CZ303171B6 - Použití cholestanových derivátu k výrobe léciva pro lécbu nádorového bujení a s ním spojené angiogeneze - Google Patents

Abstract

Rešení se týká použití cholestanových derivátu k výrobe farmaceutických prostredku pro použití jako protinádorová a antiangiogenní léciva, vcetne postupu k selektivnímu snížení životaschopnosti nádorových bunek. Dále popisuje použití techto látek pro inhibici angiogeneze inhibováním migrace a tvorby tubulu lidských endotheliálních bunek. Zahrnuje i použití prostredku obsahujících cholestanové deriváty pro regulaci nepríznivých úcinku nádorového bujení a angiogeneze savcích bunek in vitro a in vivo u savcu.

Description

Použití cholestanových derivátů k výrobě léčiva pro léčbu nádorového bujení a s ním spojené angiogeneze

Oblast techniky

Vynález se týká použiti cholestanových derivátu k výrobě farmaceutických prostředků sloužících jako protinádorová a antiangiogenní léčiva k léčbě savců ajejich využití pří léčení rakoviny a pro prevenci, inhibici a léčbu angiogeneze.

io

Dosavadní stav techniky

Tento vynález se týká cholestanových derivátů, farmaceutických přípravků obsahující tyto sloui s ceniny a jejich využití především v protinádorové terapii.

Angiogeneze, růst nových krevních kapilár u živočichů, je nezbytná pro růst orgánů (Folkman et at, 1974, Adv Cancer Res., L9(0):331- 358; Folkman et al., 1992, J Biol Chem., 267(16):10931-10934; Carmeliet, 2005, Nátuře, 438 (7070:932-936) a také pro růst kompakt20 nich nádorů a metastáz (Bhat and Singh, 2008, Food Chem Toxicol., 46:1334-1345; Kesisis et al., 2007, Curr Pharm Des., 13(27):2795-2809; Risau, 1997, Nátuře, 386(6626):671-674). Endotheliální buňky jsou zásadní pro angiogenezi (Bagley et al., 2003, Cancer Res,, 63(18):58665873) a mohou být cílem pro antiangiogenní terapie, jelikož jsou netransformované a lze je jednoduše ošetřit dosažitelnými dávkami antiangiogenních látek, u kterých je nepravděpodobné, že by vznikla rezistence k léčivu (Bhat and Singh, 2008, Food Chem Toxicol, 46: 1334-1345). Pro výživu buněk a distribuci kyslíku je klíčové krevní zásobení, Angiogeneze nádorů je cílem pro objevování nových potenciálních léčiv. Její součástí je inhibice proteolytických enzymů, které rozrušují extracelulámí matrix obklopující existující kapiláry, inhibice proliferace a migrace a také zvyšování počtu apoptotických endotheliálních buněk. Účinné angiogenní inhibitory schopné

3t) blokovat růst nádorů mají dobrý předpoklad pro vývoj nových generací protinádorových léčiv. (Gourley and Williamson, 2000, Curr Pharm Des., 6(4):417-39; Ranieri and Gasparini, 2001, Curr Drug Targets Immune Endocr Metabol Disord., 1(3):241-253; Singh and Agarwal, 2003, Curr Cancer Drug Targets, 3(3):205 -217).

Antiangiogenní aktivitu má mnoho malých molekul spojených s růstovými faktory: proteiny a protilátky. Některé steroidy byly mezi prvními molekulami, u kterých byla antiangiogenní aktivita objevena. Mezi tyto látky patří progestin, medroxyprogesteronový acetát a glukokortikoidy, např. dexamethazon a kortizon (Folkman et al, 1992, Sem Cancer Biol, 3:89-96; Folkman et al., 1992, J Biol Chem, 267:10931—4). Vypadá, že tyto angiostatické steroidy mají přímý protinádo40 rový účinek na některé zhoubné nádory a také rozmanitý účinek na angiogenezi doprovázející nádory, zahrnující inhibici proliferace endotheliálních buněk, inhibici rozpouštění kolagenu a aktivace produkce plazminogenu. Primárně byly aktivity těchto látek charakterizovány jejich schopností zabránit vytváření nových krevních kapilár v systému „chick embryo allantoic membráně assay (CAM test)“ pro angiogenezi (Pietras and Weinberg, 2005, Evid Based Complement

Altemat Med., 2(1):49-57). Nej účinnější z těchto antiangiogenních steroidu, 11 a-hydrokortizon a tetrahydrokortizol, postrádá mineralokortikoidní nebo glukokortikoidní aktivitu a regresi kapilár v systému CAM test (Teicher et al., 1998, Anticancer Res, 18:2567-74).

Některé antiangiogenní steroidy mají měřitelnou aktivitu v živočišných modelech, která je často zvýšená v kombinaci s heparinem a jemu podobným molekulám (Teicher et al., 1998, Anticancer Res, 18:2567-74; Folkman et al., 1983, Science, 221:719-25; Sakamoto et al., 1987, JNatl Cancer Inst, 78:581-5). Z těchto antiangiogenních steroidu je to pouze medroxyprogesteron, který byl podroben klinickým zkouškám u pacientů s dříve léčenou rakovinou prsu (Jakobsen et al., 1986, Eur J Cancer Clin Oncol, 22:1067-72). Studie skončila, jelikož medroxyprogesteron vykazoval pouze minimální klinickou aktivitu a neprodlužoval přežívání.

-1 CZ 303171 B6

U endogenního metabolitu estrogenu 2-methoxyestradÍolu byly objeveny antiangiogenní účinky in vtiro: inhibice proliferace, migrace a invaze a také v in vivo modelech (Mooberry et al·, 2003, Drug Resist Updates, 6:355-61). Mechanismus účinku této sloučeniny ještě není zcela objasněn, ale nezdá se, že je přenášen přes klasické steroidní receptory. Současné poznatky ukazují, že

2-methoxyestradiol inhibuje HIF-Ια, což je klíčový angiogenní transkripční faktor a tudíž je schopen vyvolat široké spektrum buněčných Účinků. Tato účinnost 2-methoxyestradiolu koreluje s depolymerizací mikrotubulů. Tyto steroidní sloučeniny také iniciují apoptózu v cévních endotheliálních buňkách a buňkách kompaktního nádoru. V preklinických modelech redukoval 2io methoxyestradiol velikost nádorů a jejich krevní zásobení. V prvotních klinických zkouškách byla tato sloučenina dobře snášena pacienty s různými typy zhoubných nádorů (Mooberry et al·,

2003, Drug Resist Updates, 6:355-61).

Skvalamin, přirozený steroid nalezený v několika tkáních máčky skvrnité (Squalus acanthias), způsobuje změny ve tvaru cévních endotheliálních buněk a má významnou antiangiogenní aktivitu v nádorech plic, prsu, mozku a vaječníků (Teicher et al., 1998, Anticancer Res, 18:2567-74; Fckhardt, 1999, Hospital Prací, 1:63-78; Sílls et al., 1998, Cancer Res, 58:2784-92). Skvalamin byl u tohoto žraloka objeven nejdříve v místech syntézy žluči, např. v játrech a žlučníku, ale v menších množstvích se tento aminosterol vyskytuje ve slezině, varlatech, žaludku a střevech

2o (Moore et al., 1993, Proč Nati Acad Sci USA, 90:1354-8). Později bylo prokázáno, že skvalamin selektivně inhibuje v relativně nízkých dávkách tvorbu nových krevních kapilár. Na rozdíl od dříve zmiňovaných steroidů má skvalamin výrazné strukturní rozdíly a na glukokortikoidní a mineralokortikoidní receptory nepůsobí (Bruss, 2000, American Cancer Society Guide to Complementary and Alternativě Cancer Methods. Atlanta, GA: American Cancer Society).

Skvalamin je 7,24—dihydroxy-24-sulfát cholestanu konjugovaný se spermidinem v pozici C-3.

Skvalamin je angiostatický steroid z důvodu jeho inhibice růstu cévních endotheliálních buněk v kultuře, aktivity v systémech CAM test a „rabbit comeal micropocket assay“ u gliomů a nádorů plic invivo (Teicher et al., 1998, Anticancer Res, 18:2567-74; Sílls et al., 1998, Cancer Res,

5 8:2784-92; Williams, 1999, In Teicher: Antiangiogenic Agents. Totowa, NJ: Humana Press).

Skvalamin je poněkud jedinečný mezi současnými antiangiogenními sloučeninami, protože inhibuje proliferaci a migraci endotheliálních buněk indukovanou různými druhy růstových faktorů, včetně základního růstového faktoru fibroblastů (bFGF) a VEGF (Eckhardt, 1999, Hospital Prací, 1:63-78; Sílls et al., 1998, Cancer Res, 58:2784-92; Williams, 1999, In Teicher. Antiangiogenic

Agents. Totowa, NJ: Humana Press).

Tyto všeobecné antiangiogenní účinky skvalaminu mohou plynout z inhibice povrchové sodíkprotonové pumpy (proto se mění intracelulární pH a takto omezuje intracelulární signalizaci některými růstovými faktory) a ostatního odcházejícího signálu do endotheliálních buněk (Eckhardt, 1999, Hospital Pract, 1:63-78; Moore et al·, 1993, Proč Nati Acad Sci USA, 90:13548). Existují různé teorie o mechanismu účinku skvalaminu, které zbývá prozkoumat.

Cílem tohoto vynálezu je poskytnout cholestanové deriváty vhodné pro inhibici růstu mnoha různých nádorových buněčných linií v mikromolámích koncentracích s minimálními účinky na nor45 mální buňky. Tyto protinádorové účinky mohou alespoň částečně záviset na interakci se steroidními receptory. Cholestanové deriváty jsou novou skupinou látek, které nejsou kompletně prozkoumány na molekulární úrovni mechanismu působení a naším cílem je zde poskytnout vysvětlení molekulárních mechanismů účinku. Ukazujeme zde, že ošetření cholestanovými deriváty také indukuje cytotoxicitu a růstovou inhibici prsních a prostatických nádorových buněk. Zde popsané cholestanové deriváty jsou rovněž schopny inhibovat angiogenezi v nádorech, a proto mohou být použity jako antimitotické a proapoptotické látky, a tedy i jako protinádorová léčiva. Cílem tohoto vynálezu jsou rovněž antiangiogenní sloučeniny na bázi cholestanových derivátů, které mají vysoký index selektivity a efektivity, tzn. jsou méně toxické, avšak účinnější, než dříve známá analoga.

