252.2	20	10,04	0,388
LÍPA	NM 000235.2	21	10,35	-0,373
LOC645649	XM 928663.1	22	7,85	0,286
(M97723)	M97723	23	6,92	0.382
EPAS1	NM 001430.3	24	6,75	-0,314
CLINT1	NM 014666.2	25	9,52	-0,246
MYCT1	NM 025107.1	26	5,43	-0,150
VPS29	NM 016226.2	27	10,64	-0,145
LOC130951	NM 138804.2	28	5,20	-0,125

sada C:

Název / Lokus genu	RefSeqlT)	SEQ ID No.	Referenční hodnota intenzity exprese (nízké riziko)	Min. odchylka od ref. hodnoty exprese, značící zvýšené riziko
ADORA3	NM 020683.5	8	6,30	+ 1
(M97723)	M97723	23	7,26	-1
ERLIN1	NM 006459.2	6	6,81	+1
CLYBL	NM 206808.1	29	6,84	-1
TCEA3	NM 003196.1	30	7,08	-1
(BC070337)	BC070337	31	10,87	-1
CLYBL	NM 206808.1	29	6,55	-t
HSD17B8	NM 014234.3	32	7,31	-l
FLT3	NM 004119.1	33	5,99	+1
AX1N2	NM 004655.2	34	Λ15	-l
(CR596519)	CR596519	35	11,57	-1

Oligonukleotidový čip může být připraven např. spotováním či jakýmkoliv jiným způsobem známým odborníkovi v daném oboru.

Postup stanovení míry genetického rizika spočívá v tom, že se v biologickém vzorku odebraném z těla pacienta, jímž mohou být například buňky periferní krve, změří intenzita genové exprese v io biologickém vzorku a její logaritmovaná hodnota při základu 2 se srovná s referenční hodnotou intenzity exprese uvedenou pro jednotlivé geny a genetické lokusy. V posledním sloupci tabulek je pro každý gen/lokus uvedena minimální odchylka od referenční hodnoty exprese, značící zvýšené riziko. Je třeba mít na paměti, že vypovídací hodnotu mají sady jako celek, nikoliv jednotlivé geny/lokusy, a tedy pro naplnění kritéria zvýšeného genetického rizika je nutné, aby se u sle15 dováného pacienta hodnoty genové exprese lišily od hodnot referenčních alespoň o požadovanou hodnotu u všech genů/lokusů v sadě.

Ve výhodném provedení technického řešení obsahuje oligonukleotidový čip právě sadu A genů a genetických lokusů, a umožňuje stanovit zejména zvýšené riziko výskytu akutního infarktu myo-8CZ 22758 Ul kardu se zvýšeným rizikem následného úmrtí v důsledku kardiovaskulárních komplikací do 6 měsíců od okamžiku výskytu akutního infarktu myokardu.

V jiném výhodném provedení technického řešení obsahuje oligonukleotidový cíp právě sadu B genů a genetických lokusů, a umožňuje stanovit zejména zvýšené riziko výskytu akutního infarktu myokardu s nízkým rizikem následného úmrtí v důsledku kardiovaskulárních komplikací do 6 měsíců od okamžiku výskytu akutního infarktu myokardu.

V dalším výhodném provedení technického řešení obsahuje oligonukleotidový čip právě sadu C genů a genetických lokusů, a umožňuje stanovit zejména zvýšené riziko úmrtí v důsledku kardiovaskulárních komplikací do 6 měsíců od okamžiku výskytu akutního infarktu myokardu.

V případě všech zde uváděných genů a genetických lokusů jsou míněny geny a genetické lokusy hybridizující s odpovídajícími sondami (viz tabulky 5, 8, 11 v příkladu 2) na celogenomových Čipech Illumina. Sekvence DNA kódující mRNA uváděné v předkládané přihlášce jsou uváděny podle dostupných katalogů pouze pro informaci.

Předkládané technické řešení přináší možnost identifikovat v české populaci jedince, kteří mají zvýšené genetické riziko výskytu akutního infarktu myokardu, což umožní zacílit prevenční a sledovací programy na jedince, kterým to přinese největší benefit, a možnost identifikovat jedince se zvýšeným rizikem úmrtí v důsledku kardiovaskulárních komplikací v krátkodobém horizontu po výskytu akutního infarktu myokardu umožní efektivní využití lůžkových kapacit.

Technické řešení je dále osvětleno na následujících příkladech provedení, aniž je jimi jeho rozsah jakkoliv omezen.

Přehled vyobrazení

Obr. la-lc ukazují teplotní mapy genů identifikovaných v rámci experimentu genové exprese pro jednotlivé kontrasty, a - kontrast AIMD6 vs Kontroly, b - kontrast ATM vs Kontroly, c - kontrast AÍMD6 vs AIM.

Obr. 2 ukazuje kvantilovou diagnostiku lineárního modelu pro logaritmovaná data intenzit genové exprese při základu 2 (Q-Q grafy) a dále vulkánové grafy, které charakterizují data na základě logaritmu podílů intenzit genové exprese ve studované a srovnávací populaci (viz daný kontrast) a na základě logaritmu šance na diferenciální expresi pro daný gen či transkript. Dává komplexní představu o povaze diferenciální exprese pro daný kontrast.

Seznam sekvencí

SEQ ID No. I: sekvence DNA kódující mRNA genu ECHDC3

SEQ ID No. 2: sekvence DNA kódující mRNA genu IL18RAP

SEQ ID No. 3: sekvence DNA kódující mRNA genu PFKFB2

SEQ ID No. 4: sekvence DNA kódující mRNA genu IRS2

SEQ ID No. 5: sekvence DNA kódující mRNA genu PHACTR1

SEQ ID No. 6: sekvence DNA kódující mRNA genu ERLIN1

SEQ ID No. 7: sekvence DNA kódující mRNA genu VNN3

SEQ ID No. 8: sekvence DNA kódující mRNA genu ADORA3

SEQ ID No. 9: sekvence DNA kódující mRNA genu CLEC4E

SEQ ID No. 10: sekvence DNA kódující mRNA genu ASPRV1

SEQ ID No. 11: sekvence DNA kódující mRNA genu PFKFB2

SEQ ID No. 12: sekvence DNA kódující mRNA genu CPD

SEQ ID No. 13: sekvence DNA kódující mRNA genu FKBP5

SEQ ID No. 14: sekvence DNA kódující mRNA genu PRKDC

SEQ ID No. 15: sekvence DNA kódující mRNA genu NPM1

SEQ ID No. 16: sekvence DNA kódující mRNA genu SAMSN1

SEQ ID No. 17: sekvence DNA kódující mRNA genu OLIG2

SEQ ID No. 18: sekvence DNA kódující mRNA genu MS4A3

-9CZ 22758 Ul

SEQ ID No. 19: sekvence DNA kódující mRNA genu CEBPE

SEQ ID No. 20: sekvence DNA kódující mRNA genu FOS

SEQ ID No, 21: sekvence DNA kódující mRNA genu LIRA

SEQ ID No. 22: sekvence DNA kódující mRNA genového lokusu LOC645649

SEQ ID No. 23: sekvence DNA odpovídající ReíSeqlD M97723

SEQ ID No. 24: sekvence DNA kódující mRNA genu EPAS1

SEQ ID No. 25: sekvence DNA kódující mRNA genu CLINT1

SEQ ID No. 26: sekvence DNA kódující mRNA genu MYCTl

SEQ ID No. 27: sekvence DNA kódující mRNA genu VPS29

SEQ ID No. 28: sekvence DNA kódující mRNA genového lokusu LOC130951

SEQ ID No. 29: sekvence DNA kódující mRNA genu CLYBL

SEQ ID No. 30: sekvence DNA kódující mRNA genu TCEA3

SEQ ID No. 31 : sekvence DNA odpovídající RefSeq_ID BC070337

SEQ ID No. 32: sekvence DNA kódující mRNA genu HSD17B8

SEQ ID No. 33: sekvence DNA kódující mRNA genu FLT3

SEQ ID No. 34: sekvence DNA kódující mRNA genu AXIN2

SEQ ID No. 35: sekvence DNA odpovídající RefSeq_ID CR596519

Příklady provedení technického řešení

Příklad 1: Čípová analýza buněk periferní krve pacientů smíchané s RNA láteř na lidském celogenomovém čipu Human WG6-v2 Expression BeadChip firmy Illumina

Pozn.: Kurzívou jsou označeny přesné obchodní názvy produktů či specifické komponenty produktů, které nemají odpovídající jednoznačné české ekvivalenty.

Sběr vzorků plné krve do RNAlater® (kat. č. AM7024, Ambion, Applied Biosystems) byl prováděn tak, že vzorek nesrážlivé plné krve (2,4 ml) byl nejpozději do 15 min od odběru smíchán s RNAlater® Tissue Collection: RNA Stabilization Solution (7,6 ml). Vzorek byl rádně promíchán a poté přesunut do mrazicího boxu -70 °C k dlouhodobému skladování. Izolace RNA pomocí kitu RiboPure™ - Bio od, Ambion lne. (kat. č. AM1928, Ambion, Applied Biosystems) byla prováděna tak, že vzorky byly vyndány z mrazicího boxu a ponechány na ledu rozmrazit. Snažili jsme se vždy šestice vzorků jdoucí na jeden čip připravovat najednou. Pro izolaci RNA bylo pipetováno 1,8 ml vzorku krve s RNAlater® do 2ml zkumavky bez RNase. Vzorek krve v roztoku RNAlater® byl centrifugován na 16 100 g (13 200rpm) 1 min. Supematant byl odstraněn včetně bílé fáze těsně nad peletem. Buňky byly lyžovány v 800 μΐ lyzačního roztoku a 50 μΐ roztoku acetátu sodného. Směs byla řádně promíchána na vortexu. Lyzát buněk byl extrahován s 500 μΐ kyselého fenol: chloroformu. Směs byla promíchána 30 s na vortexu a ponechána stát 5 min při laboratorní teplotě. Směs byla centrifugována na 16 100 g 1 min. Celá vodná fáze, které bylo kolem 1,2 ml, byla přenesena do nové 2ml zkumavky bez RNase, znovu centrifugována a vodná fáze bez jakékoli pelety odebrána do čisté zkumavky bez RNase. Bylo přidáno 600 μΐ 100% etanolu a promícháno na vortexu.

700 μΐ vzorku bylo přeneseno na dodanou kolonku umístěnou v kolekční zkumavce a 5-10 s centrifugováno na 16 100 g. Kolekční zkumavky byly vyprázdněny a znovu do nich byly nasazeny kolonky. Do kolonek bylo naneseno dalších 700 μΙ a poté zbytek vzorku a vždy 5-10 s centrifugováno na 16 100 g. Na filtry kolonek bylo naneseno 700 μΐ promývacího roztoku 1 a 5-10 s centrifugováno na 16 100 g. Kolekční zkumavky byly vyprázdněny a znovu do nich byly vsazeny kolonky. Do kolonek bylo 2x naneseno 700 μΐ promývacího roztoku 2/3 (láhev musí být doplněna o 56 ml 100% etanolu) a 5-10 s centrifugováno na 16 100 g. Kolekční zkumavky byly vyprázdněny a znovu do nich byly vsazeny kolonky, centrifugovány, aby byla odstraněna veškerá kapalina. Kolonky byly přeneseny na označenou kolekční zkumavku a naneseno 50 μΐ elučního roztoku (předehřátého na 75 °C). 20 s ponecháno stát při laboratorní teplotě a 20-30 s centriťugováno na maximum. Při druhé eluci dalšími 50 μΐ elučního roztoku centrifugováno 1 min.

