CZ303299A3 - Analogy faktoru X s modifikovanými štěpnými místy proteas, preparáty tyto látky obsahující, jejich použití a způsob jejich výroby - Google Patents
Analogy faktoru X s modifikovanými štěpnými místy proteas, preparáty tyto látky obsahující, jejich použití a způsob jejich výroby Download PDFInfo
- Publication number
- CZ303299A3 CZ303299A3 CZ19993032A CZ303299A CZ303299A3 CZ 303299 A3 CZ303299 A3 CZ 303299A3 CZ 19993032 A CZ19993032 A CZ 19993032A CZ 303299 A CZ303299 A CZ 303299A CZ 303299 A3 CZ303299 A3 CZ 303299A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- factor
- analogue
- protease
- preparation
- modification
- Prior art date
Links
- 108010014173 Factor X Proteins 0.000 title claims abstract description 313
- 239000004365 Protease Substances 0.000 title claims abstract description 125
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 title claims abstract description 124
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 90
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 54
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 title claims description 123
- 230000008569 process Effects 0.000 title description 19
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 title description 2
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 claims abstract description 168
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims abstract description 88
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims abstract description 77
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims abstract description 55
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims abstract description 55
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims abstract description 17
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 14
- 108090001126 Furin Proteins 0.000 claims description 89
- 102000004961 Furin Human genes 0.000 claims description 69
- 238000001994 activation Methods 0.000 claims description 66
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 65
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 56
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 54
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 47
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 40
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 35
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 30
- 101710118538 Protease Proteins 0.000 claims description 27
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 claims description 23
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 claims description 23
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 22
- 108010071241 Factor XIIa Proteins 0.000 claims description 21
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 21
- 102100035233 Furin Human genes 0.000 claims description 20
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 20
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 18
- 108010080805 Factor XIa Proteins 0.000 claims description 15
- 101710172072 Kexin Proteins 0.000 claims description 15
- 108060005987 Kallikrein Proteins 0.000 claims description 14
- 102000001399 Kallikrein Human genes 0.000 claims description 14
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 14
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 13
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 claims description 13
- 101800001401 Activation peptide Proteins 0.000 claims description 12
- 102400000069 Activation peptide Human genes 0.000 claims description 11
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 claims description 11
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 claims description 11
- -1 STEAM 4 Proteins 0.000 claims description 11
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 claims description 11
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 11
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 11
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 11
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 10
- 101001098833 Homo sapiens Proprotein convertase subtilisin/kexin type 6 Proteins 0.000 claims description 9
- 102100038946 Proprotein convertase subtilisin/kexin type 6 Human genes 0.000 claims description 9
- 108010029144 Factor IIa Proteins 0.000 claims description 8
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 8
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 8
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 8
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 claims description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 7
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims description 6
- 230000000468 autoproteolytic effect Effects 0.000 claims description 6
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 6
- 230000009471 action Effects 0.000 claims description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 5
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims description 5
- 238000003860 storage Methods 0.000 claims description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 5
- 229960000182 blood factors Drugs 0.000 claims description 4
- 238000009472 formulation Methods 0.000 claims description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 4
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 4
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 claims description 3
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 claims description 3
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 claims description 3
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 claims description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N serine Chemical compound OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims 2
- 241001522306 Serinus serinus Species 0.000 claims 1
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 claims 1
- 238000004326 stimulated echo acquisition mode for imaging Methods 0.000 claims 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 abstract description 3
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 abstract 1
- 229940012426 factor x Drugs 0.000 description 242
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 47
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 37
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 29
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 29
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 28
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 28
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 28
- 241000894007 species Species 0.000 description 28
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Chemical group NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 27
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 24
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 19
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 18
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 16
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 15
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 15
- 101100275473 Caenorhabditis elegans ctc-3 gene Proteins 0.000 description 14
- 108010055341 glutamyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 13
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 12
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 12
- BUZMZDDKFCSKOT-CIUDSAMLSA-N Glu-Glu-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O BUZMZDDKFCSKOT-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 11
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 11
- KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N alpha-L-glutamyl-L-glutamic acid Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 description 11
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 11
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 229940012414 factor viia Drugs 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 108010054265 Factor VIIa Proteins 0.000 description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 9
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical group NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 8
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 8
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 8
- 108010048049 Factor IXa Proteins 0.000 description 7
- 125000002059 L-arginyl group Chemical group O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])N([H])C(=N[H])N([H])[H] 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 7
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 7
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 description 6
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 6
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010018823 anti-inhibitor coagulant complex Proteins 0.000 description 6
- 230000008859 change Effects 0.000 description 6
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 6
- 229960004222 factor ix Drugs 0.000 description 6
- 229940105776 factor viii inhibitor bypassing activity Drugs 0.000 description 6
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 101001030665 Dictyostelium discoideum GDP-L-fucose synthase Proteins 0.000 description 5
- 108010062466 Enzyme Precursors Proteins 0.000 description 5
- 102000010911 Enzyme Precursors Human genes 0.000 description 5
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 5
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 5
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- 239000012084 conversion product Substances 0.000 description 5
- 229940067631 phospholipid Drugs 0.000 description 5
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 5
- 102100023804 Coagulation factor VII Human genes 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 108010023321 Factor VII Proteins 0.000 description 4
- SOEATRRYCIPEHA-BQBZGAKWSA-N Gly-Glu-Glu Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O SOEATRRYCIPEHA-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 4
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 4
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 108090001015 cancer procoagulant Proteins 0.000 description 4
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 4
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 4
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 4
- 229940012413 factor vii Drugs 0.000 description 4
- 108010015792 glycyllysine Proteins 0.000 description 4
- 108010014806 prothrombinase complex Proteins 0.000 description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 4
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- VXLXATVURDNDCG-CIUDSAMLSA-N Cys-Lys-Asp Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N VXLXATVURDNDCG-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 3
- JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N H-Gly-Phe-OH Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- RVVBWTWPNFDYBE-SRVKXCTJSA-N Leu-Glu-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O RVVBWTWPNFDYBE-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 101100170937 Mus musculus Dnmt1 gene Proteins 0.000 description 3
- XMBSYZWANAQXEV-UHFFFAOYSA-N N-alpha-L-glutamyl-L-phenylalanine Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 XMBSYZWANAQXEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010002311 N-glycylglutamic acid Proteins 0.000 description 3
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 3
- 108010081551 glycylphenylalanine Proteins 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 3
- 108010034529 leucyl-lysine Proteins 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 3
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 3
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 108010061238 threonyl-glycine Proteins 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- ZXJZGWOMAFPSJH-DCAQKATOSA-N (2S)-1-[2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[(2-aminoacetyl)amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]acetyl]amino]acetyl]pyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O ZXJZGWOMAFPSJH-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- GSCLWXDNIMNIJE-ZLUOBGJFSA-N Ala-Asp-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O GSCLWXDNIMNIJE-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 2
- JQDFGZKKXBEANU-IMJSIDKUSA-N Ala-Cys Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O JQDFGZKKXBEANU-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 2
- KZXPVYVSHUJCEO-ULQDDVLXSA-N Arg-Phe-Lys Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 KZXPVYVSHUJCEO-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 2
- GNKVBRYFXYWXAB-WDSKDSINSA-N Asn-Glu-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O GNKVBRYFXYWXAB-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- CBWCQCANJSGUOH-ZKWXMUAHSA-N Asn-Val-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O CBWCQCANJSGUOH-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- RVMXMLSYBTXCAV-VEVYYDQMSA-N Asp-Pro-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O RVMXMLSYBTXCAV-VEVYYDQMSA-N 0.000 description 2
- BDWIZLQVVWQMTB-XKBZYTNZSA-N Cys-Glu-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N)O BDWIZLQVVWQMTB-XKBZYTNZSA-N 0.000 description 2
- GGRDJANMZPGMNS-CIUDSAMLSA-N Cys-Ser-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O GGRDJANMZPGMNS-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 108010014172 Factor V Proteins 0.000 description 2
- 108010074864 Factor XI Proteins 0.000 description 2
- 108010080865 Factor XII Proteins 0.000 description 2
- 102000000429 Factor XII Human genes 0.000 description 2
- IRDASPPCLZIERZ-XHNCKOQMSA-N Glu-Ala-Pro Chemical compound C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N IRDASPPCLZIERZ-XHNCKOQMSA-N 0.000 description 2
- NLKVNZUFDPWPNL-YUMQZZPRSA-N Glu-Arg-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(O)=O NLKVNZUFDPWPNL-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- KOSRFJWDECSPRO-WDSKDSINSA-N Glu-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- CGOHAEBMDSEKFB-FXQIFTODSA-N Glu-Glu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O CGOHAEBMDSEKFB-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- FVGOGEGGQLNZGH-DZKIICNBSA-N Glu-Val-Phe Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 FVGOGEGGQLNZGH-DZKIICNBSA-N 0.000 description 2
- KKBWDNZXYLGJEY-UHFFFAOYSA-N Gly-Arg-Pro Natural products NCC(=O)NC(CCNC(=N)N)C(=O)N1CCCC1C(=O)O KKBWDNZXYLGJEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IKAIKUBBJHFNBZ-LURJTMIESA-N Gly-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN IKAIKUBBJHFNBZ-LURJTMIESA-N 0.000 description 2
- VBOBNHSVQKKTOT-YUMQZZPRSA-N Gly-Lys-Ala Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O VBOBNHSVQKKTOT-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- RVKIPWVMZANZLI-UHFFFAOYSA-N H-Lys-Trp-OH Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)C(N)CCCCN)C(O)=O)=CNC2=C1 RVKIPWVMZANZLI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000031220 Hemophilia Diseases 0.000 description 2
- 208000009292 Hemophilia A Diseases 0.000 description 2
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 2
- GBMSSORHVHAYLU-QTKMDUPCSA-N His-Val-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)N)O GBMSSORHVHAYLU-QTKMDUPCSA-N 0.000 description 2
- JZBVBOKASHNXAD-NAKRPEOUSA-N Ile-Val-Ser Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N JZBVBOKASHNXAD-NAKRPEOUSA-N 0.000 description 2
- 108010065920 Insulin Lispro Proteins 0.000 description 2
- NEEOBPIXKWSBRF-IUCAKERBSA-N Leu-Glu-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O NEEOBPIXKWSBRF-IUCAKERBSA-N 0.000 description 2
- RXGLHDWAZQECBI-SRVKXCTJSA-N Leu-Leu-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O RXGLHDWAZQECBI-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- JVTYXRRFZCEPPK-RHYQMDGZSA-N Leu-Met-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N)O JVTYXRRFZCEPPK-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 2
- AAORVPFVUIHEAB-YUMQZZPRSA-N Lys-Asp-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O AAORVPFVUIHEAB-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- YUAXTFMFMOIMAM-QWRGUYRKSA-N Lys-Lys-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(O)=O YUAXTFMFMOIMAM-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 2
- FYRUJIJAUPHUNB-IUCAKERBSA-N Met-Gly-Arg Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N FYRUJIJAUPHUNB-IUCAKERBSA-N 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- FXPZZKBHNOMLGA-HJWJTTGWSA-N Phe-Ile-Arg Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=CC=C1)N FXPZZKBHNOMLGA-HJWJTTGWSA-N 0.000 description 2
- LRBSWBVUCLLRLU-BZSNNMDCSA-N Phe-Leu-Lys Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(=O)[C@@H](N)Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O LRBSWBVUCLLRLU-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 2
- ALJGSKMBIUEJOB-FXQIFTODSA-N Pro-Ala-Cys Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 ALJGSKMBIUEJOB-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- CWZUFLWPEFHWEI-IHRRRGAJSA-N Pro-Tyr-Asp Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O CWZUFLWPEFHWEI-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 2
- 102000004245 Proteasome Endopeptidase Complex Human genes 0.000 description 2
- 108090000708 Proteasome Endopeptidase Complex Proteins 0.000 description 2
- 108010054530 RGDN peptide Proteins 0.000 description 2
- KCFKKAQKRZBWJB-ZLUOBGJFSA-N Ser-Cys-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O KCFKKAQKRZBWJB-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 2
- IFLVBVIYADZIQO-DCAQKATOSA-N Ser-Met-Lys Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N IFLVBVIYADZIQO-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 2
- TWLMXDWFVNEFFK-FJXKBIBVSA-N Thr-Arg-Gly Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(O)=O TWLMXDWFVNEFFK-FJXKBIBVSA-N 0.000 description 2
- NAXBBCLCEOTAIG-RHYQMDGZSA-N Thr-Arg-Lys Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](N)[C@H](O)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O NAXBBCLCEOTAIG-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 2
- QGXCWPNQVCYJEL-NUMRIWBASA-N Thr-Asn-Glu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O QGXCWPNQVCYJEL-NUMRIWBASA-N 0.000 description 2
- MYNYCUXMIIWUNW-IEGACIPQSA-N Thr-Trp-Lys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N)O MYNYCUXMIIWUNW-IEGACIPQSA-N 0.000 description 2
- 108010000499 Thromboplastin Proteins 0.000 description 2
- 102000002262 Thromboplastin Human genes 0.000 description 2
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- IUFQHOCOKQIOMC-XIRDDKMYSA-N Trp-Asn-Lys Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N IUFQHOCOKQIOMC-XIRDDKMYSA-N 0.000 description 2
- DZIKVMCFXIIETR-JSGCOSHPSA-N Trp-Gly-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O DZIKVMCFXIIETR-JSGCOSHPSA-N 0.000 description 2
- FNWGDMZVYBVAGJ-XEGUGMAKSA-N Tyr-Gly-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)N FNWGDMZVYBVAGJ-XEGUGMAKSA-N 0.000 description 2
- VYTUETMEZZLJFU-IHRRRGAJSA-N Tyr-Pro-Cys Chemical compound C1C[C@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC2=CC=C(C=C2)O)N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O VYTUETMEZZLJFU-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 2
- CLEGSEJVGBYZBJ-MEYUZBJRSA-N Tyr-Thr-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@H](O)C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 CLEGSEJVGBYZBJ-MEYUZBJRSA-N 0.000 description 2
- APQIVBCUIUDSMB-OSUNSFLBSA-N Val-Ile-Thr Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N APQIVBCUIUDSMB-OSUNSFLBSA-N 0.000 description 2
- YQYFYUSYEDNLSD-YEPSODPASA-N Val-Thr-Gly Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(O)=O YQYFYUSYEDNLSD-YEPSODPASA-N 0.000 description 2
- 229930003448 Vitamin K Natural products 0.000 description 2
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 108010087924 alanylproline Proteins 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 238000005844 autocatalytic reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 2
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 2
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 2
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 2
- AGVAZMGAQJOSFJ-WZHZPDAFSA-M cobalt(2+);[(2r,3s,4r,5s)-5-(5,6-dimethylbenzimidazol-1-yl)-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] [(2r)-1-[3-[(1r,2r,3r,4z,7s,9z,12s,13s,14z,17s,18s,19r)-2,13,18-tris(2-amino-2-oxoethyl)-7,12,17-tris(3-amino-3-oxopropyl)-3,5,8,8,13,15,18,19-octamethyl-2 Chemical group [Co+2].N#[C-].[N-]([C@@H]1[C@H](CC(N)=O)[C@@]2(C)CCC(=O)NC[C@@H](C)OP(O)(=O)O[C@H]3[C@H]([C@H](O[C@@H]3CO)N3C4=CC(C)=C(C)C=C4N=C3)O)\C2=C(C)/C([C@H](C\2(C)C)CCC(N)=O)=N/C/2=C\C([C@H]([C@@]/2(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=N\C\2=C(C)/C2=N[C@]1(C)[C@@](C)(CC(N)=O)[C@@H]2CCC(N)=O AGVAZMGAQJOSFJ-WZHZPDAFSA-M 0.000 description 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000012407 engineering method Methods 0.000 description 2
- 230000020764 fibrinolysis Effects 0.000 description 2
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 2
- 108010073628 glutamyl-valyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 2
- XBGGUPMXALFZOT-UHFFFAOYSA-N glycyl-L-tyrosine hemihydrate Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XBGGUPMXALFZOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000006623 intrinsic pathway Effects 0.000 description 2
- 108010044374 isoleucyl-tyrosine Proteins 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 108010017391 lysylvaline Proteins 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N phylloquinone Natural products CC(C)CCCCC(C)CCC(C)CCCC(=CCC1=C(C)C(=O)c2ccccc2C1=O)C SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 2
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000019168 vitamin K Nutrition 0.000 description 2
- 239000011712 vitamin K Substances 0.000 description 2
- 150000003721 vitamin K derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 229940046010 vitamin k Drugs 0.000 description 2
- FSNVAJOPUDVQAR-UHFFFAOYSA-N 2-[[6-amino-2-[[2-amino-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]amino]hexanoyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)pentanoic acid Chemical compound NC(N)=NCCCC(N)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(O)=O FSNVAJOPUDVQAR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 1
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- DKJPOZOEBONHFS-ZLUOBGJFSA-N Ala-Ala-Asp Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O DKJPOZOEBONHFS-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- CCUAQNUWXLYFRA-IMJSIDKUSA-N Ala-Asn Chemical compound C[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@H](C([O-])=O)CC(N)=O CCUAQNUWXLYFRA-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- FXKNPWNXPQZLES-ZLUOBGJFSA-N Ala-Asn-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O FXKNPWNXPQZLES-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- ZIWWTZWAKYBUOB-CIUDSAMLSA-N Ala-Asp-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O ZIWWTZWAKYBUOB-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- NINQYGGNRIBFSC-CIUDSAMLSA-N Ala-Lys-Ser Chemical compound NCCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](N)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O NINQYGGNRIBFSC-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- 241000024188 Andala Species 0.000 description 1
- ZZZWQALDSQQBEW-STQMWFEESA-N Arg-Gly-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O ZZZWQALDSQQBEW-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- NGTYEHIRESTSRX-UWVGGRQHSA-N Arg-Lys-Gly Chemical compound NCCCC[C@@H](C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N NGTYEHIRESTSRX-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- PRLPSDIHSRITSF-UNQGMJICSA-N Arg-Phe-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O PRLPSDIHSRITSF-UNQGMJICSA-N 0.000 description 1
- QLSRIZIDQXDQHK-RCWTZXSCSA-N Arg-Val-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O QLSRIZIDQXDQHK-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 1
- GQRDIVQPSMPQME-ZPFDUUQYSA-N Asn-Ile-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O GQRDIVQPSMPQME-ZPFDUUQYSA-N 0.000 description 1
- RLHANKIRBONJBK-IHRRRGAJSA-N Asn-Met-Phe Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N RLHANKIRBONJBK-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- KYQJHBWHRASMKG-ZLUOBGJFSA-N Asn-Ser-Cys Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O KYQJHBWHRASMKG-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- NCXTYSVDWLAQGZ-ZKWXMUAHSA-N Asn-Ser-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O NCXTYSVDWLAQGZ-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- GWTLRDMPMJCNMH-WHFBIAKZSA-N Asp-Asn-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O GWTLRDMPMJCNMH-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- UGKZHCBLMLSANF-CIUDSAMLSA-N Asp-Asn-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O UGKZHCBLMLSANF-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- CUQDCPXNZPDYFQ-ZLUOBGJFSA-N Asp-Ser-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O CUQDCPXNZPDYFQ-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- DRCOAZZDQRCGGP-GHCJXIJMSA-N Asp-Ser-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O DRCOAZZDQRCGGP-GHCJXIJMSA-N 0.000 description 1
- JDDYEZGPYBBPBN-JRQIVUDYSA-N Asp-Thr-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O JDDYEZGPYBBPBN-JRQIVUDYSA-N 0.000 description 1
- XOASPVGNFAMYBD-WFBYXXMGSA-N Asp-Trp-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O XOASPVGNFAMYBD-WFBYXXMGSA-N 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 108091005658 Basic proteases Proteins 0.000 description 1
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 101800005309 Carboxy-terminal peptide Proteins 0.000 description 1
- 102100029117 Coagulation factor X Human genes 0.000 description 1
- AEJSNWMRPXAKCW-WHFBIAKZSA-N Cys-Ala-Gly Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O AEJSNWMRPXAKCW-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ODDOYXKAHLKKQY-MMWGEVLESA-N Cys-Ile-Pro Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N ODDOYXKAHLKKQY-MMWGEVLESA-N 0.000 description 1
- POSRGGKLRWCUBE-CIUDSAMLSA-N Cys-Met-Glu Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N POSRGGKLRWCUBE-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- BCWIFCLVCRAIQK-ZLUOBGJFSA-N Cys-Ser-Cys Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N)O BCWIFCLVCRAIQK-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- IXPSSIBVVKSOIE-SRVKXCTJSA-N Cys-Ser-Tyr Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CS)N)O IXPSSIBVVKSOIE-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 102000005593 Endopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010059378 Endopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 108010061932 Factor VIIIa Proteins 0.000 description 1
- 108010074105 Factor Va Proteins 0.000 description 1
- 101800000969 Factor X light chain Proteins 0.000 description 1
- 102400000515 Factor X light chain Human genes 0.000 description 1
- 201000007176 Factor XII Deficiency Diseases 0.000 description 1
- 201000007371 Factor XIII Deficiency Diseases 0.000 description 1
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 1
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 1
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 1
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 1
- SRZLHYPAOXBBSB-HJGDQZAQSA-N Glu-Arg-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O SRZLHYPAOXBBSB-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- LXAUHIRMWXQRKI-XHNCKOQMSA-N Glu-Asn-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)C(=O)O LXAUHIRMWXQRKI-XHNCKOQMSA-N 0.000 description 1
- PHONAZGUEGIOEM-GLLZPBPUSA-N Glu-Glu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O PHONAZGUEGIOEM-GLLZPBPUSA-N 0.000 description 1