-2CZ 303171 B6

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu jsou eholestanové deriváty obecného vzorce I

(I) ajejich farmaceuticky přijatelné soli, ve kterých

X znamená skupinu -CH=, CH₂, CH-OH nebo atom kyslíku, io R² znamená atom vodíku, hydroxy 1 nebo atom kyslíku, vázaný dvojnou vazbou na atom uhlíku C2 eholestanové struktury, nebo společně s R³ může vytvořit skupinu oxiranu,

R³ znamená atom vodíku, hydroxyI, atom kyslíku, vázaný dvojnou vazbou na atom uhlíku C3 eholestanové struktury, acetoxy skupinu, atom halogenu či skupinu EtOCOO s tím, že v případě, kdy R³ znamená skupinu EtOCOO, pak je mezi atomy uhlíku C1 a C2 dvojná vazba,

R⁴ znamená atom vodíku, atom deuteria, hydroxyl, atom halogenu, skupinu H₂P, nebo v případě delta4 dvojné vazby mezi atomy uhlíku C4 a C5 nebo delta5-dvojné vazby mezi atomy uhlíku C5 a C6 a/nebo jednoduché vazby mezi atomy uhlíku C3 a C5, kdy atom uhlíku C5 není účasten žádné dvojné vazby, pak R⁴ chybí,

R⁵ znamená atom vodíku nebo hydroxyl,

R⁶ znamená atom vodíku nebo hydroxyl, skupina -Y-Z- znamená jednu z následujících struktur:

o

-3 CZ 303171 B6

:O

O nebo mezi Y a Z neexistuje vazba a v tom případě Y i Z znamenají skupinu COOH, a -----znamená možnou jednoduchou vazbu, znamená možnou dvojnou vazbu, přičemž v případě, kdy se jedná a o jedinou dvojnou vazbu zahrnující atom uhlíku C5, pak skupina R⁴ není přítomna, pro použití k výrobě léčiva pro léčbu nádorového bujení a s ním spojené angiogeneze.

Tento vynález zahrnuje zejména uvedené deriváty pro použití k výrobě léčiva pro inhibici nádorového bujení a indukci apoptózy savčích buněk, zejména pro selektivní prevenci, inhibici a/nebo léčbu nádorů a související angiogeneze.

Dále jsou předmětem vynálezu cholestanové deriváty obecného vzorce 1 pro použití k výrobě léčiva působícího jako regulátor ve zvířecích a lidských tkáňových kulturách pro regulaci nádorového bujení a angiogeneze.

I ento vynález rovněž zahrnuje cholestanové deriváty ve formě volné sloučeniny podle obecného 20 vzorce I nebo ve formě farmaceuticky přijatelných solí. Farmaceuticky přijatelná sůl může být sůl takovéto sloučeniny s alkalickým kovem, amoniakem či aminem, adiční sůl s kyselinou, případně lze použít racemát nebo opticky aktivní izomer.

Mimořádně výhodnými sloučeninami podle vynálezu jsou cholestanové deriváty obecného 25 vzorce I vybrané ze skupiny zahrnující:

-4CZ 303171 B6

-5CZ 303171 B6

Terapeutické aplikace

Vhodné cesty pro aplikaci jsou orální, rektální, vazální místní (zahrnující okulámí, bukální a sublinguální), vaginální a parenterální (zahrnující subkutánní, intramuskulámí, intravitrózní, nitrožilní, intradermální, intrathekální a epidurální). Preferovaný způsob podání závisí na stavu pacienta, toxicitě sloučeniny a místě infekce, kromě ostatních ohledů známých klinikovi.

io Terapeutický přípravek obsahuje od 1 do 95 % aktivní látky, přičemž jednorázové dávky obsahují přednostně od 20 do 90% aktivní látky a při způsobech aplikace, které nejsou jednorázové, obsahují přednostně od 5 do 20 % aktivní látky. Jednotkové dávkové formy jsou např. potahované tablety, tablety, ampule, lahvičky, čípky nebo tobolky. Jiné formy aplikace jsou např. masti, krémy, pasty, pěny, tinktuiy, rtěnky, kapky, spreje, disperze atd. Příkladem jsou tobolky obsahu15 jící od 0,05 g do 1,0 g aktivní látky.

Farmaceutické přípravky tohoto vynálezu jsou připravovány známým způsobem, např. běžným mícháním, granulací, potahováním, rozpouštěcími nebo lyofilizačními procesy.

Přednostně jsou používány roztoky aktivních látek a dále také suspenze nebo disperze, obzvláště izotonické vodné roztoky, suspenze a disperze, které mohou být připraveny před použitím, např. v případě lyofilizovaných preparátů obsahujících aktivní látku samotnou nebo s nosičem jako je mannitol. Farmaceutické přípravky mohou být stabilizovány anebo obsahují látky neutrální povahy, např. konzervační přípravky, stabilizátory, zvlhěovadla anebo emulgátory, rozpouštěcí

Činidla, soli pro regulaci osmotického tlaku anebo pufry. Jsou připravovány známým způsobem, např. běžným rozpouštěním nebo lyofilizací. Zmíněné roztoky nebo suspenze mohou obsahovat látky zvyšující viskozitu, jako např. sodnou sůl karboxymethylcelulózu, dextran, polyvinylpyrrolidon nebo želatinu.

-6CZ 303171 B6

Olejové suspenze obsahují jako olejovou složku rostlinné, syntetické nebo sem i syntetické oleje obvyklé pro injekční účely. Oleje, které zde mohou být zmíněny, jsou obzvláště kapalné estery mastných kyselin, které obsahují jako kyselou složku mastnou kyselinu s dlouhým řetězcem majícím 8 až 22, s výhodou pak 12 až 22 uhlíkových atomů, např. kyselinu laurovou, tridekanovou, myristovou, pentade káno vou, palmitovou, margarovou, stearovou, arachidonovou a behenovou, nebo odpovídající nenasycené kyseliny, např. kyselinu olejovou, alaidikovou, eurikovou, brasidovou a linoleovou, případně s přídavkem antíoxidantů, např. vitaminu E, β-karotenu nebo 3,5-di-/É?rř-butyl-4-hydroxytoluenu. Alkoholová složka těchto esterů mastných kyselin nemá io více než 6 uhlíkových atomů a znamená mono nebo polyhydroxyalkohol, např. mono-, di- nebo trihydroxyalkoholy, jako methanoi, ethanol, propanol, butanol nebo pentanol ajejich izomery, ale hlavně glykol a glycerol. Estery mastných kyselin jsou s výhodou např. ethyl-oleát, isopropylmyristát, isopropyl-palmitát, „Labrafil M 2375“ (trioleát polyoxyethylenglycerolu, Gattefbseé, Paříž), Labrafil M 1944 CS“ (nenasycené póly gly kolované glyceridy připravené alkoholýzou ole15 je z meruňkových jader a složený z glyceridů a esterů polyethylen glykolu; Gattefoseé, Paříž), „Labrasol“ (nasycené polygly kolované glyceridy připravené alkoholýzou TCM a složené z glyceridů a esterů polyethylenglykolu; Gattefoseé, Paříž), „Míglyol 812“ (triglycerid nasycených mastných kyselin s délkou řetězce C₈ až C₎₂ od Hůls AG, Německo) a zvláště rostlinné oleje jako bavln íkový olej, mandlový olej, olivový olej, ricinový olej, sezamový olej, sójový olej a olej z pod20 zemnice olej né.

Příprava injekčního přípravku se provádí za sterilních podmínek obvyklým způsobem, např. plněním do ampulí nebo lahviček a uzavíráním obalů.

Např. farmaceutické přípravky pro orální použití se mohou získat smícháním aktivní látky s jedním nebo více tuhými nosiči, případnou granulací výsledné směsi, a pokud je to požadováno zpracováním směsi nebo granulí do tablet nebo potahovaných tablet přídavkem dalších neutrálních látek.

Vhodné nosiče jsou obzvláště plnidla jako cukry, např. laktóza, sacharóza, mannitol nebo sorbitol, celu lóžové preparáty anebo fosforečnany vápníku, s výhodou fosforečnan vápenatý nebo hydrofosforečnan vápenatý, dále pojivá jako Škroby, s výhodou kukuřičný, pšeničný, rýžový nebo bramborový škrob, methylcelulóza, hydroxypropylmethylcelulóza, sodná sůl karboxymethylcelulózy a polyvinylpyrrolidin, a pokud požadováno desintegrátory jako výše zmíněné škroby a dále karboxymethylškrob, zesítěný polyvinylpyrrolidin, alginová kyselina a její soli, s výhodou alginát sodný. Další neutrální látky jsou regulátory toku a lubrikanty, s výhodou kyselina salicylová, talek, kyselina stearová a její soli jako stearát hořečnatý nebo vápenatý, polyethylenglykol nebo jeho deriváty.

Jádra potahovaných tablet mohou být vybavena vhodnými potahy, které mohou být odolné vůči žaludeční šťávě, přičemž používané potahy jsou mezi jinými koncentrované roztoky cukrů, které mohou obsahovat arabskou gumu, talek, polyvinylpyrrolidin, polyethylenglykol a nebo oxid titaničitý, dále potahovací roztoky ve vhodných organických rozpouštědlech nebo směsích rozpouštědel, ěi pro přípravu potahů odolných vůči žaludeční šťávě roztoky vhodných celulózových preparátů jako ftalát acetylcelulózy nebo ftalát hydroxypropylmethylcelulózy. Barviva nebo pigmenty jsou přimíchávána do tablet nebo potahovaných tablet např. pro identifikaci nebo charakterizaci různých dávek účinné složky.