-10CZ 22758 Ul

K RNA ve 100 μΙ elučního pufru bylo přidáno 5 μΐ DNase pufru a 1 μΐ DNase I a ponecháno 30 min inkubovat při 37 °C. K RNA po odstranění DNA bylo přidáno 20 μΐ DNase inaktivační reagencie. Směs byla jemně promíchána na vortexu a ponechána 2 min stát při laboratorní teplotě. Během této doby ještě byla směs dvakrát promíchána.

s Vzorek byl centrifugován 1 min na 16 100 g. V peletě byla DNase inaktivační reagencie. Roztok RNA byl přenesen do nové zkumavky bez RNase.

Byla změřena koncentrace RNA na Nanodropu, Thermo Scientific (1 μ|), případně ponechán alikvot pro analýzu na Bioanalyzeru 2100, Agilent Technologies.

Po provedení čipové analýzy s takto ošetřenými vzorky RNA bylo zjištěno, že díky použití plné ío krve dochází k preferenční amplifikaci glób i nových RNA a nedostatečné intenzitě signálu ostatních genů. Proto byly vzorky RNA přečištěny pomocí GLOBINclear™ Ritu firmy Ambion (kat.

č. AM1980, Applied Biosystems):

K cca 110 μί vzorku RNA isolované pomocí RiboPure™ Blood Kit, Ambion z plné krve s RNAlater® bylo přidáno 11 μΐ octanu sodného {RiboPure™), případně 0,35 μΐ GlycoBlue (AM9515, Ambion, Applied Biosystems) a 300 μΙ 100% ethanolu, vše bylo řádně promícháno.

Vzorky byly uskladněny na l hod v mrazicím boxu při teplotě -20 °C. Pak byly centrifugo vány při 16 100 g 30 min, 4 °C, a supematant byl opatrně odstraněn. Bylo přidáno 0,7 ml ledového 70% ethanolu, vzorek vortexován, centrifugován 10 min pri 4 °C a supematant opatrně odstraněn. Peleta byla rozpuštěna ve 14 μΐ vody bez nukleas (v 15 μΐ pokud chceme v tomto kroku měřit koncentraci na Nanodropu).

V průběhu točení byly připraveny potřebné roztoky:

RNA vazebný pufr: Byly přidány 2 ml 100% isopropanolu do koncentrátu vazebného pufru, promícháno a skladováno při laboratorní teplotě.

RNA promývací roztok: Byly přidány 4 ml 100% etanolu do koncentrátu promývacího roztoku, promícháno a skladováno při laboratorní teplotě.

Kuličky resuspendující směs (1 reakce / 6 reakcí): 10 μΐ / 60 μΐ RNA vazebné kuličky, 4 μΐ / 24 μΐ pufru pro RNA kuličky, 6 μΐ Z 36 μΐ 100% isopropanolu. Směs byla homogenízována a skladována při laboratorní teplotě.

Streptavidinové magnetické kuličky (30 μΐ / vzorek): do inkubátoru (50 °C) byly vloženy zku30 mavky s 2x hybridizačním pufrem a pufrem pro streptavidinové kuličky minimálně na 15 min, před použitím řádně vortexovány. 6x 30 μΐ (180 μΐ) homogenizovaných streptavidinových magnetických kuliček bylo pipetováno do čisté 1,5 ml zkumavky, centrifugováno cca 2 s na méně než 1000 g a zkumavka byla umístěna do magnetického stojánku na dobu 3-5 minut (dokud není roztok průsvitný). Supematant byl opatrně odstraněn a přidáno 6x 30 μΐ (180 μί) pufru pro streptavidinové kuličky předehřátého na 50 °C, řádně vortexováno a ponecháno inkubovat po dobu nejméně 15 min při 50 °C před dalším použitím. Ke vzorkům RNA ve 14 μί (1-10 pg) byl přidán l pl Capture Oligo Mix. Ke směsi bylo přidáno 15 μί 2x hybridizaěního pufru předehřátého na 50 °C. Vzorky byly krátce vortexovány a rychle centrifugovány při max. 1000 g a ponechány inkubovat pri 50 °C po dobu 15 minut (dojde k hybridizaci s globinovou mRNA).

Připravené streptavidinové magnetické kuličky umístěné v inkubátoru byly jemně vortexovány a centrifugovány méně než 2 s na max. 1000 g. Ke každému vzorku RNA bylo přidáno 30 μί připravených streptavidinových magnetických kuliček, směsi řádně promíchány vortexován ím, stočeny cca 2 s na 1000 g a ponechány inkubovat 30 min pri teplotě 50 °C. Po vyjmutí z inkubátoru jemně vortexovány, centrifugovány cca 2 s na max. 1000 g a zkumavky umístěny do magnetic45 kého stojánku na 3-5 min (dokud není roztok průsvitný). Supematanty obsahující celkovou RNA bez globinové mRNA opatrně odstraněny a přeneseny do čistých 1,5 ml zkumavek.

- ll CZ 22758 Ul

Byl předehřát eluční pufr na 58 °C. Ke každému RNA vzorku bylo přidáno 100 μΐ RNA vazebného puťru. Kuličky resuspendující směs řádně homogenizována vortexováním a následně přidáno 20 μΙ směsí ke každému vzorku. Směs 10 s řádně vortexována, aby došlo k navázání RNA na kuličky, centrifugována cca 2 s na 1000 g. Zkumavky byly umístěny do magnetického stojánku na 3-5 minut (dokud není roztok průsvitný). Opatrně byly odstraněny veškeré supematanty. Zkumavky byly vyjmuty z magnetického stojánku. Až poté bylo ke každému vzorku přidáno 200 μΙ RNA promývacího roztoku, řádně 10 s vortexováno, krátce a jemně stočeno (viz výše). Zkumavky se vzorky umístěny do magnetického stojánku na 3-5 minut než došlo k usazení magnetických kuliček s navázanou RNA, opatrně byl odstraněn veškerý supematant a zkumavky vyjmuty ze stojánku. Zkumavky krátce a jemně stočeny, umístěny zpět do magnetického stojánku a malou špičkou byla odstraněna veškerá kapalina. Zkumavky se vzorky vyndány z magnetického stojánku a otevřené nechány 5 min na vzduchu oschnout. Ke každému vzorku přidáno 30 μΐ elučního pufru předehřátého na 58 °C, rádně 10 s vortexováno a směs inkubována 5 min při 58 °C. Řádně 10 s vortexováno a krátce a jemně centrifugováno (cca 2 s na 1000 g). Vzorky byly umístěny do magnetického stojánku na 3 až 5 minut než došlo k usazení magnetických kuliček, Supematant obsahující přečištěnou celkovou RNA byl opatrně odebrán do Čistých 1,5ml zkumavek.

Kritickým parametrem se stal poměr absorbancí u 260 nm ku 230 nm, který má být pro čípovou analýzu vyšší než 1,5. Pro zajištění dostatečné kvality musela být prováděna finální etanolová precipitace. K cca 30 μΐ vzorku RNA isolované pomocí RiboPure™ Blood Kit, Ambion z plné krve s RNAlater® přečištěné kitem GLOBlNclear^rM Whole Blood Kit byly přidány 3 μΐ octanu sodného (RiboPure™) a 85 μΐ 100% etanolu. Řádně promícháno a vzorky uskladněny přes noc v mrazicím boxu při teplotě -20 °C. Ráno centrifugováno při 16 100 g 30 min, 4 °C, supematant opatrně odstraněn, peleta promyta 0,7 ml vychlazeného 70% etanolu, vzorek vortexován, centrifugován 15 min při 4 °C a poté veškerý supematant opatrně odstraněn. Pelety rozpuštěny ve 14 μΐ vody bez nukleas či dle velikosti pelety a vstupní koncentrace ve větším objemu. Byla změřena koncentrace přečištěné a přesrážené RNA na Nanodropu (1 μΐ), integrita stanovena pomocí Bioanalyzeru 2100, Agilent Technologies (1 μΐ) - Agilent RNA 6000 Nano/Pico Kit (kat. č. 50671511/5067-1513).

Pokud to bylo z hlediska výchozího materiálu možné, aby kvantitativní i kvalitativní parametry byly v pořádku (R1N > 7; A_260/2í!on_m> 1,8; A2óo/230nm > 1,5), byla připravená RNA dále amplifikována pomocí Illumina® TotalPrep RNA Amplification Kit, Ambion (kat. č. IL1791). Systém biotinem označí amplifíkovanou RNA k hybridizaci na čipech. Protokol se skládá z reversní transkripce s využitím oIigo(dT) primerů pro syntézu cDNA obsahující T7 promotorovou sekvenci. K získané cDNA je syntetizován druhý řetězec při využití DNA polymerasy a RNasy H. Přečištěný cDNA produkt vstupuje do in-vitro transkripce s T7 RNA polymerasou. Výsledná cRNA je následně přečištěna od neinkorporo váných nukleotidů, solí, enzymů a anorganického fosfátu. Vstupní množství RNA, které jsme využívali pro amplifikaci, bylo 150 ng v maximálně 11 μΐ. Pro jednotlivé kroky byl využit DNA Engine Dyad Peltier Thermal Cycler, Bio-Rad Laboratories.

RNA vzorky o objemu 11 μΐ (150 ng RNA) byly umístěny do sterilních 0,2ml zkumavek bez RNas. Případně byly do daného objemu naředěný vodou bez nukleas. Při laboratorní teplotě byl připraven master mix pro reversní transkripci - syntézu jednořetězcové DNA:

μΐ T7 oligo(dT) primer μΐ lOx pufr pro první řetězec (objemy jsou udány na jednu 20 μΐ reakci) μΐ směs dNTP (složky byly přidávány v daném pořadí) μΐ inhibitor RNas 1 μΐ ArrayScript (enzym).

Master mix byl jemně vortexován a krátce centrifugován (5s). Bylo přidáno 9 μΐ master mixu do každého vzorku RNA, důkladně promícháno pipetováním (2-3x) a 3-4x cvmknuto do zkumavek,

-12 CZ 22758 Ul

Krátce centrifugováno a umístěno do bloku cykleru (42 °C). Reakce byly inkubovány 2 hod při 42 °C. poté krátce stočeny a dány na led (4 °C).

Na ledu byl připraven master mix pro syntézu druhého řetězce cDNA:

μΐ voda bez nukleas

10 μΐ lOx puťr pro druhý řetězec (objemy jsou udány na jednu 100 μΐ reakci) μί směs dNTP (složky byly přidávány v daném poradí) μΐ DNA polymerasy μί RNasy H.

Master mix byl jemně vortexován a krátce stočen (5s). Bylo přidáno 80 μί master mixu ke kažio dému vzorku, důkladně promícháno pipetováním (2-3x) a 3-4x cvmknuto do zkumavek. Krátce centrifugováno, umístěno do předem vychlazeného bloku cykleru na 16 °C. Reakce byly inkubovány 2 hod při 16 °C, poté 4 °C.

Získaná cDNA byla přečištěna. Centrifugace byly prováděny při 10 000 g a laboratorní teplotě (otáčky nesmí překročit 16 000 g, došlo by k poškození skleněného filtru a vlákna filtru by mohla kontaminovat eluát). Bylo předehřáto dostatečné množství vody bez nukleas pro eluci na 55 °C (při teplotě > 58 °C dochází k částečné denaturaci cDNA) nejméně 10 min před použitím. Do promývacího pufru bylo přidáno 24 ml etanolu.

Ke vzorkům cDNA bylo přidáno 250 μΐ cDNA vazebného pufru, důkladně promícháno pipetováním (2-3x), 3-4x poklepáno na zkumavky a krátce stočeno. Kolonky byly umístěny do doda20 ných promývacích zkumavek a na jejich střed naneseny vzorky (cDNA s cDNA vazebným pufrem). Centrifugováno 1 min 10 000 g, eluát byl zlikvidován. Na každou kolonku bylo aplikováno 500 μί promývacího pufru, centrifugováno 1 min 10 000 g a eluát byl zlikvidován. Vzorky na kolonkách byly opětovně 1 min centrifugovány 10 000 g (odstranění veškerého promývacího pufru). Kolonky s cDNA byly přendány do elučních zkumavek. Na střed kolonek bylo naneseno

10 μί vody bez nukleas vytemperované na 55 °C, necháno 2 min stát při laboratorní teplotě a poté centrifugováno 1,5 min 10 000 g. Na střed kolonek byl nanesen druhý alikvot předehřáté vody bez nukleas - 9 μί, centrifugováno 2 min 10 000 g.

