CZ300776B6 - Polymerní konjugát antimykotického léciva, zpusob jeho prípravy a farmaceutická kompozice jej obsahující - Google Patents

Abstract

Polymerní konjugát antimykotického léciva obsahujícího aminoskupinu, obsahující vodorozpustný polymer a antimykotické lécivo obsahující aminoskupinu, který obsahuje fragment obecného vzorce I, kde R znamená acetyl skupinu nebo atom vodíku; Z znamená amidickou vazbu (CONH) nebo imino vazbu (CH=N) mezi polymerem a fenylem spojovacího fragmentu. Vynález se dále týká zpusobu prípravy polymerního konjugátu a farmaceutické kompozice konjugát obsahující.

Description

(57) Anotace:

Polymerni konjugát antimykotického léčiva obsahujícího aminoskupinu, obsahující vodorozpustný polymer a antimykotické léčivo obsahující aminoskupinu, který obsahuje fragment obecného vzorce I, kde R znamená acetyl skupinu nebo atom vodíku; Z znamená amid tekou vazbu (CONH) nebo imino vazbu (CH=N) mezi polymerem a feny lem spojovacího fragmentu. Vynález se dále týká způsobu přípravy polymemiho konjugátu a farmaceutické kompozice konjugát obsahující.

Polymerní konjugát antimykotického léčiva, způsob jeho přípravy a farmaceutická kompozice jej obsahující

Oblast techniky

Předmětem vynálezu je polymerní konjugát antimykotického léčiva obsahujícího aminoskupinu, způsob jeho přípravy a farmaceutická kompozice jej obsahující.

Dosavadní stav techniky

Ke zvýšení terapeutického indexu významných antimykotik, jako je například amfotericin B (AMB) a nystatin, byly připraveny komplexy a konjugáty s polymeruími nosiči, které jednak umožňují solubilizaci ve vodném prostředí a také zajišťují plynulé uvolňování, což zpravidla vede i ke snížení toxicity (A. S. Janoff, L. T. Boni, M. C Poescu, S. R. Minchey, P. R. Cullis, T. D Madden, T. F. Tarashi, S. M. Gruner, E. Shyamsunder: Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 1988, 85,61 227.).

Klinicky používané lékové formy jsou nekovalentní komplexy typu amfotericin B lipidový komplex (ABLC), což jsou koloidní systémy složené z biodegradabilních fosfolipidových matric (např. dimyristoylfosfatidyl cholín (DMPC)) nebo modifikovaných poly(ethylenglykolů) (např, distearoyl-A-(monomethoxy)poly(ethylenglykol)sukcinylfosfatidylethanoiamin (DSPE-PEG)) s amfotericinem B (A. S. Janoff, W. R. Perkins, S. L. Saleton, C. E. Swenson: J. Liposome Res.

1993,3,451.). Takovéto lipidové formulace amfotericinu B často významně zvyšují antifungální aktivitu in vitro ve srovnáni s běžným amfotericinem B (K. Moribe, K.; Mararuyama, K.

M. Iwatsuru M,: Int. J. Pharm. 2000, 201, 37,). Tyto typy komplexů však řeší zejména problém rozpustnosti účinných látek, přičemž však k uvolňování jejich účinné složky dochází přímo v krevním oběhu, což vede k celkovému působeni na léčený organismus včetně nežádoucích účinků. V krvi uvolněný amfotericin B podléhá následné distribuci mezí přítomné lipoproteiny (high-density-lipoprotein (HDL) a low-density-lipoprotein (LDL)) (O. Sivak, B. Lau

N. Patankar, K. M. Wasan: Pharm. Res. 2004,21,2 336). Bylo zjištěno, že zvýšená hladina komplexů AMB s LDL má za následek nefrotoxické působení AMB (K. M. Wasan, J.C. Wong, T. Coit, S. Pritcharrd: Cancer Chemother. Pharmacol. 2006,57,120.).