Farmaceutické přípravky, které mohou být užívány orálně jsou také tvrdé tobolky ze želatiny nebo měkké uzavřené tobolky ze želatiny a změkčovadla jako glycerol nebo sorbitol. Tvrdé tobolky mohou obsahovat aktivní látku ve formě granulí, smíchanou např. s plnidly jako je kukuřičný škrob, pojivý nebo lubrikanty jako talek nebo stearát hořečnatý, a se stabilizátory. V měkkých tobolkách je aktivní látka přednostně rozpuštěna nebo suspendována ve vhodných kapalných látkách neutrální povahy jako mazací tuk, parafínový olej nebo kapalný polyethylenglykol

-7CZ 303171 B6 či estery mastných kyselin a ethylen nebo propy lenglykolu, přičemž je také možno přidat stabilizátory a delergenty např. typu esterů polyethylen sorbitanovýeh mastných kyselin.

Ostatní formy orálního podávání jsou např. sirupy připravované běžným způsobem, které obsahují aktivní složku např. v suspendované formě a v koncentraci okolo 5 až 20 %, přednostně okolo 10 % nebo podobné koncentrace, která umožňuje vhodnou individuální dávku, např. když je měřeno 5 nebo 10 ml. Ostatní formy jsou např. práškové nebo kapalné koncentráty pro přípravu koktejlů, např. v mléce. Takovéto koncentráty mohou být také baleny v množství odpovídajícím jednotkové dávce.

Farmaceutické přípravky, které mohou být používány rektálně, jsou např. čípky, které obsahují kombinaci aktivní látky se základem. Vhodné základy jsou např. přírodní nebo syntetické triglyceridy, parafinové uhlovodíky, polyethylen glykoly nebo vyšší alkoholy.

Přípravky vhodné pro parenterální podání jsou vodné roztoky aktivní složky ve formě rozpustné ve vodě, např. ve vodě rozpustná sůl nebo vodná injekční suspenze, která obsahuje látky zvyšující viskozitu, např. sodnou sůl karboxymethylcelulózy, sorbitol nebo dextran, a stabilizátory tam, kde je to vhodné. Aktivní látka může být také přítomna ve formě lyofílizátu společně s neutrálními látkami, kde je to vhodné a může být rozpuštěna před parenterální aplikací přidáním vhodných rozpouštědel. Roztoky, které jsou použity pro parenterální aplikaci, mohou být použity např. pro infúzní roztoky. Preferovaná konzervovadla jsou s výhodou antioxidanty jako kyselina askorbová, nebo mikrobicidy kyselina sorbováči benzoová.

Masti jsou emulze oleje ve vodě, které obsahují ne více než 70 %, ale přednostně 20 až 50 % vody nebo vodné fáze. Tukovou fázi tvoří uhlovodíky, např. vazelína, parafinový olej nebo tvrdé parafíny, které přednostně obsahují vhodné hydroxys loučen iny jako mastné alkoholy ajejich estery, např. cetylalkohol, nebo alkoholy lanolinu, s výhodou lanolin pro zlepšení kapacity pro vázání vody. Emulgátory jsou odpovídající lipofilní sloučeniny jako sorbitanové estery mastných kyselin (Spaný), s výhodou oleát sorbitanu nebo isostearát sorbitanu. Aditiva k vodné fázi jsou např. smáčedla jako polyalkoholy, např. glycerol, propylenglykol, sorbitol a polyethylenglykol, nebo konzervační prostředky či příjemně vonící látky.

Mastné masti jsou nevodné a obsahují jako bázi hlavně uhlovodíky, např. parafín, vazelínu nebo parafinový olej, a dále přírodní nebo semisyntetické tuky, např. hydrogenované kokosové triglyceridy mastných kyselin nebo hydrogenované oleje, např. hydrogenovaný ricínový olej nebo zpodzemnice olejně a dále částečné glycerolové estery mastných kyselin, např. glycerol monoadistearát. Dále obsahují např. mastné alkoholy, emulgátory a aditiva zmíněná v souvislosti s mastmi, která zvyšují příjem vody.

Krémy jsou emulze oleje ve vodě, které obsahují více než 50 % vody. Používané olejové báze jsou mastné alkoholy, např. isopropy 1-myristát, lanolin, včelí vosk, nebo uhlovodíky, s výhodou vazelína (petrolátum) a parafinový olej. Emulgátory jsou povrchově aktivní sloučeniny s převážně hydrofilními vlastnostmi, jako jsou odpovídající neiontové emulgátory, např. estery mastných kyselin polyalkoholů nebo jejich ethy len oxyadukty, např. polyglycerických mastných kyselin nebo polyethylensorbitanové estery či kyselé estery polyglycerických mastných kyselin (Tween), dále polyoxyethylenové ethery mastných alkoholů nebo polyoxyethylenové estery mastných kyselin, nebo odpovídající iontové emulgátory, jako alkalické soli sulfátů mastných alkoholů, s výhodou laurylsulfát sodný, cetylsulfát sodný nebo stearylsulfát sodný, které jsou obvykle používány v přítomnosti mastných alkoholů, např. cetylstearylalkoholu nebo stearylalkoholu. Aditiva k vodné fázi jsou mimo jiné činidla, která chrání krémy před vyschnutím, např. polyalkoholy jako glycerol, sorbitol, propylenglykol a polyethylenglykol, a dále konzervační činidla a příjemně vonicí látky.

-8CZ 303171 B6

Pasty jsou krčmy nebo masti obsahující složky absorbující sekreci jako jsou oxidy kovů, např. oxidy titanu nebo oxid zinečnatý, a dále talek či silikáty hliníku, které mají za úkol vázat přítomnou vlhkost nebo sekreci.

Pčny jsou aplikovány z tlakových nádob a jsou to kapalné emulze oleje ve vodě v aerosolové formě, přičemž jako hnací plyny jsou používány halogenované uhlovodíky, jako chlorfluor-(nížší)alkany, např. dichlorfluormethan a dichlortetrafluorethan, nebo přednostně nehalogenované plynné uhlovodíky, vzduch, N₂O či oxid uhličitý. Používané olejové fáze jsou stejné jako pro masti a také jsou používána aditiva tam zmíněná.

io

Tinktury a roztoky obvykle obsahují vodně-ethanolickou bá2Í, ke které jsou přimíchána zvlhčovadla pro snížení odpařování jako jsou polyalkoholy, např. glycerol, glykoly a polyethylenglykol, dále mazadla jako estery mastných kyselin a nižších po lyethy lengly kolů, tj, I ipofilní látky rozpustné ve vodné směsi nahrazující tukové látky odstraněné z kůže ethanolem, a pokud je to nutné is i ostatní neutrální látky a aditiva.

Tento patent dále poskytuje veterinární přípravky obsahující jednu aktivní složku společně s veterinárním nosičem. Veterinární nosiče jsou materiály pro aplikaci přípravku a mohou to být látky pevné, kapalné nebo plynné, které jsou inertní nebo přijatelné ve veterinární medicíně a jsou kompatibilní s aktivní složkou. Tyto veterinární přípravky mohou být podávány orálně, parenterálnč nebo jakoukoli jinou požadovanou cestou.

Vynález se také vztahuje na procesy nebo metody pro léčení nemocí zmíněných výše. Látky mohou být podávány profylakticky nebo terapeuticky jako takové nebo ve formě farmaceutic25 kých přípravků, přednostně v množství které je efektivní proti zmíněným nemocem, přičemž u teplokrevných živočichů, např. člověka, vyžadujícího takovéto ošetření je látka používána zejména ve formě farmaceutického přípravku. Na tělesnou hmotnost okolo 70 kg je aplikována denní dávka látky okolo 0,1 až 50 g, s výhodou 0,5 až 10 g.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. I ukazuje inhibiční účinek látek 39 a 42 na buněčnou viabilitu nádorových buněčných linií MCF-7 a MDA-MB-468. Data reprezentují výsledky ze tří nezávislých experimentů, z nichž byla určena směrodatná odchylka.

Obr. 2 představuje výsledky MTT testu, kde byl zjištěn cytotoxický efekt vybraných derivátů cholestanu (39 a 42) u hormonálně závislých a hormonálně nezávislých buněčných linií odvozených od karcinomu prsu (MCF-7 a MDA-MB-468). Oba cholestanové deriváty inhibovaly růst buněk obou buněčných linií v závislosti na koncentraci. Buňky MDA-MB-468 byly na aplikaci cholestanových derivátů více citlivé v porovnání s buňkami MCF-7. tabulka 2 shrnuje hodnoty IC₅₀ (koncentrace látek vedoucí k 50% inhibici buněčné viability po 24h inkubaci buněk s testovanou látkou) vypočtené z obr. 2.

Obr. 3 znázorňuje výsledky analýzy buněčného cyklu včetně subGi fáze u linie MCF-7 (A) a MDA-MB-468 (B) pomocí průtokové cytometrie. Kontrolní neovlivněné buňky byly porovnány s buňkami ovlivněnými látkou 39 a 42. Grafy představují buňky ve fázi subG] (apoptotické buňky s redukovaným obsahem DNA), Go/Gi, S a G₂/M. Histogramy ošetřených buněk byly porovnávány s kontrolními neošetřenými buňkami. Data ukazují počet buněk v procentech (%) v jednotlivých fázích buněčného cyklu.

Obr. 4 znázorňuje Western blot analýzu proteinů (pbcl-2, bcl-2, pRb, Rb, mcl-1, p53) uplatňujících se při regulaci apoptózy a buněčného cyklu u mammámí nádorové linie (MDA MBM68).

Exprese proteinů u buněk ovlivněných látkou 39 a 42 (5, 15, 30, 40 μΜ) po dobu 24 (A) a 48 ho-9CZ 303171 Β6 din (B) byla porovnávána s proteinovou expresí neovlivněných kontrolních buněk. Exprese prolenili PCN A nebo u-tubulinu byla použita jako vnitrní kontrola množství proteinů vzorku.