Získaná dvouřetězcová DNA v cca 17,5 μί vody z výsledného eluátu byla použita pro in-vítro transkripci. Při laboratorní teplotě byl připraven master mix pro syntézu cRNA:

2,5 μί T7 lOx reakční pufr (objemy jsou udány na jednu 25 μί reakci)

2,5 μί směs T7 enzymu (složky byly přidávány v daném pořadí)

2,5 μί směs btotinem značených NTP.

Master mix byl jemně vortexován a krátce stočen (5s). Bylo přidáno 7,5 μΐ master mixu ke každému vzorku cDNA, důkladně promícháno pipetováním (2-3x) a 3-4x cvmknuto do zkumavek.

Vzorky krátce centrifugovány a umístěny do bloku cykleru, kde byly inkubovány při 37 °C po dobu 14 hod, poté 4 °C. Reakce byly ukončeny přidáním 75 μΙ vody bez nukleas ke každému vzorku cRNA a důkladně, ale jemně, vortexovány.

Při následném přečištění došlo k odstranění enzymů, solí a neinkorporovaných nukleotidů. Centrifugace byly prováděny při lOOOOg při laboratorní teplotě (otáčky nesmí překročit 16 000 g, došlo by k poškození skleněného filtru a vlákna filtru by mohla kontaminovat eluát). Bylo predehřáto dostatečné množství vody bez nukleas pro eluci na 60 °C nejméně 10 min před použitím a byly připraveny kolonky do sběrných zkumavek. Ke každému vzorku ve 100 μΐ bylo přidáno 350 μί cRNA vazebného pufru. Ihned bylo přidáno 250 μί 100% etanolu, vzorky 3x promíchány pipetováním, ale nevortexovány a necentrifugovány. Po smísení etanolu se vzorkem byla směs přenesena na střed připravených kolonek, centrifugováno 1 min 10 000 g, eluát byl zlikvidován. Na střed každé cRNA kolonky bylo aplikováno 650 μΐ promývacího pufru, centrifugováno 1 min lOOOOg a eluát byl zlikvidován. Zkumavky s kolonkami byly centrifugovány další l min 10 000 g (odstranění veškerého promývacího pufru) a kolonky poté byly umístěny do nových

- 13 CZ 22758 Ul sběrných zkumavek. Na střed kolonky bylo naneseno 100 μΐ vody bez nukleas vytemperované na 60 °C, necháno 2 min stát při laboratorní teplotě a centriťugováno 1,5 min 10 000 g.

Byla změřena koncentrace ampliťikované cRNA na Nanodropu (1 μΐ). Pokud byla nižší než 150 ng/μΐ ČÍ byl nízký poměr absorbancí u 260 nm ku 230 nm, tak byly vzorky precipitovány. Ke vzorku přečištěné cRNA byla přidána 1/10 objemu 3M CHjCOONa, pH 5,2, RiboPure™ (10 μΐ) a 2,5 násobek objemu 100% etanolu (275 μΐ), důkladně promícháno a ponecháno 60 min v mrazicím boxu při -20 °C. Vzorky byly centrifugo vány na 16 100 g po dobu 30 až 60 min při 4°Ca opatrně byl odstraněn supernatant. Pelety byly promyty 500 μΐ 70% etanolu, zkumavky centritugovány na 16 100 g po dobu 15 min při 4 °C, supematant opatrně odstraněn, případně byly ío znovu rychle centrifugovány a odstraněny i zbytky etanolu. Pelety cRNA byly ponechány cca 2 min na vzduchu, aby oschly. Poté byly suspendovány v požadovaném objemu vody bez nukleas (> 12 μΐ).

Výtěžek závisel na množství a kvalitě poly(A)RNA v celkové RNA. Byla změřena koncentrace na NanoDropu (1 μΐ) a stanoven profil délek cRNA pomocí Bioanalyzeru 2100, Agilent (1 μΐ), který má být mezi 250-5500 nt s většinou cRNA mezi 1000-1500 nt.

Pokud byla finální koncentrace cRNA > 150 ng/μΐ a profil v pořádku, byly vzorky použity pro hybridizaci na Human WG6-v2 Expression BeadChip firmy Illumina.

Byla předehřátá hybridizační pec s výkyvnou plošinou na 58 °C alespoň 1 hod před použitím. Vzorky byly připraveny tak, aby vstupní množství cRNA do hybridizace bylo 1,5 pg. Maximální možný objem je 10 μΐ, případně vzorky na tento objem byly doplněny vodou bez nukleas a promíchány. Po dobu 10 min nechány stát při laboratorní teplotě, aby došlo k řádnému rozpuštění. Do hybridizační pece vytemperované na 58 °C byly na 10 min vloženy zkumavky s GEX-HYB a GEX-HCB (pro rozpuštění skladováním precipitovaných solí). Ke každému vzorku 1,5 pg cRNA v 10 μΐ vody bez nukleas bylo přidáno 20 μΐ GEX-HYB, byty jemně vortexovány a rychle centri25 fugo vány.

Illumina Hyb Chamber Basket byl umístěn do BeadChip Hyb Chamber. Bylo pipetováno 200 μΐ GEX-HCB do každého ze dvou reservoárů pro zvlhčující pufr v každé Hyb Chamber. Pufr byl dáván pouze do komor, které byly použity. Hyb Chamber byl utěsněn víkem a nechán při laboratorní teplotě (~22 °C) než byly Čipy dány do Hyb Chamber. Na laboratorní teplotu vytempero30 vaně čipy byly vyndány z jejich obalů (Human WG6-v2 Expression BeadChip). Byly používány výhradně rukavice bez pudru. Čipy byly pinzetou drženy za krycí fólii v oblasti barkódu, vloženy do Hyb Chamber Insert tak, aby jejich směr souhlasil se symbolem barkódu na Insertu.

Analyzované vzorky cRNA smíchané s GEX-HYB byly zahřátý na 65 °C po dobu 5 min. Jemně vortexovány a rychle centrifugovány, aby byla kapalina shromážděna na dně zkumavky. Před dalším použitím vzorky ponechány při laboratorní teplotě vychladnout a ihned poté byly pipetovány na čipy.

Hyb Chamber Inserts obsahující čipy byly umístěny do Hyb Chamber a bylo pipetováno 30 μΐ analyzovaného vzorku na vstupní otvor každého pole. Hyb Chamber opatrně uzavřen víkem a inkubován v hybridizační peci při 58 °C po dobu 16 hodin s rychlostí kyvů plošiny nastavenou na 5. Před ukončením práce v daný den byl ještě připraven lx vysokoteplotní promývací pufr přidáním 50 ml lOx koncentrovaného zásobního roztoku ke 450 ml vody bez RNas. Teplota zahřívacího bloku naplněného 500 ml lx vysokoteplotního promývacího pufru byla nastavena na 55 °C, víko bylo zavřeno a ponecháno hřát přes noc.

Další den byl připraven promývací roztok E1BC přidáním 3 ml E1BC pufru do 1 1 vody bez

RNas. Na laboratorní teplotu byl předehrát blokovací pufr El (4 ml/čip). Bylo připraveno odpovídající množství blokovacího pufru El (2 ml/čip) se streptavidin-Cy3 (2 μΐ zásobního roztoku o koncentraci 1 mg/ml najeden čip). Byla použita jedna kónická zkumavka pro všechny aktuálně zpracovávané čipy a před detekcí byl tento roztok uchováván v temnu.

- 14CZ 22758 Ul

Z hybridizační pece byla vyndána Hyb Chamber a rozebrána. Čipy byly ponořeny do 250 mi promývacího roztoku E1BC a byla z nich opatrně oddělána krycí fólie. Rozebrání a umístění vElBC promývacím roztoku bylo opakováno pro všechny aktuálně zpracovávané cípy. Čipy byly následně umístěny do držáku, který byl za rukojeť přemístěn do Hybex Waterhath Insert obsahujícího lx vysokoteplotní promývací pufr přes noc předehřátý na 55 °C. Se zavřeným víkem byly čipy bez třepání inkubovány 10 min. Během této inkubace bylo připraveno 250 ml promývacího roztoku E1BC v čisté barvicí nádobě. Ihned po lOmin inkubaci s vysokoteplotním promývacím pufrem byl držák s čipy přesunut do připraveného čerstvého promývacího roztoku E1BC. Držák krátce a intenzivně v nádobě protřepán pohybem nahoru a dolů, poté na 5 min umístěn na rotační třepačku na maximální rychlost, při které nedocházelo k vyšplíchnutí roztoku z nádoby (120 rpm). Přemístěn do čisté barvicí nádoby s 250 mi 100% etanolu. Krátce a důsledně pomocí rukojeti držáku byly čipy proprány a poté 10 min třepány na orbitální třepačce při maximální rychlosti. Čipy byly přemístěny do čisté barvicí nádoby s 250 ml promývacího roztoku E1BC, krátce a intenzivně promíchány a třepány na orbitální třepačce po dobu 2 min. Čipy byly přemístěny do připravených Wash Tray se 4 ml blokovacího pufru El, dány na výkyvnou desku (analyzovaná plocha se vzorky musí vždy směřovat nahoru) a kývány na střední rychlost po dobu 10 min. Čipy byly přendány do čisté Wash Tray se 2 ml blokovacího pufru El + streptavidin-Cy3, přikryty víkem a kývány na střední rychlost dalších 10 min. Čipy byly přesunuty do připravené čisté barvicí nádoby s 250 ml promývacího roztoku E1BC, krátce proprány a poté 5 min rotačně třepány při laboratorní teplotě. Čipy v držáku byly přesunuty do centrifugy s rotorem na mikrodestičky a točeny při laboratorní teplotě na 270 rcf po dobu 4 min. Usušené čipy byly ihned skenovány pomocí Illumina® BeadArray Readeru na skenovací faktor 1,0 a 1,5 a získaná data jsou uchovávána na DVD a webovém úložišti dat.

Příklad 2: Statistické vyhodnocení expresního protilu

Předkládané technické řešení je doloženo výsledky, které jsme obdrželi na základě celogenomové analýzy vzorků periferní krve získaných od jedinců hospitalizovaných v letech 2006-2009 v Městské nemocnici Čáslav či kardio logické klinice v Pardubicích s diagnózou primárního akutního infarktu myokardu a párových kontrolních osob hospitalizovaných v Městské nemocnici v Čáslavi ve stejném období z důvodu komplikací pohybového ústrojí. Věk případů byl omezen hranicí 80 let. Párové kontrolní osoby nesměly mít pozitivní historii výskytu závažných kardiovaskulárních onemocnění a byly k odpovídajícím případům vybírány tak, aby docházelo k podstatné shodě v rizikových faktorech výskytu akutního infarktu myokardu. Zejména byla požadována shoda v pohlaví, věku (kontroly mohly být o maximálně 5 let starší než případy) a shodný musel být též status diabetů mellítu a kuřácký status. Vzorky byly analyzovány pomocí technologie firmy Illumina, přičemž byly použity čipy verze 2 (Human WG6-v2 Expression BeadChip).

Ke genetickému vyšetření pacientů s akutním infarktem myokardu byly zařazovány osoby, které byly přijaty či ambulantně ošetřeny s diagnosou akutního infarktu myokardu (A1M) na příjmové ambulanci Interního oddělení MN Čáslav. Do souboru byli rovněž zařazování pacienti, kteří byli vezeni posádkou rychlé záchranné služby přímo na Kardiologickou kliniku v Pardubicích, kde byl na koronární jednotce proveden odběr krevního vzorku. Odběr byl vždy proveden po podepsání „Informovaného souhlasu“ pacientem. Smíchání vzorků venózní krve s RNAlater®, jejich uskladnění a transport krevních vzorků byly prováděny dle pracovních protokolů v souladu s platnými právními předpisy a veškerá data ke vzorkům jsou uložena v příslušných databázích.