- OAGVHWYIBZMWLA-YFKPBYRVSA-N Glu-Gly-Gly Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)NCC(O)=O OAGVHWYIBZMWLA-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KRGZZKWSBGPLKL-IUCAKERBSA-N Glu-Gly-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N KRGZZKWSBGPLKL-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- WNRZUESNGGDCJX-JYJNAYRXSA-N Glu-Leu-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O WNRZUESNGGDCJX-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- OCJRHJZKGGSPRW-IUCAKERBSA-N Glu-Lys-Gly Chemical compound NCCCC[C@@H](C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O OCJRHJZKGGSPRW-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- MIIGESVJEBDJMP-FHWLQOOXSA-N Glu-Phe-Tyr Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 MIIGESVJEBDJMP-FHWLQOOXSA-N 0.000 description 1
- IDEODOAVGCMUQV-GUBZILKMSA-N Glu-Ser-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O IDEODOAVGCMUQV-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- JWNZHMSRZXXGTM-XKBZYTNZSA-N Glu-Ser-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O JWNZHMSRZXXGTM-XKBZYTNZSA-N 0.000 description 1
- SUDUYJOBLHQAMI-WHFBIAKZSA-N Gly-Asp-Cys Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O SUDUYJOBLHQAMI-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- BIRKKBCSAIHDDF-WDSKDSINSA-N Gly-Glu-Cys Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O BIRKKBCSAIHDDF-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- QSVCIFZPGLOZGH-WDSKDSINSA-N Gly-Glu-Ser Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O QSVCIFZPGLOZGH-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- CUYLIWAAAYJKJH-RYUDHWBXSA-N Gly-Glu-Tyr Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 CUYLIWAAAYJKJH-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- UQJNXZSSGQIPIQ-FBCQKBJTSA-N Gly-Gly-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)CN UQJNXZSSGQIPIQ-FBCQKBJTSA-N 0.000 description 1
- COVXELOAORHTND-LSJOCFKGSA-N Gly-Ile-Val Chemical compound NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O COVXELOAORHTND-LSJOCFKGSA-N 0.000 description 1
- VLIJYPMATZSOLL-YUMQZZPRSA-N Gly-Lys-Cys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)CN VLIJYPMATZSOLL-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- FXGRXIATVXUAHO-WEDXCCLWSA-N Gly-Lys-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CCCCN FXGRXIATVXUAHO-WEDXCCLWSA-N 0.000 description 1
- HUFUVTYGPOUCBN-MBLNEYKQSA-N Gly-Thr-Ile Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O HUFUVTYGPOUCBN-MBLNEYKQSA-N 0.000 description 1
- XBGGUPMXALFZOT-VIFPVBQESA-N Gly-Tyr Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XBGGUPMXALFZOT-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- GBYYQVBXFVDJPJ-WLTAIBSBSA-N Gly-Tyr-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)NC(=O)CN)O GBYYQVBXFVDJPJ-WLTAIBSBSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- HTZKFIYQMHJWSQ-INTQDDNPSA-N His-Ala-Pro Chemical compound C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CN=CN2)N HTZKFIYQMHJWSQ-INTQDDNPSA-N 0.000 description 1
- TXLQHACKRLWYCM-DCAQKATOSA-N His-Glu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O TXLQHACKRLWYCM-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- MKWSZEHGHSLNPF-NAKRPEOUSA-N Ile-Ala-Val Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)O)N MKWSZEHGHSLNPF-NAKRPEOUSA-N 0.000 description 1
- CDGLBYSAZFIIJO-RCOVLWMOSA-N Ile-Gly-Gly Chemical compound CC[C@H](C)[C@H]([NH3+])C(=O)NCC(=O)NCC([O-])=O CDGLBYSAZFIIJO-RCOVLWMOSA-N 0.000 description 1
- AXNGDPAKKCEKGY-QPHKQPEJSA-N Ile-Ile-Thr Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)O)N AXNGDPAKKCEKGY-QPHKQPEJSA-N 0.000 description 1
- KLBVGHCGHUNHEA-BJDJZHNGSA-N Ile-Leu-Ala Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)O)N KLBVGHCGHUNHEA-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 1
- GVKKVHNRTUFCCE-BJDJZHNGSA-N Ile-Leu-Ser Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N GVKKVHNRTUFCCE-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 1
- KTNGVMMGIQWIDV-OSUNSFLBSA-N Ile-Pro-Thr Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O KTNGVMMGIQWIDV-OSUNSFLBSA-N 0.000 description 1
- WXLYNEHOGRYNFU-URLPEUOOSA-N Ile-Thr-Phe Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O)N WXLYNEHOGRYNFU-URLPEUOOSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- RCFDOSNHHZGBOY-UHFFFAOYSA-N L-isoleucyl-L-alanine Natural products CCC(C)C(N)C(=O)NC(C)C(O)=O RCFDOSNHHZGBOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KFKWRHQBZQICHA-STQMWFEESA-N L-leucyl-L-phenylalanine Natural products CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 KFKWRHQBZQICHA-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- 241000880493 Leptailurus serval Species 0.000 description 1
- QUAAUWNLWMLERT-IHRRRGAJSA-N Leu-Arg-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O QUAAUWNLWMLERT-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- JQSXWJXBASFONF-KKUMJFAQSA-N Leu-Asp-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O JQSXWJXBASFONF-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- WIDZHJTYKYBLSR-DCAQKATOSA-N Leu-Glu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O WIDZHJTYKYBLSR-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- KGCLIYGPQXUNLO-IUCAKERBSA-N Leu-Gly-Glu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O KGCLIYGPQXUNLO-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- YOKVEHGYYQEQOP-QWRGUYRKSA-N Leu-Leu-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O YOKVEHGYYQEQOP-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- OTXBNHIUIHNGAO-UWVGGRQHSA-N Leu-Lys Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN OTXBNHIUIHNGAO-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- OVZLLFONXILPDZ-VOAKCMCISA-N Leu-Lys-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O OVZLLFONXILPDZ-VOAKCMCISA-N 0.000 description 1
- JIHDFWWRYHSAQB-GUBZILKMSA-N Leu-Ser-Glu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O JIHDFWWRYHSAQB-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- BRTVHXHCUSXYRI-CIUDSAMLSA-N Leu-Ser-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O BRTVHXHCUSXYRI-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- ZDJQVSIPFLMNOX-RHYQMDGZSA-N Leu-Thr-Arg Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N ZDJQVSIPFLMNOX-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- WSXTWLJHTLRFLW-SRVKXCTJSA-N Lys-Ala-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O WSXTWLJHTLRFLW-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- NQCJGQHHYZNUDK-DCAQKATOSA-N Lys-Arg-Ser Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O)CCCN=C(N)N NQCJGQHHYZNUDK-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- WLCYCADOWRMSAJ-CIUDSAMLSA-N Lys-Asn-Cys Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O WLCYCADOWRMSAJ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- WGLAORUKDGRINI-WDCWCFNPSA-N Lys-Glu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O WGLAORUKDGRINI-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 1
- NKKFVJRLCCUJNA-QWRGUYRKSA-N Lys-Gly-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN NKKFVJRLCCUJNA-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- WRODMZBHNNPRLN-SRVKXCTJSA-N Lys-Leu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O WRODMZBHNNPRLN-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- BDFHWFUAQLIMJO-KXNHARMFSA-N Lys-Thr-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N)O BDFHWFUAQLIMJO-KXNHARMFSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- HGAJNEWOUHDUMZ-SRVKXCTJSA-N Met-Leu-Glu Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O HGAJNEWOUHDUMZ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 108010086093 Mung Bean Nuclease Proteins 0.000 description 1
- SITLTJHOQZFJGG-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-valine Natural products CC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O SITLTJHOQZFJGG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 description 1
- PLNHHOXNVSYKOB-JYJNAYRXSA-N Phe-Arg-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC1=CC=CC=C1)N PLNHHOXNVSYKOB-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- IUVYJBMTHARMIP-PCBIJLKTSA-N Phe-Asp-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O IUVYJBMTHARMIP-PCBIJLKTSA-N 0.000 description 1
- RIYZXJVARWJLKS-KKUMJFAQSA-N Phe-Asp-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 RIYZXJVARWJLKS-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- KNPVDQMEHSCAGX-UWVGGRQHSA-N Phe-Cys Chemical compound SC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 KNPVDQMEHSCAGX-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- ALHULIGNEXGFRM-QWRGUYRKSA-N Phe-Cys-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 ALHULIGNEXGFRM-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- QEPZQAPZKIPVDV-KKUMJFAQSA-N Phe-Cys-His Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC2=CN=CN2)C(=O)O)N QEPZQAPZKIPVDV-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- FIRWJEJVFFGXSH-RYUDHWBXSA-N Phe-Glu-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 FIRWJEJVFFGXSH-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- KDYPMIZMXDECSU-JYJNAYRXSA-N Phe-Leu-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 KDYPMIZMXDECSU-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- MMPBPRXOFJNCCN-ZEWNOJEFSA-N Phe-Tyr-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O MMPBPRXOFJNCCN-ZEWNOJEFSA-N 0.000 description 1
- FRKBNXCFJBPJOL-GUBZILKMSA-N Pro-Glu-Glu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O FRKBNXCFJBPJOL-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- KLSOMAFWRISSNI-OSUNSFLBSA-N Pro-Ile-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 KLSOMAFWRISSNI-OSUNSFLBSA-N 0.000 description 1
- XYSXOCIWCPFOCG-IHRRRGAJSA-N Pro-Leu-Leu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O XYSXOCIWCPFOCG-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- 102100027378 Prothrombin Human genes 0.000 description 1
- 102000002085 Prothrombin/thrombin Human genes 0.000 description 1
- 108050009405 Prothrombin/thrombin Proteins 0.000 description 1
- 101710130181 Protochlorophyllide reductase A, chloroplastic Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- BYIROAKULFFTEK-CIUDSAMLSA-N Ser-Asp-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO BYIROAKULFFTEK-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- KMWFXJCGRXBQAC-CIUDSAMLSA-N Ser-Cys-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CO)N KMWFXJCGRXBQAC-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- FYUIFUJFNCLUIX-XVYDVKMFSA-N Ser-His-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O FYUIFUJFNCLUIX-XVYDVKMFSA-N 0.000 description 1
- NFDYGNFETJVMSE-BQBZGAKWSA-N Ser-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO NFDYGNFETJVMSE-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- FUMGHWDRRFCKEP-CIUDSAMLSA-N Ser-Leu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O FUMGHWDRRFCKEP-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- KZPRPBLHYMZIMH-MXAVVETBSA-N Ser-Phe-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O KZPRPBLHYMZIMH-MXAVVETBSA-N 0.000 description 1
- XQAPEISNMXNKGE-FXQIFTODSA-N Ser-Pro-Cys Chemical compound C1C[C@H](N(C1)C(=O)[C@H](CO)N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O XQAPEISNMXNKGE-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- VFWQQZMRKFOGLE-ZLUOBGJFSA-N Ser-Ser-Cys Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N)O VFWQQZMRKFOGLE-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- BMKNXTJLHFIAAH-CIUDSAMLSA-N Ser-Ser-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O BMKNXTJLHFIAAH-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- ILZAUMFXKSIUEF-SRVKXCTJSA-N Ser-Ser-Phe Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 ILZAUMFXKSIUEF-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- XQJCEKXQUJQNNK-ZLUOBGJFSA-N Ser-Ser-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O XQJCEKXQUJQNNK-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- 108090000787 Subtilisin Proteins 0.000 description 1
- MQBTXMPQNCGSSZ-OSUNSFLBSA-N Thr-Arg-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)O)CCCN=C(N)N MQBTXMPQNCGSSZ-OSUNSFLBSA-N 0.000 description 1
- MMTOHPRBJKEZHT-BWBBJGPYSA-N Thr-Cys-Ser Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O MMTOHPRBJKEZHT-BWBBJGPYSA-N 0.000 description 1
- UZJDBCHMIQXLOQ-HEIBUPTGSA-N Thr-Cys-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)O)N)O UZJDBCHMIQXLOQ-HEIBUPTGSA-N 0.000 description 1
- MSIYNSBKKVMGFO-BHNWBGBOSA-N Thr-Gly-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)NCC(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N)O MSIYNSBKKVMGFO-BHNWBGBOSA-N 0.000 description 1
- XVHAUVJXBFGUPC-RPTUDFQQSA-N Thr-Tyr-Phe Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O XVHAUVJXBFGUPC-RPTUDFQQSA-N 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- HLDFBNPSURDYEN-VHWLVUOQSA-N Trp-Ile-Asp Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)N HLDFBNPSURDYEN-VHWLVUOQSA-N 0.000 description 1
- MNMYOSZWCKYEDI-JRQIVUDYSA-N Tyr-Asp-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O MNMYOSZWCKYEDI-JRQIVUDYSA-N 0.000 description 1
- 108010064997 VPY tripeptide Proteins 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- ZLFHAAGHGQBQQN-GUBZILKMSA-N Val-Ala-Pro Natural products CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O ZLFHAAGHGQBQQN-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- XQVRMLRMTAGSFJ-QXEWZRGKSA-N Val-Asp-Arg Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)N XQVRMLRMTAGSFJ-QXEWZRGKSA-N 0.000 description 1
- UEHRGZCNLSWGHK-DLOVCJGASA-N Val-Glu-Val Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O UEHRGZCNLSWGHK-DLOVCJGASA-N 0.000 description 1
- SDUBQHUJJWQTEU-XUXIUFHCSA-N Val-Ile-Lys Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N SDUBQHUJJWQTEU-XUXIUFHCSA-N 0.000 description 1
- OTJMMKPMLUNTQT-AVGNSLFASA-N Val-Leu-Arg Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N OTJMMKPMLUNTQT-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- QWCZXKIFPWPQHR-JYJNAYRXSA-N Val-Pro-Tyr Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 QWCZXKIFPWPQHR-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- JQTYTBPCSOAZHI-FXQIFTODSA-N Val-Ser-Cys Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N JQTYTBPCSOAZHI-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 108091005605 Vitamin K-dependent proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010016200 Zinc Finger Protein GLI1 Proteins 0.000 description 1
- 108010005233 alanylglutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010047495 alanylglycine Proteins 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- INJRKJPEYSAMPD-UHFFFAOYSA-N aluminum;silicic acid;hydrate Chemical compound O.[Al].[Al].O[Si](O)(O)O INJRKJPEYSAMPD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003024 amidolytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 108010013835 arginine glutamate Proteins 0.000 description 1
- 108010068380 arginylarginine Proteins 0.000 description 1
- 108010047857 aspartylglycine Proteins 0.000 description 1
- 108010092854 aspartyllysine Proteins 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 230000021523 carboxylation Effects 0.000 description 1
- 238000006473 carboxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 1
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 1
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 1
- 239000000701 coagulant Substances 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 108010016616 cysteinylglycine Proteins 0.000 description 1
- 108010060199 cysteinylproline Proteins 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 1
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 1
- 230000003480 fibrinolytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004992 fission Effects 0.000 description 1
- 238000002825 functional assay Methods 0.000 description 1
- 230000006251 gamma-carboxylation Effects 0.000 description 1
- 108010006664 gamma-glutamyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000000762 glandular Effects 0.000 description 1
- XKUKSGPZAADMRA-UHFFFAOYSA-N glycyl-glycyl-glycine Natural products NCC(=O)NCC(=O)NCC(O)=O XKUKSGPZAADMRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010087823 glycyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 230000023597 hemostasis Effects 0.000 description 1
- 239000008241 heterogeneous mixture Substances 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010044056 leucyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000012153 long-term therapy Methods 0.000 description 1
- 108010003700 lysyl aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010045397 lysyl-tyrosyl-lysine Proteins 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- COCAUCFPFHUGAA-MGNBDDOMSA-N n-[3-[(1s,7s)-5-amino-4-thia-6-azabicyclo[5.1.0]oct-5-en-7-yl]-4-fluorophenyl]-5-chloropyridine-2-carboxamide Chemical compound C=1C=C(F)C([C@@]23N=C(SCC[C@@H]2C3)N)=CC=1NC(=O)C1=CC=C(Cl)C=N1 COCAUCFPFHUGAA-MGNBDDOMSA-N 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- XULSCZPZVQIMFM-IPZQJPLYSA-N odevixibat Chemical compound C12=CC(SC)=C(OCC(=O)N[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC)C(O)=O)C=3C=CC(O)=CC=3)C=C2S(=O)(=O)NC(CCCC)(CCCC)CN1C1=CC=CC=C1 XULSCZPZVQIMFM-IPZQJPLYSA-N 0.000 description 1
- 238000011369 optimal treatment Methods 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 108010018625 phenylalanylarginine Proteins 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000003805 procoagulant Substances 0.000 description 1
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 108010079317 prolyl-tyrosine Proteins 0.000 description 1
- 108010015796 prolylisoleucine Proteins 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 229940039716 prothrombin Drugs 0.000 description 1
- 229940024790 prothrombin complex concentrate Drugs 0.000 description 1
- 108010012557 prothrombin complex concentrates Proteins 0.000 description 1
- 238000011403 purification operation Methods 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 108010048818 seryl-histidine Proteins 0.000 description 1
- 239000003998 snake venom Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 108010031491 threonyl-lysyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 108010087967 type I signal peptidase Proteins 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 239000002821 viper venom Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6432—Coagulation factor Xa (3.4.21.6)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21006—Coagulation factor Xa (3.4.21.6)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
τ—π τ
? 1/ \v5 h -1.¾ aUDr. au. -»* <|gO oo PRAH·· 2, Há!UQ«aí
J
Analogy faktoru X s modifikovanými štěpnými místy proteas, preparáty tyto látky obsahující, jejich použití a způsob jejich výroby
Oblast techniky
Vynález se týká analogů faktoru X s modifikací v oblasti aktivačního peptidu, preparátů obsahujících analogy faktoru X podle vynálezu a rovněž způsobu přípravy jednořetězcových a dvouřetězcových analogů faktoru X .
Dosavadní stav techniky
Po inicializaci procesu srážení krve probíhá srážecí kaskáda postupnou aktivací různých proenzymů (zymogenů), které jsou přítomny v krvi v aktivní formě serinproteas. K nim patří mimo jiné faktor XII/XIIa, faktor Xl/XIa, faktor IX/IXa, faktor X/Xa, faktor VII/Vila a prothrombin/throm-bin. Většina těchto enzymů je ve svém fyziologickém stavu aktivní pouze tehdy, jsou-li tyto enzymy asociovány v komplexu na membránovém povrchu. Řady těchto procesů se účastní i Ca-ionty. Srážení krve probíhá buď vnitřní dráhou, při níž j sou všechny proteinové komponenty v krvi obsaženy, nebo vnější dráhou, při níž má rozhodující úlohu tkáňový faktor / buněčných membrán. K uzavření rány nakonec dojde rozštěpením fibrinogenu na fibrin působením thrombinu.
Aktivaci prothrombinu na thrombin způsobuje prothrom-binasový komplex. Thrombin je důležitý enzym, který může působit jako prokoagulant i jako antikoagulant. Prothrombi- - 2 /1 Λ • · 3· : • · ··· . · ·· • · · nasový komplex, v němž se uplatňují mimo jiné faktor Va (jako kofaktor) a faktor Xa (jako serinproteasa), spouští asociaci,, která je závislá na přítomnosti Ca na povrchu fosfolipidů. Uvádí se, že faktor Xa při tom působí jako katalytická komponenta prothrombinasového komplexu.
Faktor X (Stuart-Prowerův faktor) je koagulační glyko-prótein závislý na vitaminu K, který je možno aktivovat vnitřní nebo vnější dráhou kaskády srážení krve. Primární produkt translace faktorp X (pre-pro-FX) obsahuje 488 aminokyselin a je syntetizován v játrech nebo lidskými jaterními buňkami nejprve jako 75 kD prekurzorový protein s jedním řetězcem. V plazmě se faktor X vyskytuje převážně ve formě molekuly se dvěma řetězci (Fair a spol., 1984,
Blood 64:194-204). V průběhu biosyntézy dojde po odštěpení pre-sekvence působením signálpeptidasy'(mezi Sér23/Leu24) a propeptidu (mezi Arg40/Ala41) u molekuly faktoru X s jedním řetězcem po přeměně a odstranění tripeptidu Argl80-Lysl81-Argl82 k přechodu na formu se dvěma řetězci, skládající se z 'cca 22 kD lehkého řetězce a cca 50 kD těžkého řetězce, které jsou navzájem spojeny disulfidickým můstkem a k rozštěpení této molekuly (Obr.l). Faktor X proto cirkuluje v plazmě jako molekula se dvěma řetězci. Při procesu srážení krve se faktor X konvertuje z inaktivního zymogenu na aktivní proteasový faktor Xa působením limitované proteolysy, přičemž aktivace faktoru X na faktor Xa může probíhat v jednom ze dvou komplexů vázaných na membránu: ve vnějším komplexu faktor Vlla/tkáňový faktor nebo ve vnitřním komplexu faktor VlIIa-faktor IXa-fosfolipid-Ca, tzv. "tenasovém komplexu" /
(Mertens a spol., 1980, Biochem. J. 185:647-658). Proteolytické štěpení mezi aminokyselinami Arg234/IIe235 vede k uvolnění aktivačního peptidu o délce 52 aminokyselin z N-konce těžkého řetězce a tím ke tvorbě aktivního enzymu, faktoru Xa. Katalytické centrum faktoru Xa je umístěno v těžkém řetězci. f
Aktivace prostřednictvím vnějšího komplexu faktor VIIa-TF vede ke tvorbě faktoru Xaa (35 kD) a faktoru Xa0 K‘ (31 kD), přičemž vedle nepatrných koncentrací faktoru Vila v komplexu se vyskytuje i polypěptid 42 (kD). Při tvorbě faktoru Xaa dochází ke štěpeni u Arg234/IIe235 v těžkém řetězci, což znamená aktivaci faktoru X na faktor Xa. Výskyt faktoru Xap je zřejmě způsoben autokatalytickým štěpením u Arg469/Gly470 u C-konce těžkého řetězce faktoru Xaa a odštěpením 4,5 kD-peptidu. Faktor Xap vykazuje stejně jako faktor Xaa katalytickou aktivitu. Bylo však prokázáno, že štěpením faktoru Xaa na faktor Xap vzniká plasminogeii-vazné místo a že faktor Xaβ vykazuje případně fibrinolytickou aktivitu, respektive že se podílí na fibrinolýze jako kofaktor. Přeměna faktoru Xaa na faktor Xap je však pomalejší než tvorba thrombinu, což zabraňuje iniciaci fibri-nolysy před vytvořením krevní sraženiny (Pryzdial a spol., 1996, J.Biol.Chem. 271:16614-16620; Pryzdial a spol., 1996, J.Biol.Chem. 271:16621-16626). r f Při přeměně na C-konci těžkého řetězce mezi > Arg469/Gly470 bez předchozí úpravy mezi Arg234/IIe235 vzniká 42 kD-polypeptid. Tento meziprodukt nevykazuje žádnou katalytickou aktivitu stejně jako fragment faktoru Xat, který vzniká proteolysou u Lys370 (Mertens a spol., 1980, J.Biol. Chem. 185:647-658; Pryzdial a spol., 1996, J.Biol.Chem. 271:16614-16620).
\ I > > • ♦ ♦ · . ♦* ψ · - 4 f ň '· · '4 4 ··
Aktivace faktoru X vnitřní dráhou je katalyzována komplexem faktor IXa-faktor Vlila. Při této aktivaci se získají stejné reakční'produkty, faktor XafJ se však získá ve vyšším množství než ostatní procesní produkty faktoru X (Jesty a spol., 1074, J.Biol.Chem. 249:5614).
In vitro je možno faktor X aktivovat například působením Russelova Viper Venomu (RVV) nebo působením trypsinu (Bajaj a spol., 1073, J.Biol.Chem. 248:7729-7741) nebo pomocí čištěných fyziologických aktivátorů, jako jsou komplex FVIIa/TF nebo komplex faktor IXa/faktor Vlila (Mertens a spol., 1980, J.Biol.Chem. 185:647-658).
Komerčně dostupné produkty faktoru X z plazmy obsahuj i většinou směs faktoru Xaa a faktoru Xa£, přičemž po aktivaci faktoru X na faktor Xa vzniká především faktor Xaa, který se při autokatalytickém procesu opět štěpí na faktor Xap.. Aby bylo možno získat jednotný produkt faktoru Xa s vyšší molekulární integritou, byla v patentu· EP 0 651 054 navržená aktivace faktoru X působením RW po delší dobu tak, aby vzniklý konečný produkt obsahoval v podstatě pouze faktor Xaβ. Jak vedlejší produkty, a to například faktor Xaa , tak také proteázy, byly nakonec odstraněny několikanásobnou chromatografií.
Byla provedena izolace a charakterizace cDNA faktoru X (Leytus a spol., 1984, Proč.Nati.Acad,.Sci., USA, 82: 3699-3702; Fung a spol., 1985, Proč.Nati.Acad,.Sci., USA, 82:3591-3595). Lidský faktor X byl exprimován in vitro v různých typech buněk, jako např. v lidských embryonálních ledvinových buňkách nebo v CHO-buňkách (Rudolph a spol., 1997, Prot.Expr.Purif.10: 373-378, Volf a spol., 1991, « · 9 5 • * <*
*· * '·· » c · ··· J.Biol.Chem. 266:13726-13730). Bylo však zjištěno, že při rekombinačni expresi lidského faktoru X byla úprava na pozici Arg40/Ala41 na rozdíl od provedení in vivo neúčinná a že vznikaly různé N-konce na lehkém řetězci faktoru X (Volf a spol., 1991, J.Biol.Chem 266:13726-13730). Rekombi-novaný faktor X (rFX) byl pomocí RW aktivován in vitro na rfaktor Xa (rFXa) nebo byl rFXa přímo exprimován, přičemž byl aktivační peptid deletován v oblasti aminokyseliny 183 až aminokyseliny 234 a nahrazen tripeptidem, aby bylo možno provést přeměnu bezprostředně v rFXa-formě s dvojitým řetězcem. Vyčištěný rFX byl přeměněn asi ze 70 % na lehký a těžký řetězec, zatímco zbývajících 30 % tvořil rFX s jedním řetězcem se 75 kD. Přímá exprese rFXa sice vedla ke tvorbě aktivního faktoru Xa, avšak zároveň vznikaly i inak-tivní intermediáty. Volf a spol. (1991, J.Biol.Chem. 266: 13726-13730) zjistili kromě toho i sníženou aktivitu rekom-binovaného faktoru X, která byla způsobena horší aktivova-telností rFX působením RW a rovněž populací ináktivních proteinů a polypeptidů z molekul prekurzorů s jedním řetězcem. Tito autoři zjistili zejména vysokou nestabilitu rFXa při expresi rekombinovanými buňkami, což vysvětlují vysokou rychlostí autoproteolýzy.
Aby bylo možno sledovat funkci C-terminálních polypeptidů faktoru Xaa, zavedli Eby a spol. (1992, Blood 80 (Suppl.1):1214A) stop-kodon do sekvence faktoru X na pozici Gly430. Nezjistili však žádný rozdíl mezi rychlostí aktivace faktoru Xa (FXaa) s β-peptidem nebo delečního mutantu bez β-peptidu (FXaβ).
Faktor Xa je důležitou součástí prothrombinasového komplexu a proto se může použít pro léčbu pacientů s poruchami srážení krve, jako například při výskytu hemofilie.
t* • ·· ·· • é • · • · f · • « « · • • í • • 9 · '· · · · • • • · ··· ·· · • · · ·» ··
Zejména léčba hemofiliků s deficitem faktoru VIII nebo faktoru IX,, prováděná koncentráty faktorů vyrobených z plazmy by mohla být při dlouhodobné terapii komplikována tvorbou inhibujícich protilátek proti těmto faktorům. Proto byla pro léčbu pacientů trpících hemofilií vyvinuta řada alternativ s použitím faktorů s bypassovou aktivitou. Bylo f navrženo použití koncentrátu prothrombinového komplexu, částečně aktivovaného prothrombinasového komplexu (APPC), faktoru Vila nebo FEIBA. Komerčními preparáty s faktor VIII-bypassovou aktivitou (FEIBA) jsou například FEIBA nebo Autoplex. Preparát FEIBA obsahuje přibližně stejné jednotky faktoru II, faktoru VII, faktoru IX, faktoru X a FEIBA, nepatrná množství faktoru VIII a faktoru V, a dále stopová množství aktivovaných koagulačnich faktorů jako jsou thrombin a faktor Xa resp. faktor s aktivitou odpovídající faktoru X (Elsinger, 1982, Activated Prothrombin Complex Concentrates. Ed.Maruiani, Ruso, Mandelli, str. 77-87). Elsinger poukazuje zejména na význam aktivity FEIBA, která je podobná aktivitě faktoru Xa. Bypassová aktivita faktoru VIII byla prokázána Gilesem a spol. (1988, British J.Haema- tology 9:491-497) u kombinace čištěného faktoru Xa a fosfo-lipidů v modelu na zvířatech. V řadě aplikačních oblastí je proto velká potřeba faktoru X/Xa nebo proteinů podobných faktoru X/Xa buď samotných, nebo jako součást koagulačnich komplexů pro zastavení krvácení.