Obr. 5 reprezentuje vliv eholestanových derivátů na expresí proteinů steroidních receptorů (AR, ER-a, ER-β) a proteinů buněčného cyklu (CDK-4) u buněčné linie MCF-7. Exprese proteinů buněk ovlivněných testovanými látkami 39 a 42 (5, 15, 30, 40 μΜ) po dobu 24 a 48 h byla srovnávána s expresí proteinů buněk kontrolních. Vnitřní kontrolou množství proteinů byla detekce mcm-7 nebo a-tubulinu.

Obr. 6 ukazuje aktivitu caspas-3/7 v buňkách prsního karcinomu MDA-MB-468. Buňky ošetřené cholestanovýmí deriváty 39 a 42 byly porovnány s kontrolními neošetřenými buňkami po 24 a 48 h. Data ukazují nárůst aktivity caspas-3/7.

Obr. 7 znázorňuje inhibiční účinek eholestanových derivátů 39 a 42 na viabilitu buněk HMEC-1. Cytotoxicita byla měřena pomocí Crystal violet assay. Buněčná viabilita je prezentována jako procento živých buněk (kontrola je 100%) po 72 h. Výsledky byly získány ze tří nezávislých experimentů prováděných v hexaplikátech, z nichž byla určena směrodatná odchylka.

Obr. 8 znázorňuje výsledky analýzy buněčného cyklu u lidských mikrovaskulámích endotheliálních buněk HMEC-1 ošetřených sloučeninou 42 po 24 a 48 h pomocí průtokové cytometrie. Graf představuje počet buněk v Go/G|, S a G₂/M fází buněčného cyklu v porovnání s kontrolními neošetřenými buňkami. Výsledky byly získány ze tří nezávislých experimentů prováděných v tripI i kát ech.

Obr. 9 ukazuje výsledky kvantifikace apoptózy (sub G| pík) v mikrovaskulámích endotheliálních IIMEC-1 buňkách ošetřených sloučeninou 42 po 24 a 48 h. Tři koncentrace látky byly porovnány s kontrolními neošetřenými buňkami. Prezentovaná data jsou průměry ze tří nezávislých experimentů, z nichž byla určena směrodatná odchylka.

Obr. 10 znázorňuje inhibici migrace lidských endotheliálních buněk HUVEC ošetřených 30 μΜ 42 (A). Prezentovaná data jsou průměry ze tří nezávislých experimentů, z nichž byla určena směrodatná odchylka. Obrázky z „rýhového“ testu: kontrolní neošetřené buňky (B)a30 μΜ 42 (C).

Obr. 11 ukazuje vliv 30 μΜ 42 na tvorbu tubulů lidských endotheliálních HMEC-1 buněk (A). Prezentovaná data jsou průměry ze tří nezávislých experimentů, z nichž byla určena směrodatná odchylka. Obrázky z testu tvorby tubulů jsou kontrolní neošetřené buňky (B) a 30 μΜ 42 (C).

Následující příklady slouží pro ilustraci použití eholestanových derivátů, aniž se tím jakkoliv omezují.

Příklady provedení vynálezu

Všeobecný protokol

Zásobní roztoky testovaných látek (10 mM) byly připraveny rozpuštěním ekvivalentního množství látky v dimethylsulfoxidu. Kultivační média (DMEM, RPMI 1640, F-12), fetální telecí sérum, L-glutamin, penicilín a streptomycin byly zakoupeny u firmy Sigma (MO, USA),

3-(4,5-dimethyltÍazol~2-yl)-2,5-difenyltetrazolium-bromid (MTT) u firmy Serva Electrophoresis (Heidelberg, Německo) a Calcein AM u firmy Molecuiar Probes (Invitrogen Corporation, CA, USA).

- 10CZ 303171 B6

Všechny použité buněčné linie (T-lymfoblastická leukemická buněčná linie CEM, buněčné linie odvozené od karcinomu mléčné žlázy MCF-7 (estrogen-senzitivní) a MDA-MB-468 (estrogennesenzitivní), buněčné linie LNCaP (androgen-senzitivní) a DU-145 (androgen-nesenzitivní) odvozené od karcinomu prostaty, buňky cervikálního karcinomu HeLa, buňky lidského mnohočetného myelomu RPMI 8226, buněčná linie lidského glioblastomu T 98 a normální lidské fibroblasty BJ) byly získány z registru firmy American Type Culture Collection (Manassas, V A, USA). Buňky MCF-7 byly kultivovány v F-12 médiu (Sigma, MO, USA). Buňky LNCaP byly kultivovány v RPMI 1640 médiu (GIBCO, USA). Všechny ostatní buňky byly kultivovány v DMEM médiu (Sigma, MO, USA). Všechna používaná média obsahují 5 g/l glukosy, 2 mM glutaminu, 100 U/ml penicilinu, 100 μg/ml streptomycinu, 10% fetálního telecího séra a hydrogenuhličitanu sodného. Buňky byly kultivovány při 37 °C, 100% vlhkosti a v 5% atmosféře CO?. Buněčné linie byly pasážovány trypsinem (Sigma, USA) dvakrát až třikrát týdně.

Lidské mikrovaskulámí endotheliální buňky HMEC-1 byly laskavým darem Dr. F.J. Candala (CDC, Atlanta, GA, USA). Lidské endotheliální buňky zpupeěníkové žíly HUVEC byly izolovány z pupeční ku kolagenasovou d i gescí a používány ve dvou až třech následujících pasážích, jak bylo popsáno dříve (McGregor et al., 1994, J Pharmacol Toxicol Methods, 32(2): 73—7). Tyto buňky byly kultivovány v buněčném endotheliálním růstovém médiu (Provitro, Berlin, Německo) doplněném o 10% séra za standardních podmínek při 37 °C a 5% CCb ve vlhké atmosféře (100%). Buňky byly pasážovány trypsinem dvakrát týdně. Matrigel byl zakoupen od firmy BD Biosciences (NJ, USA).

Statistická analýza

Všechny experimenty byly provedeny nejméně ve třech nezávislých opakováních v triplikátech. Všechna kvantitativní data jsou prezentována jako průměr ± standardní chyba (SEM) nebo jako průměr ± standardní odchylka (SD).

Příklad 1

Testování in vitro cytotoxické aktivity u buněčných linií různého typu

Buněčná suspenze o koncentraci přibližně 1,25 x I0⁵ buněk/ml byla přenesena do 96-jamkových mikrotitračních destiček a po 12h stabilizaci byly přidány testované cholestanové deriváty o různé koncentraci. Sloučeniny byly rozpuštěny v DMSO před přidáním do destiček. Kontrolní buňky byly ošetřeny pouze pomocí DMSO. Finální koncentrace DMSO nepřesáhla v testovacím roztoku 1 %. Jednotlivé koncentrace testovaných látek byly přidány čase nula jako 20μΙ alikvotní podíl do jamek mikrotitračních destiček. Obvykle se sloučeniny ředily na šest koncentrací v čtyřnásobné ředicí řadě. Při rutinním testování byla nejvyšší koncentrace v jamce 50μΜ, změny této koncentrace závisí na dané látce. Inkubace buněk s testovanými deriváty trvala 72 hodin při 37 °C, 100% vlhkosti a v 5% atmosféře CO₂. Na konci inkubační periody byly buňky analyzovány po přidání roztoku Calceinu AM (Molecular Probes) a inkubace probíhala další 1 hodinu. Fluorescence (OD) byla měřena pomocí Labsystem FIA readeru Fluoroskan Ascent (Microsystems). Přežití nádorových buněk (IC₅₀) bylo spočítáno podle následujícího vztahu:

IC50 (ODiéčivu vystavené jamky / mean ODkontrolni jamky) Ιθθ

Hodnota 1C_5O, která odpovídá koncentraci látky, kdy je usmrceno 50 % nádorových buněk, byla vypočtena ze získaných dávkových křivek.

Ke sledování cytotoxického účinku cholestanových derivátů a příbuzných steroidních látek byly použity buněčné linie rozdílného histogenetického původu. Lidská T-lymfoblastická leukemická buněčná linie CEM, buňky cervikálního karcinomu HeLa, buněčná linie odvozená od mnohočetného myelomu RPMI 8226, buněčná linie lidského glioblastomu T98 a normální lidské fibroblas- 11 CZ 303171 B6 ty BJ byly použity pro rutinní sereening cytotoxických vlastností cholestanových derivátů. Buňky byly vystaveny 6 koncentracím ve čtyřnásobných ředicích řadách pro každou látku po dobu 72 h pro určení množství přeživších buněk. Hodnoty lC₅o získané pomocí Caleein AM testu jsou prezentovány v tabulce č. I.

Tabulka I: Cytotoxicita cholestanových derivátů pro různé typy buněčných linií (1C_5O: μΜ). Výsledky byty získány ze tri nezávislých experimentů v triplikátech.