Jednou z metod, jak lze dosáhnout cíleného antimykotického působení polymemích konjugátu s antimykotickými léčivy, je využití poznatku, že řada patogenů, mezi něž lze zařadit i fungální agens, způsobuje v napadené tkáni takové biochemické procesy, které vedou k lokálnímu snížení pH až na hodnoty pH»5 (I. Mellman, R. Fuchs, A. Helenius: Ann. Rev. Biochem. 1986, 55,

773.). Pro intravenózni aplikace byly nedávno připraveny pH-senzitivní lipidové formulace (liposomy) ny stati nu (T. H. Nasti, M. A. Khan, J. M. Owais. J. Antimicrob. Chemother. 2006,57, 349.) nebo pH senzitivní kovalentní konjugáty poly(ethylenglykolů) a poly(ethylenglykol)-6poly(L-lysinu) (M. Sedlák, L. Kubicová, K. Ventura, M. Pravda, F. Staud, V. Buchta: přihláška vynálezu PV 2006-538; M. Sedlák, M. Pravda, L. Kubicová, K. Týčová, K. Ventura: Bioorg.

Med. Chem. 2007, 15, 2 554; M. Sedlák, M. Pravda, L. Kubicová, P. Mikulčíková, K. Ventura: Bioorg. Med. Chem. Lett. 2007, 17,4069.).

Skupina R. B. Greenwalda podala k ochraně způsob připojení amino léčiv pomocí tzv. labilní karbamátové vazby (R. B. Greenwaid, A. Pendri, Y. H. Choe: PCT Int. Appl. WO 99/30727;

Chem. Abstr. 1999, 131, 59098.). Následně byly takto připraveny i konjugáty amfotericinu B s poly(ethylenglykolem) (PEG), kde je amfotericin B vázán prostřednictvím zmíněné labilní karbamátové vazby, jež se v krevní plazmě rozpadá eliminačním mechanismem za vzniku volného amfotericinu B (/_w =1,5 až 3 h, krevní plazma, potkan) (C. D. Conover, H. Zhao, B. Clifford, C. B. Longley, K. L. Shum, R. B. Greenwaid: Bioconjugate Chem. 2003, 14, 661.). Tato spojka mezi polymemím nosičem (PEG) a amfotericinem B je konstruována tak, že prvním nejpomalejCZ 300776 B6 ším krokem uvolňování je enzymatická hydrolýza esterové vazby krevními hydrolázami. Primárně vzniklé proléčivo podléhá v druhém kroku rychlé bazicky katalyzované 1,4-nebo 1,6-benzylové eliminaci, která je již delší dobu obecně známá a využívaná např. pro ochranu aminoskupin (M. Wakselman: Noův. J. Chim. 1983, 7, 439.; T. W. Greene, P. G. M. Wuts v knize: Protective

Groups in Organic Synthesis Third Edition str. 542., John Wiley & Sons, New York 1999.). Pri benzylové eliminaci vzniká chinonmethid a karbamová kyselina účinné látky. Chinonmethid se dále okamžitě hydratuje a karbamová kyselina příslušné účinné látky se rychle rozpadá na oxid uhličitý a volné léčivo. Tento systém uvolňování účinné látky je vhodný pro cílenou distribuci cytostatik majících primární aminoskupinu, a to v systémech, kdy je na polymemím nosiči dále io navázána monoklonální protilátka mající afinitu vůči specifickému glykoproteinovému povrchu nádorově trans formovaných buněk (R. B. Greenwald, Y. Choe, J. McGurie, C. D. Conover: Adv. Drug. Delivery Rev. 2003, 55, 217.). Tento princip však nelze aplikovat obecně na libovolné skupiny léčiv. Například v případě konjugátů PEG-amfotericin B tento systém 1,4— a 1,6-benzylové eliminace vede k poměrně rychlému odštěpení volného amfotericinu B přímo do krevního oběhu, a tím způsobuje rychlý vzestup jeho koncentrace i v ledvinách, což je nežádoucí zejména z důvodu nefrotoxicity amfotericinu B.