Doba poločasu účinnosti (Halbwertszeit) faktoru Xa je v porovnání se zymogenem jak v prostředí in vivo, tak i in vitro silně snížena. Tak např. je možno faktor X v glycero-lu přechovávat po dobu 18 měsíců ve stabilním stavu, zatímco 4 · • · 4 * » 4 4 *
i 4 4 · - 7 • · · · * · 4 4 44 ·· faktor Xa je za stejných podmínek stálý pouze 5 měsíců (Bajaj a spol., 1973, J.Biol.Chem 248:7729-2241) resp. v glycerolu při 4 dojde po 8 měsících ke snížení aktivity o více než 60 % (Teng a spol. , 1981, Thrombosis. Res. 22: 213-220). Doba poločasu účinnosti faktoru Xa v séru je pouze 30 sekund. v
Vzhledem k nestálosti faktoru Xa bylo navrženo podávání preparátů obsahujících faktor X (US 4,501,731). Při krváceních ohrožujících život, zejména u hemofiliků, je však podávání faktoru X neúčinné, poněvadž při nedostatku účinného "tenasového komplexu" při vnitřním srážení krve nedojde k dostatečné aktivaci faktoru X na faktor Xa a aktivace přes vnější dráhu probíhá často příliš pomalu, takže nelze dosáhnout rychlého působení. Kromě toho hemofilici mají dostatek faktoru X, ten však vykazuje ve srovnání s faktorem Xa tisíckrát menší prothrombinasovou aktivitu. V těchto případech je žádoucí podávat aktivovaný faktor Xa přímo, případně v kombinaci s fosfolipidy, jak uvedli Giles a spol. (1988, British.J.Haematology 9:491-497) nebo s jinými koagulačními činidly, případně s činidly s faktor VlII-bypassovou aktivitou . ' Při přípravě faktoru Xa z faktoru X se aktivace doposud provádí převážně nefyziologickými aktivátory živočišného původu, jako jsou RW nebo trypsin, přičemž však musí být absolutně zajištěno, aby konečný produkt neobsahoval žádnou z těchto proteas. Jak bylo uvedeno již dříve, vzniká při aktivaci faktoru X na faktor Xa řada intermediátů, z nichž některé jsou inaktivní (Bajaj a spol., 1973, J.Biol.Chem 248:7729-2241; Mertens a spol., 1980, J.Biol.Chem. 185: 647-658). Přítomnost těchto intermediátů způsobuje snížení specifické aktivity tohoto produktu, některé intermediáty mohou dokonce na aktivní serinproteasy působit antagonisticky. Příprava jednotného čistého produktu s vysokou specifickou aktivitou proto při použití běžných metod vyžaduje nákladné postupy aktivace a zdlouhavé chromáto-grafické čištění.
Podstata vynálezu Úkolem předloženého vynálezu je proto získání takového preparátu, který by obsahoval polypeptid s aktivitou faktoru X/Xa, který by měl vysokou stabilitu, a při jehož získávání by se při aktivaci na faktor Xa nemusely používat běžné proteasy, zejména živočišného původu, jako jsou například RW nebo trypsin. Dalším úkolem je příprava farmaceutického preparátu s faktor VIII-bypassovou aktivitou.
Tento úkol byl podle předloženého vynálezu vyřešen tak, že byl získán analog faktoru X-, který,má modifikaci v oblasti přírodně se vyskytujícího faktor ..Xa,-aktivačního štěpného místa. Modifikace v oblasti aktivačního štěpného místa je nové rozpoznávací resp. reakční místo, které se .dosud v této pozici na polypeptidu přírodně nevyskytovalo, pro působení proteasy, která v tomto místě polypeptid běžně neštěpí.
Analog faktoru X podle předloženého vynálezu vykazuj při tom v aktivačním peptidu, který se odštěpuje při aktiva ci faktoru X na faktor Xa, modifikaci. Tato modifikace se při tom týká alespoň jedné aminokyseliny uvnitř aminokyselinové sekvence aktivačního peptidu faktoru X . Modifikace je při tom obzvláště v C-terminálni oblasti aktivačního peptidu a představuje alespoň jednu výměnu alespoň jedné aminokyseliny mezi pozicemi Gly228 a Arg234 v aminokyseli- 9 9 ·· · ♦· Μ • · · · • · · · * · # · · · 4 m ·· ·· t nové sekvenci faktoru X. Pozice jednotlivých aminokyselin je při tom vztažena na číslováni podle sekvence uvedené v obr. 1, která začíná Metl a končí Lys488.
Tato modifikace v analogu faktoru X podle předloženého vynálezu spočívá výhodně ve výměně na tomto místě se vyskytujiécího faktor Vila- , popřípadě faktor IXa-reakční-ho místa za alternativní štěpné místo jiné proteasy. Tato modifikace může při tom představovat substituci alespoň jedné aminokyseliny nebo v jedné inzerci peptidové sekvence obsahující specifické rozpoznávací místo pro proteasy, resp. specifické místo štěpení. Tato modifikace v analogu faktoru X podle předloženého vynálezu je přitom přednostně taková, že rozpoznávací místo pro proteasy, resp. místo štěpení představuje proteasa ze skupiny endoproteas, jako jsou kexin/Kex2, furin/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE4, LPC/PC7 (jak uvádějí Barr a spol. 1991, Cell 66:1-3 nebo v US patentu US 5,460,950), ze skupiny serinproteas, jako jsou faktor Ha, faktor Vila, faktor IXa, faktor XIIa, faktor Xla, faktor X nebo kallikrein, nebo deriváty uvedených pro-teas.
Tato modifikace se volí přednostně tak, aby se působením jedné z těchto proteas se získal polypeptid, odpovídající nativnímu faktoru Xa , který by se podobal sekvenci přírodně se vyskytujícího faktoru Xa a jehož aktivita by byla stejná jako aktivita faktoru Xa.
Pro dosažení optimální úpravy může být v některých případech nezbytné vyměnit navíc aminokyselinu IIe235. NH2-"term:‘-I1^^-n^ aminokyselina isoleucin na těžkém řetězci by měla však být výhodně po aktivaci zachována, poněvadž tato aminokyselina má významnou funkci při tvorbě míst pro vázání *} 10 *} 10 , · ·
* • • é ·· • f • · • · · ' · 9 • · · • • • ·· • • ·· · ·» ·· substrátu (Vatzke a spol., 1995, Molecular Basis of Thrombosis and Hemostasis, ed. Katherine High. and Harold Roberts). Analogy faktoru X podle předloženého vynálezu vykazuj í v porovnání s nativní sekvencí faktoru X strukturální rozdíl zej’ména ve složení aminokyselin, mají však srovnatelnou aktivovatelnost jako přírodně se vyskytující P faktor X , popřípadě aktivitu faktoru Xa po aktivaci. í* V tomto vynálezu jsou uvedeny příklady řady analogů <%, - faktoru X , které vykazují modifikaci v aktivačním peptidu ve vztahu k přírodně se vyskytující sekvenci faktoru X a změněnou proteasovou specifitu.
Modifikace mohou být provedeny na jednom nebo několika místech v oblasti mezi aminokyselinami Gly228 a Arg234, případně IIe235, vztaženo na sekvenci faktoru X s číslováním Metl až Lys488 podle obr.1. Substituce aminokyselin mohou být provedeny v místě IIe235 (Rl), Arg234, Thr233 (R2), Leu232 (R3), Asn231 (R4), Asn230 (R5) a Asp229 (R6), přičemž však přednostně zůstává Arg239 nezměněn.
Analogy faktoru X podle předloženého vynálezu obsahuj i přednostně sekvenci faktoru X
Gly228-R6-R5-R4-R3-R2-Arg234-Rl, kde Rl = Ile, Val, Ala, Ser nebo Thr, R2 = Thr, Pro, Gly, Lys nebo Arg; R3 = Leu, Phe,
Lys, Glu, Met, Gin, Ser, Val, Arg nebo Pro; R4 = Asn, Asp,
Ile, Ser, Met, Pro, Thr, Arg nebo Lys; R5 = Asn, Lys, Ser,
Glu, Glii, Ala, His nebo Arg a R6 = Arg, Asp, Phe, Thr, Leu nebo Ser. Výhodné formy provedení analogů faktoru X podle předloženého vynálezu jsou analogy faktoru X s modifikací
9 9 9 9 • 9 9 9 9 9 · 9 9 9 9 9 99 99 a) R1 = Val, R2 = Thr, R3 = Phe, R4 = Asp, R5 = Asn a popřípadě R6 = Phe (obr. 2A) a upravené faktorem Xla ; b) R1 = Ser, R2 = Arg, R3 = Thr, R4 = Leu (obr.2B) a upra vené faktorem Ha; c) R1 = Ile, R2 = Pro, R3 = Lys, R4 = Ile a případně R5 = Lys a/anebo R6=Thr (obr. 2C) nebo R1 = Ile, R2 = Thr, R3 = Ser, R4 = Thr a případně R5 = Lys a/anebo R6 = Thr (Obr.21) a upravené faktorem Xlla; d) R1 = Ile, R2 = Thr, R3 = Met, R4 = Ser a případně R5 = Ser a/anebo R6 = Leu (Obr. 2D) a upravené kallikre-inem; e) R1 = Ile, R2 = Gly, R3 = Gin, R4 = Pro a případně R5 = Lys a/anebo R6 = Ser (Obr . 2H) nebo R1 = Ile, R2 = Thr, R3 = Lys a R4 = Met (Obr. 2E) nebo R1 = Ile, R2 = Gly, R3 = Glu a R4 = Ile (Obr. 2F) a upravené faktorem Xa; f) R1 = Ile, R2 = Lys, R3 = Arg, R4 = Arg a případně R5 = Glu, a/anebo R6 = Leu nebo R1 = Ile, R2 = Thr, R3 = Val, R4 = Arg a případně R5 = Ala a/anebo R6 = Leu nebo R1 = Ile, R2 = Arg, R3 = Val, R4 = Arg a případně R5 =Gln, a /anebo R6 = Leu nebo R1 = Ile, R2 = Arg, R3 = Arg, R4 = Arg a případně R5 = His a/anebo R6 = Leu nebo R1 = Ile, R2 = Lys, R3 = Pro, R4 = Arg a případně R5 = Asn a/anebo R6 = Leu nebo R1 = Ile, R2 = Lys, R3 = Arg, R4 = Ile a případně «4 • Φ · · ·· ♦· - 12 - R5 = Arg a/anebo R6 = Leu nebo R1 = Ile, R2 = Lys, R3 = Ser a R4 = Arg nebo ' R1 = Ile, R2 = Thr, R3 = Val a R4 = Arg nebo
Rl=1I e JR2 = LysR3 = Leu a R4 = Arg (viz‘ obr v 2G) ,. přičemž sekvence uvedené pod f) jsou upravovány bibázickými endoproteasarai, jako jsou furin, PÁCE, kexin/Kex2, furin/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE4, LPC/PC7 nebo derivátem těchto proteas.
Možný výběr modifikaci a zaměň aminokyselin, které vedou ke změněné proteasové specifitě, je uveden na obr. 2.
Tyto modifikace mohou při tom být prováděny například řízenou mutagenesí in vitro nebo PCR nebo jinými genově-technickými metodami podle současného stavu techniky, které jsou vhodné pro provádění specifických změn DNA-sekvence pro dosažení požadované výměny aminokyselin.
Aktivace analogů faktoru X podle předloženého vynálezu na nativní faktor Xa, popřípadě na analog faktoru Xa, se provádí podle tohoto vynálezu výhodně proteasou ze skupiny endoproteas, jako jsou kexin/Kex2, furin/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE4, LPC/PC7, ze skupiny serinproteas, jako jsou faktor Xlla, faktor Xla, faktor Xa, faktor Ha nebo kalli-krein, nebo derivátů těchto proteas.
Jedním z problémů při přípravě aktivního faktoru Xa je nestabilita tohoto faktoru, poněvadž při autokatalýze vznikají kromě faktoru Xaa a faktoru Xap i jiné neaktivní inter-mediáty. 13 ·:· ♦ ♦ ·4 \m 4 49 · # ·· · 4 0 9 .9 4 4 4 · 9 4 % 4 4 é 9 9 4 '90 .04 9 ··· ·#· 94 99 Φ 9 9 $ 9 9 009 99 4 9 4 9 4 44
Pro přípravu v podstatě intaktních molekul aktivního faktoru X/Xa, popřípadě molekul podobných aktivnímu faktoru X/Xa , je proto žádoucí získávat pouze takové proteiny, které by vedly ke stabilním.konečným produktům.
Je známo, že výhodné místo štěpení pro přeměnu faktoru Xaa (FXaa) na faktor Xa£ (FXaP) je mezi Arg469/Gly470. Na základě zkoumání Ebyho a spol. (1992, Blood, Vol. 80,
Suppl·. 1;—1214) byl kromě prominentního^karboxyterminálního peptidu (aminokyselinové.zbytky. 476 - 487) faktoru X nalezen i další kratší peptid (aminokyselinově zbytky 464 až 477), který vzniká autokatalýzou z faktoru Xaa. Aby bylo možno provést požadovanou úpravu intaktního faktoru X na v podstatě aktivní faktor Xa bez vzniku inaktivních procesních intermediátů při této úpravě, vykazují analogy faktoru X podle předloženého vynálezu popřípadě další modifikace.
Analogy faktoru X podle předloženého vynálezu se' tedy vyznačují tím, že vykazují ve zvláštní formě svého provedení i další modifikaci v C-koncové části aminokyselinové sekvence faktoru X.
Jedna z forem provedení se vyznačuje tím, že analog faktoru X výše popsaného druhu je intaktní β-peptid (FXa). Analogy faktoru X podle předloženého vynálezu mají při tom provedenou modifikaci zejména v oblasti C-koncového β-peptidického místa štěpení, která zabraňuje, aby po aktivaci faktoru X na analog faktoru Xa došlo k odštěpení β-peptidu z faktoru X. Tak byl získán faktor Xa, který je možno izolovat až ze 100 % ve formě intaktní molekuly faktoru Xaa.
Tuto modifikaci je možno provést mutací, delecí nebo 14 14 '·· ·» ·♦ φ φ ΦΦ ΦΦ ♦· ♦ · · ♦ ΦΦΦ -· · · ·· · · #-· · · Φ φ Φ ·φφ φφφ -φ Φ Φ Φ Φ Φ Φ \φφ· \Φ·ΦΦ ··· ΦΦΦ φφ ΦΦ inzercí v oblasti aminokyselinové sekvence* faktoru X mezi aminokyselinami v místě Arg469 a Ser476 a případně Lys370. Preferována je,však taková substituce aminokyselin, při které se zabrání tomu, aby při .výměně aminokyselin nedošlo ke změně prostorového uspořádání polypeptidu, což by mohlo dále -vést ke změně struktury a případně i funkce á aktivity -daného«proteinu.
Jeden způsob provedení se vyznačuje tím, že u analogů faktoru X podle předloženého vynálezu je provedena záměna jedné aminokyseliny na místě Arg469 a/anebo Gly470, přičemž Arg469 je přednostně zaměňován za Lys, His nebo Ile a Gly470 je přednostně zaměňován za Ser, Ala, Val nebo Thr.
Analogy faktoru X podle předloženého vynálezu mohou obsahovat kromě mutace na pozici Arg469 a/anebo Gly470 další mutaci na pozici Lys370 a/anebo Lys475 a/anebo Ser476.
Substitucí aminokyselin na některé ztěchto pozicí sě zabrání přeměně analogů faktoru Xaa na faktor Xap , popřípadě faktor Xagama, poněvadž přirozeně se vyskytující sekvence přeměny (přeměn) je (jsou) modifikována (-y) tak, že nemůže dojít k případnému autokatalytickému odštěpení karboxyter-minálního peptidu.
Jiný způsob provedení se vyznačuje tím, že je u analogu faktoru X podle tohoto vynálezu provedena delece kar-boxyterminálniho β-peptidu (FXp). Takovýto analog faktoru X je možno připravit tak, že cDNA pro kódování analogu faktoru X se exprimuje v rekombinantním expresním systému, přičemž se klonují pouze ty sekvence, které jsou kódovány pro aminokyseliny Metl až Arg469.
Další forma provedení se vyznačuje tím, že analogy faktoru X podle předloženého vynálezu obsahují translační stop-signál v C-terminální části sekvence faktoru X. Tento translační stop-signál jě přitom přednostně na pozici, která, následuje za C-terminální aminokyselinou vznikající při přirozeném rekačním průběhu. Tento translační stop-signál je proto přednostně na pozici aminokyseliny 470 V sekvenci faktoru X, přičemž koncový Arg469 ve faktoru Χηβ zůstává zachován. Při tom kódující kodon GGC pro aminokyselinu Gly470 nahrazuje TAA, TAG nebo TGA.
Další aspekt předloženého vynálezu se týká analogů faktoru X , které se aktivují působením příslušné proteasy in vitro na nativní faktor Xa , popřípadě analogu faktoru Xa . V závislosti na použitém a aktivovaném analogu faktoru X se získá nativnímu faktoru Xa odpovídající a v podstatě identický polypeptid, popřípadě-polypeptid, který má sice * . ’ V- ' ' aktivitu faktoru Xa , která se Však liší od sekvence přiro- · zeného faktoru Xa , která však neovlivňuje biologickou aktivitu. Při aktivaci analogů faktoru X , které mají modifikaci v oblasti aktivačního peptidu, se získají výhradně polypeptidy, odpovídající nolekule přírodního faktoru Xa.
Jestliže takovýto analog faktoru X zahrnuje případně ještě translační stop-signál v C-koncové části β-peptidu, získají se homologní molekuly faktoru Xaβ. Jestliže se však použije analog faktoru X, tato modifikace (tyto modifikace) β-peptidické sekvence vede (vedou) k tomu, že se β-peptid neodštěpí, takže se získá analog faktoru Xaa s provedenou záměnou aminokyselin na C-konci molekuly.
Analogy faktoru X podle předloženého vynálezu se - 16 - .· ·· • · 1% # · · * • · • · · » r· · · · • · · é · • · ··· ··· ·· «·· ·# vyznačují výhradně takovými modifikacemi·, které mění specificitu při aktivaciavšak aktivitu významně neovlivňují. To znamená, že se získávají' vždy biologicky i funkčně aktivní molekuly faktoru Xa , popřípaěanalogů^faktoru Xa.
Pro aktivaci iň vitro je možno volit proteasu ze skupiny endoproteas, jako jsou kexin/Kex2, furin/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE4, LPC/PC7, ze skupiny serinproteas, jako jsou faktor Xlla, faktor Xla, faktor Xa nebo kalli-krein, nebo derivát těchto proteas. V rámci tohoto vynálezu je .možno použít jakoukoli proteasu s výjimkou RW, trypsinu, faktoru IXa nebo faktoru Vila , která je vhodná pro přeměnu analogů faktoru X na faktor Xa.
Podle další formy provedení podle předloženého vynálezu obsahuje analog faktoru X modifikaci., která dovoluje aktivaci analogu faktoru X na faktor Xa , výhodně nativní faktor Xa , in vivo. "Nativní" faktor Xa znamená v této souvislosti, že aktivovaný faktor Xa , odvozený od analogu X podle předloženého vynálezu, který má odpovídající a homologní sekvenci aminokyselin s nativním faktorem Xa , má aktivitu faktoru Xa . Modifikace je při tom volena tak, aby změna faktoru X na faktor Xa , probíhala pomocí in vivo, tedy v těle se vyskytující proteasou, výhodně protea-sy, vyskytující se v kaskádě srážení krve. Tato proteasa může být zvolena ze skupiny proteas, zahrnuj ící faktror Ha , faktor XIIa , faktor Xla , faktor Xa nebo kallikrein. Analogy faktoru X , které mají vedle modifikace v aktivačním peptidu modifikaci v C-terminální oblasti molekuly faktoru X , se jak je popsáno výše také aktivují in vivo na odpo-vídaj ící analogy faktoru Xa .
Volf a spol. (1991, J. Biol. Chem. 266: 13726-137309) 1 například sice uvádějí, že endopeptidasa jako je Kex2, furin nebo PÁCE se může podílet na tvorbě delečních mutantů faktoru Xa, v žádném případě však tito autoři neuváději údaje o vlivu těchto proteas při přípravě faktoru X. Zrovna tak je v patentu US 5,669,950'popsána rekombinantní příprava PÁCE a použití proteasy pro zlepšenou tvorbu proteinů závislých na vitaminu K. V řadě výčtů jiných krevních faktorů je uveden i faktor X, u tohoto údaje však chybí ověřující data. V rámci tohoto vynálezu bylo poprvé jednoznačně prokázáno, že jednou z proteas nezbytných pro proces zrání faktoru X je bibázická endoproteasa, zejména endogenně se vyskytující furin. V prostředí in vivo zajišťuje tato endoproteasa především štěpení molekuly faktoru X s jedním řetězcem na zralou formu, skládající se z těžkého a lehkého řetězce. V prostředí in vitro zajišťuje tato endoproteasa kromě toho i odštěpení pro-peptidové sekvence faktoru X (příklad 2).
Analogy faktoru X podle předloženého vynálezu, které mají proteasové štěpné místo pro ne-přírodně se v buňce vyskytující proteasu, se selektivní procesní reakcí štěpí pouze v místech, která se štěpí také v nativním faktoru X . Tím se získá rekombinantní molekula faktoru X , která sestává pouze z 22 kD lehkého řetězce a asi 50 kD těžkého řetězce a nemá inaktivní molekuly faktoru X , vyskytuj ící se vlivem nespecifického procesu. Tyto modifikované molekuly faktoru X , stejně jako molekuly nativního faktoru X , se neaktivují intracelulární proteasou na faktor Xa. Aktivují se teprve dodatečně pomocí odpovídajících proteas (výhodně serinových proteas nebo subtilisin-příbuzných proteas) na faktor Xa. " t « • ' *· ,· · * · - 18 - A • * ♦ ♦ • · · + • ·«· • (· · · · • ··· ··
Podle jedné formy provedení se tedy dá k disposici i ·· * * - dvouřetězcový analog faktoru X .
Podle zvláštní formy provedení se připraví analogy faktoru X , které existují přednostně v čištěné formě jako » molekuly s jedním řétězcem. Expresí analogů faktoru X v buňce deficientní pro basickou proteasu, se pro faktor X r získají ve formě molekul s jedním řetězcem. Molekuly faktoru * X s jedním řetězcem se vyznačuj i zejména vysokou stabilitou a integritou molekul. Dosud nebylo možno izolovat molekuly faktoru X s jedním řetězcem v čisté formě, poněvadž’se velmi rychle přeměňuje na dvouřetězcovou formu (Fair a kol., 1984, Blood 64 : 194 až 204) . Rekombinantní analogy faktoru X s jedním řetězcem je možno specifickým postupem přeměnit na dvouřetězcovou formu faktoru X a potom aktivovat na faktor Xa , popřípadě aňalog faktoru Xa-. Tato aktivace může probíhat tak', že dojde ke styku jednořetězcové , r , ♦ rekombinantní molekuly faktoru X , isolované z proteasa-de-ficientní buňky, s bibasičkou přoteasou, jako je furin/PACE nebo Kex2 a přemění se tak na dvouřetězcový analog faktoru X .
Dvouřetězcový analog faktoru X je možno aktivovat na formu faktoru Xa , popřípadě analogu faktoru Xa . Tato « aktivace může probíhat například tak, že se analog faktoru % X , který má modifikací v oblasti aktivačního peptidu fu- * rin-specifické štěpné místo, isoluje z furin-deficientní * buňky jako molekula s jedním řetězcem a potom se uvedením do kontaktu s endoproteasou převede na aktivovanou molekulu faktoru Xa .
Rovněž je možno isolovaný analog faktoru X s jedním Ί řetězcem, který má modifikaci v aktivačním .peptidu, která umožňuje alternativní přeměnu proteasou ze skupiny serino-vých proteas nebo kallikreinu, rozštěpit nejprve zpracováním s basickou endoproteasou na dvouřetězcovou molekulu faktoru X a‘tuto v dalším průběhu uvést do kontaktu se serinpro-teasou tak, aby proběhla aktivace na faktor Xa , popřípadě analog faktoru Xa .
Analog faktoru X , isolovaný z buněčné kultury jako dvouřetězcová molekula, je možno přímo zpracovat pro aktivaci specifickou proteasou.
Takto získaný faktor Xa , popřípadě analog faktoru Xa , vykazuje díky selektivní a řízené procesní reakci vysokou stabilitu a strukturní integritu. Zvláště důležité je, že neobsahuje inaktivní intermediáty analogů faktoru X/Xa a produkty autoproteolytického odbourávání.
Další aspekt tohoto vynálezu se týká rekombinantní DNA kódované pro analogy faktoru X podle předloženého vynálezu. Rekombinantní DNA se získá po expresi v analogu faktoru X s aminokyselinovou sekvencí odpovídající lidskému faktoru X, až na jednu modifikaci, která ovlivňuje specifitu přeměny a produkty přeměny, přičemž biologická srážecí aktivita zůstává v podstatě neovlivněna.
Podle dalšího aspektu předloženého vynálezu jsou dávány k disposici také transformované buňky, obsahující rekombinantní DNA .
Další aspekt tohoto vynálezu se týká preparátu obsahujícího čištěný analog faktoru X nebo jeho předběžný protein s jednou modifikací v oblasti přírodně se vyskytující- 20 ·'· • • .9 t • - · «· ·> • · • • · ♦ \· 9 • · • "· · • · • * • ··· • • · * • ‘ « • ·· ·♦· • * · ·· · • · • ho aktivačního místa faktoru Xa . Touto modifikací v oblasti aktivačního štěpného místa se získá nové rozpoznávací resp. .štěpné místo, které se na této pozici polypeptidu v přírodě normálně nevyskytuje, pro proteázu. Tento preparát může přitom být čištěný preparát obsahující jednořetězcový nebo dvouřetězcový analog faktoru X , přičemž polypeptidy se získají z kultivovaného buněčného systému buď po izolaci ze supernatantu buněčné kultury nebo z extraktu buněčné kultury. Předčištěný rekombinovaný analog faktoru X , získaný z kultivovaného buněčného systému, je možno dále čistit známými postupy odpovídajícími současnému stavu techniky. K tomu jsou vhodné zejména chromatografické metody jako je gelová filtrace, chromatografie na iontoměničích nebo afinitní chromatografie.