Cholestanové deriváty č.	Buněčná linie
CEM	RPMI 8226	T98	líeLa	BJ
cholesterol	>50	38,4	>50	>50	>50
1	9,6	12,9	49,9		>50
2	15,5				>50
3	4,3	1,7	17,2	14,7	>50
4	19,7				>++50
5	9,7				42,3
6	10,4	9,0	38,3	21,5	44,6
7	13,9				48,0
8	14,7				47,5
9	14,4				>50
10	11,6	14,4			>50
11	11,0				47,0
12	16,2				32,2
13	11,8				10,7
14	17,8	16,7			>50
15	7,7	16,0	44,1	35,0	45,4
16	8,4				42,7
17	4,5	4,7	46,3	9,0	42,8
18	12,8				48,2
19	20,5	5,2	41,1		41,2
20	10,2				39,8
21	44,5				>50
22	18,5				41,0
23	17,6				>50
24	19,1				>50
25	15,5				>50
26	8,8	3,9	44,9	19,9	35,9
27	15,0			>50	>50
26	6,3	6,4	16,0	8,7	8,2
29	9,9				12,7
30	12,1	15,0	46,6	15,9	12,7
31	13,1	28,0	47,9	40,6	22,0

- 12CZ 303171 B6

32	10,0	19,7	46,6	34,4	44,8
33	18,1	24,5	42,2	40,7	28,5
34	15,3	8,6	44,7	19,0	44,4
35	31,4				36,3
36	17,5	16,1	45,1	33,1	31,5
37	6,9	6,7	46,2	8,7	41,4
38	27,4	8,8	39,9	8,5	7,1
39	6,8	8,5	21,4	13,2	44,6
40	8,3	12,5	43,0	9,8	10,5
41	11,2				16,0
42	5,2	10,5	15,2	11,9	18,4

Ošetření cholestanovými deriváty mělo za následek na dávce závislé snížení životaschopnosti buněk linií CEM, RPMI 8226 a HeLa na různé úrovni (Tab. I). Uvedeny jsou pouze účinné cholcstanové deriváty. Inhibiční účinek látky 39 a 42 na prsních nádorových liniích MCF-7 a MDA-MB—468 je ukázán v obr. 1. Cholestanový derivát 3 byl nejúčinnější látkou na lymťoblastické leukemické linii CEM (lC₅o: 4,3 μηηοΙ/Ι) a na buňkách mnohočetného myelomu RPMI 8226 (1C_5O 1,7 pmol/J). Kromě látky 3 byla vysoká cytotoxická účinnost zaznamenána po aplikaci látek 17,39 a 42. Cholesterol, necholestanový derivát rostlinného sterolu, je však ne1» aktivní nebo má téměř nulovou cytotoxickou účinnost. Cholesterol má rovněž minimální proti nádorovou aktivitu (ICso > 35 pmol/l) na buňkách linie RPMI 8226. Je překvapující, že většina cholestanových derivátů má minimální nebo téměř nulový vliv na viabilitu normálních lidských fibroblastů BJ. Tyto výsledky nasvědčují rozdílnému působení cholestanových derivátů na nádorové buňky v porovnání s buňkami normálními. V současnosti je známo pouze několik sloučenin, které splňují potenciální schopnost pro selektivní eliminaci nádorových buněk bez ovlivnění růstu normálních buněk. Tato práce také poskytuje první důkazy o cholestanových derivátech jako proti nádorových sloučeninách s antiproliferačními vlastnostmi.

Jak vyplývá ze studia vztahů mezi chemickou strukturou a biologickou aktivitou, nejaktivnější cholestanové deriváty v testu cytotoxicity byly 3, 39 a 42. Změna funkčnosti 6-oxo-7-oxalaktonu na 6-oxo zvyšuje dramaticky inhibici růstu pomocí cholestanových derivátů. Tudíž sloučenina 42 má třikrát silnější účinek než 36. Postranní řetězec 24R je také rozhodující pro zvýšení cytotoxicity cholestanových derivátů. Výsledky z tab. I poukazují na využití cholestanových derivátů jako léčiva pro inhibici hyperproliferace v nádorech.

Příklad 2

Vliv látek na mammámí a prostatické nádorové buněčné linie

Ze škály testovaných látek byly k dalším experimentům vybrány analogy derivátů cholestanu, jejichž účinek byl sledován u buněčných linií MCF-7 (estrogen-senzitivní) a MDA-MB-468 (estrogen-nesenzitivní) odvozených od karcinomu mléčné žlázy a u buněčných linií LNCaP (androgen-senzitivní) a DU-145 (androgen-nesenzitivní) odvozených od karcinomu prostaty.

Karcinom prostaty u lidí představuje mnohastupňový proces, kteiý je zpočátku u většiny nádorů prostaty závislý na androgenech a většina pacientů úspěšně odpovídá na terapeutickou androgenní blokádu. U části nemocných nádory po určité době mohou přecházet do stadia růstu na androgenech nezávislého. Tyto androgen-independentní nádory prostaty jsou potom rezistentní na konvenční terapii. Zatímco androgen-dependentní nádorové buňky podléhají během androge- 13CZ 303171 B6 nove ablaee apoptotieké buněčné smrti, androgen-independentní buňky mají schopnost obejít apoptotieké dráhy během androgenové deprivace, aniž by došlo k narušení této dráhy. Vývoj a progrese karcinomu prostaty souvisí s akumulací změn genů podílejících se na udržení normální buněčné proliferace a homeostázy. Podobný model hormonální responzibility představují estrogen-senzitivní nebo estrogen-nesenzitivní nádory mléčné žlázy. Na studium vzniku a vývoje těchto nádorů je v dnešní době zaměřeno intenzivní výzkumné úsilí, které by přineslo nové přístupy v terapii nádorových onemocnění.

Účinek látek na buněčnou víabilitu byl v tomto případě sledován pomocí MTT testu cytotoxicity jo za použití 3-(4,5-d imethy Ithiozo 1-2-y l)-2,5-d ifenyltetrazol i um-bromidu (MTT) k určení koncentrace ICso studovaných látek u nádorových buněčných linií. Do 96-jamkových míkrotitračních destiček byly nasazeny buňky v závislosti na typu buněčné linie ve 100 μΙ příslušného média v počtu 4,5 x IO³ (MCF-7, DU-145) nebo 5 x 10³ (MDA-MB-468, LNCaP) buněk na jamku.

Po 24 h (MCF-7, MDA-MB-468, DU-145), popřípadě 48 h (LNCaP) latence, během níž došlo k adhezi buněk ke dnu destičky, byly buňky ovlivněny vybranými cholestanovými deriváty po dobu 24 a 48 h v kultivačním médiu. Buňky, které byly použity jako kontrolní, byly inkubovány jen s maximálním množstvím rozpouštědla DMSO. Na základě tohoto testu byla stanovena koncentrace látek (IC₅₀), která vedla k 50% inhibicí buněčného růstu (IC₅₀). Naměřená absorbance, která přímo korelovala s počtem vitálních buněk, byla změřena pomocí ELISA readeru Labsys20 tem Multiscan RC pri 570 nm. Viabilita ovlivněných buněk testovanými deriváty byla vztažena ke kontrolním buňkám představující 100% víabilitu. Experiment byl proveden v triplikátech a nejméně čtyřikrát nezávisle zopakován.

Tabulka 2

Výsledné koncentrace 1C_5O (pmol/l) cholestanových derivátů stanovené u mammárních aprostatických nádorových buněčných linií pomocí MTT testu cytotoxicity. Výsledky byly získány ze tří nezávislých experimentů prováděných v triplikátech.

Testovaná látka	MCF-7	Buněčná linie: IC50 (pmol/l)
MDA-MB-468	LNCaP	DU-145
26	27,8	27,8	13,0	26,0
37	27,4	17,3	16,5	26,0
39	25,9	18,6	29,0	45,0
42	29,5	14,8	27,6	24,0

Ke zjištění účinku vybraných derivátů cholestanu na buněčnou víabilitu byl použit MTT test cytotoxicity u hormonálně senzitivních a hormonálně nesenzitivních nádorových buněčných linií (MCF-7, MDA-MB-468, LNCaP a DU-145). Cytotoxické koncentrace derivátů byly stanoveny u všech buněčných linií. Cholestanové deriváty inhibovaly růst buněk v závislosti na jejich kon35 centraci u všech linií. Derivát 42 vykazoval cytotoxický účinek při nižších koncentracích (Obr. 2). Na základě MTT testu jsme našli koncentrace cholestanových derivátů, které vedly k 50% inhibicí růstu buněk (IC₅o) po 24 h (Tab. 2). Zajímavé je, že zde byly zjištěny malé rozdíly mezi účinností cholestanových derivátů na různých buněčných liniích, přičemž hodnoty koncentrací ÍC₅₀ se pohybovaly na mikromolámí úrovni. Pouze v případě buněčných linií MDA40 MB—468 a DU-145 byla zjištěna větší rezistence buněk na aplikaci testovaných derivátů.

- 14CZ 303171 B6

Příklad 3

Vliv cholestanových derivátů na aktivitu caspas-3/7 u nádorových buněk mammárních linií

Ošetřené buňky byly sklizeny centrifugací a homogenizovány v extrakčním pufru (10 mM KCI, 5 mM HEPES, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 0,2% CHAPS, inhibitory proteáz, pH 7,4) na ledu 20 min. Homogenáty byly odstřeďovány (lOOOOxg, 20 min, 4 °C), proteiny byly kvantifikovány metodou podle Bradfordové a naředěny na stejnou koncentraci. Lyzáty byly inkubovány l h s lOOmM Ac-DEVD-AMC substrátem (Sigma-Aldrich) v testovacím pufru (25 mM PIPES, 2 mM EGTA. 2 mM MgCI₂, 5 mM DTT, pH 7,3). Pro negativní kontrolu byly lyzáty inkubovány se 100 mM Ac-DEVD-CHO inhibitorem caspas-3/7 (Sigma-Aldrich). Fluorescence produktu byla měřena pomocí Fluoroskan Ascent mic rop latě reader (Labsystems) při 346/442 nm (ex/em).

Aktivita caspas-3/7 byla měřena v buňkách MDA—MB—468 ošetřených cholestanovými deriváty a 42 pomocí fluorogenického substrátu Ac-DEVD-AMC a/nebo inhibitoru caspas-3/7 Ac-DEVD-CHO. Buňky byly ošetřeny látkami v závislosti na čase a jejich koncentraci, jež překračovaly jejich hodnoty IC50 (5, 15, 30,40 μΜ) po 24 a 48 h. Sloučenina 42 silně indukovala aktivitu easpas-3/7; po 24 h ošetření buněk 30 μΜ 42 vzrostla aktivita efektorových caspas pětkrát v porovnání s neošetřenými kontrolními buňkami. Aktivita caspas poklesla po ošetření μΜ této látky a/nebo po delším ošetření látkou (48 h) (Obr. 7). Na rozdíl od sloučeniny 42, látka 39 pouze slabě aktivovala caspasy-3/7: po 24 h ošetření látkou se dvakrát zvýšila aktivita caspas, ale po vyšší dávce a/nebo delší inkubaci s látkou tato aktivita poklesla (data zde nejsou ukázána).