Akutní infarkt myokardu byl diagnostikován na základě anamnestických údajů, EKG křivky a laboratorního průkazu nekrosy myokardu. Byl definován jako bolest na hrudi nebo její ekvivalent trvající alespoň 10 min v posledních 24-ti hodinách s elevací úseku ST na EKG křivce (STEMI), či bez elevací ST (NONSTEMI). Biochemický průkaz nekrózy byl stanovován v naší laboratoři vyšetřením Troponinu I. Jako pozitivní hodnotu Troponinu I bylo považováno překročení horního limitu normální hodnoty v čáslavské laboratoři, tj. 0,3 pg/l. Jako pomocná diagnostická metoda byla používána echokardiografie k průkazu regionální poruchy kinetiky levé komory v povodí „infarktové tepny“. Jako standardní panel vyšetření pacientů s podezřením na AIM

- 15 CZ 22758 Ul byl vyšetřován Troponin I okamžitě při přijetí a dále ve 4-6 hodinovém intervalu v prvních 24 hodinách, AST, ALT, KO, koagulace (QT, APTT), glykémie, iontogram, urea, kyselina močová, lipidogram, CRP, u diabetiků HBAlc, Vyšetření CK a CK-MB mass a LD bylo prováděno nepravidelně dle uvážení lékaře.

Studie zahrnovala šestiměsíční sledování pacientů s akutním infarktem myokardu od okamžiku jeho výskytu. V návaznosti na zvolený statistický design byla skupina pacientů s výskytem akutního infarktu myokardu rozdělena na osoby, které z kardiovaskulárních příčin zemřely v průběhu šestiměsíčního sledování (AIMD6, 4 osoby) a na osoby, které přežívaly déle (AIM, 41 osob), párové kontroly čítaly dalších 45 osob. Tabulka 1 ukazuje vybraná data osob v analyzovaném ío souboru a základní data ke zpracovaným vzorkům.

Tabulka 1: Základní data k osobám z analyzovaného souboru a k analyzovaným krevním vzorkům odebraným z těla těchto pacientů

ID	Vzorek	Pohlaví	Ročník	Exitus	Diabetes mellitus	Kouřeni	c (ng/μΙ) RNA	RIN	PS cRNA
029	AIM	Muž	1948	Ne	Ne	Ano (20)	243,68	7,8	8,522
084	AIM	Muž	1947	Ne	Ne	Ano (10)	163,76	8,8	8,813
C056	AIM	Muž	1953	Ne	Ne	Ano (15)	109,2	7,4	13,577
PQ08	AIM	Žena	1949	Ne	Ne	Ne	41,9	84	8,752
P009	AIM	Muž	1951	Ne	Ne	Ano (2)	28,6	74	5,108
C029	AIM	Muž	1955	Ne	Ne	Ne	43.3	7.1	9.496
C048	AIM	Žena	1960	Ne	Ne	Ne	170,3	8,5	16,748
C099	Λ1Μ	Muž	1951	Ne	Ne	Ne	261,2	8,0	10,146
070	AIM	Žena	1929	Ne	Ne	Ne	404,7	64	2.390
072	AIM	Žena	1931	Ne	Ano	Ne	353,0	7,7	8,093

- 16CZ 22758 Ul

ID	Vzorek	Pohlaví	Ročník	Exitus	Diabetes inellitus	Kouření	c (ng/μΐ) RNA	R1N	Mg eRNA
Cl 81	AIM	Žena	1934	Ne	Ano	Ne	195,2	8,1	8,633
C069	AIM	Muž	1941	Ne	Ne	Ne	185,3	8,7	6,997
P011	AIM	Muž	1947	Ne	Ne	Ne	245,2	6,9	4,194
047	AIM	Muž	1945	Ne	Ne	Ne	317,5	6.7	5,176
C005	AIMD6	Muž	1939	Ano	Ne	Ne	89,5	3,1	7,351
CÚ53	AIMD6	Žena	1935	Ano	Ne	Ne	327,1	7,7	8,389
POIO	AIMD6	Žena	1928	Ano	Ano	Ne	188,3	8,1	8.248
085	AIM	Muž	1937	Ne	Ano	Ne	191,54	8,2	7.695
095	AIM	Muž	1946	Ne	Ano	Ne	293,41	8,2	13,269
C284	AIM	Muž	1953	Ne	Ne	Ano (20)	210,06	7,4	8,364
094	AIM	Muž	1933	Ne	Ne	Ne	160,62	8.0	15,856
C23S	AIM	Muž	1934	Ne	Ano	Ne	204,88	7,8	8,750
C078	AIMDÓ	Muž	1937	Ano	Ano	Ne	170,38	8,2	15,901
C016	AJM	Muž	1944	Ne	Ne	Ne	84	7,1	6,802
C074	AIM	Muž	1943	Ne	Ne	Ne	209,2	6,9	7,509
P003	AIM	Žena	1936	Ne	Ne	Ano (10)	113,8	6,8	7,505
C037	AIM	Žena	1933	Ne	Ano	Ne	226,2	8,5	3,76
C036	AIM	Žena	1934	Ne	Ne	Ne	31,4	6,2	2.986
C030	AIM	Muž	1951	Ne	Ne	Ne	152,2	8,7	3.186
008	AIM	Muž	1955	Ne	Ne	Ano (15)	197,9	7,5	10.566
019	AIM	Muž	1948	Ne	Ne	Ano (2)	365	7,1	6,499
C065	AIM	Žena	1933	Ne	Ano	Ne	79,7	7,6	2,536
C039	AIM	Žena	1959	Ne	Ano	Ne	434,2	6,5	7,939
025	AIM	Muž	1928	Ne	Ano	Ne	184,7	8,4	4.120
039	AIM	Muž	1939	Ne	Ne	Ne	126,5	8,4	7,674
020	AIM	Muž	1949	Ne	Ne	Ne	103,6	3,7	4,480
C063	AIM	Žena	1941	Ne	Ne	Ne	282,9	8.5	4,526
C2O5	AIM	Muž	1944	Ne	Ano	Ano (10)	85,7	8.4	7,141
074	AIM	Muž	1950	Ne	Ne	Ne	127,97	8,0	6,820
082	AIM	Muž	1954	Ne	Ne	Ano (40)	97,47	8,1	12.236
C289	AIM	Muž	1957	Ne	Ne	Ne	213,42	8,0	9,322
CO 19	AIM	Žena	1930	Ne	Ne	Ne	36,59	7,7	3,043
C0I3	AIM	Muž	1939	Ne	Ano	Ne	194,74	7,9	4.813
C269	AIM	Muž	1938	Ne	Ne	Ne	320.41	8,2	4,974
P019	AIM	Žena	1931	Ne	Ano	Ne	86,65	7,9	4,535
C083	CTRL	Muž	1947	Ne	Ne	Ano (5)	186,6	8,4	15,045
C25O	CTRL	Muž	1946	Ne	Ne	Ano (25)	10,04	7,7	1,907
038	CTRL	Muž	1950	Ne	Ne	Ano (15)	290,9	7,1	6,189
C081	CTRL	Žena	1949	Ne	Ne	Ne	58,4	6,7	9,044
049	CTRL	Muž	1949	Ne	Ne	Ano (20)	47,39	7,6	5,758
CO 14	CTRL	Muž	1955	Ne	Ne	Ne	51.74	7.2	2.403

- 17CZ 22758 Ul

10	Vzorek	Pohlaví	Ročník	Exitus	Diabetes mcilitus	Kouřeni	c (ng/μΐ) RNA	R1N	μ« cRNA
033	CTRL	Žena	1960	Ne	Ne	Ne	177,2	8,6	9,447
C101	CTRL	Muž	1951	Ne	Ne	Ne	237,38	8.7	10.019
009	CTRL	Žena	1928	Ne	Ne	Ne	302,8	8,5	9,941
C022	CTRL	Žena	1929	Ne	Ano	Ne	232,48	7.6	8,534
C023	CTRL	Žena	1931	Ne	Ano	Ne	223,54	8,1	4.486
C213	CTRL	Muž	1941	Ne	Ne	Ne	124,24	7,8	7.42
C282	CTRL	Muž	1948	Ne	Ne	Ne	297,68	7.0	3.988
C260	CTRL	Muž	1946	Ne	Ne	Ne	147,18	8.5	8,003
C010	CTRL	Muž	1938	Ne	Ne	Ne	301,91	8,0	7,3
063	CTRL	Žena	1934	Ne	Ne	Ne	112,15	7,9	6.127
C208	CTRL	Žena	1928	Ne	Ano	Ne	246,12	7,8	4.79
C348	CTRL	Muž	1937	Ne	Ano	Ne	94,68	7,8	14,11
C304	CTRL	Muž	1946	Ne	Ano	Ne	213,16	8.5	17.068
C302	CTRL	Muž	1952	Ne	Ne	Ano (10)	80,07	8,2	15,571
C098	CTRL	Muž	1932	Ne	Ne	Ne	200,5	7,3	8,272
C272	CTRL	Muž	1930	Ne	Ano	Ne	91,86	8,3	8.709
C287	CTRL	Muž	1936	Ne	Ano	Ne	145,6	8.3	8,272
098	CTRL	Muž	1944	Ne	Ne	Ne	270,3	7 2	-Tj2
C204	CTRL	Muž	1943	Ne	Ne	Ne	249,8	6.6	8,982
C209	CTRL	Žena	1937	Ne	Ne	Ano (10)	191	7.4	13,377
024	CTRL	Žena	1933	Ne	Ano	Ne	64,91	8,6	2,198
010	CTRL	Žena	1934	Ne	Ne	Ne	207,59	8,0	4,37
050	CTRL	Muž	1952	Ne	Ne	Ne	130,5	8.4	2.566
CO58	CTRL	Muž	1954	Ne	Ne	Ano (8)	327,4	9,2	6,875
C066	CTRL	Muž	1947	Ne	Ne	Ano (10)	345,4	6.2	8,219
018	CTRL	Žena	1934	Ne	Ano	Ne	79,4	6.0	9,242
C210	CTRL	Žena	1960	Ne	Ano	Ne	577,3	7,4	3,562
C3iO	CTRL	Muž	1929	Ne	Ano	Ne	127,05	8.5	6,859
C294	CTRL	Muž	1939	Ne	Ne	Ne	120,56	7.0	7.361
087	CTRL	Muž	1949	Ne	Ne	Ne	123,56	7,5	3,689
C01I	CTRL	Žena	1940	Ne	Ne	Ne	28,12	7,3	2,632
016	CTRL	Muž	1941	Ne	Ano	Ano (20)	111,21	7,9	10,515
C274	CTRL	Muž	1950	Ne	Ne	Ne	209,68	7,8	4,306
068	CTRL	Muž	1953	Ne	Ne	Ano (20)	69,67	8,5	10,008
C061	CTRL	Muž	1955	Ne	Ne	Ne	164,27	8,3	8,27
006	CTRL	Žena	1928	Ne	Ne	Ne	27,9	8,3	5,31
C207	CTRL	Muž	1937	Ne	Ano	Ne	82,02	8.7	10,79
C206	CTRL	Muž	1934	Ne	Ne	Ne	142.91	7.8	4,888
C221	CTRL	Žena	1 1929	Ne	Ano	Ne	210,16	8,0	4.3