Podle jedné formy provedení obsahuje preparát podle i , předloženého vynálezu analog faktoru X výhodně ve formě molekuly s jedním řetězcem v isolované formě. Takovýto preparát se vyrobí tak, že se'analog faktoru X získá re-kombinantní výrobou jako jednořetězcová molekula z buněčného systému, výhodně buněčné kultury buněk, kterým chybí endoproteasa, která štěpí jednotlivý řetězec na těžký a lehký řetězec.
Podle zvláštního aspektu obsahuje tento preparát jednořetězcový analog faktoru X s modifikací, která umožňuje aktivaci na faktor Xa působením některé z proteas, zvolené ze skupiny bibázických endoproteas, jako jsou kexin/Kex2, furin/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PÁCE 4 a LPC/PC7 in vitro. Aktivace probíhá přitom při kontaktu analogu faktoru X s proteasou, přičemž na základě přírodně se vyskytujícího procesu probíhá štěpení na přírodní formu faktoru X a modifikací odštěpení aktivačního peptidu, přičemž se získá - 21 » • ·« ·· • · »· • · • · • • · • . · • · • • • ··· • · · • t • :· ·· · ·♦* «· · • · ·· faktor Xa , popřípadě analog faktoru Xa. V preparátu podle předloženého vynálezu se může analog faktoru X vyskytovat jako jednořetězcová molekula buď jako faktor Xa (FXa) nebo s delecí β-peptidu. Preparát obsahuje obzvláště analog faktoru X v enzymaticky inaktivní formě s čistotou alespoň 80 % , výhodně 90 % , obzvláště výhodně 95 % a neobsahuje žádné inaktivní proteolytické intermedi-áty analogů faktoru X/Xa .
Podle další formy provedení obsahují preparáty podle předloženého vynálezu analog faktoru X přednostně jako dvouřetězcové molekuly v izolované formě. K tomu se například analog faktoru X , získaný rekombinantní výrobou jako jednořetězcová molekula z buněčného systému in vitro, tedy mimo buňku, štěpí proteasou, výhodně bibasickou proteasou, na dvouřetězcovou formu. Toto může probíhat tak, že se proteasa smísí přímo se supernatantem kultury klonu, expri-mujícího analog faktoru X , buď smísením vyčištěné proteasy nebo supernatantu buněčné kultury, exprimuj ící proteasu v rekombinantní formě, nebo společnou kultivací klonů, exprimuj ících společně analog faktoru X a proteasu.
Rovněž se může supernatant buněčné kultury, obsahující analog faktoru X , nebo čištěný analog faktoru X , uvést do kontaktu s imobilisovanou proteasou, přičemž nastává přeměna na dvouřetězcovou formu. Při tomto způsobu je vázána proteasa výhodně na matrici a supernatant buněčné kultury nebo čištěný preparát, obsahující analog faktoru X , se vede přes tuto matrici. Je však také možná imobi-lisace analogu faktoru X , zatímco proteasa je v mobilní fázi. Stejně tak se mohou reaktanty (analog faktoru X a proteasa) smísit a po určité časové období inkubovat. - 22 ·· r· • f i i • · • · • • * • e«i • • • ifřr • « • • · · • M# • ·· ··
Proteasa se potom ze směsi odstraní, například pomocí afi-nitni chromatografie.
Dvouřetězcová forma analogu faktoru X se může získat také společnou expresí proteasy a analogu faktoru X přímo v dané buňce a popřípadě se-čistí. ífc.
Podle zvláštní formy provedení podle předloženého * vynálezu obsahuj í preparáty analogů faktoru X podle tohoto vynálezu jednořetězcové nebo dvouřetězcové molekuly s modifikací, která umožňuje provést aktivaci na faktor Xa , popřípadě analogy faktoru Xa. Tuto aktivaci analogů faktoru X na faktor Xa , popřípadě analogy faktoru Xa , je možno provést stykem analogu faktoru X s proteasou vybranou ze skupiny bibázických endoproteas, jako jsou kexin/Kex2, furin/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PÁCE 4, LPC/PC7, ze skupiny " serinproteas, jako jsou faktor Ha, faktor Vila, faktor IXa, faktor XIIa, faktor Xla, faktor Xa nebo kaliíkrein, nebo derivát těchto proteas. Tyto proteasy mohou být přitom imobilizovány na nosiči.
Preparáty podle tohoto vynálezu se mohou použít jako ; výchozí materiál pro přípravu a získávání faktoru Xa. Ve velkém technologickém měřítku se přitom uvede do styku preparát obsahující jednořetězcový nebo dvouřetězcový analog * faktoru X například s případně imobilizovanou proteasou za %
podmínek umožňujících optimální aktivaci analogů faktoru X * na faktor Xa, takže se získá faktor Xa , popřípadě analogy %· faktoru Xa. Takto získaný faktor Xa , popřípadě analogy faktoru Xa , je možno potom pomocí všeobecně známých metod převést na farmaceutický preparát.
Podle zvláštního provedení zahrnuje tento preparát ob-
- 23 - • · • ··· ··· • · ·· ♦ · s jedním nebo dvěma sáhující čištěné analogy faktoru X řetězci a fyziologicky přijatelný nosič a je možno z něj případně připravit farmaceutický preparát. Tuto přípravu je možno provést běžným způsobem smísením s přídavkem pufru obsahujícího soli jako jsou NaCl, ČaCl2 a aminokyseliny jako je glycin a/anebo lysin při pH v rozmezí 6 až 8, a získat tak farmaceutický preparát. Vyčištěné preparáty obsahující analog faktoru X , je možno připravovat jako hotové rozitoky, lyofilizáty nebo hlubokozmrazené produkty skladovatelné až do doby jejich konečného použití. Skladování těchto preparátů se přednostně.provádí ve formě lyofilizátu a jejich převedení na opticky čirý roztok se provádí pomocí odpoví-dajícího rekonstitučního roztoku.
Preparáty podle tohoto vynálezu je možno připravit i v kapalné formě jako kapalný, preparát.nebo ve formě hlubokozmrazené kapaliny. Preparáty podle tohoto vynálezu jsou obzvláště stabilní, to znamená, že ‘je možno-je nechat stát v rozpuštěné formě i po delší dobu před jejich použitím. Bylo prokázáno, že u preparátů podle tohoto vynálezu nedošlo k žádnému úbytku aktivity ani po několika hodinách až dnech.
Preparáty podle tohoto vynálezu je možno získat ve vhodném zařízení, přednostně v aplikátoru, s použitím proteasy, vybrané ze skupiny endoproteas, jako jsou kexin/Kex2, furin/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PÁCE 4, LPC/PC7, ze skupiny serinproteas, jako jsou faktor Ha, faktor Vila, faktor IXa, faktor Xlla, faktor Xla, faktor Xa nebo kalli-krein, nebo deriváty těchto proteas.
Preparát podle tohoto vynálezu, obsahující analog faktoru X v kombinaci s proteasou schopnou aktivovat analog faktoru X na fakltor Xa , popřípadě analog faktoru Xa, je možno připravit jako kombinovaný produkt skládající se z nádobky obsahující proteasu imobilizovanou na nosiči, případně ve formě minikolonky nebo injekční stříkačky s imobilizovanou proteasou a z nádobky obsahující farmaceutický preparát s analogem faktoru X . Aktivace analogu faktoru X se provede tak, že se např. roztok s analogem faktoru X protlačí přes imobilizovanou proteasu. Roztok obsahující analog faktoru X se přednostně po dobu skladování preparátu ukládá odděleně od imobilizované proteasy. Preparát podle tohoto vynálezu může být uložen i ve stejné nádobce jako proteasa, ovšem je třeba, aby obě složky byly odděleny nepropustnou membránou, kterou je možno při případném použití snadno odstranit. Tyto roztoky je možno uchovávat i v oddělených nádobách a uvést je do kontaktu až krátce před jejich použitím.
Ve zvláštním provedení se jako proteasa používá pro aktivaci přírodní serinproteasa, která se podílí na přirozeném srážení krve, jako je např. faktor XIIa nebo faktor Xla, který nemusí být před aplikací oddělen od aktivovaného faktoru Xa a může s ním být aplikován společně.
Aktivace analogu faktoru X na analog faktoru Xa se může provést krátce před přímým použitím, tedy krátce před podáním pacientům. Tuto aktivaci je možno provést stykem s imobilizovanou proteasou nebo smísením roztoků, obsahujících jednak proteasu a jednak analog faktoru X . Je proto možné obě složky uchovávat v oddělených roztocích a smísit je při průtoku vhodným infusním zařízením, přičemž dojde k aktivaci analogu faktoru X na analog faktoru Xa. Pacientu je tak podávána směs faktoru Xa a další serinproteasy, která vyvolala aktivaci. Přitom je zvláště třeba dbát na dávková- ní, poněvaž nadbytečná dávka serinproteasy aktivuje i endogenní faktor X, což může způsobit zkrácení doby koagulace.
Podle výhodné formy způsobu provedení se farmaceutický preparát dodává ve vhodném zařízení, přednostně v aplikáto-ru; buď v kapalné-zmrazené formě nebo v lyofilizované formě. Jako vhodný aplikátor je možno použit dvoukomorovou injekční stříkačku, popsanou v patentech AT 366 916 nebo AT 382 783.
Podle dalšího aspektu předloženého vynálezu obsahuj í preparáty analogy faktoru X s modifikací, která umožňuje aktivaci analogů faktoru X na faktor Xa in vivo. Analogy faktoru X preparátů podle předloženého vynálezu vykazují obzvláště modifikaci, která představuje rozeznávací/štěpné místo pro proteasu, zvolenou ze skupiny zahrnující serin-proteasy, jako je faktor XIIá, faktor Xla, faktor Xa nebo kallikrein a jsou štěpeny některou z uvedených proteas in. vivo na nativní faktor Xa , popřípadě analog faktoru Xa . : Při tom jsou obzvláště pro terapeutické, popužití výhodné takové analogy faktoru X , které mají rozeznávací/štěpné místo pro proteasu, nezávislou na uvnitř srážecí kaskády na faktorVIIa/tkáňovém komplexu a tenasovém komplexu. Takto je možno aplikovat preparát podle předloženého vynálezu jak u pacientů s deficiencí faktoru IX a faktoru VII , tak také faktoru VIII . U pacientů, u kterých dochází k poruchám srážení krve na základě deficience faktoru XI nebo faktoru XII , by se neměly používat farmaceutické preparáty, obsahující analog faktoru X , který se aktivuje faktorem XIIa nebo faktorem Xla . Při deficiencí například faktoru XI by měla být možná aplikace analogu faktoru X se štěpným místem faktoru XIIa .
Podle dalšího aspektu tohoto vynálezu obsahuje preparát podle tohoto vynálezu případně jako další složku krevní faktor ve formě zymogenu nebo aktivní serinproteasy. Jako další složky jsou přitom preferovány složky s faktor VIII-bypass-aktivitou. K těmto látkám patří zejména faktor II, faktor VII, faktor IX, faktor VIII, faktor V a/anebo aktivní serinproteasy. Jako další složky mohou být použity i fosfolipidy, Ca-ionty a podobně. Podle zvláštního způsobu provedení podle tohoto vynálezu obsahuje preparát podle předloženého vynálezu minimálně jednu další složku s faktor VIII bypass-aktivitou.
Preparát podle tohoto vynálezu sé může dodávat jako farmaceutický preparát s aktivitou faktoru Xa jako jednosložkový preparát nebo v kombinaci s jinými faktory jako vícesložkový preparát. Před zpracováním na farmaceutický preparát se vyčištěný protein podrobuje běžné kontrole kvality a převede se na terapeuticky použitelnou formu. Při rekombinační přípravě je nutno zejména vyčištěný preparát kontrolovat, zda neobsahuje buněčné nukleové kyseliny a nukleové kyseliny pocházející z expresního vektoru, přičemž preferovaným postupem je postup popsaný v EP 0 714 987.
Vzhledem k tomu, že každý biologický materiál může být principielně kontaminován infekčními zárodky, je nutno pro přípravu bezpečného preparátu případně provést inaktivaci, popřípadě odstranění virů.
Podle dalšího aspektu předloženého vynálezu se dává k disposici preparát, obsahující analog faktoru Xa , s vysokou stabilitou a strukturní integritou, který je obzvláště priostý inaktivních intermediátů analogů faktoru X/Xa a autoproteolytických produktů odbourávání, čímž je dostupné, -že'se může aktivovat analog faktoru X výše popsaného druhu a upravit na odpovídaj ící preparát.
Další aspekt tohoto vynálezu se týká použití preparátu výše uvedeného druhu pro výrobu léčiva. Léčivo, obsahující analog faktoru X , popřípadě analog faktoru Xa podle předloženého vynálezu, je vhodné zejména pro léčbu pacientů s poruchami srážení krve, jako jsou hemofilici nebo pacientíku nichž se vyvinuly inhibující protilátky proti obvykle podávaným terapeutickým prostředkům proti faktoru VIII a/nebo faktoru IX a obzvláště jako preparát s faktor VIII-bypass-aktivitou.
Dalčím aspektem předloženého vynálezu je použití nukleové kyseliny, obsahující kódující sekvenci analogů, · faktoru X podle předloženého vynálezu, pro výrobu léčiva. Při tom se může nukleová kyselina, pokud obsahuje vhodnou expresní kontrolní sekvenci, aplikovat jako prostá.nukleová kyselina, být integrovaná v rekombinantním expresním vektoru nebo být vázaná na nosiči, buď fosfolipidu nebo virální částici . Nukleová kyselina se při tom může použít pro výrobu léčiva, které je vhodné obzvláště pro ošetření pacientů s poruchami srážlivosti krve, jako jsou hemofilikové nebo hemofilikové s inhibitorickými protilátkami. Možné je rovněž použití nukleové kyseliny v genové terapii.
Další aspekt tohoto vynálezu se týká postupu přípravy analogů faktoru X a preparátů obsahujících analogy faktoru X podle tohoto vynálezu. Přitom se kódovací sekvence pro analog faktoru X vloží do vhodného expresního systému a příslušné buňky, výhodně permanentní buněčné linie, se 28 28
t . : • · ·♦ ·· ·# ··· ·· · transfikují rekombinantni DNA. Tyto buňky se kultivují za optimálních podmínek pro expresi genu a analog faktoru X se izoluje buď z extraktu buněčné kultury nebo ze supernatantu buněčné kultury. Rekombinované molekuly je možno dále čistit pomocí všech známých chromatografických postupů, jako jsou anexová, katexová, afinitní nebo imunoafinitní chromatogra-fie nebo kombinací těchto metod.
Pro přípravu analogů faktoru X podle tohoto vynálezu se klonuje úplná cDNA pro kódování faktoru X v expresním vektoru. To se provádí podle všeobecně známých způsobů klonování. Nukleotidová sekvence kódující faktor X se nakonec modifikuje tak, že se kódující sekvence v oblasti aktivačního peptidu a popřípadě také v oblasti C-terminálního β-pep-tidu se tak změní, aby se získaly molekuly faktoru X výše popsaného druhu. To se provádí známými genově-technickými v metodami odpovídajícími aktuálnímu stavu techniky, jako jsou řízená mutageneze in vitro nebo delece sekvencí, například restrikčním odstraňováním pomocí endonuklěas, insercí jiných, pozměněných sekvencí nebo pomocí PCR. Takto připravené mutanty faktoru X se potom inserují a exprimují do expresního systému vhodného pro rekombinantni expresi.
Analogy faktoru X podle předloženého vynálezu je možno připravovat i chemickou syntézou.
Analogy faktoru X se výhodně připravuj i rekombinační expresí. Genově-technickou přípravu je možno provádět pomocí veškerých dostupných expresních systémů, jako jsou například permanentní buněčné linie nebo virální expresní systémy. Permanentní buněčné linie se připraví stabilní integrací cizí DNA do chromozomu hostitelské buňky například Věro, MRC5, CHO, BHK, 293, Sk-Hepl, zejména z jaterních buněk a buněk ledvin, nebo pomoci episomálního vektoru, odvozeného například *z viru Papilloma. Rovněž je možno použít virální expresní systémy, jako jsou například Vaccinia Virus, Baculóvirus nebo retrovirálni systémy. Jako buněčné linie je možno obecně použít Věro, MRC5, CHO, BHK, 293, Sk-Hepl, žlázové, jaterní a ledvinové buňky. Jako eukaryotické expresní systémy je možno použít i kvasinky, endogenní žlázy (např.žlázy transgenních zvířat) a jiné buněčné typy. Trans-genní zvířata je možno samozřejmě použít i k expresi poly-peptidů podle předloženého vynálezu nebo jeho derivátů. Pro expresi rekombinantních proteinů se osvědčily speciální buňky CHO-DHFR" (Urlaub a spol., Proč.Nati.Acad. Sci., USA, 77:4216-4220, 1980).
Pro rekombinantní přípravu analogu faktoru X podle předloženého vynálezu je možno použít i prokaryotické expresní systémy. K tomu jsou vhodné zejména .systémy, které umožňují expresi v E.coli nebo B.subtilis.t • i
Analogy faktoru X se exprimují v odpovídajících expresních systémech řízených vhodnými promotory. Při expresi v eukaryontech jsou vhodné všechny známé promotory, jako jsou SV40-, CMV-, RSV-, HSV-, EBV-, β-aktin-, hGH nebo indukovatelné promotory jako jsou například hsp-, nebo metallothionein-promotor. Preferována je exprimace analogů faktoru X , řízená β-aktinovým promotorem v CHO-DHFR- buňkách .
Podle jednoho způsobu provedení podle předloženého vynálezu zahrnuje postup přípravy preparátu podle tohoto vynálezu následuj ící kroky : příprava DNA pro kódování analogu faktoru X , transformace buňky s rekombinantní DNA, exprese analogu faktoru X , případně za přítomnosti protea- 9} - 30 9} - 30
·· «t • Ψ · · • « · ··· ··· • « · · •·· ··· ·# ·· sy, izolace analogu faktoru X a případné čištění pomocí chromatografického postupu.
Podle jednoho způsobu provedení tohoto vynálezu se analog faktoru X izoluje přímo jako molekula ze dvou řetězců. Při tom se analog faktoru X exprimuje v buňce, která dovoluje přeměnu analogu pro-faktoru X na dvouřetěz-cový analog faktoru X. Jako buňka se používá přednostně buňka, která exprimuje proteasu vhodnou pro provedení této přeměny, jako je bibázická proteasa, obzvláště furin nebo jeho derivát. Pro zvýšení, popřípadě pro zlepšení účinnosti této přeměny je případně možno buňku modifikovat tak, aby exprimovala proteasu ve zvýšené míře. To je možno provést například ko-expresí příslušné bibázické endoproteasy,, jako je furin/PACE, Kex2 nebo odpovídajícího derivátu. Analog faktoru X podle tohoto vynálezu je možno rovněž exprimovat v buňce, která vykazuje normální nebo. suboptimální endogenní koncentraci proteasy pro přeměnu a proto probíhá neúplná přeměna na dvouřetězcovou formu. Následující přeměna na těžké a lehké řetězce probíhá v tomto případě, pokud se secernuje v supernatantu buněčné kultury jednořetězcový analog faktoru X v supernatantu kultury, jak bylo popsáno dříve, ko-kultivací s buňkami exprimujícími proteasu nebo při styku s proteasou, případně v imobilizovaném stavu. Buněčný supernatant je možno přečerpat také přes nosnou matrici, na níž je navázána proteasa, přičemž se v eluátu získá dvouřetězcový analog faktoru Xa. Také je možno reaktanty smísit v roztoku, inkubovat je po určité časové období a potom proteasu odstranit například pomocí afinitní matrice.
Takto získaný dvouřetězcový analog faktoru X je možno nakonec izolovat, vyčistit a až do příštího použití, jak bylo popsáno dříve, ve stabilizovaném stavu uskladnit. Při zvláštní formě provedení se dvouřetězcový, případ ně přečištěný analog faktoru X , uvede in vitro do styku s proteasou vybranou ze skupiny endoproteas, jako jsou kexin/Kex2, furin/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE4, LPC/PC7 ,' ze skupiny serinproteas, jako jsou faktor Ha, faktor Vila, faktor IXa, faktor XIIa, faktor Xla, faktor X nebo kalii-krein, nebo s derivátem těchto proteas za podmínek, při nichž se analog faktoru X aktivuje na nativní faktor Xa nebo analog faktoru Xa . ~ '
Podle jednoho způsobu provedení se aktivace provádí chromatografickým postupem, přičemž proteasa je imobilizo-vána na nosiči. Čištěný analog faktoru X se dvěma řetězci se přitom vede přes matrici, na níž je navázána proteasa a z eluátu sé potom izoluje vyčištěný faktor Xa , ·*; *· ‘ «
Podle jiné formy provedení sé komponenty smísí a proteasa se selektivně ze směsi odstraní.
Je přirozeně také možná kombinace přeměny jednořetěz-cových analogů pro-faktoru X na dvouřetězcovou formu analogů faktoru X a aktivace na faktor Xa v jednom jediném postupu. Jednořetězcový analog faktoru X nebo jeho předstupeň se při tom uvede do styku přímo s bibasickou proteasou, výhodně s furinem nebo jeho derivátem, které dovolují přeměnu na těžký a lehký řetězec a aktivaci na faktor Xa . Analog faktoru X , který nemá žádné štěpné místo pro furin nebo jeho deriváty v aktivačním peptidu, se popřípadě uvede do styku s další proteasou, odlišnou od první, která však umožňuje aktivaci. Proteasy se při tom mohou vyskytovat ve směsi, například furinu a faktoru Xla .
Aktivace se může také provádět kombinací obou kroků pomocí za sebou zařazených, navzájem přímo spojených zařízení, výhodně nosičů, jako jsou sloupce, na kterých je imobilisována proteasa, nebo jsou imobilisované proteasy. Při tom probíhá na prvním nosiči štěpení faktoru X na těžký a lehký řetězec a na druhém aktivace na faktor Xa pomoci imobilisované proteasy. Spojení nosičů se při tom může provést přímým napojením výtoku z prvního sloupce s nátokem druhého sloupce.
Reakční podmínky pro procesní reakci nebo reakce a aktivaci se mohou bez dalšího odborníky optimalisovat vždy podle při uspořádání pokusu daných rámcových podmínek. Při tom má obzvláštní význam pro kontaktní dobu rychlost průtoku použitých reaktantů. Hodnoty průtoku by se v ideálním případě měly pohybovat v rozmezí 0,01 ml/min až 1 ml/min. Dalšími důležitými parametry jsou teplota, hodnota’pH a eluční podmínky. Po průtoku může být aktivovaný faktor Xa případně dále čištěn selektivními chromatografickými metodami. Provedení tohoto postupu s proteasou navázanou na nosiči je výhodné proto, že uspořádání reakce s použitím nosiče, přednostně v chromatografické koloně, umožňuje provedení dalších čisticích operací.
Podle dalšího aspektu přípravy analogu faktoru X se analog faktoru X isoluje jako jednořetězcová molekula. K tomu se analog faktoru X exprimuje v buňce, která nepodporuje přeměnu jednotlivého řetězce na lehký a těžký řetězec. Tato buňka při tom přednostně vykazuje deficienci bibázické endoproteasy, jako je kexin, furin, PÁCE nebo jejich homology. Jak bylo v rámci předloženého vynálezu zjištěno, je jednou z důležitých proteas, zodpovědných za štěpení faktoru X na lehký a těžký řetězec, furin. . ’ * * Z takové endoproteasa-deficientní mutantní buňky je možno izolovat analog faktoru, X ve formě jednořetězcové molekuly. Takto izolovaný a případně přečištěný analog faktoru X se nakonec uvede do styku s proteasou vybranou ze skupiny endoproteas, jako jsou kexin/Kex2, furin/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE4, LPC/PC7,.za podmínek, při nichž se analog faktoru X s jedním řetězcem rozštěpí na dvouřetězcovou formu faktoru X . Analogy faktoru X podle předloženého vynálezu, které mají modifikaci v oblasti aktivačního peptidu, které umožňuj i štěpení některou z těchto endoproteas, se mohou aktivovat pomocí tohoto způsobu popřípadě přímo uvdenim do kontaktu s endoproteasou jednořetězcového analogu faktoru X , na faktor Xa , popřípadě analog faktoru Xa .'
Analogy faktoru X podle předloženého vynálezu, které mají v oblasti aktivačního’peptidu modifikaci, která umožňuje štěpení serinproteasou'nebo kallikreinem,·' se* po přípravě na dvouřetězcový analog faktoru X uvedou do; styku s další proteasou, odlišnou od první proteasy a aktivují se na analog faktoru Xa .