Nevýhody dosavadních řešení odstraňuje předložený vynález.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je polymemí konjugát antimykotického léčiva obsahujícího aminoskupinu, obsahující vodorozpustný polymer a antímykotické léčivo obsahující aminoskupinu, jehož pod25 stata spočívá v tom, že obsahuje fragment obecného vzorce I,

N-ANTIMYKOTIKUM kde R znamená acetyl skupinu nebo atom vodíku; z znamená amidiekou vazbu (CONH) nebo io imino vazbu (CH=N).

Ve výhodném provedení vynálezu jsou vodorozpustnými polymery poly(ethylenglykoly) nebo blokové kopolymery poly(ethylenglykolu) a poly(aminokyselin) s molekulovými hmotnostmi 10 000 až 30 000. Blokovým kopolymerem může být například poly(ethylenglykol)-Z>-poly(L35 glutamová kyselina).

S výhodou jsou antimykotickými léčivy obsahujícími amínoskupiny (ΑΝΤΙΜΥΚΟΤΙΚΌΜNH₂) amfotericin B nebo nystatin, jejichž amínoskupiny jsou k spojovacímu fragmentu polymeru vázány karbamátovou vazbou (CH₂OCONH).

Podstatu vynálezu tedy představuje enzymově senzitivní spojka, citlivá k β-glykosidázám (E.C.3.2.1.21), mezi molekulami ve vodě rozpustných polymemích nosičů a molekulami antimy't

CL JW//O DO koticky aktivních látek obsahujících aminoskupinu (amfotericin B (AMB)), nystatin (NY)) (v knize: The Merck Index-an Encyclopedia of Chemicals, Drugs, and Biologicals 13th edition (J. 0'Neil, A, Smith, P. E. Hackelman Eds.) Merck & CO., INC. New Jersey 2001.). Při intravenózní aplikaci polymemího konjugátu dojde k uvolnění aktivního antimykotika cíleně, tj. až v místě působení houbového patogenu, a to vlivem uplatňující se enzymatické reakce. Acylovaný fragment 2-amino-4-{hydroxymethyl)fenyl-p-D-glukopyranosidu je vázán pomocí amidické nebo imino vazby na vodorozpustný polymemí nosič. Léčivo je vázáno na benzylalkoholovou skupinu prostřednictvím labilní karbamátové vazby. U acetylovaných forem konjugátů obsahujících fragment obecného vzorce I (kde R = CH₃CO) dojde účinkem krevních hydroláz k hydrolýze acetylovaných hydroxyskupin fragmentu β-D-glukosy. Připravený nebo takto vzniklý deacetylovaný konjugát (R = H) bude v přítomnosti β-glykosidáz štěpen na volné aktivní antimykotikum, glukózu a 3-amino-4_hydroxy benzyl alkohol vázaný na polymemí nosič. Vynález využívá poznatku, že řada patogenních bakterií a hub obsahuje specifické enzymy β-glykosidázy, které nejsou ve významném množství přítomny v savčích buňkách (lidských a zvířecích), is Spojení mezí polymemím nosičem a účinnou látkou je konstruováno tak, že se účinná látka odštěpuje z konjugátu (proléčiva) enzymaticky působením β-glykosidáz, jež jsou v enzymové výbavě řady bakterií a houbových parazitů (Agrobacterim faecalis, Alcaltgenes faecalis, Aspergillius niger, Aspergillius fumigatus, Candida albicans, Candida tropicalis, Trichosporon beigelii atd.) (LiY-K.., ChírJ., ChenF-Y.: Bíochem. J. 2001, 335, 835.). V případě lidského organismu se β-glykosidázy vyskytují pouze u některých bakterií, které jsou součástí střevní mikroflóry, čehož bylo dříve využito k řízenému uvolnění některých léčiv z perorálních proléčiv, a to cíleně ve střevě (Hiyarama F., Uekama K., v knize: Prodrugs: Challenges and Rewards (V, J. Stella, R. T. Borchardt, M. J. Hageman, R. Oliyai, H. Maag, J. W. Tilley Eds.), Part 1 s. 683. Springer 2007.). Přirozeně se však β-glykosidázy ve zdravé lidské tkáni nenacházejí (HutbergB., Ockerman P.A.: Clin. Chim, Acta 1970, 28, 169.). Základní strukturní jednotkou spojky je β-glykosidická vazba substituované molekuly fenyl-p-D-glukopyranosidu. Tedy účinkem krevních hydroláz nejprve dojde k hydrolýze acetylovaných hydroxyskupin fragmentu β—D— glukosy. Následným enzymatickým štěpením β-glykosidické vazby vznikne glukóza, a karbamová kyselina amfotericinu B nebo nystatinu, která se velmi rychle rozpadne na volný amfoteri30 cín B nebo nystatin. Zbylá molekula polymemího nosiče s kovalentně vázaným fragmentem substituovaného 4-hydroxybenzylalkoholu se vyloučí z organismu. Schéma 1 ukazuje postup uvolňování léčiva z polymemího konjugátu podle předloženého vynálezu.