-18CZ 22758 Ul

Tabulky 2 a 3 shrnují popisné charakteristiky relevantních klinických a demografických údajů. Kompletní datový soubor obsahoval záznamy o 45 pacientech s primárním výskytem akutního infarktu, z toho 41 ve skupině AIM a 4 ve skupině AIMD6, a dále záznamy o 45 kontrolních pacientech. V datovém souboru bylo 60 mužů a 30 žen. Ve skupině AIM bylo 13 žen a 28 mužů, ve skupině A1MD6 2 muži a 2 ženy a ve skupině CTRL bylo 15 žen a 30 mužů. Ve skupině AIM bylo 10 kuřáků a 31 nekuřáků, ve skupině AIMD6 byly všechny osoby nekuřáci a ve skupině CTRL bylo 10 kuřáků a 35 nekuřáků. Co se týče diabetů mellitu II. typu, ve skupině AIM bylo 12 osob s touto diagnózou a 29 bez ní, ve skupině AIMD6 byly 2 osoby s touto diagnózou a 2 bez ní a konečně ve skupině CTRL (Kontroly) bylo 14 pacientů s touto diagnózou a 31 bez ní.

io Tabulka 2: Počty pacientů a procentuální vyjádření zastoupení popisných charakteristik kategorických veličin

Proměnná	Počty a procentuální údaje ve skupinách
AIM	A1MD6	Kontroly
Pohlaví	Muži	28 (68 %)	2(50%)	30(67%)
Ženy	13 (32 %)	2 (50 %)	15(33%)
Kouření	Kuřáci	10(24%)	0 (0 %)	10(22%)
Nekuřáci	31 (76%)	4(100%)	35 (78 %)
Diabetes meilitus H. typu	ANO	12(29%)	2 (50 %)	14(31 %)
NE	29 (71 %)	2 (50 %)	31(69%)

Tabulka 3: Popisné charakteristiky spojitých veličin

Skupina	Věk pacienta
N	Průměrná hodnota	Směrodatná odchylka
AIM	41	63,6	9,18
AÍMD6	4	72,3	4,73
Kontroly	45	65,5	9,42

Vzorky venózní krve odebrané od pacientů byly zpracovávány postupem podle Příkladu 1. Data genové exprese byla analyzována pomocí lineárních modelů pro analýzu dat z microarray experimentů „limma“ (Smyth, G. K.: Linear models and empirical Bayes methods for assessing differentíal expression in microarray experiments, 2004, Statistical Applications in Genetics and Molecular Biology 3, No. 1, Article 3, doi: 10.2202/15446115, 1027), navržených pro statistický a grafický systém R (http://www.r-project.org) v rámci projektu Bioconductor (http://www.bioconductor.org). Data byla normalizována pomocí kvantilové normalizace (Smyth G. K. and Speed T. P.: Normalization of cDNA microarray data, 2003, Methods 31, 265-273, doi:10.1016/j.physletb.2003, 10.071). Šum signálu na pozadí čipu, u kterého se předpokládá normální rozložení, byl odstraněn pomocí konvolučního modelu. Tento model předpokládá, že signál z čipů čtený pomocí skeneru je směsí normálně rozděleného šumu a exponenciálně rozděleného signálu intenzit genové exprese (Ritchie Μ. E., Silver 1, Oshlack A., Holmes M., Diyagama D., Holloway A., Smyth G. K.: A comparison of background correction methods for two-colour microarrays, 2007, Bioinformatics 23, 2700-2707, PMID: 17720982).

- 19CZ 22758 Ul

Medicínská hypotéza předpokládala možnost genetické determinace (predispozice) výskytu akutního infarktu myokardu vzhledem k obecné české populaci jak v populaci pacientů přežívajících období šestiměsíčního sledování (kontrast AIM vs Kontroly), tak též u pacientů v tomto období zemřelých (kontrast AIMD6 vs Kontroly). Podobně byla předpokládána vyšší genetická zátěž u pacientů s výskytem infarktu, kteří zemřeli v období šestiměsíčního sledování, v porovnání s populací pacientů přežívající srdeční příhodu dlouhodoběji (kontrast AIMD6 vs AIM). Párový statistický design byl zvolen s cílem snížit počty odhadovaných parametrů, které by jinak bylo nutné zohlednit jako možné zavádějící faktory (pohlaví, věk, výskyt kouření a diabetů mellitu) a dále odlišit klinickou a genetickou komponentu komplexního rizika výskytu akutní srdeční io příhody. Síla statistických testuje navíc v párovém designu v porovnání s dvou- a vícevýběrovými plány statistických studií typicky vyšší.

Vzhledem k tomu, že o lllumtna čipech je známo, že aktuální naměřené hodnoty intenzit genové exprese bývají na jednotlivých čipech plošně posunuty o neznámou konstantu, je tuto skutečnost nutné zohlednit v rámci statistické analýzy a odpovídající korekční konstanty je třeba odhadnout v lineárním modelu. Z tohoto důvodu také není vhodné uvažovat o korelacích mezi naměřenými hodnotami intenzit genové exprese a hodnotami klinických proměnných. Relevantní závěry proto nutné vycházejí pouze z výsledků obdržených z lineárního modelu, kde jsou lineární efekty jednotlivých čipů na hodnoty intenzit genové exprese adjustovány. Lineární statistický model (limma) zohledňoval vliv použitého čipu na hodnoty intenzit genové exprese. Intenzity genové exprese vstupovaly do lineárního modelu jako dvojkové logaritmy původních hodnot. Obrázky 2a a 2b ukazují diagnostiku lineárního modelu pro logaritmovaná data intenzit genové exprese při základu 2 pro všechny tri uvažované kontrasty pomocí Q-Q kvantilových grafů. Ideální kvantilový Q-Q graf by měl mít shodné empirické a teoretické hodnoty kvantitu, takže všechny zobrazené hodnoty by ležely na přímce. Q-Q gratý shodně potvrzují, že použití lineárního modeluje ve všech třech případech adekvátní. Lineární model můžeme schematicky popsat následovně: log₂( intenzita) - pár + skupina, přičemž proměnná „pár“ identifikuje dvojici případu a odpovídající párové kontroly, která byla vždy umístěna na stejném lllumina čipu. Proměnná „skupina“ kóduje příslušnost k populacím AIM, AIMD6 a Kontrol. Tento model je zobecněnou verzí párového testu.

Množiny genů identifikované na základě výsledků z lineárního limma modelu byly dále analyzovány pomocí PAM modelu, s jehož pomocí byla pro každý kontrast zjištěna podmnožina genů s prediktivními vlastnostmi v nezávislých výběrech. Lineárním modelem dříve zjištěné množiny genů mohou až „příliš dobře“ vysvětlovat konkrétní data, ze kterých jsou výsledky odvozeny (tzv. „over-fitting“), ovšem na úkor prediktivity v nezávislých výběrech. K tomuto účelu byl využit PAM model („Predictive Analysis for Microarrays“), který pomocí křížové validace a využití „shrinkage“ principu identifikuje podmnožinu genů, která by měla mít optimální vlastnosti z hlediska určování pravděpodobné příslušnosti sledovaných jedinců k některé ze sledovaných populací (AIMD6, AIM a Kontroly).

Za diferenciálně exprimované byly obecně považovány geny, které splňovaly jak podmínku sta40 tistické významnosti na hladině 5 %, tak též klinické významnosti, která předpokládá, že dvojkový logaritmus podílu hodnot intenzit genové exprese je v absolutní hodnotě větší nebo roven jedné. Statistická analýza prokázala statisticky i klinicky významnou asociaci mezi krátkodobou úmrtností subjektů (v horizontu 6 měsíců po primární akutní srdeční příhodě) a jejich expresním genovým profilem u 15 genů v případě diagnostického kontrastu AIMD6 vs Kontroly a u 10 genů v případě prognostického kontrastu A1MD6 vs AIM. Prediktivní diagnostická množina genů pro kontrast AIM vs Kontroly čítala 13 genů a v limma modelu byla pouze statisticky signifikantní na hladině statistické významnosti a - 0,10. Tuto množinu již nebylo možné dále redukovat pomocí PAM modelu.

-20CZ 22758 Ul

Popis výsledků

Geny resp. transkripty uvedené v tabulkách 4, 7 a 10 specifikují prediktivni diagnostické a prognostické množiny genu pro výše uvedené kontrasty, které byly získány následujícím postupem; nejprve byla pomocí limma modelu („Linear Models for Microarray Data“, s http://bioinf.wehi.edu.au/limma/) na úrovni celého lidského genomu (na Illumina čipech verze 2 bylo zmapováno celkem 25036 genů) identifikována množina statisticky (q-hodnota<0,05) i klinicky významných genů (|log₂-fcld change|>l, tj. alespoň dvojnásobná změna intenzity genové exprese směrem nahoru nebo dolů). Tato množina byla následně redukována aplikací prediktivního PAM modelu (Prediction Analysis for Microarrays, io http://www.stat.stanford.edu/~tibs/PAM/), navrženého k vyhledávání množin genů s prediktivními vlastnostmi v nezávislých výběrech. Výskyt opakovaných pozorování (tj. technických replikátů) u 7 pacientů byl na úrovni limma modelu ošetřen použitím smíšeného lineárního modelu pro korelovaná data. Sekvence sond pro každý z kontrastů jsou uvedeny v Tabulkách 5, 8 a II.

(i) Kontrast A1MD6 vs Kontroly

V Tabulce 4 je uvedena prediktivni množina genů identifikovaná v rámci technického řešení, která se vzhledem k obecné české populaci jeví z Hlediska genové exprese jako diagnostická ve smyslu zvýšeného rizika výskytu akutního infarktu myokardu s následným úmrtím v krátkodobém časovém horizontu (do 6 měsíců od okamžiku výskytu srdeční příhody).

Uvedená množina 15 genů (gen PFKFB2 se vyskytl ve dvou transkriptech) byla stanovena na základě celogenomové analýzy genové exprese vzorků lidské venózní krve odebrané z těla pacientů s primárním výskytem infarktu myokardu. Průměrné hodnoty logaritmované genové exprese při základu 2 v populacích AIMD6 a Kontrol jsou uvedeny v Tabulce 6. Simultánně zvýšené hodnoty intenzit genové exprese 14 genů (ECHDC3, IL18RAP, PFKFB2, IRS2, PHACTR1, ERLIN1, VNN3, AD0RA3, CLEC4E, ASPRV1, CPD, FKBP5, PRKDC a SAMSN1) a současně naopak hodnoty nižší u genu NPMI indikují příslušnost pacienta k rizikové populaci AIMD6, obecně naznačují zvýšené riziko výskytu akutního infarktu myokardu s následným úmrtí z kardiovaskulárních příčin v krátkodobém horizontu. Diagnóza na základě exprese genů, stanovené jak je popsáno v tomto technického řešení, by měla implikovat zvýšenou pozornost klinickým rizikovým faktorům výskytu akutního infarktu myokardu (např. výskyt diabetů mellitu, kouření, nadváha) a j ej ich cílené zvýšené prevenci.