Podle dalšího aspektu předloženého vynálezu se pomocí tohoto způsobu získá preparát, obsahující aktivní faktor Xa , popřípadě aktivní analog faktoru Xa tak, že analog faktoru X , vyrobený výše popsaným způsobem, podrobí aktivačnímu kroku a aktivovaný polypeptid se dále zpracuje na čištěný preparát, který se popřípadě formuluje jako farmaceutický přípravek. Při použití analogů faktoru X , aktivovaných výše uvedeným postupem na faktor Xa , se získá čištěný faktor Xa , popřípadě analogy faktoru Xa s vysokou stabilitou 34 - 34 - ·· ·· • t » · • · '· · ··· ··· • · , · · '·· • · ♦ · • f · y · • ·· · V · · %'« ··· a strukturní integritou, které při tom neobsahují iňaktivní intermediáty faktoru X/Xa. Přehled obrázků na výkresech
Obr:1 : Nukleotidová a aminokyselinová sekvence faktoru X
Obr.2 : Schematické znázornění analogu faktoru X s modifikovaným štěpným místem pro proteasy v oblasti aktivačního peptidu
Obr.3 : Schematické znázornění expresního vektoru phAct-rFX
Obr.4 : Vesternblot-analýza rFaktoru X , exprimovaného v CHO-buňkách před a po amplifikaci , ' * * * ' · * ' - · - „ #*.'. · v
Obr 5 : Vesternblot-analýza rFaktoru X po invitro-štěpení furinovými deriváty
Obr. 6 : Vesternblot-analýza molekul rFaktoru X , exprimova-ných v buňkách obsahujících a neobsahujících furin
Obr.7 : Schematické znázornění konstruktů analogu rFX/rFXa s pozměněným C-koncem těžkého řetězce
Obr.8 : Schematické znázornění N-konce produktu přeměny rFaktoru X z furin-obsahujících a z furin-deficit-ních CHO-buněk před a po zpracování pomocí rFurinem
Obr. 9 : Vesternblot-analýza rFaktoru FX exprimované ho v CHO-buňkách 35 - 35 -
<9 9 9' 9 · 9 99 ·· 99 • f • ♦ 9 ·♦ 1 9 9 '9 • ··· 999 9 • 9 9 9 9 ·♦ 99
Obr.10 : Vesternblot-analýza rFaktoru FX^*^/^ po in vitro- aktivaci furinovým derivátem % ‘ . « * f . '
Obr .11. : Vesternblot-analýza rFaktoru FX®^**/^ po in vitro-aktivaci furinovým derivátem.
Vynález je blíže popsán v dále uvedených příkladech provedení, přičemž se však neomezuje pouze na tyto zvláštní příklady provedení. Příklady provedení vynálezu Příklad 1 popisuje konstrukci a expresi rFaktoru X ; příklad 2 popisuje přeměnu rFaktoru X na těžký a lehký řetězec furinem ; příklad 3 popisuje postup.pro získání pro-faktoru X pomocí imobilizované proteasý ; přiklad 4 popisuje aktivitu rFaktoru X , připravovaného in vitro ; příklad 5 popisuje expresi rFaktoru X ve furin-deficitních buňkách ; příklad 6 popisuje konstrukci a expresi analogů rFaktoru X ; příklad 7 popisuje stanovení produktů přeměny faktoru X na N-konci ; příklad 8 popisuje expresi a charakterizaci FX-analogu s furinovým štěpným místem Arg-Arg-Lys-Arg/Ile (rFX RRKR/Í) ; příklad 9 popisuje in vitro-aktivaci rFX RRRR/I-proteinu pomocí derivátu rFurinu ; příklad 10 popisuje funkcionalitu in vitro aktivovaného rekombinantního FX-analogu rpxRRRR/*; příklad 11 popisuje in vitro aktivaci rFX-analogu s FXIa-štěpným místem Asp-Phe-Thr-Arg/Val pro FXIa .
Expresní vektory byly připraveny běžnými způsoby klonování (Maniatis a spol.: "Molecular Cloning" - 36 - 36
·· ·« ·· · « Φ · • I · t · • * ··· ··· • « t ,· · ♦ ·« · · - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, USA, 1983). Příprava DNA-fragmentů pomocí polymerasové reakce (Polymerase-Ketten-Reaktion - PCR) byla provedena obecnými metodami (Clackson a spol., 1991, PCR A practical approach. ED.McPherson.Quirke, Taylor, S.187-214). Přikladl
Exprese a převedení jednpřetězcového rFX na rFX s lehkým/těžkým řetězcem a. Příprava rFX-expresního vektoru
Pro přípravu rekombinantního FX (rFX) byla izolována cDNA z FX z lidské jaterní Lambda-cDNA-banky (Leber Lambda-rcDNA-Bank) , jak uvedli Messier a spol.* (1991, Gene 99291-294) ; Z pozitivního klonu byl pomocí PCR s pligonukleotidem #2911 (5’-ATT ACT CGA GAA GCT TAC CAT GGG GCG CCC ACTG-3’) (SEQ. ID. Nr 1) jako 5’-primerem a oligonukleotidem #2912 (5’-ATTACAATTGCTGCAGGGATCCAC-3’) (SEQ. ID. Nr 2) jako 3-pri -merem amplifikován DNA-fragment, který obsahoval 1,467 kB FX-kódující sekvenci a dále 39 bp 3’-netranslatovanou oblast, a který byl atakován v místě štěpení Xhol na 5’konci a v místě štěpení Mfel na 3’-konci. Kromě toho byla působením primeru #2911 vložena sekvence ACC před ATG v FX, takže vznikla optimální Kozák-translačně-inicializační sekvence. Nakonec byl tento PCR-produkt klonován jako XhoI/Mfel-frag-ment v expresním vektoru se Sall a EcoRI. Vzniklý expresní plasmid byl označen jako phAct-rFX (Obr. 3). Expresní vektor phAct zahrnuje lidský beta-actin-pro- moter, 78bp 5’UTR a rovněž intron, násobné klonovací místo štěpení a SV40-polyadenylačni místo. b. Exprese rFX v CHO- buňkách
Pro.získání stabilní buněčné linie pro expresi rFX byly ko-transfekovány dhfr-deficitní CHO-buňky s expresním plasmiděm phAct-rFX a selektivním markerplasmidem pSV-dhfr. Při všech dalších expresních a funkčních analýzách byly buněčné kultury s bezsérovým selektivním.mediem inkubovány za přítomnosti 10 pg/ml vitaminu K po dobu 24 hodin. Exprese rFX ve vzniklých buněčných klonech byla prokazována pomocí protilátky (ELISA, Asserachrom,~Boehringer Mannheim) a re-kombinantní protein byl potom charakterizován pomocí SDS-PAGE (Obr. 4A a B). V počátečních klonech i v subklo-nech je rekombinantní FX-protein ve formě lehkého řetězce (LC) 22 kD a těžkého řetězce (HC) o cca 50 kD, které jsou identické s plasmatickým proteinem faktoru X, jak vyplývá z Vesternblot-analýzy (Obr. 4A). Kromě toho z pásu .proteinu při 75 kD vyplývá, že tento pás odpovídá (SC)-molekule s jedním řetězcem, jejíž přítomnost byla popsána v FX-trans-fekačních CHO-buňkách (Volf a spol., J.Biol.Chem.· 266: 13726-13730, 1991) a rovněž v lidské plazmě (Fair a spol., Blood 64: 194-204, 1984). Pro přípravu vysoce exprimujících klonů byly počáteční klony amplifikovány se stoupajícím množstvím methotrexátu a nakonec subklonovány až do stabilizace. Expresi bylo možno zvýšit z cca 200-500 ng/10E6 buněk resp. 1 μg/ml na 78 μg/10E6 buněk resp. 120 pg/ml za 24 hodin. Vesternblotting-analýza těchto vysoce exprimo-vaných buněčných klonů (obr. 4B a obr. 5A, záznam 2) vykazuje obohacení jednořetězcových rFX-molekul a rovněž přítomnost dalších forem v lehkém řetězci. Vedle 22 kD-formy v lehkém řetězci, která odpovídá formě v plazmě (úplně karboxylovaná a bez propeptidu), jsou přítomny ještě tři další varianty lehkého řetězce s 21 kD, 22,5 kD a 20 kD. - 38 ·· Φ ♦ * · '♦· • · • . · · '· • · * (·« ··· ·· Μ .· *'· ·
Heterogenita lehkého řetězce v těchto klonech může být způsobena vytvářením N-terminálních sekvencí v rekombi-nantním materiálu na neúplně odštěpený propeptid (v tomto případě:^ca 50 % materiálu rFX) a rovněž nedostatečným stupněm karboxylace (Untercarboxylierung) (v tomto případě: 50 % rFX). 21 kD-protein je nedostatečně karboxylovaná forma lehkého řetězce obsahující propeptid a 20 kD-protein je nedostatečně karboxylovaná forma lehkého řetězce neobsahující propeptid, zatímco 22,5 kD-pás představuje úplně karboxylo-vanou LC-formu obsahující propeptid. Příklad 2 Přeměna j ednořetězcové rFX na rFX lehký/těžký řetězec působením rFurinového derivátu. >»·
Vzhledem k podobnosti štěpných míst mezi faktor X-propeptidem/N-koncem lehkého řetězce (ŘVTR A) a mezi leh-kým/těžkým řetězcem (RRKR S) s rozpoznávací sekvencí furinu (Furin-Konsensus-Erkennungssequenz) (RXK/RR X) se naskytla možnost pro zlepšení přeměny jak jednořetězcové, tak i propeptid- obsahuj ící rFX-molekuly působením rFurinůvého derivátu in vitro. V literatuře byly pro oba způsoby přeměny navrženy proteasy, které však neměly k furinu žádný vztah (Rehemtulla a spol., 1992, Blood 79:2349-2355; Vallin a spol., 1994, Thromb.Res. 1994:395-403).
Supernatanty buněčných kultur CHO-rFX a CHO-rFurin TMóxHis (přihláška vynálezu EP 0 775 750) a rovněž CHO-rFX a netransfekované CHO (jako negativní kontrola) byly smíseny v poměru 1:1a inkubovány při teplotě 37 °C. V alikvotních podílech reakční směsi byl pomocí Vesternblotting-analýzy sledován obsah přeměněného rFX před inkubací (t=0) a po růz- 39 ·»
• '· • ♦ «
ných dobách inkubace (t= 2, 4, 6 hodin) (obr. 5). Důkaz rFX v supernatantu buněčných kultur byl prováděn.pomoci antihu-mánniho FX-antiséra (obr.5A) resp. monoklonální protilátky specifické pro lehký řetězec FX (obr. 5B).
Na rozdíl od směsi CHO-rFX/CHO vykazovala směs CHO-rFX/CHO-rFurin již po dvou hodinách inkubace při teplotě 37 °C (obr. 5A, záznam 7; Obr. 5B záznam 8) téměř úplnou přeměnu. Jednořetězcový rFX je v převážné míře převeden na formu lehkého a těžkého řetzězce. V oblasti lehkého řetězce byly však ještě nalezeny přeměněné bezpropeptidové formy 22 kD (karboxylovaná forma) a 20 kD (nedostatečně karboxylovaná forma) v poměru 50 : 50. Optimalizací podmínek buněčné kultury je možno tento poměr posunout ve prospěch karboxylova-né formy. Správné odštěpování pro-sekvence mezi Arg-1 a Ala+1 a homogenita N-konce lehkého, řetězce byly stanovovány pomocí N-terminálního vytváření sekvencí. Při srovnávacím pokusu, při němž byly smíseny CHO-rFX se supernatanty CHO nebyla ani po 6-hodinové inkubaci prokázána žádná změna rFX-pásů (obr. 5A, záznam 5; obr. 5B, záznam 6). Bylo tak prokázáno, že rFurin v supernatantu CHO-buněk je biologicky aktivní a že je možno uskutečnit jak přeměnu propeptidu, tak i těžkého/lehkého řetězce rFX. Příklad 3 Přeměna faktoru X pomocí rFurinu imobilizovaného na chelát-tentakelgelu
Pro zjištění, zda je možno substrát štěpit rFurinovým derivátem vázaným v chromatografické koloně bylo při jednom experimentálním uspořádání zjišťováno, zda je možno jako matrici v koloně namísto Ni -NTA-agarosy použít Fractogel % <· · - . 40 · · .* · · ·· · • ’* · .· · \· ··· · ·» · EMD^-Tentakelgel (Fa.Merck). Kovové ionty jsou v tomto případě v porovnání s Ni·* -NTA-agarosou prostorově více vzdáleny od vlastní matrice v koloně, což by mohlo zlepšit sterickou přístupnost vázaného rFurinového derivátu. Při ‘ tomto pokusném uspořádání byl profaktor X získán pomocí rFurinového derivátu vázaného na Tentakelgel následujícím způsobem : Do Fractogel EMD -Tentakelgelu byly podle předpi-su přípravy zakotveny ionty a získaný materiál byl ekvilibrován s bezsérovou buněčnou kulturou. Nakonec byl na kolonu zakotven CHO-rFurinový derivát. Promývání bylo prováděno bezsérovou buněčnou kulturou obsahuj ící stoupaj ící koncentraci imidážolu až na 40 mM. Nakonec byl přes tuto kolonu veden profaktor X jako bezsérový GHO-supernatant. Pomocí Vesternblot-analýzy se specifickým faktor X-antisérem byla po průtoku kolonou prokázána přeměna profaktoru X na faktor X se dvěma řetězci. Příklad 4 /. *'*.
Aktivita rekombinantního faktoru X připravovaného in vitro
Rekombinantní prekurzor faktoru X byl inkubován při teplotě 4 °C s rFurinem a bez rFurinu. Po určitých intervalech byly odebírány vzorky a zmrazovány na tepotu -20 °C. Po ukončení inkubace (po 4 dnech) byla u všech vzorků sledována FX-aktivita pomocí sady FX-Coatest Kit (Fa.Chromo-genix). Přitom bylo vždy 50 μΐ supernatantu smíseno s 50 μΐ FX-deficitního lidského plazmatu a podle předpisu výrobce byl rFX přídavkem hadího jedu (RWj za přítomnosti CaCl2 převeden na rFXa; rFXa hydrolyzoval nakonec chromogenní substrát (S-2337), přičemž došlo k uvolnění žlutého para-nitroanilinu. Množství rFXa a intenzita barvy jsou vzájemně úměrné, což umožňuje stanovit množství rFXa aktivovatelného - 41 - 41
*
·♦ *· • · · · • · « · • ··· ·«{) • ' · #· ·♦ v rFX/ml-buněčném supernatantu pomocí kalibrační přímky, in-terpolované podle hodnot zřeďovací řady v plazmatu. Z těchto výsledků a ze známého množství rFX-antigenu (ELISA-data) je možno vypočíst procentuální podíl rFaktoru X , aktivo-vatelného na faktor Xa. Získané výsledky jsou uvedeny v Tabulce 1.
Aby bylo možno vyloučit nespecifickou proteolytickou aktivitu CHO- a CHO-rFurinových supernatantu, byla vyhodnocována i směs těchto obou supernatantů buněčných kultur. CHO-rFX inkubovaný s CHO-supernatanty (bez rFurinu) jako kontrolní vzorek nevykázal po 4 dnech žádnou podstatnou změnu aktivity rFXa, která v rozmezí experimentálních chyb byla cca 800 mU/ml, což odpovídalo 55 až 61 % funkčního rFX. Pro porovnání byl CHO-rFX inkubován s CHO-rFurinem, přičemž byl po dobu inkubace zjištěn konstantní nárůst rFX-aktivity z cca 61 % (čas T = 0) na 86 % (Tabulka 1). Tím bylo prokázáno, že in vitro-úpravou CHO-rFX z vysoce exprimovaných klonů pomocí derivátu rFurinu se podstatně zvyšuje podíl rFX aktivovatelného na funkční rFXa. - 42 - 42 ·· • · ·· ♦ · * • · • • · * ·· *·♦ » · ··· ♦ ·· ··# ·«· ·» ·· • ♦ · ··· ·♦
Tabulka 1 ' · · .Inkubace,. „ dny . Aktivita.. mU Množství antigenu, pg/ml Funkční podíl rFX, % CHO-rFX+ 0 814 14 58 CHO 1 847 14 61 2 835 14 60 3 790 14 56 4 763 14 55 CHO-rFX+ 0 853 14 61 CHO-rFurin . 1 1018 14 73 2 1099 14 49 3 1135 14 81 4 1198 14 86 CHO + 0 CHO-rFurin Plasma FX 500 mU 585 • f' Příklad5
Exprese rekombinantního faktoru X ve furin-deficitních buňkách
Jak bylo uvedeno v předcházejících příkladech, dochází u prekurzorového proteinu faktoru X působením furinu in vitro jak k odštěpení propéptidu, tak i ke štěpení jednoduchého řetězce na lehký/těžký řetězec. Z toho vyplývá, že tyto kroky mohou být s různou účinností uskutečněny i endogenně v buňkách působením všudypřítomného furinu v závislosti na množství příslušného exprimovaného rFaktoru X. k. - 43 ·· - · • • ·· • • 0 • · • • • • • Ψ • · «· ·· ·· Μ ♦ ♦ · · • ♦ · ♦ · « • · · ··· ··# • · · · ··· ,+ ?· ·· Tímto postupem se dále získá směs heterogenních forem rFaktoru X.
Jednou z možností, jak získat maximálně homogenní a přitom stabilní formu molekul rFaktoru X, je zabránit štěpení rFaktoru X endogenními proteasami, zejména furinem, a tak získat funkčně inaktivní prekurzor rFaktoru X (který je možno pozdější úpravou průtokem kolonou převést na funkčně aktivní formu, pokud možno přímo před použitím).
Tento postup je obzvláště'výhodný při přípravě FX-analogů, které obsahují namísto původního aktivačního místa místo štěpitelné furinem. U těchto konstruktů je možno provést aktivaci těchto rekombinantních rFX-mutantů in vivo působením endogenního furinu a sekrecí aktivovaných nestabilních rFX forem. Degradací těchto forem CHO-proteasami, například v podmínkách buněčných kultur s vysokou buněčnou lysí, při skladování supernatantu buněčné kultury nebo pomocí čisticích postupů nebo autoproteolysou je možno získat inaktivní produkty odbourávání (Volf a spol., 1991).
Tohoto cíle je možno dosáhnout například přídavkem činidel, která snižují nebo blokují intracelulární furinovou aktivitu, do buněčné kultury.
Jinou možností je apriorní použiti furin-deficitních buněk (Mohring a spol., 1983, Infect. Immun. 41:998-1009; Ohniski a spol., 1994, J. Virol. 68:4075-4079; Gordon a spol., 1995, Infect. Immun. 63:82-87). Při tomto postupu byl furin-deficitní CHO-buněčný klon FD11 (Gordon a spol., 1995, Infect. Immun. 63:82-87) ko-transfekován s 20 pg phAct-FX a 1 pg pUCSV-neo (s obsahem
neomycin-rezistetního genu v pUC vektoru za kontroly SV40-promptoru). Pro získáni stabilního klonu bylo toto medium suplementováno 0,8 pg G418/ml. Při porovnání molekul rFak-toru secernovaného v bezsérovém*supernatantu CHO klonů s obsahem a bez' obsahu furinu bylo pomocí Vesternblotting-ahalýzy prokázáno, že ve furindeficitních buňkách nedocházelo k přeměně prekurzoru rFaktoru a byl přítomen pouze jednořetězcový prekurzor faktoru X (obr.6); naproti tomu se rFaktor X z "normálních" buněk při mírnější (modeste) expresi přeměňoval ještě úplně, při vyšší expresi se přes přítomnost endogenního furinu přeměňoval pouze v omezené míře. Vzhledem k velmi nízkému stupni exprese rFX u použitého buněčného klonu není lehký řetězec rFaktoru X při Βίοι-analýze vidět. Příklad 6 - Příprava analogů faktoru X V ' * (podle vyjádřeni přihlašovatele jde v současné době o nej lepší způsob provedení podle tohoto vynálezu) i. ’
6.1 Konstrukce expresních plasmidů pro přípravu analogů faktoru X
Pro výrobu rekombinantních analogů rFaktoru X se štěpné místo Asn-Leu-Thr-Arg/Ile (aminokyseliny 231 až 235), které slouží pro aktivaci faktoru X na faktor Xa , nahradí štěpným místem specifickým pro jinou protéasu, jako je furin, FXIa, FXa, FXIIa, Fila nebo kallikrein. Expresní plasmidy pro tyto analogy faktoru X jsou všechny odvozené od plasmidů phAct-FX (popsaný v příkladě 1) .
Pro zjednodušení klonování expresního plasmidů faktoru Ί .1 45 .1 45
• # ι : X byl DNA-fragment HindlII-Nael z expresního plasmidu phAct-FX, obsahujícího oblast; kódování faktoru X od pozice +1 až do +1116, vložen do HindiII/Smál-restrikčních štěpných míst plasmidu pUC19. Takto získaný plasmid byl označen jako pUC/FX. Tím je možno sekvenci faktoru X nukleotidu na posici 508 až 705 (aminokyseliny 160 až 235) z pUC/FX-plasmidu lehce odstranit a nahradit různými DNA-fragmenty mutovaného faktoru X . Tyto DNA-fragmenty jsou identické s deletova-nou sekvencí divokého typu faktoru X , kromě posicí 691 až 705 (aminokyseliny 231 až 235) , které kódují nová štěpná místa.
Sekvence divokého typu faktoru X byla z pUC/FX-plasmidu přes restrikční štěpy Bspl20I a BstXI odstraněna. 3’-Přečnívající sekvence BstXI-místa byla dodatečně odstraněna pomocí Mung Bean-nukleasy (Biolab).
Mutované DNA-fragmenty faktoru X se vyrobí pomocí PCR. 5’-Primer je identický pro všechna klonování a obsahuje sekvenci faktoru X posice 496 až 516 . 3’-Primery obsahují sekvenci komplementující faktor X (posice 676 až 690) a nekomplementujicí 5’-přesah, který nese sekvence pro nové štěpné místo a restrikční štěpné místo. Amplifikovaný PCR-produkt se potom dále štěpí pomocí odpovídajícího restrikčního enzymu nebo restrikčních enzymů a klonuje se v předem připraveném pUC/FX-vektoru (viz výše).
Potom se mutované DNA-fragmenty faktoru X překlonují přes HindlII-Agel z pUC/FX-plasmidů na phAct-FX-vektor. Konečné konstrukty jsou schematicky znázorněné na obr. 2.1 a 2.2 . Jako referenční konstrukt je uváděn divoký typ - 46
; ι o faktoru X . Aminokyseliny jsou uváděné v jednopísměnovém kódu, mutované posice jsou přídavně stínované.. t
Pro přípravu Asp_-Phe-Thr_-Arg/Val FXIa-štěpného místa byl použit jako 5’-primer oligonukleotid # 1001 (5,’-CCC ACA GGG CCC TAC CCC TGT - 3 ’ (SEQ. ID. Nr.3) a jako 3’-primer oligonukleotid # 1002 (5 ’-ACCA GTT AAC CCT GGT GAA GTC GTT GTC GCC CCT CTC-3’) (SEQ. ID. Nr.4) . Tímto způsobem byly nahrazeny aminokyseliny Asn, Leu a Ile na pozici 231, 232 a 235 sekvence faktoru X. na Asp, Phe a Val . PCR-fragment se dodatečně štěpí pomocí Bstl20I a Hpal (Obr. 2A).
Pro přípravu Arg/Ser FIla-štěpného místa byl použit jako 5’-primer oligonukleotid # 1001 (5’-CCC ACA GGG CCC TAC CCC TGT-3’ (SEQ. ID. Nr.3) a jako 3’-primer oligonukleotid #1003 (5’-ACCA TCG CGA CCT. GGT CAG GTT GTT GTC-3’) (SEQ. ID. Nr.5) . Tímto způsobem byla provedena mutace aminokyseliny Ile na pozici 235 na Ser . PCR-fragment se dodatečně štěpí pomocí Bstl20I á Nrul (Obr. 2B).
Pro přípravu IIe-Lys-Pro-Arg/Ile FXIIa-štěpného místa byl použit jako 5’-primer oligonukleotid # 1001 (5’-CCC ACA GGG CCC TAC CCC TGT-3’ (SEQ. ID. Nr.3) a jako 3’-primer oligonukleotid # 1004 (5’-ACC AGA ATC GAT TCT GGG TTT GAT GTT GTC GCC CCT GTC-3’) (SEQ. ID. Nr.6) . Tímto způsobem byla provedena mutace aminokyselin Asn, Leu a Thr na pozicích 231, 232 a 233 FX-sekvence na Ile, Lys a Pro . PCR-fragment se dodatečně parcielně štěpí pomocí Bstl20I a XmnI (Obr. 2C).
Pro přípravu Ser-Met-Thr-Arg/Ile kallikrein-štěpného místa byl použit jako 5’-primer oligonukleotid # 1001 (5’-CCC ACA GGG CCC TAC CCC TGT-3’ (SEQ. ID. Nr.3) a jako - 47
Λ ι · « ♦ «
I ·· ··
3’-primer oligonukleotid # 1005 (5’-ACC AGA ATC GAT TCT GGT CAT GCT GTT GTC GCC CCT CTC-3’ (SEQ. ID. Nr.7). Tímto ! způsobem byla provedena mutace aminokyselin Asn a Leu na pozicích 231 a 232 FX-sekvence na Ser a Met . PCR-fragment se dodatečně parcielně štěpí pomocí Bstl20I a XmnI (Obr. 2D) .
Pro přípravu Met-Lys-Thr-Arg/Ile FXa-štěpného místa byl použit jako 5’-primer oligonukleotid # 1001 (5’-CCC ACA GGG CCC TAC CCC TGT-3’ (SEQ. ID, Nr.3) a jako 3’-primer oligonukleotid # 1014 (5’-ACC AGA ATC GAT TCT CGT TTT CAT GTT GTC GCC CCT CTC-3’) (SEQ. ID. Nr.9) . Tímto způsobem byla provedena mutace aminokyselin Asn a Leu na pozicích 231 a 232 FX-proteinu na Met a Lys . PCR-fragment se dodatečně parcielně štěpí pomocí Bstl20I a XmnI (Obr. 2E).
Pro přípravu Pro-Glň-Gly-Arg/Ile FXa-štěpného místa byl použit jako 5’-primer oligonukleotid # 1001 (5’-CCC AGA GGG CCC TAC CCC TGT-3’ (SEQ. ID. Nr.3) a jako 3’-primer oli gonukleotid # 1016 (5’-ACC AGA ATC GAT TCT TCC TTG GGG GTC GCC CCT CTC-3’) (SEQ. ID. Nr.8) . Tímto způsobem byla provedena mutace aminokyselin Asn, Leu a Thr na pozicích 231, 232 a 233 FX-proteinu na Pro, Gin a Gly . PCR-fragment se dodatečně parcielně štěpí pomocí Bstl20I a XmnI (Obr. 2H).