-3CZ 300776 B6

OH

Z: NH-CO-, N=CHSchéma 1

Předpokládané použití těchto ve vodě velmi dobře rozpustných konjugátů podle předloženého vynálezu jsou intravenózní aplikace pro jinak málo ve vodě rozpustná antimykotika. Polymemí konjugáty podle předloženého vynálezu umožní cílené uvolnění aktivního léčiva, což by mělo vést ke zvýšení jejich terapeutického indexu ve srovnání s dosud užívanými lékovými formami amfotericinu B a nystatinu.

Předmětem vynálezu je dále způsob přípravy polymemího konjugátu podle předloženého vynáleio zu, jehož podstata spočívá v tom, že se připraví (2-amíno-4-hydroxymethylfenyl)-(2,3,4,6-tetra-OacetyiPji-D-glukopyranosid (vzorec II),

jeho aminová skupina se naváže na vodorozpustný polymemí nosič za tvorby amidové nebo iminové vazby, jeho hydroxyskupina se následně naváže na antimykotické léčivo obsahující ami5 noskupinu za tvorby karbamátové vazby a případně se poté odstraní acetylové skupiny na glukopyranosidovém zbytku za vzniku hydroxyskupin.

Acetylové skupiny na glukopyranosidovém zbytku v (2-amino-4-hydroxymethylfenyl)-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl)-p-D-glukopyranosidu chrání hydroxyly, aby nereagovaly v dalších krocích io přípravy polymemího konjugátu.

Ve výhodném provedení vynálezu je vodorozpustným polymemím nosičem poly(ethylenglykol) nebo blokový kopolymer poly(ethylenglykolu) a poly(aminokyselin) s molekulovou hmotností 10 000 až 30 000, nesoucí alespoň jednu aldehydickou nebo karboxylovou skupinu, umožňující vytvoření amidové nebo iminové vazby. Blokovým kopolymerem může být například poly(ethylenglykol)-b-poly(L-glutamová kyselina).

S výhodou je antimykotickým léčivem obsahujícím aminoskupinu amfotericin B nebo nystatin.