Příklad 4

Cholestanové deriváty regulují buněčný cyklus a apoptózu u nádorových buněk mammárních linií

V buňkách prsního adenokarcinomu MCF-7, které jsou častým experimentálním modelem, dochází k poklesu části buněk syntetizujících DNA (S fáze) po ošetření anti estrogeny, což způsobuje typický inhibiční účinek. Tento pokles v S fázi buněčného cyklu je doprovázen nárůstem počtu buněk ve fázi Go/Gi- Změny v buněčné signalizaci regulují také aktivitu androgenového receptoru (AR). Různé růstové faktory jsou schopny aktivovat AR nezávisle na ligandu v buňkách karcinomu prostaty. Přestože může být AR aktivován v nepřítomnosti hormonu, vypadá to, že podmínky mohou být více omezené než ty pozorované u ER. Použití fyziologických dávek ligandu (dihydrotestosteron, DHT) je významné u buněk LNCaP, které proliferují pouze v koncentraci 10 ⁹ M DHT nebo nižší. Vyšší dávky ligandu inhibují proliferaci. Na rozdíl od proliferace pokračuje aktivace specifických cílových genů AR (např. PSA) i s nárůstem dávek DHT 10‘¹⁰ M a vyšších. To by mohl být důvod, proč mají cholestanové deriváty 39 a 42 díky estrogenovým nebo androgenovým receptorům silnější cytotoxickou účinnost na hormon-senzitivní (MCF-7) buněčné linii v porovnání s hormon-nesenzitivními buňkami prsního adenokarcinomu MDA-MB—468. Proto jsme ověřili možnost, že by cholestanové deriváty mohly způsobovat poruchy buněčného cyklu v prsních nádorových buňkách. Pro vyhodnocení počtu buněk v příslušných fázích buněčného cyklu, včetně buněk ve fázi subGi, byla použita průtoková cytometrie. Kontrolní a ošetřené buňky po 24 a 48 h inkubace byly promyty dvakrát v PBS a centrifugovány (lOOOxg, 10 min, 4 °C), dvakrát promyty ve studeném PBS a fixovány ledovým ethanolem (70%; obj./obj.) za pomalého míchání. Obsah DNA byl stanoven po obarvení buněčných jader propidium jodidem. Buňky byly analyzovány na průtokovém cytometru Cell Lab Quanta (Beckman Coulter, CA, USA).

- 15CZ 303171 B6

Tabulka 3

Distribuce fází buněčného cyklu v buňkách prsního adenokarcínomu MCF-7 a MDA-MB—168 5 pomocí průtokové cytometrie. Histogramy buněk ovlivněných cholestanovými deriváty byly srovnávány s histogramy buněk kontrolních. Data představují procentuální zastoupení buněk subG| Trakce a v jednotlivých Tázích buněčného cyklu Go/G μ S, G₂/M.

Buněčná linie	Kontrola í sloučenina (40 μΜ: 24 h)	Apoptóza subG}	Fúze buněčného cyklu
G</G,	3	G:/M
MCF-7	Kontrola	2%	54%	17%	27%
	42	2%	64%	11%	22%
	39	20%	41%	13%	27%
MDA-MB-468	Kontrola	3%	68%	15%	13%
	42	11%	60%	13%	16%
	39	15%	57%	9%	10%

Analýza buněčného cyklu průtokovou cytometrií ukazuje nárůst buněk ve fází subGj (apoptotici() ké buňky) v buněčných liniích MCF-7 a MDA-MB-468 po ošetření cholestanovými deriváty 39 nebo 42 ( Tabulka 3). Po ošetření látkou 42 se zvyšoval počet buněk ve fázích subGi a G_fl/G| se současným poklesem počtu buněk v S fázi v buňkách MCF-7. Sloučenina 39 způsobovala silný nárůst počtu apoptotických buněk (subG) fáze) se současným poklesem počtu buněk v ostatních fázích buněčného cyklu v prsní nádorové buněčné linii MCF-7 (Obr. 3 A). V buňkách prsního is adenokarcínomu MDA-MB—468 způsobilo ošetření látkou 42 zvýšený podíl buněk ve fázi subG) a pokles ve fázi S. Sloučenina 39 indukovala pouze slabý nárůst počtu buněk ve fázi subG] v buňkách MDA-MB-468 (Obr. 3 B). Oba cholestanové deriváty způsobují pokles počtu buněk v S fázi buněčného cyklu, ale silnější účinek byl zaznamenán pouze u estrogen-senzitivních buněk MCF-7 (Obr. 3). Zdá se, že by cholestanové deriváty mohly mít vliv na steroidní receptory.

Příklad 5

Vliv látek 39 a 42 na expresi proteinů steroidních receptorů a proteinů buněčného cyklu u nádo25 rových buněk mam mám ích linií

Pro Western blot analýzu bylo patnáct až třicet mikrogramů proteinů separováno na 10%, případně na 12% polyakrylamidovém gelu. Elektroforeticky separované proteiny byly přeneseny na nitrocelu lóžovou membránu (Amersham Biosciences, Rakousko) pomocí „semi-dry“ metody.

Pro určení molekulové hmotnosti byl použit barevný molekulový hmotnostní standard (Raibow™, Amersham Biosciences, Rakousko). Nespecifická vazebná místa byla blokována minimálně 2 h v 5% roztoku sušeného nízkotučného mléka s 0,1% Tweenem 20 v PBS. Po inkubaci membrány s příslušnou naředěnou primární protilátkou po dobu 12 až 14 h pri 4 °C byla membrána promyta vychlazeným promývacím pufrem (roztok PBS s 0,1% Tweenem 20) po 10 min po dobu jedné hodiny. Poté byla na membrány aplikována naředěna sekundární protilátka konjugovaná s křenovou peroxidázou. Pro myší primární protilátky byla použita sekundární králičí protilátka proti myším imunoglobulínům (ředění 1 : 6000, Santa Cruz, USA) a pro králičí primární protilátky byla použita sekundární kozí protilátka proti králičí (ředění l : 2000, Dako, Dánsko). Doba inkubace membrány se sekundární protilátkou byla 45 min při 4 °C. Následovalo promytí membrány vychlazeným promývacím pufrem, který se měnil po 10 min po dobu jedné hodiny. Proteiny byly detekovány chemi luminiscenčním systémem (Amersham Biosciences,

Rakousko) dle protokolu výrobce. Pro kontrolu kvality a množství proteinů přenesených na membránu bylo použito barvení pomocí Ponceau S (Sigma Aldrich, USA) a detekce a-tubulinu

- 16CZ 303171 B6 (Sigma, USA) nebo mcm-7 (Santa Cruz, USA). Experimenty byly opakovány třikrát. Exprese proteinů u buněk ovlivněných testovanými látkami byly srovnávány s proteinovou expresí kontrolních buněk.

Na základě Western blot analýzy bylo zjištěno, že kontrolní buňky MCF-7 vykazovaly vysokou expresi obou typů estrogenových receptorů ER-α a ER-β, zatímco buňky MDA-MB-468 exprimovaly velmi nízkou hladinu ER-β a neexprimovaly ER-oc. Ovlivnění buněk látkou 39 u buněk MCF-7 vedlo k poklesu exprese ER-α v závislosti na koncentraci i čase. Exprese ER-β byla snížena pouze po 48 h působení látky 39 (30 a 40 μΜ). U buněk MDA-MB—468 byla hladina io ER-β na hranici detekčního limitu. U buněk MCF-7 byl zjištěn pokles hladiny androgenového receptorů (AR) po 48 h působení látky 39 v koncentraci 40 μΜ. Po ovlivnění buněk MCF-7 látkou 42 byl zjištěn pokles hladiny ER-α jak v závislosti na koncentraci tak na době působení (Obr. 5).

Pokles hladiny proteinu buněčného cyklu cdk—4 byl zjištěn u buněk MCF-7 ovlivněných látkou 39 (40 μΜ) po 48 h, zatímco ovlivnění buněk látkou 42 vedlo ke snížení hladiny proteinu v závislosti na koncentraci i době působení látky.

io Příklad 6

Detekce apoptózy u buněk odvozených od karcinomu prsu

Detekce apoptózy pomocí průtokové cytometrie

Podle některých studií může být apoptóza závislá na buněčném cyklu. Proto jsme v následujících experimentech testovali, zda cholestanové deriváty 39 a 42 způsobují apoptózu prsních nádorových buněk blokem buněčného cyklu. Pozdní fáze apoptózy byla detekována na základě fragmentace nízkomolekulámí DNA pomocí analýzy buněčného cyklu průtokovou cytometrií. Tato technika umožňuje detekovat specifické formy buněčné smrti na základě buněčné frakce subG₍ buněčného cyklu. Analýza prokázala, že oba cholestanové deriváty 39 a 42 zvyšovaly u buněk odvozených od karcinomu prsu MCF-7 a MDA-MB-468 procenta subGi buněk v porovnání s kontrolními buňkami (Tab. 3). Deriváty cholestanu zprostředkovaná apoptotická buněčná smrt je významným zjištěním, protože molekulární analýza lidských karcinomů odhaluje častou muta35 ci regulátorů buněčného cyklu v nejběžnějších zhoubných nádorech.