Pro přípravu IIe-Glu-Gly-Arg/Ile FXa-štěpného místa byl použit jako 5’-primer oligonukleotid # 1001 (5’-CCC ACA GGG CCC TAC CCC TGT-3’ (SEQ. ID. Nr.3) a jako 3’-primer oli gonukleotid # 1015 (5’-ACC AGA ATC GAT TCT TCC CTC GAT GTT GTC GCC CCT CTC-3’ (SEQ. ID. Nr.10) . Tímto způsobem byla provedena mutace aminokyselin Asn, Leu a Thr na pozici 231 až 233 FX-proteinu na Ile, Glu a Gly . PCR-fragment se do- - 48 ·~· ·, * · Μ • · · • V Ψ • « · • 4 ·#·
V • f 99 9 · · · ♦ ? Μ ·· datečně parcielně štěpí pomocí Bstl20I a XmnI (Obr. 2F).
Pro přípravu Arg-Arg-Lys-Arg/Ile furin-štěpného místa , byl použit jako 5’-primer oligonukleotid # 1001 (5’-CCC ACA GGG CCC TAC CCC TGT-3 ’ (SBQ. ID'. Nr.3) a jako 3’-primer oligonukleotid # 1006 (5 ’ - ACC AGA ATC GAT TCT TTT CCT CCT GTT GTC GCC CCT CTC-3’ (SEQ. ID. Nr.H) . Tímto způsobem byla provedena mutace aminokyselin Asn, Leu a Thr na pozici 231 až 233 na Arg, Arg a Lys . PCR-fragment se dodatečně štěpí, pomocí Bspl20I a XmnI (Obr. 2G).
Pro přípravu Arg-Val-Arg-Arg/Ile furin-štěpného místa byl použit jako 5’-primer oligonukleotid # 1001 (5’-CCC ACA GGG CCC TAC CCC TGT-3’ (SEQ. ID. Nr.3) a jako 3’-primer oligonukleotid # 1007 (5’-ACC AGA ATC GAŤ TCT CCT CAC CCT GTT GTC GCC CCT CTC-3’ (SEQ. ID. Nr.12) . Tímto způsobem byla provedena mutace aminokyselin Asn, Leu a Thr . na pozici 231 až 233 na Arg, Val a Arg . PCR-fragment se dodatečně parcielně štěpí pomocí Bspl20I a XmnI (Obr. 2G).
Pro přípravu Arg-Arg-Arg-Arg/Ile furin-štěpného místa byl použit jako 5’-primer oligonukleotid # 1001 (5’-CCC ACA GGG CCC TAC CCC TGT-3’ (SEQ. ID. Nr.3) a jako 3’-primer oligonukleotid # 1008 (5’-ACC AGA ATC GAT TCT CCT CCT GTT GTC GCC CCT CTC-3’ (SEQ. ID. Nr.13) . Tímto způsobem byla provedena mutace aminokyselin Asn, Leu a Thr na pozici 231 až 233 na Arg, Arg a Arg . PCR-fragment se dodatečně parcielně štěpí pomocí Bspl20I a XmnI (Obr. 2G).
Pro přípravu Arg-Pro-Lys-Arg/Ile furin-štěpného místa byl použit jako 5’-primer oligonukleotid # 1001 (5’-CCC ACA GGG CCC TAC CCC TGT-3’ (SEQ. ID. Nr.3) a jako 3’-primer oligonukleotid # 1009 (5’-ACC AGA ATC GAT TCT TTT GGG CCT GTT GTC GCC CCT CTC-3’ (SEQ. ID. Nr.14) . Tímto způsobem byla provedena mutace aminokyselin Asn, Leu a Thr ná'pozici 231 až 233 na Arg, Pro a Lys . PCR-fragment se’dodatečně parcielně štěpí pomocí Bspl20I a XmnI (Obr. 2G).
Pro přípravu Ile-Arg-Lys-Arg/Ile furin-štěpného místa byl použit jako 5’-primer oligonukleotid # 1001 (5’-CCC ACA GGG CCC TAC CCC TGT-3 ’ (SEQ-. ID. Nr.3) a jako 3’-primer oligonukleotid # 1010 (5’-ACC AGA ATC GAT TCT TTT CCT GAT GTT GTC GCC CCT CTC-3’ (SEQ. ID.~ Nr. 15) . Tímto způsobem byla provedena mutace aminokyselin Asn, Leu a Thr na pozici 231 až 233 na Ile, Arg a Lys . PCR-fragment se dodatečně parcielně štěpí pomocí Bspl20I a XmnI (Obr. 2G).
Pro přípravu Arg-Ser-Lys-Arg/Ile furin-štěpného místa byl použit jako 5’-primer oligonukleotid #1001 (5’-CCC ACA GGG CCC TAC CCC TGT-3’ (SEQ. ID. Nr.3) a·.jako 3’-primer oligonukleotid #1011 (5.’ -ACC AGA ATC GAT TCT TTT GCT CCT GTT GTC GCC CCT CTC-3’ (SEQl/lD. Nr.16) .Tímto způsobem byla provedena mutace aminokyselin Asn, Leu a Thr na pozici 231 až 233 na Arg, Ser a Lys . PCR-fragment se dodatečně parcielně štěpí pomocí Bspl20I a XmnI (Obr. 2G).
Pro přípravu Arg-Val-Thr-Arg/Ile furin-štěpného místa byl použit jako 5’-primer oligonukleotid # 1001 (5’-CCC ACA GGG CCC TAC CCC TGT-3’ (SEQ. ID. Nr.3) a jako 3’-primer oligonukleotid # 1012 (5’-ACC AGA ATC GAT TCT GGT CAC CCT GTT GTC GCC CCT CTC-3’ (SEQ. ID. Nr.17) . Tímto způsobem byla provedena mutace aminokyselin Asn a Leu na pozici 231 a 232 na Arg a Val . PCR-fragment se dodatečně parcielně štěpí pomocí Bspl20I a XmnI (Obr. 2G).
Pro přípravu Arg-Leu-Lys-Arg/Ile furin-štěpného místa - 50
4» · · ♦ '·» ··· byl použit jako 5’-primer oligonukleotid # 1001 (5’-CCC ACA GGG CCC TAC CCC TGT - 3 ’ (SEQ. ID. Nr.3) a jako 3’-primer oligonukleotid # 1013 (5’-ACC AGA ATC GAT TCT TTT GAG CCT GTT GTC GCC CCT CTC-3’ (SEQ. ID. Nr.18) . Tímto způsobem byla provedena mutace aminokyselin Asn a Thr na pozici 231 a 233 na Arg a Lys . PCR-fragment se dodatečně parcielně štěpí pomoci Bspl20I a XmnI (Obr. 2G).
Pro přípravu Thr-Ser-Thr-Arg/Ile FXIIa-štěpného místa byl použit jako 5’-primer oligonukleoxid # 1001 (5’-CCC ACA GGG CCC TAC CCC TGT-3’ (SEQ. ID. Nr.3) a jako 3’-primer oligonukleotid # 1017 (5’-ACC AGA ATC GAT TCT CGT GCT CGT GTT GTC GCC CCT CTC-3’ (SEQ. ID. Nr.19) . Tímto způsobem byla provedena mutace aminokyselin Asn a Leu na pozici 231 a 232 FX-proteinu na Ile a Lys . PCR-fragment se dodatečně parcielně štěpí pomocí Bstl20I a XmnI (Obr. 21). 6.2 Konstrukce expresních plasmidů pro přípravu FXp-analogů
Tyto konstrukty jsou odvozeny od konstruktů dříve uvedených analogů faktoru X , do nichž byl vložen jeden TGA-stop-kodon na pozici 470. Při tom byly aminokyseliny od pozice 457 na cDNA-Level až ke stop-kodonu odstraněny natrá-vením působením Spěl a částečně BstEII a nahrazeny oligo-nukleotidovým párem # 0003 (5’-GTC ACC GCC TTC CTC AAG TGG ATC GAC AGG TCC ATG AAA ACC AGG TGA A-3’) (SEQ.ID Nr.20) a # 0004 (5’-CTA GTT CAC CTG GTT TTC ATG GAC CTG TCG ATC CAC TTG AGG AAG GCG-3’) (SEQ.ID.Nr.21). Schematické znázornění tohoto konstruktu analogu faktoru Χβ je uvedeno v obr.7. Pro zj ednodušení vyobrazení j sou všechny konstrukty analogu faktoru Χβ znázorněny jako obecný konstrukt, v němž jsou proměnlivé aminokyseliny v oblasti místa štěpení znázorněny jako stínované "X". 6.3 Konstrukce expresních plasmídů pro přípravu FXa-analogů
Aktivací faktoru X odštěpením 4,5 kDa-aktivačního pep-tidu na N-konci těžkého řetězce vznikne forma faktoru Xaa. Tato forma se potom přemění působením autoproteolytické aktivity a odštěpením C-konce těžkého řetězce mezi Arg 469 a Gly 470 na formu FXap . Pro přípravu expresních plasmidů faktoru X , vedoucích k tvorbě analogů faktoru X , které se po aktivaci vyskytují výhradně ve formě FXaa s intaktním β-peptidem, byla provedena záměna aminokyseliny Arg 469 na Lys, takže nemohlo docházet k žádné přeměně na C-konci těžkého řetězce.
Proto byla DNA-sekvence faktoru X kódující C-koncovou sekvenci aminokyselin odstraněna od pozice 1363 až ke stop-signálu částečným naštěpením pomocí BstEII-Spel a nahrazena dvěma vaznými oligonuklěotidovými páry. Oligonukleó-tid # 0005 (5 ’ -GTC ACC GCC TTČ CTC AAG TGG ATC GAC AGG TCC ATG AAA ACC AAG GGC TTG CCC AAG-3’) (SEQ.ID Nr.22) a oligo-nukleotid # 0006 (5’-TTG GCC TTG GGC AAG CCC TTG GTT TTC ATG GAC CTG TCG ATC CAC TTG AGG AAG GCG-3’) (SEQ. ID.Nr. 23) byly ligovány s oligonukleotidem # 0007 (5’-GCC AAG AGC CAT GCC CCG GAG GTC ATA ACG TCC TCT CCA TTA AAG TGA GAT CCC A-3’) (SEQ.ID Nr.24) a oligonukleotidem # 0008 (5’-CTA GTG GGA TCT CAC TTT AAT GGA GAG GAC GTT ATG ACC TCC GGG GCA TGG CTC-3’) (SEQ.ID.Nr.25). Mutace aminokyseliny Arg 469 byla provedena oligonukleo-lidovým párem # 0005-# 0006. Schematické znázornění FX-analogu je uvedeno v obr. 7. - 52 I ♦ • 9 ♦ ·· ··· ♦·· Přiklad 7
Stanoveni N-konce faktoru X a produktů jeho přeměny s rFurinem a bez rFurinu
Rekombinantní faktor X byl exprimován v CHO-buňkách s endogenním furinem, jak bylo popsáno v příkladu 1, resp. ve furin-deficitních buňkách, jak bylo popsáno v příkladu 5. Izolace rFaktoru X byla provedena jednak z a) předběžně neupravené b) inkubované 12 hodin při 37 °C a c) 12 hodin při 37 °C s CHO-rFurinem upravené buněčné kultury vysoce exprimujícího CHO-rFX-klonu a jednak z d) předběžně neupravené a e) 12 hodin při 37 °C s CHO-rFurinem upravené buněčné kultury klonu CHO-FDll-fRX. Vzniklá N-koncová aminokyselina faktoru X a produktů přeměny při reakčních podmínkách a) až e) byla stanovena Edmanovou analýzou. V obr. 8 je uvedeno schematické znázornění dosažených výsledků. , rFaktor X z vysoce exprimujících CHO-buněk se vyskytuje ve formě zralého těžkého a lehkého řetězce a rovněž v jednořetězcové formě, která částečně obsahuje propeptid. Po inkubaci supernatantu této buněčné kultury po dobu 12 hodin při 37 °C (b) vznikají navíc, jak popsali již Volf a spol. (1991, J.Biol.Chem. 266:13726-13730), chybné N-koncovky lehkého řetězce rFX s třemi přídavnými aminokyselinami Val38-Thr39-Arg40. Tyto kryptické konce byly nalezeny i při sekvenováni rFX-materiálu z neupravených CHO-FD11-buněk (d) . Z těchto pozorování vyplývá, že výskytu těchto chybných N-koncovek je možno zabránit minimalizací rFX-proteolýzy působením CHO-proteas, jestliže se použijí vhodné reakční nebo buněčné podmínky, odpovídající způsoby skladování a odpovídající čisticí postupy.
Na rozdíl od čištěného materiálu z CHO-buněk (a a b) je rFX z neamplifikováných furindeficitních buněk (d) pří- · tomen pouze ve formě neupraveného jednořetězcového prekur-zoru. Nebyly nalezeny ani žádné N-koncové sekvence, které by odpovídaly podílu propeptidu. Tím bylo prokázáno·, že úprava jednořetězcového prekurzoru rFX v lehkém/těžkém řetězci ve furin-deficitních CHO-buňkách (d) již neprobíhá, což ukazuje na hlavní roli endoproteasy furinu v tomto operačním kroku probíhajícím in vivo.
Dodatečně bylo prokázáno, že přeměna rFX-molekul obsahuj ících propeptid probíhá i ve furin-deficitních CHO-buňkách, takže furin nemá při úpravě v podmínkách in vivo žádnou podstatnou úlohu. Po inkubaci rFX z CHO-buněk (c) a z CH0-FD11-buněk (e) za přítomnosti furinu byly nalezeny lehké a těžké řetězce se správnými N-konci. Tím bylo prokázáno, že jak jednořetězcové. prekurzory FX, tak také rFX-molekuly, obsahujcí, propeptid, sé při zpracování in vitro přeměňuji na homogenní zralý faktor X. Faktor X , připravovaný za přítomnosti furinu, vykazoval kromě toho mimořádnou strukturní integritu a homogenitu. Příklad 8
Exprese a charakterizace FX-analogu s furinovým místem štěpení Arg-Arg-Lys-Arg/IIe (rFX RrkR/I)
Pro výrobu rekombinantního rFX^^^/^-proteinu se FX-expresní plasmid se štěpným místem Arg-Arg-Lys-Arg/Ile (viz příklad 6.1, obr. 2G) a selekční plasmid pSV/dhfr ko-transfikule do CHO-buněk, jak je popsáno v příkladě 1. Analysa Vestern Βίοι supernatantu buněčné kultury (obr. 9) ukazuje, že se rekombinantní protein vyskytuje převážně ve dvouřetězcové formě. Ve srovnání s plasmovým FX má těžký řetězec 46 kD namísto 50 kD, z čehož je'možno.pravděpodobně usuzovat na různé zcukření rekombinantního proteinu. Dodatečně jsou, jak již bylo pozorováno při expresi divokého typu rFX (příklad 1 b) , patrná nepatrná množství jedno-řetězcových prekursorů (SC) , jakož i LC4- i soforma lehkého řetězce. Tyto molekulární formy analogu rFX poukazují na limitování jak přeměny jednořetězcového FX-prekursoru endogenními proteasami, tak také gama-karboxyláce lehkého řetězce. Ačkoliv štěpná místa,' zavedená do analogu FX , representují furin-konsensus-sekvenci, nejsou patrné žádné proteinové pásy, které by odpovídaly aktivovaným formám proteinu (35 kD, 31 kD) . Struktura v oblasti štěpného místa, jakož i odpovídající aminokyselinová sekvence, mohou vést k tomu, že přeměna modifikovaného aktivačního.místa furinem představují pouze suboptimální podmínky. P ř i k 1 a d 9 *
In vitro aktivace rFX^^^/^-proteinu deriváty rFurinu
Aktivovatelnost rekombinantního FX-analogu na a (35 kD) a β (31 kD) FXa formy pomocí rFurinu in vitro se testuje stejně, jako je popsáno v příkladě 2 pro směsné experimenty, s tím rozdílem, že se použijí čištěné deriváty rFurinu rFurin<ů Cys-spacer-lOxHis, popsané v patentové přihlášce EP 0 775 750 A2 , v 10 mM Hepes, pH 7,0, 150 mM NaCl, 2 mM CaCl2 a 0,2% BSA namísto CHO-rFurin supernatantů. V kontrolním pokusu bez rFurinu se supernatant CHO-rFX-analogu smísí s pufrem 10 mM Hepes, pH 7,0, 150 mM NaCl, 2 mM CaCl2 a 0,2% BSA v poměru 1:1. Alikvotní části vsázek před a po inkubačních dobách 6, 24, 48 a 72 hodin (t = 0, 6, 55 55 • · · · • · · ♦ ··· ··« • · • 9 ♦« ♦ · · t · · • · · * t ·· ··· ··· ··· 24, 48, 72) při teplotě 37 °C se testuj i pomocí Vestern-Blot analysy a rFX-aktivaci (obr. 10). Zatímco pás za nepřítomnosti derivátu rFurinu samotného je po dvaasedmdesátihodinové inkubaci nezměněn (obr. 10B) , je za přítomnosti rurinu již po 6 hodinách (obr. 10A, stopa 5) patrný 35 kD těžký proteinový pás, který odpovídá a-formě plásmatického FX (obr. 10A, stopa 9) . V průběhu inkubace akumuluje tato α-forma a po 72 hodinách inkubace (obr. 10A, stopa 8) je asi 50 % výchozího materiálu (HC) zreagováno na aktivovanou formu. Přídavný 31 kD těžký proteinový pás, který je patrný po 24 hodinách (obr. 10A, stopa 6) a odpovídá β-formě aktivovaného plasmatického FX (obr. 10A, stopa 9), ukazuje, že α-forma, vzniklá z rekombinantního analogu FX , má autoproteolytickou aktivitu a je tedy funkční.
Tyto výsledky dokazují, že heterologiií aktivační štěpné místo Arg-Arg-Lys-Arg/Ile ,v analógu.rFX se derivátem rFurinu in vitro specificky rozezná a korektně'štěpí a je tedy vhodné pro aktivaci analogu rFX na α-FXa a β-FXa molekuly. Příklad 10
Funkcionalita rekombinantního analogu FX rFX^^/^, aktivovaného in vitro
Alikvotni části směsných pokusů z příkladu 9 se zkou-maji na FXa-aktivitu pomocí chromogenního testu. K tomu se smísí vzorek s chromogenním substrátem S2337 (600 μΜ) v 50 mM Tris, pH 7,3, 150 mM NaCl, 0,1% BSA . Po inkubační době 3 minut při teplotě 37 °C se reakce ukončí přídavkem 20 % kyseliny octové a potom se měří OD při 405 nm . Ve srovná- - 56 - 56
·· · ·· ·« ♦ · · · ··♦ · ·%· #»♦ • · ♦ · «· ní s kalibrační křivkou, získanou pomocí čištěného, RW-ak-tivovaného plasmatického FXa , se stanoví množství rekombi-nantní FXa-aktivity v reakčních vsázkách. Výsledky této analysy, použitá množství antigenu (ELISA-hodnoty) , jakož i z tohb vypočítané specifické aktivity, jsou uvedené v tabulce 2 .
Aby se vyloučily nespecifické amidolytické aktivity v roztoku rFurinu a supernatantu CHO-buněčné kultury, byla zkoušena také směs supernatantu netransfikovaných CHO-buněk s čištěným derivátem rFurinu na FXa-aktivitu (CHO + rFurin). V této směsi nebyla, stejně jako u směsi rFX-analog/pufr (rpxRRKR/1 + pufr) , také po inkubaci po dobu 72 hodin naměřena žádná FXa-aktivita. Na rozdíl od toho byla u rFX^RKR/I/rFurin-reakce již po 6 hodinách inkubace měřitelná rFXa-aktivita 56 mU , která v průběhu inkubace konstantně vzrůstá a po 72 hodinách dosáhne hodnoty 133 mU. Ačkoliv po tomto časovém období je podle Vestern Bot analysy zreagovaná pouze asi polovina rFX-analogu na aktivované a-a β-formy (obr. 10A, stopa 8) , dosáhne in vitro aktivovaný rFX-analog-materiál se 190 mU/pg podstatně vyšší specifické aktivity než pomocí RW úplně aktivovaný plasmatický FX (153 mU/pg). Naměřená zvýšení aktivity se obráží ve výskytu a- a β-forem podle Vestern Βίοι analysy (obr. 10A, stopy 5 až 8) . Tím vbylo dokázáno, že do FX mohou být zabudovaná štěpná místa heterologních proteas, tato jsou příslušnými proteasami rozeznána a štěpena a může se rekombinantně vyrobit vysoce cenný rFXa (nebo popřípadě analogy rFXa s FXa-aktivitou) ve funkční formě. - 57 ΦΦ· * Φ • Φ Φ Φ (Φ Φ φ φ · ' Φ · , Φ • # · Φ-Φ Φ Φ # ·Φ Φ·'Φ , φ φ φ φφφ ΦΦ ΦΦ
Tabulka 2
- '4 * · -*k - -* T Inkubace, -hodiny , -i. -Aktivita mU/ml . ‘Množství.' . antigenu, pg/ml « specifická-aktivita mU/mg rFXRRKR/I+ 0 r . <25 0,7 0 pufr 6 <25 ' 0,7 0 24 <25 0,7 0 48 <25 0,7 0 72 <25 0,7 0 rFXRRKR+ 0 • <25 0,7 0 rFurin 6 56 0,7 80 24 101 0,7 144 48 124 0,7 177 72 133 0,7 190 CHO + 0 <25 0 rFurin 6 <25 0 24 ' <25 0 48 • . <25 ' 0 72 <25 0 Plasma FX 614 4 153 aktivovaný RW Příklad 11 Ιη vitro aktivace analogu rFX se FXIa-štěpným místem Asp-Phe-Thr-Arg/Val (rFX^R^R/^) plasmatickým FXIa
Mutagenesí FX-aktivační sekvence na FXIa-štěpné místo se vyrobí konstrukt FX-analogu. Potom se připraví stabilní CHO-buněčné klony, které tyto molekuly exprimují. Superna-tant CHO-buněčné kultury s rFX^F^R/^ se smísí s čištěným plasmatickým FXIa (100 pg/ml) za přítomnosti 10 mM Tris, 58 ·« ♦ t « ♦ • - · '· · ♦·♦ ··♦ pH 7,3, 150 mM NaCl, 8 mM CaCl2, PCPS a 0,1% BSA a po různé doby se inkubuje při teplotě 37 °C . Jako negativní kontrola se inkubuje supernatant buněčné kultury pouze s BSA-obsahuj ícím pufrem. rFX^RTR/^ -protein a výsledné produkty aktivace se charakterisiij i pomocí Vestern Blot analysy (obr. 11) . Jak je patrné ve směsi bez FXIa před inkubací « (t = 0) , je rekombinantní protein (obr. 11, stopa 5) sek- retován prakticky identicky jako plasmatický FX (stopa 2) * ve dvouřetězcové formě s tím rozdílem, že těžký řetězec (HC) t nni/n má stejně, jak bylo pozorováno u ΓρχΛΛΛ-Λ z příkladu 8 , poněkud nižší molekulovou hmotnost než 50 kD . Během inkubace této směsi při teplotě 37 °C (obr. 11, stopa 6) není patrná žádná podstatná změna pásu. Ve směsi CHO-rFX/FXIa jsou již krátce po přídavku čištěného FXIa ale před vlastní inkubací supernatantu buněčné kultury (obr. 11, stopa 3) patrné proteinové pásy 35 kD a 31 kD , které velikostí odpovídají plasmatickým a- a β-formám těžkého řetězce (obr. 11, stopa 9). Tyto obě formy po čtyřhodinové inkubaci s FXIa silně přibývají (obr. 11, stopa 4).
Tim bylo ukázáno, že analog FX , který nese hetero-logní proteasová štěpná místa pro ve srážecí kaskádě aktivní proteolytický enzym, může být také úspěšně přeměňován.