Tabulka 4: Prediktivni diagnostická množina genů pro kontrast AIMD6 vs Kontroly

Illumina ID	Název/ l.okus g«n«	RefSeqlD	Průměrná exprese	logjFC	q- bodnota	Pravděpúd. DiflL Expr.
6220204	ECÍIDC3	NM 024693.2	7.15	2.03	0,04983	0,453
5130475	IL18RAP	NM 003853.2	11,70	1.93	0,00849	0,988
3190326	PFKFB2	NM 0062121	7,68	1,86	0,03523	0,753
6980095	IRS2	NM. 0027491	9,81	1,77	0,04159	0,622
3800095	PHACTR1	NM 030948J.	6,16	1,45	0,03082	0,842
1690309	ERL1NI	NM 006459.2	6,79	1,28	0,01951	0,959
2810373	VNN3	NM 001024460. L	9,98	1.44	0,02903	0,874
4730669	ADORA3	NM 020683.5	6,33	1,75	0,02878	0,896
940754	CLEC4E	NM 0143581	7,89	1,69	0,04159	0,639
6290358	ASPRV1	NM 1527921	7,82	1,31	0,03966	0,692
2650347	PFKFB2	NM 0OI018OS3.1	6,37	1,97	0.04055	0,655
6590553 650543	CPD FKBPS	NM 001304.3	9,93	1,01	0,03523	0.745
N_M 0041171	9.56	2,11	0,04052	0,660
1660026	PRKDC	NM 006904.6	8.89	1.36	0,02612	0,913
2060154	NPMI	NM 1991851	11,52	Ί.15	0,02228	0,939
150632	SAMSNl	NM 022136,3	9.18	1,37	0,04777	0.489

illumina ID ... Illumina identifikátor genu

RefSeq_ID ... NCBI Reference Sequence ID („Accession number“)

Průměrná exprese ... Průměrná hodnota intenzit genové exprese ve spojeném souboru

Iog₂fC... Dvojkový logaritmus adjustovaného podílu intenzit ve skupinách AIMD6 a Kontrol

-21 CZ 22758 Ul q-hodnota... Storeyho adjustace dosažené hladiny významnosti pro mnohonásobná porovnávám (Storey JD, Tibshiram R. Statistical sigmficance ťor genomewide studies. Proč Nati Acad Sci USA. 2003 Aug 5;100(16):9440-5. Epub 2003 Jul 25. PubMed PM1D: 12883005; PubMed Central PMCID: PMC170937.)

Pravděpod. Diferenciální Exprese ... Pravděpodobnost, že sledovaný gen je skutečně diferenciálně exprimován.

Tabulka 5: Sekvence sond prediktivní diagnostické množiny genů pro kontrast AIMD6 vs Kontroly

tllo mina ID	Sekvence sondy	Definice
6220204	GCCAGCTATGGTGGGAAG CCTGGCATTTGGGGTGCT CCTTGCAACGTCTT	Lidský enoyiový koenzym A obsahující hydratázovou doménu (Homo sapiens enoyl Coenzyme A hydratase domain containing 3 (ECHDC3)), mRNA.
5130475	GGGTACTTTCAGTACACA ACACCCCTAAGA TTTCCC AGTGGTCCGAGCAG	Lidský receptářovy protein interleukinu 18 (Homo sapiens interleukin 18 receptor accessory protein (IL18RAP)), mRNA.
3190326	GGGCTGAGCACCTCTGGG TTGAATGGGAATGGGTCA GATTGGGAAGCCTA	Lidská 6-fosfofnikto-2-kináza/fruktóza-2,6- bifosfatáza 2, transkripční varianta l (Homo sapiens 6-phosphofructo-2-kÍnaseJfi,uctose“2,6- biphosphatase 2 (PFKFB2), transcript variant t), mRNA.
6980095	GTAACTCCCCCCAGGTAC GA TAGGGACTGAATATGG ACCCTGCTGAAAGC	Lidský inzulínový receptář 2 (Homo sapiens insulin receptor substráte 2 (IRS2)), mRNA.
3800095	AGATAAGCCGTGGACCCG CCTCACCGCTGCAGACAA AGCTGCCATCCGAA	Lidský regulátor fosfatázy a aktinu 1 (Homo sapiens phosphatase and actin regulátor 1 (PHACTR1)), mRNA.
1690309	TGTTGCCCCAAAGTGATG GCCCTGGAGGCGGGGCTG AGGAACAGGGAAAT	Lidský ER lipidový nosič 1 (Homo sapiens ER lipid raft associated 1 (ERLIN1)), mRNA.
2810373	GGCCCTGTATGCAAGAGT GTTTGAGAAGGACCCTCC ACGCTTAGGGCAGG	Lidský vanín 3, transkripční varianta 3 (Homo sapiens vanín 3 (VNN3), transcript variant 3), mRNA.
4730669	GTAGTCAGAGGAGCTATG ATAGACCACACCCAAGCA AGGCTGCCCTCAAA	Lidský receptor adenosinu A3, transkripčnf varianta l (Homo sapiens adenosine A3 receptor (ADORA3), transcript variant 1), mRNA.
940754	GGCTGTAACCAAGTCCAC CCA rCCCTGGGGCTTCCTT TGCTCTGCCTTAT	Lidský lektin C-typu doménové rodiny 4, člen E (Homo sapiens C-type Icctin domain family 4, member E (CLEC4E)! mRNA.
6290358	AACTGTGGGACCCCTTCA GATTCCCTGAGGTATGGC TTGGTCACTCTCAG	Lidská aspartyl peptidáza, podobná retrovirové 1 (Homo sapiens aspartic peptidase, retroviraUike 1 (ASPRV1)), mRNA.
2650347	CAGGACTCTGTTACCTAA GATGTGATAAGCTGGGCT GCAGGCGGTTCAGC	Lidská 6-fosfofrukto-2-kínázaZfruktóza-2,6- -bifosfatáza 2, transkripčnf varianta 2 (Homo sapiens 6-phosphoťructo-2-kínase/ fhictose-2,6- -biphosphatase 2 (PFKFB2), transcript variant 2), mRNA.
6590553	CTCCCAGTTCTAGAGCAA TCTACAGCTGTTTATG TG AGGTGCCCAACACC	Lidská karboxypeptidáza D (Homo sapiens carboxypeptidáse D (CPD)). mRNA.
650543	CTCAGATGATGCCAGCTG TCTCCCACGTGTGTATTAT GGTTCACCAGGGG	Lidský FK506 vážící protein 5 (Homo sapiens FK.506 binding protein 5 (FKBP5)), mRNA.
1660026	CCCCCCGCCAGTCCTCCA CACCCAAACTGTTTCTGA TTGGCTTTTAGCTT	Lidská protein kináza, aktivovaná DNA, katalytický polypeptid, transkripční varianta I (Homo sapiens protein kinase, DNA-activated, catalytic polypeptide (PRKDC), transcript variant 1), mRNA.
2060154	GTTGTCCAGGTTCTA TTGC CAAGAATGTGTTGTCCAA AATGCCTGTTTAG	Lidský nukieofosmin, transkripční varianta 2 (Homo sapiens nucleophosmin (nucleolar phosphoprotein B23, numatrin) (NPM1), transcript variant 2), mRNA.
150632	CACAGTTAGATGACTGCC CAAGGGACTCTGGTTGCT ATATCTCATCAGGA	Lidská SAM doména, SH3 doména a jaderné lokalizační signály I (Homo sapiens SAM domain, SH3 domain and nuclear localization sígnals 1 (SAMSNI)), mRNA.

-22CZ 22758 Ul

Tabulka 6: Průměrné hodnoty logaritmovaných genových expresí prediktivní diagnostické množiny genů pro kontrast AIMD6 vs Kontroly

ÍUumina ID	Název / Lokus Genu	Průměrná Exprese
A1MD6	Kontrol/^
6220204	ECHDC3	8,72	6,89
5130475	IL18RAP	13,13	11,46
3190326	PFKFB2	9,20	7,60
6980095	IRS2	11,05	9,57
3800095	PHACTR1	7,32	5,94

1690309	ERLINl	7,89	6,70
2810373	VNN3	11,04	9,69
4730669	ADORA3	7,66	6,29
940754	CLEC4E	9,15	7,72
6290358	ASPRV1	9,11	7,72
2650347	PFKFB2	7,92	6,29
6590553	CPD	11,00	9,82
650543	FKBP5	10,90	9,44
1660026	PRKDC	10,07	8,68
2060154	NPM1	10,39	11,64
150632	SAMSNI	10,30	9,04

(*) Referenční hladina intenzity genové exprese pro posouzení zvýšeného kardiovaskulárního rizika.

Porovnáním hladin genové exprese ve skupinách AIMD6 a Kontrol bylo popsáno 15 genů (gen PFKFB2 se vyskytuje ve dvou tran skriptech), z nichž u 14 genů byla hladina genové exprese zvýšena a u jednoho snížena. Jediný gen, u nějž byla genová exprese snížena, je gen NPM1 ío (nukleofosmin, jaderný fosfoprotein B23), který je významným jaderným proteinem zprostředkovávajícím transport mezi jádrem a cytoplasmou buňky. To zahrnuje celou řadu uvažovaných biologických procesů, jakými mohou být např. sestavování a transport ribosomálních proteinů či kontrola centrosomové duplikace. U zbývajících 15 genů byly identifikovány zvýšené hladiny genové exprese. Z těchto 14 up-regulováných genů bylo 7 genů vybaveno různými enzymatic15 kými aktivitami / ECHDC3 (hydratáza), PRKDC (proteinová kináza), PFKFB2 (6-fosfofrukto2-kináza/fruktóza-2,6-bifosfatáza 2), PHACTR1 (proteinová fosfatáza), VNN3 (vanin3, panteteináza indukovaná na proteinové a mRNA úrovni prozánětlivými cytokiny), ASPRV1 (aspartyl proteáza, hydroláza) a CPD (Karboxypeptidáza D) patří do rodiny enzymů metalokarboxypeptidáz,

Další 3 geny byly identifikovány jako molekuly, obsahující receptorové domény: IL18RAP (interleukin receptor), IRS2 (insulin receptor), ADORA3 (adenosin A3 receptor) s možnou kardioprotektivní aktivitou a zbývající 4 geny kódující molekuly s různými regulačními funkcemi: FKPB5 (chaperon) spojovaný s odpovědí na antidepresivní léčbu a označovaný jako rizikový faktor rozvoje posttraumatického šoku s vlivem na kortikosteroidní receptory, ERLIN1 (Endo25 plasmic Reticulum Lipid Raft-Associated Protein 1), kódující protein, v jehož struktuře jsou popisována aktivní místa pro fosforylaci, N-glykosylaci a N-myristoylaci, CLEC4E (C-type Lectin Domain Family 4, Member E), lektin exprimovaný na povrchu makrofágů, jehož jednou z hlavních biologických funkcí jsou mezi buněčné interakce a SAMSNI (Sam Domain, SH3 Domain, and Nuclear Localization Signals 1), kódující hematopoetický adaptor s popisovanou funkcí v cytoplazmě buňky.

-23QL 22758 Ul (ii) Kontrast AIM vs Kontroly

V Tabulce 2a je uvedena prediktivní množina 13 genů identifikovaná v rámci technického řešení, která se vzhledem k obecné české populaci z hlediska genové exprese jeví jako diagnostická ve smyslu zvýšeného rizika výskytu akutního infarktu myokardu, bez fatálních následků v krátko5 dobém horizontu. Jedná se o sestavu genů, jejichž expresní intenzity, se ve skupinách pacientů s výskytem akutního infarktu myokardu bez fatálních následků do 6 měsíců od doby výskytu srdeční příhody (AIM) a pacientů kontrolních (Kontroly) odlišovaly statisticky významně na hladině statistické významnosti a = 0,10. Tuto množinu již nebylo možné pomocí prediktivního modelu PAM dále redukovat.

io Množina 13 genů resp. lokusů a transkriptů byla stanovena na základě celogenomové analýzy genové exprese vzorků lidské venózní krve odebrané z těla pacientů s primárním výskytem infarktu myokardu. Průměrné hodnoty logaritmované genové exprese při základu 2 v populacích AIM a Kontrol jsou uvedeny v Tabulce 9. Simultánně snížené hodnoty intenzit genové exprese 9 genú/lokusu uvedených v Tabulkách 7, 8 a 9 (OLIG2, MS4A3, CEBPE, LÍPA, EPAS1, CLINTl,

MYCT1, VPS29 a LOC130951) a současně zvýšené hodnoty genové exprese u genů VNN3, FOS, LOC645649 a lidského T-buněčného receptoru (ReťSeq_ID „M97723“) vzhledem ke kontrolní obecné české populaci, indikují příslušnost pacienta k rizikové populaci AIM. Obecně naznačují zvýšené riziko výskytu akutního infarktu myokardu bez fatálních následků v krátkodobém časovém horizontu. Diagnóza na základě exprese genů, stanovené jak je popsáno v tomto technickém řešení, by měla implikovat zvýšenou pozornost klinickým rizikovým faktorů výskytu akutního infarktu myokardu (např. výskyt diabetů mellitu, kouření, nadváha) a jejich cílené zvýšené prevenci.