Detekce apoptotíckého indexu metodou TdT-Mediated dUTP nick end labeling (TUNEL)

K detekci apoptotických buněk byla dále použita metoda TUNEL (terminál deoxynucleotide transferase (TdT)-mediated deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling). Pro analýzu byly připraveny buňky rostoucí na krycích sklech v 60 mm Petriho kultivačních miskách v počtu 1,4 x 10⁴ buněk/cm² (MCF-7) nebo 1,6 x 10⁴ buněk/cm² (MDA-MB-468). Po 24 h následovala inkubace látek 39 či 42 (5, 15, 30 a 40 μΜ) s buňkami po dobu 24 a 48 h. Po časové periodě léčby byly následně buňky opláchnuty roztokem PBS a fixovány po dobu 10 min chlazenou smě45 sí aceton:methanol (1:1, obj./obj.). Fragmentace jaderné DNA indukovaná apoptózou byla detekována na základě vazby terminální deoxynukleotidyltransferasy (TdT) metodou TUNEL dle protokolu výrobce (In Sítu Cell Death Detection Kit; Roche Diagnostics, Mannheim, Německo). Po dalším oplachu buněk v PBS byla jádra dobarvena DAPI (50 pg/ml; Sigma, St. Louis, MO, USA) po dobu 10 min ve tmě. Poté následoval rychlý oplach buněk v deionizované vodě a skla byla ponořena do vodného média Mowiolu (Calbiochem, Fremont, CA, USA) neředěného v roztoku glycerolu a PBS (1 : 3, obj./obj.) určeného pro fluorescenci. Buňky ovlivněné byly pomocí fluorescenční mikroskopie analyzovány a srovnávány s buňkami kontrolními.

- 17CZ 303171 B6

Metoda TUNEL byla použita ke zjištění apoptotických bunčk po ovlivnění mammárních nádorových buněčných linií eholestanovými deriváty 39 a 42. Na základě tohoto experimentu bylo zjištěno, že oba typy derivátů zvyšují počet TUNEL pozitivních buněk v závislosti na koncentraci a době jejich působení.

Tabulka 4

Detekce DNA zlomů v jádrech apoptotických buněk stanovená na základě metody TUNEL u buněk MCF-7 a MDA-MB^458 ovlivněných látkami 39 a 42 po dobu 24 a 48 h.

K24/K48.....kontrolní buňky (24 h, 48 h); %.....procenta TUNEL pozitivních buněk.

MCF-7 MDA-MB468

--1 I I

39	%	42	%	39	%	42	%
K24	0	Κ24	0	Κ24	0	Κ24	0
5 μΜ	1	5 μΜ	1	5 μΜ	4	5 μΜ	1
15 μΜ	2	15 μΜ	3	15 μΜ	6	15 μΜ	3
30 μΜ	8	30 μΜ	4	30 μΜ	12	30 μΜ	6
40 μΜ	12	40 μΜ	10	40 μΜ	20	40 μΜ	11
Κ48	0	Κ48	0	Κ48	0	Κ48	0
5 μΜ	1	5 μΜ	2	5 μΜ	6	5 μΜ	4
15 μΜ	5	15 μΜ	8	15 μΜ	14	15 μΜ	7
30 μΜ	13	30 μΜ	12	30 μΜ	19	30 μΜ	15
40 μΜ	26	40 μΜ	23	40 μΜ	29	40 μΜ	20

Příklad 7

Vliv cholestanových derivátu na expresi proteinů regulujících apoptózu na základě Western blot analýzy u nádorových buněk mammárních linií

Pro přípravu vzorků byly buňky nasazeny v počtu 1,4 x 10⁴ buněk/cm² (MDA-MB-468 a MCF 7) do lOOmm kultivačních Petriho misek a po 24 h při konfluenci 70 až 80 % byly ovlivněny testovanými látkami 39 a 42 v koncentracích 5, 15, 30 a 40 μΜ. Kontrolní buňky byly připraveny inkubací s příslušným objemem DMSO jako vehikulem. Po 24 a 48 h byly buňky opláchnuty vychlazeným fosfátovým pufrem (10 mM, pH 7,4) a uvolněny z misek škrábáním do extrakčního RIPA pufru, který obsahoval 20 mM Tris-HCI, pH 7,4; 5 mM EDTA; 2 mM EGTA; 100 mM NaCl; 2 mM NaF; 0,2% Nonidet P-40; 30 mM PMSF; I mM DTT; 10 mg/ml aprotininu a leupeptinu. Buňky byly v protein extrakčním pufru inkubovány 30 min za občasného míchání při 4 °C. Po odstřeďování (10 000 xg, 4 °C, 30 mín) byl supematant odebrán, rozdělen na alikvoty a zamražen při -80 °C. V supematantu byla změřena celková koncentrace proteinů Bradfordovou metodou dle protokolu výrobce (bio-Rad Laboratories, CA, USA). K proteinovým extraktům byl přidán příslušný objem 4x koncentrovaného lyzačního pufru (Laemmli pufr: 200 mM TRIS-báze, pH 6,8; 400 mM dithiotreitol; 8% SDS, 40% glycerol a bromfenolová modř) v poměru 3:1,

Dvacet až třicet mikrogramů proteinů bylo separováno na 10%, případně na 12% SDS-polyakrylamidovém gelu. Elektroforeticky separované proteiny byly přeneseny na nitrocelulózovou membránu (bio-Rad Laboratories, CA, USA) a obarveny Ponceau S pro kontrolu množství nanesených proteinů. Membrány byly blokovány v 5% BSA a 0,1% Tween-20 v TBS pufru 2 h a inkubovány s příslušnou primární protilátkou přes noc. Po promytí v TBS s 0,1% Tween-20 po dobu 30 minut byla membrána inkubována se sekundární protilátkou konjugovanou s křenovou peroxidázou a vizualizována chemi luminiscenčním systémem Super Signál West Pico (Thermo

- 18CZ 303171 B6

Fisher Scientific, Rockford, USA). Pro kontrolu kvality a množství proteinů přenesených na membránu byla použita imunodetekce monoklonální protilátkou anti-PCNA nebo anti-a-tubulin. Experimenty byly třikrát opakovány. Exprese proteinů u buněk ovlivněných cholestanovými deriváty byly srovnávány s proteinovou expresí u kontrolních buněk.

Na základě Western blot analýzy byly sledovány změny exprese proteinů uplatňujících se během apoptózy linií odvozených od karcinomu mléčné žlázy. Ke zjištění změn během léčby byly pro tuto analýzu použity buňky ovlivněné látkami 39 a 42 po dobu 24 a 48 h v koncentracích 5, 15, 30 a 40 μΜ. Změny exprese jednotlivých proteinů regulujících apoptotickou buněčnou smrt po io ovlivnění buněk cholestanovými deriváty znázorňuje Obr. 4. Nádorový supresor p53 byl detekován v kontrolních buňkách a v buňkách ovlivněnými cholestanovými deriváty 39 a 42, kde zvyšoval expresi tohoto proteinu po 24 a 48 h. Silně narostla exprese proteinu p53 po aplikaci μΜ látek 39 a 42, ale v koncentraci 40 μΜ způsobovaly mírný pokles. S narůstající expresí proteinu p53 souvisí pokles antiapoptotického proteinu Mcl-1 protein po ošetření 30 a 40 μΜ 39 a 42. Pokles fosforylace pRb S780 byla zjištěna po aplikaci stejných koncentrací testovaných látek ve stejných časech. Fosforylace antiapoptotického proteinu pBcl-2 S70 narostla po aplikaci 5, 15 a 30 μΜ testovaných látek 39 a 42 (48 h). (Obr. 4 A, B)

Již dříve bylo popsáno, že v efektorové fázi apoptózy hraje důležitou roli aktivace caspasové kas20 kády (Budihardjo et al., 1999, Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 15:269-290). Caspasa-3 představuje exekuční proteázu, která se podílí na štěpení proteinů podílejících se na výstavbě buňky a mechanismu opravy poškozené DNA (PARP) během apoptotické smrti buněk (Allen et al., 1998, Cell Mol. Life Sci. 54:427-445; Cain et al., 2002, Biochimie 84:203-214). Naše výsledky naznačují, že cholestanové deriváty mohou podpořit apoptotickou smrt buněčných linií odvozených od karcinomu prsu cestou aktivace caspasy-3 (Obr. 6) a modulací proteinu Bcl-2 (Obr. 4).

Příklad 8

Antiangiogenní účinky cholestanových derivátů na lidské endotheliální buňky Vliv cholestanových derivátů na životaschopnost lidských endotheliálních buněk

Proliferace endotheliálních buněk byla změřena pomocí testu založeném na barvení DNA pomocí krystalové violeti. HMEC-1 buňky byly vysety v hustotě 1500 buněk najednu jamku 96-jamkové testovací desky. Po 24 h adherace byla jedna deska obarvená 10 minut krystalovou violetí (0,5 % [obj./obj.] krystalové violeti, 20 % [obj./obj.] methanolu), opláchnuta vodou a usušena na vzduchu (den 0). Ostatní desky byly inkubovány s testovanými látkami 72 h. Potom byly desky s testovanými sloučeninami také obarveny a usušeny. Barva byla poté rozpuštěna v etanolu a cit40 rátu a změřena absorbance na fotometru při 540 nm (SPECTRAFluor Plus TECAN, Crailsheim, Německo). Absorpce lineárně koreluje s počtem buněk. Každý experiment byl prováděn nejméně třikrát v hexaplikátech.

Nejdříve jsme sledovali vliv cholestanových derivátů na viabilitu lidských endotheliálních buněk (HMEC-1) pomocí testu založeném na barvení krystalovou violetí. Buňky byly vystaveny sérii různých koncentrací roztoků každé látky po 72 h. Kontrolní buňky byly ošetřeny pouze pomocí DMSO. Po ošetření cholestanovými deriváty 39 a 42 byly odhadnuty počty přežívajících buněk (Obr. 7). Sloučeniny 39 a 42 redukovaly počet životaschopných buněk na 50 % při dávce 10 μΜ.