Konečně je výskytem rFXap-pásu, výsledkem autoproteo- * lytické aktivity rFXaa-aktivity, ukázána úspěšně funkční aktivita výsledného rFXaa-analogu. •1
Sekvenční protokol (1) Všeobecné údaje: (i) Přihlašovatel:'
(A) Jméno: IMMUNO AG (B) Ulice: Industriestrasse 67 (C) Místo: Wien . (D) Spolková,země: Rakousko (E) Země: Rakousko (F) PSČ: 1220 (A) Jméno: Michele Himmelspach (B) Ulice: Breitstetten 19 (C) Místo: Leopoldsdorf (D) Spolková země: Rakousko (E) Země: Rakousko 1 (F) PSČ: 2285 (A) Jméno: Uwe Schlokat (B) Ulice: Hauptstrasse 51 (C) Místo: Orth/Donau (D) Spolková země: Rakousko (E) Země: Rakousko (F) PSČ: 2304 (A) Jméno: Andreas Fisch (B) Ulice: Wiener Strasse 14 (C) Místo: Orth/Donau (D) Spolková země: Rakousko (E) Země: Rakousko (F) PSČ: 2304 60 ·· ► .· · » 1·· '·· (A) Jméno: Friedrich Dorner (B) Ulice: Peterlinigasse 17 (C) Místo: Wien (D) Spolková země: Rakousko (E) Země: Rakousko (F) PSČ: 1238 (A) Jméno: Johann Eibl (B) Ulice: Gustav Tschermakgasse 2 (C) Místo: Wien (D) Spolková země: Rakousko (E) Země: Rakousko (F) PSČ: 1180 (ii) Název vynálezu: Analogy faktoru X s modifikovaným štěpným místem proteas (iii) Počet sekvencí: 27 (iv) Počítačem čitelné znění: (A) Nosič dat: Floppy disk (B) Počítač: IBM PC compatible
(C) Pracovní systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Paten In Release #1.0,
Version #1.30 (EPA) (2) Údaje k sekvenci ID NO: 1: (i) Data sekvence (A) Délka: 34 párů basí (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec (D) Topologie: lineární 61 • '·
(ii) Druh molekuly: Genom-DNA iV . (xi) Popis sekvence: Sekvence ID N0:1: . ? ' ·· ΊΓ. ? ' - - ... *·*«·
ATTACTCGAG AAGCTTACCA TGGGGCGCCC ACTG i ** (2) Údaje k sekvenci ID NO: 2: (i) Data sekvence - (A) Délka: 24 párů basí (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec (D) Topologie: lineární
(ii) Druh molekuly: Genom-DNA (xi) Popis sekvence: Sekvence ID NO:2: ATTACAATTG CTGCAGGGAT CCAC (2) Údaje k sekvenci ID NO: 3: (i) Data sekvence (A) Délka: 21 párů basí (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec (D) Topologie: lineární
(ii) Druh molekuly: Genom-DNA
(xi) Popis sekvence: Sekvence ID NO:3: CCCACAGGGC CCTACCCCTG T - 62 - 62
• · (2) Údaje k sekvenci ID NO: 4: . , (i) Data sekvence (A) Délka: 37 párů basí (B) Druh: nukleotid * (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec (D) Topologie: lineární
(ii) Druh molekuly; Genom-DNA (xi) Popis sekvence: Sekvence ID NO:4: ACCAGTTAAC CCTGGTGAAG TCGTTGTCGC CCCTCTC • (2) Údaje k sekvenci ID NO: 5: (i) Data sekvence (A) Délka: 28 párů basí (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec (D) Topologie: lineární
; (ii) Druh molekuly: Genom-DNA t *· (xi) Popis sekvence: Sekvence ID NO: 5: '4
V ACCATCGCGA CCTGGTCAGG TTGTTGTC 1; (2) Údaje k sekvenci ID NO: 6: (i) data sekvence (A) Délka: 39 párů basí (B) Druh: nukleotid
63 (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec , (D) Topologie: lineární
- .r - = (li) "Druh molekuly :; Genom-DNA (xi) Popis sekvence: Sekvence ID NO:6: ACCAGAATCG ATTCTGGGTT TGATGTTGTC GCCCCTCTC (2) Údaje k sekvenci ID NO: 7: (i) Data sekvence (A) Délka: 39 párů basí (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec (D) Topologie: lineární \ ·.* ψ ' · "'
(ii) Druh molekuly:'· Genoin-DNA (xi) Popis sekvence: Sekvence ID NO:7: ACCAGAATCG ATTCTGGTCA TGCTGTTGTC GCCCCTCTC (2) Údaje k sekvenci ID NO: 8: (i) Data sekvence (A) Délka: 39 párů basí (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec (D) Topologie: lineární (ii) Druh molekuly: Genom-DNA (xi) Popis sekvence: Sekvence ID NO:8: ACCAGAATCG ATTCTTCCTT GGGGGTTGTC GCCCCTCTC (2) Údaje k sekvenci ID NO: 9: (i) Data sekvence (A) Délka: 39 párů basí (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec (D) Topologie: lineární
(ii) Druh molekuly: Genom-DNA (xi) Popis sekvence: Sekvence ID NO:9: ACCAGAATCG ATTCTCGTTT TCATGTTGTC GCCCCTCTC (2) Údaje k sekvenci ID NO: 10: (i) Data sekvence (A) Délka: 39 párů basí (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec (D) Topologie: lineární
(ii) Druh molekuly: Genom-DNA (xi) Popis sekvence: Sekvence ID NO: 10: ACCAGAATCG ATTCTTCCCT CGATGTTGTC GCCCCTCTC (2) Údaje k sekvenci ID NO: 11: (i) Data sekvence - 65 -
(A) Délka: 39 párů basí (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec - (D) Topologie: lineární
(ii) Druh molekuly: Genom-DNA (xi) Popis sekvence: Sekvence ID NO: 11: ACCAGAATCG ATTCTTTTCC TCCTGTTGTC GCCCCTCTC (2) Údaje k sekvenci ID NO: 12: (i) Data sekvence (A) Délka: 39 párů basí (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý,řetězec (D) Topologie: lineární
(ii) Druh molekuly: Genom-DNA r (xi) Popis sekvence: Sekvence ID NO: 12: ACCAGAATCG ATTCTCCTCA CCCTGTTGTC GCCCCTCTC (2) Údaje k sekvenci ID NO: 13: (i) Data sekvence (A) Délka: 39 párů basí (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec (D) Topologie: lineární
(ii) Druh molékuly: Genom-DNA • · 66 » β '4 · (xi) Popis sekvence: Sekvence ID NO: 13: ACCAGAATCG ATTCTCCTCC TCCTGTTGTC GCCCCTCTC (2) Údaje k sekvenci ID NO: 14: (i) Data sekvence (A) Délka: 39 párů basí (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec (D) Topologie: lineární
(ii) Druh molekuly: Genom-DNA (xi) Popis sekvence: Sekvence ID NO: 14: ACCAGAATCG ATTCTTTTGG GCCTGTTGTC GCCCCTCTC* (2) Údaje k sekvenci ID NO: 15: (i) data sekvence (A) Délka: 39 párů basí (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec (D) Topologie: lineární (ii) Druh molekuly: Genom-DNA (xi) Popis sekvence: Sekvence ID NO: 15:
ACCAGAATCG ATTCTTTTCC TGATGTTGTC GCCCCTCTC - 67 - - 67 -
(2) Údaje k sekvenci ID NO: 16: . ‘ . (i) Data sekvence , . (A) Délka: 39 párů basí (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec V ; · · _(D) Topologie: lineární_ -
^ (ii) Druh molekuly: Genom-DNA i (xi) Popis sekvence: Sekvence ID NO: 16: ACCAGAATCG ATTCTTTTGC TCCTGTTGTC GCCCCTCTC (2) Údaje k sekvenci ID NO: 17: (i) Data sekvence (A) Délka: 39 párů basí (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec (D) Topologie: lineární
(ii) Druh molekuly: Genom-DNA (xi) Popis sekvence: Sekvence ID NO: 17:
’ ACCAGAATCG ATTCTGGTCA CCCTGTTGTC GCCCCTCTC v (2) Údaje k sekvenci ID NO: 18: (i) Data sekvence (A) Délka: 39 párů basí (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec (D) Topologie: lineární
(ii) Druh molekuly: Genom-DNA (xi) Popis sekvence: Sekvence ID NO: 18: ACCAGAATCG ATTCTTTTGA GCCTGTTGTC GCCCCTCTC (2) Údaje k sekvenci ID NO: 19: (i) Data sekvence (A) Délka: 39 párů basí (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec (D) Topologie: lineární
(ii) Druh molekuly: Genom-DNA (xi) Popis sekvence: Sekvence ID NO: 19: ACCAGAATCG ATTCTCGTGC TCGTGTTGTC GCCCCTCTC (2) Údaje k sekvenci ID NO: 20: (i) Data sekvence (A) Délka: 49 párů basí (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec (D) Topologie: lineární (ii) Druh molekuly: Genom-DNA (xi) Popis sekvence: Sekvence ID NO: 20: 69 ·♦ ·· • · · ·
• · • · · « ··· «·· ♦ m • t Μ GTGACCGCCT TCCTCAAGTG GATCGACAGG TCCATGAAAA CCAGGTGAA (2) Údaje k sekvenci ID NO: 21: (i) Data sekvence , , ' (A) Délka: 48 párů basí (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec (D) Topologie: lineární
(ii) Druh molekuly: Genom-DNA (xi) Popis sekvence: Sekvence ID NO: 21: CTAGTTCACC TGGTTTTCAT GGACCTGTCG ATCCACTTGAGGAAGGCG (2) Údaje k sekvenci ID NO: 22: (i) Data sekvence , (A) Délka: 57 párů basí (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec (D) Topologie: lineární
(ii) Druh molekuly: Genom-DNA (xi) Popis sekvence: Sekvence ID NO: 22:
GTCACCGCCT TCCTCAAGTG GATCGACAGG TCCATGAAAA CCAAGGGCTT GCCCAAG (2) Údaje k sekvenci ID NO: 23: (i) Data sekvence (A) Délka: 57 párů basí (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec (D) Topologie:· lineární
(ii) Druh molekuly: Genom-DNA (xi) Popis sekvence: Sekvence ID NO: 23:
TTGGCCTTGG GCAAGCCCTT GGTTTTCATG GACCTGTCGA TCCACTTGAG GAAGGCG (2) Údaje k sekvenci ID NO: 24: (i) Data sekvence (A) Délka: 55 párů basí (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec (D) Topologie: lineární .
(ii) Druh molekuly: Genom-DNA (xi) Popis sekvence: Sekvence ID NO: 24: GCCAAGAGCC ATGCCCCGGA GGTCATAACG TCCTCTCCAT TAAAGTGAGA TCCCA (2) Údaje k sekvenci ID NO: 25: (i) Data sekvence (A) Délka: 54 párů basí (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec (D) Topologie: lineární - 71 - 71 «· #· • « · • · · ♦·· ··· • · ·♦ ·» é · · · • « · « <# • · ♦ · «· «·· «·
(ii) Druh molekuly: Genom-DNA (xi) Popis sekvence: Sekvence ID NO: 25: CTAGTGGGAT CTCACTTTAA TGGAGAGGAC GTTATGACCT CCGGGGCATG GCTC (2) Údaje k sekvenci ID NO: 26: (i) Data sekvence (A) Délka: 1467 párů basí (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec (D) Topologie: lineární
(ii) Druh molekuly: Genom-DNA (ix) Znak:
(A) Jméno/klíč: CDS (B) Poloha: 1..1467 (xi) Popis sekvence: Sekvence ID NO: 26: ATG GGG CGC CCA CTG CAC CTC GTC CTG CTC AGT GCC TCC CTG GCT GGC . 43
Met Gly Arg Pro Leu Kis Leu Val Leu Leu Ser A.la Ser Leu A.la Glv « 1 5 10 15 ♦ CTC CTG CTG CTC GGG GAA AGT CTG TTC ATC CGC AGG GAG CAG GCC AAC 96 * Leu Leu Leu Leu Gly Glu Ser Leu Phe Ile Arg Arg Glu Gin Ala A.sn % 20 25 30 AAC ATC CTG GCG AGG GTC ACG AGG GCC AAT TCC TTT CTT GAA GAG ATG 144 A.sn Ile Leu Ala A.rg Val Thr Arg Ala A.sn Ser Phe Leu Glu Glu Met 35 40 45 AAG AAA GGA CAC CTC GAA AGA GAG TGC ATG GAA GAG ACC TGC TCA TAC 192
Lys Lys Gly Kis Leu Glu Axg Glu Cys Met Glu Glu Thr Cys Ser Tyr 50 55 60 GAA GAG GCC CGC GAG GTC TTT GAG GAC AGC GAC AAG ACG AAT GAA TTC 24 0
Glu Glu Ala Aurg Glu Val Phe Glu Aap Ser Asp Lys Thr Asn Glu Phe 65 - 70 75 80 - 72 *·· ·« « Μ ·< TGG ΑΑΤ ΑΑΑ TAC ΑΑΑ GAT GGC GAC CAG Trp Asn Lys - Tyr Lys Asp Gly Asp Gin 85
AAC CAG GGC AAA TGT AAA GAC GGC CTC
Asn Gin Gly Lys Cys Lys Asp Gly Leu „ 4 ·, . -10 0 , ^ 105 TTA GAA GGA TTC GAA GGC AAA AAC TGT .Leu Glu Gly Phe Glu Gly Lys Asn Cys 'lis- 120
TGC AGC CTG GAC AAC GGG GAC TGT GAC
Cys Ser Leu Asp Asn Gly Asp Cys Asp 130 135
AAC TCT GTG GTG TGC TCC TGC GCC CGC
Ash Ser Val Val Cys Ser Cys Ala A.rg 145 150
TGT GAG ACC AGT CCT TGC CAG 28S
Cys Glu Thr Ser Pro Cys Gin 50 95 GGG GAA TAC ACC TGC ACC, TGT 336
Gly Glu Tyr Thr Cys Thr Cys HO GAA TTA TTC ACA CGG AAG CTC 384
Glu Leu Phe Thr Arg Lys Leu 125 CAG TTC TGC CAC GAG GAA CAG 432
Gin Phe Cys His Glu Glu Gin 140
GGG"'TAC ACC CTG GCT GAC AAC 48C
Gly Tyr Thr Leu Ala Asp Asn 155 160
GGC AAG GCC TGC ATT CCC ACA, GGG CCC TAC CCC TGT GGG AAA CAG ACC 52S
Gly Lys Ala Cys Ile Pro Thr Gly Pro Tyr Pro Cys Gly Lys Gin Thr 165 170 175 CTG GAA CGC AGG AAG AGG TCA GTG GCC CAG GCC ACC AGC A.GC AGC GGG . 5 76
Leu Glu Arg Arg Lys Arg Ser Val Ala Gin Ala Thr Ser Ser Ser Gly 180 185 190 GAG GCC CCT GAC AGC ATC ACA TGG AAG CCA TAT GAT GCA GCC GAC CTG 624
Glu Ala Pro A.sp Ser Ile Thr Trp Lys Pro Tyr Asp Ala Ala Asp Leu 195 200 205 GAC CCC ACC GAG AAC CCC TTC GAC CTG CTT GAC TTC AAC CAG ACG CAG 672
Asp Pro Thr Glu Asn Pro Phe Asp Leu Leu Asp Phe A.sn Gin Thr Gin 210 215 220 CCT GAG AGG GGC GAC AAC AAC CTC ACC AGG ATC GTG GGA GGC CAG GAA 72 0
Pro Glu Arg Gly Asp Asn A.sn Leu Thr Arg Ile Val Gly Gly Gin Glu 225 230 235 240 TGC AAG GAC GGG GAG TGT CCC TGG CAG GCC CTG CTC ATC AAT GAG GAA 768
Cys Lys Asp Gly Glu Cys Pro Trp Gin A.la Leu Leu Ile Asn Glu Glu 245 250 255 AAC GAG GGT TTC TGT GGT GGA ACT ATT CTG AGC GAG TTC TAC ATC CTA 815
Asn Glu Gly Phe Cys Gly Gly Thr Ile Leu Ser Glu Phe Tyr Ile Leu 260 265 270 ACG GCA GCC CAC TGT CTC TAC CAA GCC AAG AGA TTC AAG GTG AGG GTA 8 64
Thr Ala Ala His Cys Leu Tyr Gin Ala Lys Arg Phe Lys Val Arg Val 275 280 285 GGG GAC CGG AAC ACG GAG CAG GAG GAG GGC GGT GAG GCG GTG CAC GAG 912
Gly Asp Arg, Asn Thr Glu Gin Glu Glu Gly Gly Glu Ala Val His Glu * ♦ ·· ♦· 73 ·· «·· • ·* ♦ · « · ♦ · .· , * « · * * · ·*· ··· ♦ · « · ·· *♦· * ·'* ·· GTG ’GAG GTG GTC ATC AAG CAC AAC CGG TTC ACA AAG GAG ACC TAT GAC Val Glu Val Val Ile Lys His Asn Arg Phe Thr Lys Glu Thr Tyr Asp 305 310 315 320 TTC GAC ATC GCC GTG CTC CGG CTC AAG ACC CCC ATC ACC TTC CGC ATG ... - Phe-Asp .Ile Ala Val Leu Arg Leu Lys Thr Pro Ile Thr Phe Arg Met 325 330 " 335 ” AAC GTG GCG CCT GCC TGC CTC CCC GAG CGT GAC TGG GCC GAG TCC ACG Asn-Val Ala Pro Ala Cys Leu. Pro Glu Arg Asp Trp Ala Glu Ser Thr 340 345 350 CTG ATG ACG CAG AAG ACG GGG ATT GTG AGC GGC TTC GGG CGC ACC CAC Leu Met Thr Gin Lys Thr Gly Ile Val Ser Gly Phe Gly Arg Thr Eis 355 360 ' 365 GAG AAG GGC CGG CAG TCC ACC AGG CTC AAG ATG CTG GAG GTG CCC TAC Glu Lys Gly Aurg Gin Ser Thr Arg Leu Lys Met Leu Glu Val Pro Tyr 370 375 - 380 GTG GAC CGC AAC AGC TGC AAG CTG TCC AGC AGC TTC ATC ATC ACC CAG Val A.sp Arg A.sn Ser Cys Lys Leu Ser Ser Ser Phe Ile Ile Thr Gin 385 390 395 400 960 1008 1055 1104 1152 1200 1248 AAC ATG TTC TGT GCC GGC TAC GAC ACC AAG CAG GAG GAT GCC TGC CAG Asn Met Phe Cys A.la Gly Tyr A.sp Thr Lvs Gin Glu A.sp Ala Cys Gin 405 . 410 - 415' GGG GAC AGC GGG GGC CCG CAC GTC ACC CGC TTC AAG GAC ACC TAC TTC 12 96
Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Val Thr Arg Phe Lys A.sp Thr Tyr Phe 420 425 430 GTG ACA GGC ATC GTC AGC TGG GGA GAG AGC TGT GCC CGT AAG GGG AAG 1344
Val Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Glu Ser Cys Ala A.rg Lys Gly Lys 435 440 445 TAC GGG ATC TAC ACC AAG GTC ACC GCC TTC CTC AAG TGG ATC GAC AGG 139-
Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys Val Thr Ala Phe Leu Lys Trp Ile A.sp A.rg 450 455 460
TCC ATG AAA ACC AGG GGC TTG CCC AAG GCC AAG AGC CA.T GCC CCG GAG
Ser Met Lys Thr Arg Gly Leu Pro L.vs Ala Lys Ser His Ala Pro Glu 465 470 475 480 GTC ATA. ACG TCC TCT CCA TTA AAG TGA. ★
Val Ile Thr Ser Ser Pro Leu Lys 485 1467
74 - U
* ·· ·· ·· · · · « • · I · · • · ··-· ··« * · 9 ··· «» ·· .(2) Údaje k sekvenci ID NO: 27: (i) Pata sekvence (A) Délka: 489 aminokyselin ,^η (B) Druh: aminokyseliny (D) Topologie: lineární (ii) Druh molekuly:. Protein · (xi) Popis sekvence: Sekvence ID NO: 27:
Glu Gly Lys Asn 120 Asn Gly Asp Cys 135 Cys Ser Cys Ala 150 Ile Pro Thr Gly 165 Lys Arg Ser Val
Leu Leu Ser Ala 10 Phe Ile Arg Arg 25 Ala Asn Ser Phe.
Met Gly Arg Pro i
Leu Leu Leu Leu 20
Asn Ile Leu Ala 35
Lys Lys Gly Kis 50
Glu Glu Ala Arg 65
Trp Asn Lys Tyr
Asn Gin Gly Lys 100
Leu Glu Gly Phe 115
Cys Ser Leu Asp 130
Asn Ser Val Val 145
Gly Lys Ala Cys
Leu Glu Arg Arg 180
Leu Eis Leu Val 5
Gly Glu Ser Leu
Arg Val Thr Arg 40
Leu Glu Arg Glu 55
Glu Val Phe Glu 70
Lys Asp Gly Asp 85
Cys Lys Asp Gly
Cys Met Glú Glu 60
Asp Ser Asp Lys 75
Gin Cys Glu Thr 90
Leu Gly Glu Tyr 105
Cys Glu Leu Phe
Asp Gin Phe Cys 140
Arg Gly Tyr Thr 155
Pro Tyr Pro Cys 170
Ala Gin Ala Thr 185
Ser Leu Ala Gly 15
Glu Gin Ala Asn 30
Leu Glu Glu Met 45
Thr Cys Ser Tyr
Thr Asn Glu Phe 80
Ser Pro Cys Gin 95
Thr Cys Thr Cys 110
Thr Arg Lys Leu 125
His Glu Glu Gin
Leu Ala Asp Asn 160 Gly Lys Gin Thr 175 Ser Ser Ser Gly 190 75 « · ' * * » •» · ·
Glu Ala Pro Asp Ser Ile Thr Trp Lys Pro Tyr Asp Ala Ala Asp Leu 195 200 205
Asp Pro Thr Glu Asn Pro Phe Asp Leu Leu Asp Phe Asn Gin Thr Gin 210 215 220
Pro Glu Arg Gly Asp Asn Asn Leu Thr Arg Ile Val Gly Gly Gin Glu 225 230 235 240
Cys Lys Asp Gly Glu Cys Pro Trp Gin Ala Leu Leu Ile Asn Glu Glu 245 250 255
Asn Glu Gly Phe Cys Gly Gly Thr Ile Leu Ser Glu Phe Tyr Ile Leu 260 265 270
Thr Ala Ala His Cys Leu Tyr Gin Ala Lys Arg Phe Lys Val Arg Val 275 280 285
Gly Asp Arg Asn Thr Glu Gin Glu Glu Gly Gly Glu Ala Val His Glu 290 295 300
Val Glu Val Val Ile Lys His A.sn Arg Phe Thr Lys Glu Thr Tyr Asp 305 310 315 320
Phe Asp Ile Ala Val Leu Arg Leu Lys Thr Pro Ile Thr Phe Arg Met 325 330 335
Asn Val Ala Pro Ala Cys Leu Pro Glu Arg Asp Trp Ala Glu Ser Thr 340 345 350
Leu Met Thr Gin Lys Thr Gly Ile Val Ser Gly Phe Gly Arg Thr His 355 360 365 '
Glu Lys Gly Arg Gin Ser Thr Arg Leu Lvs Met Leu Glu Val Pro Tyr 370 375 380
Val Asp Arg Asn Ser Cys Lys Leu Ser Ser Ser Phe Ile Ile Thr Gin 385 390 395 400
Asn Met Phe Cys Ala Gly Tyr Asp Thr Lys Gin Glu A.sp Ala Cys Gin 405 410 415 Λ *
Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Val Thr Arg Phe Lys Asp Thr Tyr Phe 420 425 430
Val Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Glu Ser Cys Ala Arg Lys Gly Lys 435 440 445
Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys Val Thr Ala Phe Leu Lys Trp Ile Asp Arg 450 455 460
Ser Met Lys Thr Arg Gly Leu Pro Lys Ala Lys Ser His Ala Pro Glu 465 470 475 480
Val Ile Thr Ser Ser Pro Leu Lys * \ 485
Claims (50)
- hJ Wji ^Br. Miloš VŠETEél» advokát 120 00 PRAHA 2. Háítova a Patentové nároky 1. Analog faktoru X , v y, z n a č u j -í c í se t í m , že má modifikaci v oblasti přírodně se vyskytujícího aktivačního štěpného místa faktoru Xa , přičemž modifikace představuje místo přeměny pro protěasu, která za přírodních podmínek sekvenci faktoru X na tomto místě neštěpí.
- 2. Analog faktoru X podle nároku 1, vyznačující se tím, že modifikace se týká alespoň jedné aminokyseliny uvnitř aminokyselinové sekvence aktivačního peptidu.
- 3. Analog faktoru X podle některého-z nároků 1 nebo 2, vyznačující se tím, že tato modifikace spočívá ve výměně minimálně jedné z aminokyselin v oblasti mezi Gly228 a Arg234, popřípadě Ile235 , vztaženo na číslováni aminokyselin podle obr. 1.
- 4. Analog faktoru X podle některého z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že obsahuje sekvenci faktoru X zahrnující Gly228-R6-R5-R4-R3-R2-Arg234/Rl , přičemž a) R1 je aminokyselina vybraná ze skupiny Ile, Val, Ser, Thr nebo Ala b) R2 je aminokyselina vybraná ze skupiny Pro, Gly, Lys nebo Arg c) R3 je aminokyselina Vybran4 ze skupiny Phe, Lys, - 77 • · » · · ·' '··’·· • ·· ·· ·· · I'#''· i .« * · · · · · · * · · Μ ··· ··· ♦ Met, Gin, Glu, Ser, Val, Arg nebo Pro d) R4 je aminokyselina vybraná ze skupiny Asp, Ilé, . Ser „Met, Pro", Thr, Arg nebo Lys , e) R5 je aminokyselina vybraná ze skupiny Asn, Lys, Ser, Glu, Gin, Ala, His nebo Arg a f) R6 je aminokyselina vybraná ze skupiny Asp, Phe, Thr, Arg, Leu nebo Ser.
- 5. Analog faktoru X podle některého z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že modifikace představuje místo přeměny pro proteasu, vybranou ze skupiny endoproteas, jako jsou kexin/Kex2, furin/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PÁCE 4, LPC/PC7, ze Skupiny serinproteas, jako jsou faktor Ila, faktor XIla, faktor Xla, faktor Xa nebo kallikrein, nebo derivát'těchto proteas. J '
- 6. Analog faktoru X podle některého z nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že má další modifikaci v oblasti C-koncové aminokyselinové sekvence faktoru X.
- 7. Analog faktoru X podle nároku 6 , vyznačující se tím, že má modifikaci v C-koncové části β-peptidického štěpného místa.
- 8. Analog faktoru X podle nároku 7, vyznačující se tím, že tato modifikace představuje mutaci, deleci nebo inserci v oblasti aminokyselinové sekvence faktoru X mezi pozicí aminokyseliny Arg469 a Ser476.I i 78 -
- 9. Analog faktoru X podle v y z' n a č u j ící se ,, . . _ňuje odštěpení β-peptidu.