Tabulka 7: Prediktivní diagnostická množina genů pro kontrast AIM vs Kontroly

Illumina ID	Název/ Lokus genu	RefSeq_ID	Průměrná exprese	JogiFC	q- hod nota	Pravděpod. Diff. Expr.
1240136	OLIG2	NM 0058062	6,41	-0,891	0,0756	0,954
2810373	VNN3	NM 001024460.1	9,98	0,498	0,0756	0,966
3400551	MS4A3	NM 006138.4	7,82	-0,635	0,0756	0,908
10332	CEBPE	NM 001805.2	6,91	-0,447	0,0756	0,944
4250379	FOS	NM 0052522	10,27	0,388	0,0756	0,974
1470070	LÍPA	NM 000235.2	10,17	-0,373	0,0756	0,978
4040148	LOC645649	XM 9286632	8,01	0,286	0,0906	0,888
6940246	(M97723)	M97722	7,05	0,382	0,0756	0,949
780243	EPAS1	NM 001430J	6,63	-0,314	0,0756	0,908
6370187	CLINTl	..........	9,41	-0,246	0,0756	0,915
6280239	MY CTI	NM 025107.1	5,36	-0,150	0,0756	0,921
3400170	VPS29	NM 016226.2	10,57	-0,145	0,0756	0,912
4730343	LOC130951	NM 138804.2	5,14	-0,125	0,0756	0,920

Illumina ID ... Illumina identifikátor genu

RefSeq_ID ... NCBI Reference Sequence ID („Accessíon number,,)

Průměrná exprese ... Průměrná hodnota intenzit genové exprese ve spojeném souboru log₂FC... Dvojkový logaritmus adjustovaného podílu intenzit ve skupinách AIMD6 a Kontrol q-hodnota ... Storeyho adjustace dosažené hladiny významnosti pro mnohonásobná porovnávám (Storey JD, Tibshiram R. Statistical sigmficance for genomewide studies. Proč Nati Acad Sci USA. 2003 Aug 5;100(16):9440-5. Epub 2003 Jul 25. PubMed PMID: 12883005; PubMed Central PMCID: PMCI70937.)

Pravděpod. Diferenciální Exprese ... Pravděpodobnost, Že sledovaný gen je skutečně diferenciálně ex35 primován.

-24 CZ 22758 Ul tabulka 8: Sekvence sond prediktivní diagnostické množiny genů pro kontrast AIM vs Kontroly

Illumina ID	Sekvence sondy	Definice
1240136	CACAAATGGTAAACTCCTCC ACGTGCTTCCTGCGTTCCGT GCAAGCCGCC	Lidský oligodendrocytový transkripční faktor 2 (Homo sapiens oligodendrocyte lineage transcription factor 2 (OLIG2)), mRNA.
2810373	GGCCCTGTATGGAAGAGTGT TTGAGAAGGACCCTCCACGC TTAGGGCAGG	Lidský vanin 3, transkripční varianta 3 (Homo sapiens vanin 3 (VNN3), transcript variant 3), mRNA.
3400551	GTTGGCGAGTCTGAGAGCA AGCCCAAATGTGTTCTTCAA AGGACAATGGG	Lidské membránové domény 4, podrodina A, člen 3, transkripční varianta 1 (Homo sapiens membrane-spanning 4-domains, subfamily A, member 3 (hematopoietic cell-specific) (MS4A3), transcript variant 1), mRNA.
10332	AGCAGCTCACCCAGGAGCT AGACACCCTCCGCAACCTCT TCCGCCAGATT	Lidský CAAT/zesilovač vážící protein, epsilon (Homo sapiens CAAT/enhancer binding protein (C/EBP), epsilon (CEBPE)), mRNA.
4250379	CCCAGTGACACTTČAGAGA GCTGGTAGTTAGTAGCATGT TGAGCCAGGCC	Lidský homolog v-fos FBJ myšího onkogenu virového ostaosarkomu (Homo sapiens v-fos FBJ murine osteosarcoma viral oncogene homolog (FOS)), mRNA.
1470070	ČCCGCTACTGTCGTTATTGA TCACATCTGTGTGAAGCCAA AGCCCCGTGG	Lidská tipáza A, íysosomální kyselina, cholesterol esteráza, transkripční varianta 2 (Homo sapiens lipase A, lysosomai acid, cholesterol esterase (LÍPA), transcript variant 2), mRNA.
4040148	TGCAGGTCCTTTGTATGCTG AGCGCCGGTCCCCTAGGCCC ACTGTTGTTT	Lidský předpokládaný protein LOC 645649 (PREDICTED: Homo sapiens hypothetical protein LOC645649 (LOC645649)), mRNA.
6940246	GTACCGTCAGCAACCTGGAC AGAGCCTGACACTGATCGC AACTGCAAATC	Lidský T-bunéčný receptor (Human T-cell receptor (V beta 4.1-variant, J beta 2.1, C beta 2)) mRNA.
780243	AGCTGCACGGCATTACCCCA CACAGGGTGGCAGAACTTG AAGGGTTACTG	Lidský endoteliálni PAS doménový protein 1 (Homo sapiens endotheliai PAS domain protein 1 (EPASl)), mRNA.
6370187	TGGCAAGGCTTČČTTCCGTG TTTATCCCTGTAGCCATCAT TTAAGTCAGG	Lidský klathrinový ínteraktor 1 (Homo sapiens clathrin interactor 1 (CLINT1)), mRNA.
6280239	AGTGGCTGTGAACGTCGAA	Lidský cíl myc 1 (Homo sapiens myc target 1
	GCAACCTCAGCCTGGCCAGT CTCACCTTCCA	(MYCTl)), mRNA.
3400170	GCCCTGTTGCAGAGGCAATT TGATGTGGACATTCTTATCT CGGGACACAC	Lidský vakuolámí protein 29, transkripční varianta I (Homo sapiens vacuolar protein sorting 29 (yeast) (VPS29), transcript variant 1), mRNA.
4730343	AATCCAAGCCTCATTTCAGA GCCTGTGCCCTTCCCACTAC ACCACCAGGC	Lidský předpokládaný protein BC014602 (Homo sapiens hypothetical protein BCO 14602 (LOC130951)), mRNA.

- 25 CZ 22758 Ul

Tabulka 9: Průměrné hodnoty logaritmovaných genových expresí prediktivní diagnostické množiny genů pro kontrast AIM vs Kontroly

mamina ID	Název / Lokus Genu	Průměrná Exprese
AIM	Kontroly1*’
1240136	OLIG2	5,99	6.88
2810373	VNN3	10,20	9,69
3400551	MS4A3	7,56	8,17
10332	CEBPE	6,68	7,13
4250379	FOS	10,43	10,04
1470070	LÍPA	10,02	10,35
4040148	LOC645649	8.15	7,85
6940246	(M97723)	7.26	6,92
780243	EPAS1	6,45	6,75
6370187	CLINT1	9,29	9,52
6280239	MYCT1	. 5,28	5,43
3400170	VPS29	10,50	10,64
4730343	LOC130951	5,10	5,20

(*) Referenční hladina intenzity genové exprese pro posouzení zvýšeného kardiovaskulár5 ního rizika.

Porovnáním hladin genové exprese ve skupinách AIM a Kontrol bylo zjištěno celkem 13 genů s „up-“ resp. do wn-regulo vanou“ genovou expresí. Z toho 4 geny vykazovaly zvýšené hladiny (VNN3, podobně jako v případě kontrastu AIMD6 vs Kontroly), a dále FOS, M97723 a LOC645649. Zbývajících 9 genů demonstrovalo snížené hladiny genové exprese (OL1G2, ω CEBPE, LÍPA, MS4A3, EPAS1, CLINT1, VPS29, LOC130951 a MYCT1). U dvou ze sedmi uváděných genů lze biologickou funkci popsat jako enzymatickou aktivitu - VNN3 (vanin 3) a

LÍPA. Dva zástupce lze popsat jako struktury blízké buněčným receptorům - RefSeq_ID M97723.1, T-buněčný receptor, kletý je složen z variant podjednotek V, J, C (V, beta 4.1-varianta. J, beta 2.1-varianta a C, beta 2-varianta, MS4A3, transmembránový protein s potenciál15 nimi fosforylačními místy na N- i C-konci, může hrát roli v signální transdukci hematopoetických buněk. Zbylých 9 genů lze popsat jako geny kódující struktury proteinové povahy s regulačními vlastnostmi - MYCT1, up-stream transkripční aktivátor v buňce, OLIG2, transkripční faktor ovlivňující některé fáze buněčného cyklu, FOS, CEBPE, regulační vazebné proteiny, EPAS1, u nějž byla pozorována role v odpovědi na hypoxické stavy v placentě či plicích a již v roce 1997 byl popsán jako důležitý regulátor vaskularizace, CLINT1, z mála informací o biologické roli tohoto proteinu lze zmínit jeho účast ve zpětném transportu endogenních tzv. „cargo“proteinů, VPS29, gen kódující tzv. „třídící“ vakuolámí protein, jehož biologická funkce je lokalizována do lysozomů LOC645649 a LOC130951, oba dva hypotetické proteiny, jejichž funkce dosud popsána nebyla. LOC645649 byl odstraněn z NCBI databáze.

(iii) Kontrast AIMD6 vs AIM

V Tabulce 10 je uvedena prediktivní množina genů identifikovaná v rámci technického řešení, která se u pacientů s výskytem akutního infarktu myokardu jeví z hlediska genové exprese jako prognostická ve smyslu zvýšeného rizika úmrtí v důsledku kardiovaskulárních komplikací, a to v krátkodobém časovém horizontu (tj. do 6 měsíců od okamžiku výskytu srdeční příhody). Jedná se o sestavu 10 genů (gen CLYBL byl identifikován ve dvou transkriptech, Illumina ID 3180392 a 6550437), jejichž expresní intenzity, stanovené do Čtyřiadvaceti hodin od okamžiku primárního výskytu akutní srdeční události, se ve skupinách pacientů zemřelých v období 6 měsíců po srdeční příhodě (AIMD6) a skupině pacientů přežívající výskyt srdeční události po dobu sledování 6 měsíců (AIM) statisticky i klinicky významně odlišovaly. Tato množina exprimovaných genů charakterizuje zvýšenou stresovou zátěž organismu, která měla za následek úmrtí pacienta v prů-26CZ 22758 Ul běhu šestiměsíčního sledování od okamžiku výskytu akutního infarktu myokardu v důsledku kardiovaskulárních komplikací. Uvedená množina 10 genů byla stanovena na základě celogenomové analýzy genové exprese vzorků lidské venózní krve odebrané z těla pacientů s primárním výskytem infarktu myokardu. Průměrné hodnoty logaritmované genové exprese pri základu 2 v populacích AIMD6 a AIM jsou uvedeny v Tabulce 12. Simultánně zvýšené hodnoty intenzit genové exprese 3 genů (ADORA3, ERLIN1 a FLT3) a současně hodnoty snížené u 7 genů/transkripů (ReíSeqJD „M97723“, CLYBL, TCEA3, RefSeqJD „BC070337“, HSD17B8, AXIN2 a RefSeq_ID „CR596519“) indikují příslušnost pacienta k rizikové populaci AIMD6. Obecně naznačují zvýšené riziko úmrtí pacienta v krátkodobém časovém horizontu (do 6 měsíců ni od okamžiku výskytu srdeční příhody) v důsledku výskytu akutního infarktu myokardu. Diagnóza na základě exprese uvedených genů, stanovené jak je popsáno v tomto technickém řešení, by měla implikovat zvýšenou post-traumatickou léčebnou péči o tyto pacienty, jejichž prognóza je z hlediska přežití v krátkodobém časovém horizontu od okamžiku výskytu srdeční příhody statisticky i klinicky významně méně příznivá.