Vliv cholestanových derivátů na buněčný cyklus a apoptózu

Buňky HMEC-l byly ztrypsinizovány, vysety do 6-jamkových testovacích desek a bezprostředně inkubovány s testovanou látkou. Po 48 h byly buňky odlepeny trypsinem, promyty a obarveny přes noc pri 4 °C v 0,1% [m/v] citrátu sodného, 0,1% [obj./obj.] triton X-100, a 50 pg/ml propi, 19CZ 303171 B6 dium jodidu v PBS. Obsah DNA byl vyhodnocen průtokovým cytometrem (FACSCalíbur, Becton Dickinson, I leidelberg, Německo). Rozdělení buněk v histogramu je na fáze buněčného cyklu subGi („apoptotické buňky“), G<>/Gi, S a G₂/M. Píky byly kvantifikovány pomocí softwaru FlowJo (Tree Star, Oregon, IJSA).

Analýza průtokovou cytometrií byla použita pro kvantifikaci distribuce HMEC-1 buněk do jednotlivých fází buněčného cyklu včetně subGi buněk, což je ukazatel množství apoptotických buněk. Pozorovali jsme zvyšování počtu buněk v S fázi po inkubaci s 30 μΜ 42 (Obr. 8).

io Také jsme pozorovali zvýšený počet apoptotických buněk po ošetření látkou 42, a to sedmkrát po h a třináctkrát po 48 h v porovnání s neošetřenými (Obr. 9). Testované sloučeniny byly účinné v indukci apoptózy a zástavě buněčného cyklu.

Buněčná migrace po ošetření testovanou látkou 42

Konfluentní jednovrstvé HUVEC buňky byly seškrábnuty a okamžitě ošetřeny bud’ hladovějícím médiem Ml99 (bez séra, negativní kontrola; PAN Biotech, Aidenbach, Německo) nebo kompletním médiem pro endotheliální buňky obsahující testovanou látku. Po 16 h byly pořízeny snímky pomocí TILLvisiON-systému (TILL Photonics, Lochham, Německo) připojeného na mikroskop

Axiovert 200 (Zeiss, Německo). Migrace byla vyjádřena jako podíl pixelů zakrytého buňkami a celkového počtu pixelů v ploše rýhy [S.CO LifeScience (Garching, Německo)].

Potom jsme vyhodnotili vliv cholestanového derivátu na migraci HUVEC buněk pomocí rýhového testu (Liang et al., 2007, Nat Protoč., 2(2): 329-333). Kontrolní buňky migrovaly 100% v porovnání s buňkami kultivovanými v hladovějícím médiu, kde nebyly schopny migrace (0 %). Ošetření 30 μΜ 42 inhibovalo migraci na 38 % (Obr. 10).

Inhibice tvorby tubulů cholestanovými deriváty .to Ibidi μ-destičky (18-jamkové, Ibidi GmbH, Munich, Německo) byly potaženy vrstvou Matrigelu® (Schubert & Weiss-OMNILAB, Munich, Německo). Do jamek bylo přidáno médium obsahující I x IO⁴ HMEC buněk a testovanou látku. Po 16 h byly pořízeny snímky pomocí TILLvisiON-systému připojeného k mikroskopu Axiovert 200. Tento experiment byt vyhodnocen jako počet tubulů a počet nodů ošetřených buněk v porovnání s neošetřenými kontrolními buňkami pomocí specifického softwaru [S.CO LifeScience (Garching, Německo)].

Test tvorby tubulů („tube formation assay“), který byl použit ke stanovení antiangiogenní aktivity cholestanových derivátů, byl založen na analýze tubulogeneze endotheliálních buněk in vitro. Kontrolní HMEC-1 buňky ochotně tvoří spojky (tubuly) na Matrigelu®. Buňky ošetřené 30 μΜ

42 snižují počet tubulů na 66 % v porovnání s kontrolními buňkami. Na rozdíl od snižujícího se počtu tubulů, počet zauzlení nebyl po aplikaci látky 42 redukován (Obr. 11). Zajímavé je, že inkubace s látkou 42 zvyšovala tvorbu uzlů.

Příklad 9

Suché tobolky

5000 tobolek, každá obsahující jako aktivní složku 0,25 g jedné ze sloučenin obecného vzorce I, 50 zmíněných v předcházejících nebo následujících příkladech, se připraví následujícím postupem:

-20CZ 303171 B6

Složení

Aktivní složka T alek

Pšeničný škrob Magnesium stearát Laktóza

1250 g 180 g 120 g 80 g 20 g

Preparační postup: Rozetřené látky jsou protlačeny pres síto s velikostí ok 0,6 mm. Dávka 0,33 g směsi je přenesena do želatinové tobolky pomocí přístroje na plnění tobolek.

Příklad 10

Měkké tobolky

5000 měkkých želatinových tobolek, každá z nich obsahující jako aktivní složku 0,05 g jedné z látek obecného vzorce 1 zmíněných v předcházejících nebo následujících příkladech, se připraví následujícím postupem:

Složení

Aktivní složka 250 g

Lauroglykol 2 litry

Preparační postup: prášková aktivní látka je suspendována v Lauroglykolu® (propy len glykol laurát, Gattefoseé S.A., Saint Priest, Francie) a rozetřena ve vlhkém pulverizátoru na velikost částic asi 1 až 3 mm. Dávka o velikosti 0,419 g směsi je potom přenesena do měkkých želatinových tobolek pomocí přístroje na plnění tobolek.

Příklad 11

Měkké tobolky

5000 měkkých želatinových tobolek, každá z nich obsahující jako aktivní složku 0,05 g jedné ze sloučenin obecného vzorce I zmíněných v předcházejících nebo následujících příkladech, se připraví následujícím postupem:

Složení

Aktivní složka PEG 400 Tween 80

250 g 1 litr 1 litr

Preparační postup: prášková aktivní složka je suspendována v PEG 400 (polyethylenglykol o Mr mezi 380 a 420, Sigma, Fluka, Aldrich, USA) a Tween® 80 (polyoxyethylen sorbitan monolaurát, Atlas Chem. Ind., Inc., USA, dodává Sigma, Fluka, Aldrich, USA) a rozetřena ve vlhkém pulverizátoru na částice o velikosti 1 až 3 mm. Dávka o velikosti 0,43 g směsi je potom přenesena do měkkých želatinových tobolek pomocí přístroje na plnění tobolek.

Claims (8)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Použití cholestanových derivátů, majících obecný vzorec I a jejich farmaceuticky přijatelné soli, ve kterých

   X znamená skupinu -CH=, CH₂, CH-OH nebo atom kyslíku, io R² znamená atom vodíku, hydroxyl nebo atom kyslíku, vázaný dvojnou vazbou na atom uhlíku C2 cholestanové struktury, nebo společně s R³ může vytvořit skupinu oxiranu,

   R¹ znamená atom vodíku, hydroxyl, atom kyslíku, vázaný dvojnou vazbou na atom uhlíku C3 cholestanové struktury, acetoxy skupinu, atom halogenu či skupinu EtOCOO stím, že v případě, i5 kdy R³ znamená skupinu EtOCOO, pak je mezi atomy uhlíku Cl a C2 dvojná vazba,

   R⁴ znamená atom vodíku, atom deuteria, hydroxyl, atom halogenu, skupinu H₂P, nebo v případě delta4 dvojné vazby mezi atomy uhlíku C4 a C5 nebo deltaS-dvojné vazby mezi atomy uhlíku C5 a C6 a/nebo jednoduché vazby mezi atomy uhlíku C3 a C5, kdy atom uhlíku C5 není účasten
2. 2() žádné dvojné vazby, pak R⁴ chybí,

   R⁵ znamená atom vodíku nebo hydroxy],

   R^Ď znamená atom vodíku nebo hydroxyl, skupina -Y-Z- znamená jednu z následujících struktur:

   -22CZ 303171 B6 :0 nebo mezi Y a Z neexistuje vazba a v tom případě Y i Z znamenají skupinu COOH, a

   5 -----znamená možnou jednoduchou vazbu,

   ...... znamená možnou dvojnou vazbu, přičemž v případě, kdy se jedná a o jedinou dvojnou vazbu zahrnující atom uhlíku C5, pak skupina R⁴ není přítomna, io k výrobě léčiva pro léčbu nádorového onemocnění a s ním spojené angiogeneze.

   2. Použití podle nároku 1, cholestanových derivátů majících obecný vzorec I, přičemž R¹ až R⁶ mohou být nezávisle v R nebo S konfiguraci, k výrobě léčiva pro léčbu nádorového onemocnění a s ním spojené angiogeneze.
3. 3. Použití podle nároku 1 nebo 2, cholestanových derivátů, kde léčba je spojena s inhibicí angiogeneze savčích buněk.
4. 4. Použití podle nároku 1 nebo 2, cholestanových derivátů, majících obecný vzorec I, kde léčba

   20 je spojena s indukcí apoptózy v savčích nádorových buňkách.
5. 5. Použití podle nároku 1 nebo 2, cholestanových derivátů, majících obecný vzorec I, kde léčivo působí jako regulátor ve zvířecích a lidských tkáňových kulturách pro regulaci jejich nádorového bujení a s ním spojené angiogeneze.
6. 6. Použití podle nároku 1 nebo 2, cholestanových derivátů, majících obecný vzorec 1, k výrobě léčiva pro léčbu metastázujících nádorových onemocnění.
7. 7. Použití podle nároku 1 nebo 2, cholestanových derivátů, majících obecný vzorec I, kde léči30 vo inhibuje angiogenezi v nádorech.
8. 8. Použití podle nároku 6 nebo 7, přičemž jsou nádory vybrány ze skupiny zahrnující leukémie, nádory prsu, dělohy nebo prostaty.

   35 9. Použití podle nároku 1 nebo 2, cholestanových derivátů, majících obecný vzorec I, k výrobě léčiva pro léčbu onemocnění vyvolaných nadměrnou angiogenezi, tedy zejména onemocnění vybraných ze skupiny zahrnující revmatoidní artritidu, artritidy velkých i malých kloubů, astma bronchiale, chronickou pankreatitidu, venookluzivní jatemí nemoc, trofícké a zánětlivé choroby CNS, proliferativní diabetickou retinopatii, stařeckou makulopatii, pterigium, glaukom, nefro40 patie, endometriózu, psoriázu.