- 10; ’ Analog faktoru X podle & - . vyznačující se ‘ β-peptidu faktoru X. fr Λ
- 11. Analog faktoru X podle vyznačující se stop-signál v oblasti C-konce
- 12. Analog faktoru X podle vyznačuj ící se některého z nároků 6 až 8, t í m , že modifikace zabra- nároku 6, tím, že zahrnuje deleci nároku 6, t i m , že zahrnuje translační sekvence faktoru X. nároku 11, t i m , že zahrnuje translační stop-signál na pozici aminokyseliny Lys470 sekvence faktoru X.
- 13. Analog faktoru X podle některého z nároků 1 až 12, vyznačující se tím, že tato modifikace v oblasti aktivačního peptidu umožňuje aktivaci analogu faktoru X na nativní faktor Xa , popřípadě analog faktoru Xa in vitro.
- 14. Analog faktoru X podle nároku 13, vyznačující se tím, že modifikace umožňuje aktivaci působením proteasy vybrané ze skupiny endoproteas, jako jsou kexin/Kex2, furin/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PÁCE 4, LPC/PC7, ze skupiny serinproteas, jako jsou faktor Ha, faktor XIIa, faktor Xla, faktor Xa nebo kallikrein, nebo derivátu těchto proteas. Analog faktoru X podle některého z nároků 1 až 12,
- 15. - 79 ♦ « < ·· · f % ·· ·. • ♦ • • · ··· • · · • • vyznačující se t í m , že tato modifikace umožňuje aktivaci analogu faktoru X na nativní faktor Xa popřípadě analog faktoru Xa in vivo. 't ,
- 16. Analog faktoru X podle nároku 15, . vyznačující se tím, že tato modifikace umožňuje aktivaci působením proteasy vybrané ze skupiny se-rinproteas, jako jsou faktor XIIa, faktor Xla, faktor Xa nebo kallikrein.
- 17. Analog faktoru X podle některého z nároků 1 až 16, vyznačující se tím, že se vyskytuje jako analog faktoru X s intaktním β-peptidem nebo jako C-termi-nálně zkrácený analog faktoru X .
- 18. Analog faktoru X podle některého z nároků 1 až 17, vyznačuj i c í se tím, že se vyskytuje jako jednořetězcová molekula . I , - ' ·
- 19. Rekombinantní DNA, kódující analog faktoru X podle některého z nároků 1 až 18, obsažené ve vektoru pro rekombinantní expresi kódovaného proteinu.
- 20. Preparát, obsahující čištěný analog faktoru X nebo jeho prekursorový protein, s modifikací v oblasti přírodně se vyskytujícího aktivačního místa faktoru X , přičemž modifikace představuje místo přeměny pro proteasu, která za přírodních podmínek sekvenci faktoru X na tomto místě neště- Pí ·
- 21. Preparát podle nároku 20, vyznačující se tím, že modifikace představuje místo přeměny pro proteasu, vybranou ze skupiny biba- i 80 • · · ·· *** ··· t«· ·· ♦· sických endoproteas, jako jsou kexin/Kex2, furin/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PÁCE 4, LPC/PC7, ze skupiny serinproteas, jako jsou faktor Ha, faktor Xlla, faktor Xla, faktor Xa nebo kallikrein..
- , . , 22- Preparát podle některého z nároků 20 nebo 21, vyznačující se t í m , že obsahuje analog faktoru X jako analog faktoru Xa. Ψ %
- 23. Preparát podle některého z nároků 20 nebo 21, vyznačující se t í m , že obsahuje analog faktoru X jako C-terminálně zkrácený analog faktoru X .
- 24. Preparát podle některého z nároků 20 až 23, vyznačující se tím, že obsahuje analog faktoru X ve formě jednořetězcové molekuly v isolované formě.
- 25. Preparát podle některého z nároků 20 až 24, vyznačující se tím, že obsahuje jednoře-tězcový analog faktoru X v enzymaticky inaktivní formě s čistotou alespoň 80 % , výhodně 90 % , obzvláště výhodně 95 % a neobsahuje žádné inaktivní proteolytické intermediá-ty analogů faktoru X/Xa
- 26. Preparát podle některého z nároků 20 až 25, vyznačující se tím, že obsahuje analog faktoru X jako dvouřetězcovou molekulu v isolované formě.
- 27. Preparát podle některého z nároků 20 až 26, vyznačující se tím, že obsahuje analog faktoru X , vykazující modifikaci, umožňující in vitro aktivaci analogu faktoru X na nativní faktor Xa , popřípa- dě analog faktoru Xa.
- 28. Preparát podle" některého z nároků 20 až 27, vy z n ač u j_í c i . se t i m ,_že je formulován jako. farmaceutický preparát.
- 29. Preparát podle některého z nároků 20 až 28, vyznačující se tím, že se vyskytuje ve vhodném zařízení, přednostně v aplikátoru, v kombinaci s proteasou vybranou ze skupiny endoproteas, jako jsou kexin/Kex2, furin/PACE, PC1/PC3 j PC2, PC4, PACE4, LPC/PC7, ze skupiny serinproteas, jako jsou faktor Ila, faktor XIIa, faktor Xla, faktor Xa nebo kallikrein, nebo derivátem těchto proteas.
- 30. Preparát podle nároku 29, vyznačující se tím, že jednotlivé složky jsou vzájemně prostorově odděleny. .··
- 31. Preparát podle některého z nároků 20 až 26 , vyznačující se tím, že obsahuje analog faktoru X , který má modifikaci, která umožňuje aktivaci analogu faktoru X na nativní faktor Xa , popřípadě analog -faktoru Xa , in vivo.
- 32. Preparát obsahující čištěný analog faktoru Xa s vysokou stabilitou a strukturní integritou, který neobsahuje zejména inaktivní intermediáty analogů faktoru X /Xa a produkty autoproteolytického odbourávání faktoru X a který je získatelný aktivací analogu faktoru X podle některého z nároků 1 až 19.
- 33. Preparát podle některého z nároků 20 až 32, vyznačující se t í m , že obsahuje fyziolo- » gicky akceptovatelný nosič a je v pro skladování stabilní * formě.
- 34. Preparát podle některého z nároků 20 až 33, vyznačující se tím, že obsahuje případně jako další složku krevní faktor nebo aktivovanou formu krevního faktoru.
- 35. Preparát podle nároku 34, vyznačující se tím. že' obsahuje jako další složku minimálně jednu komponentu s faktor VIII bypassovou aktivitou.
- 36. Preparát podle některého z nároků 20 až 35, vyznačuj ící . s e tím , že je formulován jako farmaceutický přípravek a vyskytuje se popřípadě jako ví-cekomponentní preparát.' . .
- 37. Použití preparátu podle některého z nároků 20 až 36 pro výrobu léčiva.
- 38. Použiti nukleové kyseliny podle nároku 19 pro výrobu léčiva.
- 39. Způsob přípravy preparátu, obsahujícího čištěný re-kombinantní analog faktoru X , vyznačující se tím, že se analog faktoru X , získaný rekombinantní přípravou, izoluje a čistí se chromatografickým postupem. t í m , že zahrnuje následu- s e
- 40. Způsob podle nároku 39, vyznačuj ící 9 ·'· - ·· • · · ·· t · ·· ·* ’9 !· í# · * · * • • • · • ·' • '· • ’♦ · ·· ··(·♦ • · · .· • • '· • • · 1· *· ··· ··· • · • 1* & jící kroky; - příprava nukleové kyseliny podle nároku 19 . - transfek^ťce vhodné buňky - - exprese analogu faktoru X ψ -¾ - popřípadě inkubace analogu faktoru X s proteasou - izolace analogu faktoru X a - čištění analogu faktoru X chromatografickým postupem .
- 41. Způsob podle nároku 40 , vyznačující se tím, že se analog faktoru X isoluje jako dvouřetězcová molekula.
- 42. Způsob podle některého z nároků 39 až 41 , vyznačující se tím, že se dvouřetězcový analog faktoru X uvede do styku s proteasou vybranou ze skupiny endoproteas, jako jsou kexin/Kex2, furin/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE4, LPC/PC7, ze skupiny serinproteas, jako jsou faktor Ha, faktor XIIa, faktor Xla, faktor Xa ? Ψ nebo kallikrein, nebo derivátem těchto proteas, za podmínek, umožňujících štěpení analogu faktoru X na nativní faktor Xa • . ' A. τ nebo analog faktoru Xa .
- 43. Způsob podle nároku 42 , .·<. vyznačující se tím, že buňka je taková ’ buňka, která neexprimuje proteasu, která může provádět štěpení jednoduchého řetězce na lehký a těžký řetězecfaktoru X , popřípadě analogu faktoru X a popřípadě vykazuje deficienci proteasy.
- *44. Způsob podle nároku 43 , v’ y z n a č u j í c í se. t í m , že buňky neexprimují žádnou endoproteasu, jako je kexin, furin, PÁCE nebo jejich' deriváty. ' -
- 45. Způsob podle některého z nároků 43 nebo 44 , vyznačuj íeí se t.ím , že se analog faktoru X isoluje jako jednořetězcová molekula.
- 46. Způsob podle nároku 45 , vyznačující se tím, že j ednořetězcový, popřípadě isolovaný analog faktoru X uvede do styku s pro-teasou, zvolenou ze skupiny endoproteas, jako jsou kexin/Kex2, furin/PACE, PC1/PC3, PC2,..PC4, PACE4, LPC/PC7, nebo derivátem těchto proteas', za podmínek, za kterých se jednořetězcový analog faktoru X štěpí na dvouřetězčovou formu faktoru X , ·
- 47. Způsob podle nároku 46 , vyznačující se tím, že se jednořetězcový analog faktoru X aktivuje popřípadě uvedením do kontaktu s proteasou přímo na faktor Xa .popřípadě analog faktoru Xa.
- 48. Způsob podle nároku 46 , vyznačující se tím, že se dvouřetězcový analog faktoru X uvede do styku s další proteasou, různou od první proteasy a aktivuje se na analog faktoru Xa nebo na nativní faktor Xa .
- 49. Způsob podle některého z nároků 39 až 48 , *· l· Ř 85 • · · · · « · «· Μ· • » ·· ·· ·· · · · · • * « ♦ ♦ · « « · ··· «·« ft 4 · · ·'·· .·#>· ·· ·« vyznačující se tím, že proteasa je imobi-lisovaná.50. Způsob výroby preparátu, obsahujícího aktivní faktor Xa , popřípadě analog faktoru Xa , vyznačující se tím, že se analog faktoru X .; vyrobený způsobem podle některého z nároků 39 až 46 , podrobí aktivačnímu kroku.
- 50. Způsob podle nároku 50, vyznačující se ťí m , že se získá vyčištěný analog faktoru Xa nebo nativní faktor Xa s vysokou stabilitou a strukturní integritou, který zejména neobsahuje inaktivní intermediáty faktoru X/Xa.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| AT0033597A AT405516B (de) | 1997-02-27 | 1997-02-27 | Faktor x-analoge mit modifizierter proteasespaltstelle |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ303299A3 true CZ303299A3 (cs) | 2000-02-16 |
| CZ298298B6 CZ298298B6 (cs) | 2007-08-22 |
Family
ID=3487868
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ0303299A CZ298298B6 (cs) | 1997-02-27 | 1998-02-27 | Analogy faktoru X s modifikovanými štepnými místyproteas, preparáty tyto látky obsahující, jejich použití a zpusob jejich výroby |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6573071B1 (cs) |
| EP (1) | EP0966536B1 (cs) |
| JP (1) | JP4317976B2 (cs) |
| AR (1) | AR012034A1 (cs) |
| AT (2) | AT405516B (cs) |
| AU (1) | AU744428B2 (cs) |
| BR (1) | BR9807627A (cs) |
| CA (1) | CA2282707A1 (cs) |
| CZ (1) | CZ298298B6 (cs) |
| DE (1) | DE59813518D1 (cs) |
| ES (1) | ES2263199T3 (cs) |
| HU (1) | HU225246B1 (cs) |
| IL (2) | IL131346A0 (cs) |
| NO (1) | NO327878B1 (cs) |
| PL (1) | PL190734B1 (cs) |
| SK (1) | SK286359B6 (cs) |
| WO (1) | WO1998038317A1 (cs) |
Families Citing this family (46)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AT405517B (de) * | 1997-02-27 | 1999-09-27 | Immuno Ag | Faktor x-deletionsmutanten und analoge davon |
| IL129427A0 (en) * | 1999-04-13 | 2000-02-17 | Yeda Res & Dev | Preparation of biologically active molecules |
| AT410216B (de) * | 1999-08-10 | 2003-03-25 | Baxter Ag | Faktor x-analogon mit verbesserter aktivierbarkeit |
| AU2001249389A1 (en) * | 2000-03-22 | 2001-10-03 | The Children's Hospital Of Philadelphia | Modified blood clotting factors and methods of use |
| US7223577B2 (en) * | 2000-11-17 | 2007-05-29 | Allergan, Inc. | Post-translational modifications and Clostridial neurotoxins |
| FR2831170B1 (fr) * | 2001-10-19 | 2004-03-19 | Inst Nat Sante Rech Med | Proteines c modifiees activables directement par la thrombine |
| FR2841904B1 (fr) * | 2002-07-03 | 2004-08-20 | Inst Nat Sante Rech Med | Analogues de facteurs x clivables par la thrombine |
| JP2006507813A (ja) * | 2002-10-04 | 2006-03-09 | シエーリング アクチエンゲゼルシャフト | 置換体活性化配列を有する修飾されたヘプシン分子及びその使用 |
| CN101006175A (zh) * | 2004-08-17 | 2007-07-25 | Csl百灵有限公司 | 经修饰的维生素k依赖性多肽 |
| EP1728798A1 (en) * | 2005-06-01 | 2006-12-06 | ZLB Behring GmbH | Coagulation factor X polypeptides with modified activation properties |
| US7846445B2 (en) * | 2005-09-27 | 2010-12-07 | Amunix Operating, Inc. | Methods for production of unstructured recombinant polymers and uses thereof |
| US7855279B2 (en) * | 2005-09-27 | 2010-12-21 | Amunix Operating, Inc. | Unstructured recombinant polymers and uses thereof |
| MX336958B (es) * | 2005-11-15 | 2016-02-05 | Philadelphia Children Hospital | Metodos y composiciones para modular la hemostasia. |
| EP1820508A1 (en) * | 2006-02-21 | 2007-08-22 | CSL Behring GmbH | Coagulation factor X polypeptides with modified activation properties |
| EP2014676B1 (en) | 2006-04-20 | 2012-03-07 | Kringle Pharma Inc. | Hgf precursor protein mutant and activated form thereof |
| US9956272B2 (en) | 2007-05-30 | 2018-05-01 | Bio Products Laboratory Limited | Methods for preparing factor X, activated factor X, inactivated factor X and inactivated factor Xa, and pharmaceutical compositions comprising same |
| GB0710321D0 (en) * | 2007-05-30 | 2007-07-11 | Nhs Blood & Transplant | Method |
| AU2008287340A1 (en) * | 2007-08-15 | 2009-02-19 | Amunix, Inc. | Compositions and methods for modifying properties of biologically active polypeptides |
| DK3078743T3 (da) | 2007-09-28 | 2020-08-10 | Portola Pharm Inc | Antidoter til faktor xa-inhibitorer og fremgangsmåder til anvendelse af disse |
| MX2011004907A (es) * | 2008-11-14 | 2011-07-29 | Portola Pharm Inc | Antidotos para inhibidores del factor xa y metodos para el uso de los mismos en combinacion con agentes de coagulacion de sangre. |
| US8703717B2 (en) * | 2009-02-03 | 2014-04-22 | Amunix Operating Inc. | Growth hormone polypeptides and methods of making and using same |
| CA2748314C (en) | 2009-02-03 | 2018-10-02 | Amunix Operating Inc. | Extended recombinant polypeptides and compositions comprising same |
| US8680050B2 (en) * | 2009-02-03 | 2014-03-25 | Amunix Operating Inc. | Growth hormone polypeptides fused to extended recombinant polypeptides and methods of making and using same |
| EP3604510A1 (en) | 2009-03-30 | 2020-02-05 | Portola Pharmaceuticals, Inc. | Antidotes for factor xa inhibitors and methods of using the same |
| US9849188B2 (en) | 2009-06-08 | 2017-12-26 | Amunix Operating Inc. | Growth hormone polypeptides and methods of making and using same |
| CA2764108A1 (en) * | 2009-06-08 | 2010-12-16 | Amunix Operating Inc. | Glucose-regulating polypeptides and methods of making and using same |
| PT2453910T (pt) | 2009-07-15 | 2016-12-07 | Portola Pharm Inc | Formulação de dose unitária de antídoto contra inibidores de fator xa para uso na prevenção de sangramento |
| WO2011028229A1 (en) * | 2009-08-24 | 2011-03-10 | Amunix Operating Inc. | Coagulation factor ix compositions and methods of making and using same |
| US8557961B2 (en) | 2010-04-02 | 2013-10-15 | Amunix Operating Inc. | Alpha 1-antitrypsin compositions and methods of making and using same |
| JP6514893B2 (ja) * | 2011-09-30 | 2019-05-15 | ザ・チルドレンズ・ホスピタル・オブ・フィラデルフィアＴｈｅ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’Ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｏｆ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ | 止血を調節するための組成物および方法 |
| CA2864126A1 (en) | 2012-02-15 | 2013-08-22 | Biogen Idec Ma Inc. | Recombinant factor viii proteins |
| LT3564260T (lt) | 2012-02-15 | 2023-01-10 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Viii faktoriaus kompozicijos ir jų gamybos bei panaudojimo būdai |
| EA030911B1 (ru) | 2012-02-27 | 2018-10-31 | Амуникс Оперейтинг Инк. | Композиции конъюгата xten и способы их получения |
| GB201211617D0 (en) | 2012-06-29 | 2012-08-15 | Univ Aberdeen | Production of cyclic peptides |
| IN2015DN01404A (cs) | 2012-07-25 | 2015-07-03 | Catalyst Biosciences Inc | |
| KR20150103205A (ko) | 2013-01-31 | 2015-09-09 | 화이자 인코포레이티드 | 인자 Xa 억제를 길항하기 위한 조성물 및 방법 |
| FR3001729B1 (fr) * | 2013-02-04 | 2015-03-06 | Lab Francais Du Fractionnement | Mutants du facteur x |
| JP2016510984A (ja) * | 2013-03-12 | 2016-04-14 | ノヴォ ノルディスク アー／エス | トロンビン感受性凝固第ｘ因子分子 |
| TW202003554A (zh) | 2013-08-14 | 2020-01-16 | 美商百歐維拉提夫治療公司 | 因子ｖｉｉｉ－ｘｔｅｎ融合物及其用途 |
| WO2015044836A1 (en) | 2013-09-24 | 2015-04-02 | Pfizer Inc. | Compositions comprising heterogeneous populations of recombinant human clotting factor xa proteins |
| RU2585532C2 (ru) * | 2014-01-31 | 2016-05-27 | Федеральное государственное учреждение "Федеральный исследовательский центр "Фундаментальные основы биотехнологии" Российской академии наук"(ФИЦ Биотехнологии РАН) | Плазмида для экспрессии рекомбинантного фактора свёртываемости крови ix человека, клетка сно - продуцент рекомбинантного фактора свёртываемости крови ix человека и способ получения указанного фактора |
| US10676731B2 (en) | 2014-08-19 | 2020-06-09 | The Children's Hospital Of Philadelphia | Compositions and methods for modulating factor IX function |
| EA201890423A1 (ru) | 2015-08-03 | 2018-07-31 | Биовератив Терапьютикс Инк. | Слитые белки фактора ix, способы их получения и применения |
| CN108135968A (zh) | 2015-08-28 | 2018-06-08 | 阿穆尼克斯运营公司 | 嵌合多肽组装体及其制备和使用方法 |
| SG11202010767SA (en) | 2018-05-18 | 2020-11-27 | Bioverativ Therapeutics Inc | Methods of treating hemophilia a |
| KR102613936B1 (ko) * | 2020-11-13 | 2023-12-15 | 한국생명공학연구원 | 자가분해능이 저하된 켁신 효소 및 이의 생산 방법 |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AT366916B (de) * | 1980-04-02 | 1982-05-25 | Immuno Ag | Vorrichtung zur applikation eines gewebeklebstoffes auf basis von menschlichen oder tierischenproteinen |
| US4501731A (en) | 1983-06-27 | 1985-02-26 | Tishkoff Garson H | Treatment of disparate bleeding disorders with factor X zymogen |
| AT382783B (de) * | 1985-06-20 | 1987-04-10 | Immuno Ag | Vorrichtung zur applikation eines gewebeklebstoffes |
| US5597799A (en) * | 1990-09-04 | 1997-01-28 | Cor Therapeutics, Inc. | Recombinant agents affecting thrombosis |
| DK0574402T3 (da) | 1990-11-26 | 1998-05-18 | Chiron Corp | Ekspression af PACE i værtsceller og fremgangsmåder til anvendelse deraf |
| US5621039A (en) | 1993-06-08 | 1997-04-15 | Hallahan; Terrence W. | Factor IX- polymeric conjugates |
| DE4325872C1 (de) | 1993-08-02 | 1994-08-04 | Immuno Ag | Virusinaktivierte Faktor Xa-Präparation |
| AT401270B (de) | 1994-09-26 | 1996-07-25 | Immuno Ag | Verfahren zur quantifizierung von genomischer dna |
| AT404838B (de) | 1995-11-24 | 1999-03-25 | Immuno Ag | Herstellung von proteinen aus pro-proteinen durch fusionsproteine abgeleitet von furin oder furinanalogen |
| AT405517B (de) * | 1997-02-27 | 1999-09-27 | Immuno Ag | Faktor x-deletionsmutanten und analoge davon |
-
1997
- 1997-02-27 AT AT0033597A patent/AT405516B/de not_active IP Right Cessation
-
1998
- 1998-02-25 AR ARP980100832A patent/AR012034A1/es not_active Application Discontinuation
- 1998-02-27 ES ES98903943T patent/ES2263199T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-02-27 IL IL13134698A patent/IL131346A0/xx active IP Right Grant
- 1998-02-27 JP JP53706298A patent/JP4317976B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1998-02-27 PL PL98335382A patent/PL190734B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1998-02-27 SK SK1171-99A patent/SK286359B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1998-02-27 CZ CZ0303299A patent/CZ298298B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1998-02-27 BR BR9807627-2A patent/BR9807627A/pt not_active IP Right Cessation
- 1998-02-27 US US09/367,791 patent/US6573071B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-02-27 EP EP98903943A patent/EP0966536B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-02-27 WO PCT/AT1998/000045 patent/WO1998038317A1/de active IP Right Grant
- 1998-02-27 HU HU0100652A patent/HU225246B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1998-02-27 AT AT98903943T patent/ATE324454T1/de active
- 1998-02-27 DE DE59813518T patent/DE59813518D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-02-27 AU AU62002/98A patent/AU744428B2/en not_active Ceased
- 1998-02-27 CA CA002282707A patent/CA2282707A1/en not_active Abandoned
-
1999
- 1999-08-10 IL IL131346A patent/IL131346A/en not_active IP Right Cessation
- 1999-08-26 NO NO19994139A patent/NO327878B1/no not_active IP Right Cessation
-
2003
- 2003-04-04 US US10/407,123 patent/US7220569B2/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AT405516B (de) | 1999-09-27 |
| US20030181381A1 (en) | 2003-09-25 |
| PL335382A1 (en) | 2000-04-25 |
| NO327878B1 (no) | 2009-10-12 |
| CZ298298B6 (cs) | 2007-08-22 |
| HUP0100652A3 (en) | 2003-01-28 |
| IL131346A (en) | 2007-05-15 |
| HU225246B1 (en) | 2006-08-28 |
| JP4317976B2 (ja) | 2009-08-19 |
| US7220569B2 (en) | 2007-05-22 |
| SK117199A3 (en) | 2000-05-16 |
| CA2282707A1 (en) | 1998-09-03 |
| AU6200298A (en) | 1998-09-18 |
| BR9807627A (pt) | 2000-02-22 |
| JP2001513631A (ja) | 2001-09-04 |
| HUP0100652A1 (hu) | 2001-06-28 |
| AR012034A1 (es) | 2000-09-27 |
| IL131346A0 (en) | 2001-01-28 |
| PL190734B1 (pl) | 2005-12-30 |
| WO1998038317A1 (de) | 1998-09-03 |
| ATA33597A (de) | 1999-01-15 |
| AU744428B2 (en) | 2002-02-21 |
| EP0966536A1 (de) | 1999-12-29 |
| DE59813518D1 (de) | 2006-06-01 |
| EP0966536B1 (de) | 2006-04-26 |
| ATE324454T1 (de) | 2006-05-15 |
| NO994139D0 (no) | 1999-08-26 |
| US6573071B1 (en) | 2003-06-03 |
| NO994139L (no) | 1999-10-27 |
| ES2263199T3 (es) | 2006-12-01 |
| SK286359B6 (sk) | 2008-08-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ303299A3 (cs) | Analogy faktoru X s modifikovanými štěpnými místy proteas, preparáty tyto látky obsahující, jejich použití a způsob jejich výroby | |
| JP4108761B2 (ja) | Ｘ因子欠失突然変異体およびそのアナログ | |
| US6958322B1 (en) | Factor X analog with an improved ability to be activated | |
| JPH09183800A (ja) | フリン誘導体またはフリン同族体の誘導体とヘテロロ−ガス配列との融合タンパク | |
| JP3004375B2 (ja) | ヒトプロテインｃのグリコシル化突然変異体の発現のためのベクターおよび化合物 | |
| MXPA99007768A (en) | Factor x analogues with a modified protease cleavage site | |
| MXPA99007817A (en) | Factor x deletion mutants and analogues thereof |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20100227 |