Tabulka 10: Prediktívní prognostická množina genů pro kontrast AIMD6 vs AIM

Ulumina ID	Název/ Lokus genu	ReíSeqJD	Průměrná exprese	logiFC	q- h od nota	Pravděpod. Diff. Expr.
4730669	ADORA3	NMJ&C683...Ž	6,33	1,78	0,0490	0,852
6940246	(M97723)	M97722	7,05	-1,52	0,0130	0,997
1690309	ERLJN1	NM 006459.2	6,79	1,19	0,0490	0,823
3180392	CLYBL	N.M-2Q6808J	6,79	-1,08	0,0234	0,978
5490634	TCEA3	NM 003196.1	7.09	-1,66	0,0381	0.938
6760670	(BC070337)	8CO7O337	10,81	-1,42	0,0490	0,805
6550437	CLYBL	NM 2Q6808J	6,53	-1,18	0,0130	0,988
3130019	HSD17B8	NM 014234.1	7,30	-1,06	0,0490	0,818
1230333	FLT3	NM 004119.1	6,04	U4	0,0490	0,838
5090368	AXIN2	NM 0046551	7,09	-1,49	0,0388	0,932
670041	(CR596519)	cptrna?	11,51	-1,45	0,0490	0,828

Ulumina ID ... Illumina identifikátor genu

RetSeq-ID ... NCBI Reference Sequence ID („Accession number“)

Průměrná exprese ... Průměrná hodnota intenzit genové exprese ve spojeném souboru log₂FC... Dvojkový logantmus adjustovaného podílu intenzit ve skupinách AIMD6 a Kontrol q-hodnota ... Storeyho adjustace dosažené hladiny významnosti pro mnohonásobná porovnávám (Storey JD, Tibshiram R. Statistical sigmficance for genomewide studies. Proč Nati Acad Sci USA. 2003 Aug 5;100(16):9440-5. Epub 2003 Jul 25. PubMed PMID: 12883005; PubMed Central PMCID: PMC170937.)

Pravděpod. Diferenciální Exprese ... Pravděpodobnost, že sledovaný gen je skutečně diferenciálně exprimován.

-27CZ 22758 Ul

Tabulka 11: Sekvence sond prediktivní prognostické množiny genů pro kontrast A1MD6 vs AIM

IUumina ID	Sekvence sondy	Definice
4730669	GTAGTCAGAGGAGCTAT GATAGACCACACCCAA GCAAGGCTGCCCTCAAA	Lidský receptor adenosinu A3, transkripční varianta 1 (Homo sapiens adenosine A3 receptor (ADORA3), transcript variant l), mRNA.
6940246	GTACCGTČAGCAACCTG GACAGAGCCTGACACTG ATCGCAACTGCAAATC	Lidský T-buněčný receptor (Human T-cell receptor (V beta 4.1 -variant, J beta 2.1, C beta 2)), mRNA.
1690309	TGTTGCCCCAAAGTGAT GGCCCTGGAGGCGGGG CTGAGGAACAGGGAAA T	Lidský ER lipidový nosič 1 (Homo sapiens ER lipid raft associated 1 (ERLIN1)), mRNA.
3180392	AGGGTATTGAAGCTGCA GAGGGATCAACTTGTGC TTGCCAGAGGACGCCA	Lidská beta-podobná citrátová lyáza (Homo sapiens citráte lyase beta like (CLYBL)), mRNA.
5490634	ACCAGGTGCAGACACG CAGTGCTGATGAGCCCA TGACTACCTTTGTCTTA	Lidský transkripční prodlužovací faktor A, 3 (Homo sapiens transcription elongation factor A (Sil), 3 (TCEA3)), mRNA.
6760670	AGTAAACCCATATATCC AGAACCCTGACCCTGCC	Lidský T-buněčný receptor, alfa lokus (Homo sapiens T cell receptor alpha locus), mRNA
	GTGTACCAGCTGAGAG	(cDNA cloně MGC88342 IMAGE;30352l6ó), complete cds.
6550437	TCGACATGCCATTACTG AAGCAGGCCCAGAACA CTGTTACGCTTGCCACC	Lidská beta-podobná citrátová lyáza (Homo sapiens citráte lyase beta like (CLYBL)), mRNA.
3130019	CCGATGGGACACTTGGG GGACCCTGAGGATGTGG CAGATGTGGTCGCATT	Lidská hydroxysteroidní (17-bty) dehydrogenáza 8 (Homo sapiens hydroxysteroid (17-beta) dehydrogenase 8 (HSD17B8)), mRNA.
1230333	GGATTTGGGGCTACTCT CTCCGCAGGCTCAGGTC GAAGATTCGTAGAGGA	Lidská fms-pnbuzná tyrosinová kináza 3 (Homo sapiens fms-related tyrosine kinase 3 (FLT3)), mRNA.
5090368	ACAGTACCTGTACCTGC ACGGTCACCCGCTCCGT GTGTCGCCCTATATTG	Lidský axin 2 (Homo sapiens axin 2 (conductin, axil) (AXIN2)), mRNA.
670041	AAACCCGTCACCCAGAT CGTCAGCGCCGAGGCCT GGGGTAGAGCAGGTGA	Lidský cDNA klon placentálního lůžka (fulk length cDNA cloně CSODI056YK21 of Placenta Cot 25-normalized of Homo sapiens (human)).

-28CZ 22758 Ul

Tabulka 12: Průměrné hodnoty logaritmovaných genových expresí prediktivní prognostické množiny genů pro kontrast AIMD6 vs AIM

(Ilumina ID	Název/ Lokus Cenu	Průměrná Exprese
AIMD6	AIM°
4730669	ADORA3	7,66	6,30
6940246	(M97723)	6,13	7,26
1690309	ERLINl	7,89	6,81
3180392	CLYBL	5,93	6,84
5490634	TCEA3	5,97	7,08
6760670	(BC070337)	9,74	10,87
6550437	CLYBL	5,75	6,55
3130019	OSD17B8	6,49	7,31
1230333	FLT3	6,77	5,99
5090368	AXIN2	6,33	7,15
670041	(CR596519)	10,72	11,57

(*) Referenční hladina intenzity genové exprese pro posouzení zvýšeného kardiovaskulár5 ního rizika.

Porovnáním hladin genové exprese ve skupinách AIMD6 a AIM bylo nalezeno celkem 10 genů, z nichž u 3 byly hladiny genové exprese zvýšeny a u 7 sníženy. Tři z těchto 10 genů lze charakterizovat jako molekuly s enzymatickou aktivitou - CLYBL (citrátová lyáza Beta-like), FLT3 (FMS-příbuzná tyrosinová kináza 3), která může mít vliv na růst hematopoetických kmenových a io progenitorových buněk, HSD17B8 (hydroxysteroidová 17-beta dehydrogenáza 8). Na myšším modelu byl demonstrován regulační vliv HSD17B8 na koncentrace biologicky aktivních estrogenů a androgenů. Další 3 geny byly zařazeny do kategorie molekul receptorové povahy. Jedná se o struktury ReťSeqJD M97723.1 (popis viz kontrast AIM vs Kontroly), ADORA3 (popis viz kontrast AIMD6 vs Kontroly), RefSeq_ID BC070337.1, popisovaný jako T-buněčný receptor, t5 alfa lokus. Zbývající 4 geny můžeme charakterizovat jako geny kódující některé regulační proteiny - ERLIN1 (popis viz kontrast AIMD6 vs Kontroly), TCEA3 (transkripční elongační faktor

A (Sil) 3). Jedná se o faktor účastnící se transkripce a bývá popisován jako důležitý protein pro vazbu s RNA polymerázou II, dále AXIN2 (AXIS inhibitor 2), hrající důležitou roli při stabilizaci beta-kateninu. Z dostupných pramenů je v leukocytech modelového organismu AXIS2 inhibi20 tor obtížně detekovatelný, RefSeq_tD CR596519.1, mRNA struktura o délce 1284 bp a lokalizovaná na dlouhých raméncích chromosomu 7.

Výsledky bootstrap studie pro ověření přediktivních vlastností vybraných genových sekvencí

Prediktivní vlastnosti transkriptů byly z hlediska nezávislých výběrů posuzovány pomocí bootstrap studie zaměřené na hodnocení senzitivity (SE) a specificity (SP) klasifikace na základě

PAM modelu. Bootstrap studie zahrnovala pro každý z uvedených kontrastů analýzu 1000 náhodných výběrů pořízených s opakováním z odpovídajících populací o témže rozsahu (tj. 41 z populace AIM, 4 z populace AIMD6 a 45 z populace kontrolní). Výsledky studie jsou shrnuty v Tabulce 13.

-29CZ 22758 Ul

Tabulka 13: Výsledky bootstrap studie na posouzení senzitivity a specificity PAM klasifikačního testu v nezávislých výběrech.

Kontrast	Výsledky PAM klasifikace (počet transkriptú použitých pro klasifikaci)
AIMD6 vs Kontroly	SE=0,90, SP= 0,93 (16 transkriptú)
AIM vs Kontroly	SE= 0,73, SP= 0,87 (13 transkriptú)
AIMD6 vs AIM	SE= 0,89, SP= 0.95 (11 transkriptú)

Diagnostická i prognostická množina genů pro populaci AIMD6 (viz kontrasty AIMD6 vs Kont5 roly a AIMD6 vs AIM) se shodně vyznačují vysokou senzitivitou i spéci ficitou klasifikačního testu na základě PAM modelu. Poněkud nižší hodnoty senzitivity i specificity pro diagnostiku populace AIM (kontrast AIM vs Kontroly) vzhledem k obecné české populaci jsou dány obtížnou rozlišitelností z hlediska klinického, a to zejména nižšími hodnotami log2FC, které nedosahovaly požadované úrovně klinické významnosti.

Claims (4)

1. NÁROKY

   ΝΛ

   OCHRANU

   1. Oligonukleotidový čip pro identifikaci osob se zvýšeným genetickým rizikem výskytu akutního infarktu myokardu se zřetelem k případným fatálním následkům v důsledku kardiovaskulárních komplikací v časovém horizontu do 6 měsíců od okamžiku výskytu srdeční příhody, vyznačený tím, že obsahuje právě sondy hybridizující s DNA či RNA sady genů či ge15 netických lokusů vybrané ze skupiny zahrnující:

   Sada A:

   Název / Loktu genu SEQ ID No. ECHDC3 1 IL18RAP 2 PFKFB2 3 IRS2 4 PHACTR1 5 ERLIN1 6 VNN3 7 ADORA3 8 CLEC4E 9 ASPRVI 10 PFKFB2 11 CPD 12 FKBP5 13 PRKDC 14 NPM1 15 SAMSN1 16

   -30CZ 22758 Ul

   Sada B:

   Název / Lokus genu SEQ ID No. OLIG2 17 VNN3 7 MS4A3 18 CEBPE 19 FOS 20 LÍPA 21 LOC645649 22 (M97723) 23 EPAS1 24 CLINT1 25 MYCT1 26 VPS29 27 LOC130951 28

   Sada C:

   Název / Loku* genu SEQ ID No. ADORA3 8 (M97723) 23 ERLIN1 6 CLYBL 29 TCEA3 30 (BC070337) 31 CLYBL 29 HSD17B8 32 FLT3 33 AXIN2 34 (CR5965I9) 35

   5
2. 2. Oligonukleotidový čip podle nároku 1, vyznačený tím, hybridizující s DNA čí RNA genů či genetických lokusů sady A.
3. 3. Oligonukleotidový čip podle nároku 1, vyznačený tím, hybridizující s DNA či RNA genů či genetických lokusů sady B.
4. 4. Oligonukleotidový čip podle nároku 1, vyznačený tím, ío hybridizující s DNA či RNA genů či genetických lokusů sady C.

   že obsahuje právě sondy že obsahuje právě sondy že obsahuje právě sondy