Příprava (2-amino-4-hydroxymethylfenyl)-(2,3.4,6-tetra-č>-acetyl)-(3-D-glukopyranosidu se provádí tak, že se z 2,3,4,6-tetra-Ó-acetyl-a-D-glukopyranosyl bromidu s 4-hydroxymethyl2-nitrofenolem za katalýzy oxidem stříbrným a za působení ultrazvuku v rozpouštědle vybraném ze skupiny zahrnující suchý acetonitril, propionitril nebo etherová rozpouštědla (tetrahydrofuran, dioxan, 1,2-dimethoxyethan apod.) připraví (4-hydroxymethyl-2-nitrofenyl)-(2,3,4.6-tetra-Q25 acetyl)-p-D-glukopyranosid a nitro skupina (4-hydroxymethyl-2-nitrofenyl)-(2,3,4,6-tetra-<?acetylj-p-D-glukopyranosidu se následně redukuje vodíkem za přítomnosti Adamsova katalyzátoru (PtO₂) za vzniku (2-amino-4-hydroxvmethyIfeny 1)-(2,3,4,ó-tetra-O-acetylpp-D-glukopyranosidu. Redukce se provádí za míchání v heterogenní fázi při laboratorní teplotě a za mírného přetlaku vodíku v rozpouštědlech jako jsou alkoholy (např, ethanol, methanol, propanoly), tetrahydrofuran, cyklohexan a estery kyseliny octové (ethylacetát, propylacetát, butylacetát ap.). Reakce přípravy (4-hydroxymethyl-2-nítrofenyl)-(2,3,4,6-tetra-Oacetyl)-f)-D-glukopyranosidu je modifikovanou Koenigs-Knorrovou reakcí (Koenigs W., Knorr E.: Chem. Ber. 1901, 34, 957; Flowers Η. M.: Methods Carbohyd. Chem. 1972, 6, 474.). Modifikace této reakce spočívá ve využití ultrazvuku, což vede k utychlení reakce a ke zvýšení výtěžku. Vlivem ultrazvuku dochází k odstraňování bromidu stříbrného z povrchu oxidu stříbrného a tím i k obnově jeho katalytických vlastností. Přípravu (2-amino-4-hydroxymethylfenyl)-(2,3,4,6-tetrar-0-acetyl)β-D-glukopyranosidu (vzorec II) znázorňuje schéma 2.

-5CZ 300776 B6

Schéma 2

Navázání aminové skupiny (2-amino-4-hydroxymethylfenyl)--(2,3,4,6-tetra-í/-acety])-|3-Dglukopyranosidu amidovou nebo iminovou vazbou na vodorozpustný polymerní nosič se provádí tak, že se (2-amino-4~hydroxymethylfeny1)-(2,3,4,6-tetra-0-acetyl)-p-D-glukopyranosid uvede do kontaktu s vodorozpustnými polymemími nosiči s aktivovanými karboxylovými nebo aldehydickými skupinami. S výhodou je aktivátorem karboxylových skupin 0-[(ethoxykarbonyI)kyanmethylenamino]-V,.V.,V'.A^r -tetramethyiuronium tetrafluorborát nebo //-[(ethoxykarbonyl)kyanmethylenamino]-;V,jV,,V',.V' tetramethyluronium hexafluorfosfát. Aktivátorem aldehydicio kých skupin je s výhodou aktivované molekulové síto a trimethylorthoformíát nebo triethylorthoformiát. Těmito reakcemi se připraví odpovídající (2-polymeracylamino-4-hydroxymethylfenyl)-{2,3,4,6-tetra-č>-acetyl)-p-D-gIukopyranosidy nebo (2-polymerimino-4-hydroxymethylfenyl}-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl)-f3-D--glukopyranosidy.

Volná hydroxyskupina (2-polymeracy1amino-4-hydroxymethylfenyl)-(2,3,4,6-tetra-ť/-acetyl)P-D-glukopyranosidů nebo (2-polymerimino-4-hydroxymethylfenyÍ)-(2,3,4,6-tetra-0-acetyl)-p-D gIukopyranosidů se pro reakci s léčivy obsahujícími aminoskupinu aktivuje pomocí 4nitrofenylchlorformiátu nebo .V,,V'-disukcinimidyi karbonátu za vzniku 4-nitrofenylkarbonátů nebo sukcinimidyl karbonátů (2-polymeracylamino-4-hydroxymethylfenyl)-{2,3,4,6-tetra-č/20 acetyl)-p-D-glukopyranosidů nebo 4-nítrofenylkarbonátů nebo sukcinimidyl karbonátů (2polymerimincM-hydroxymethylfenyl)-(2,3,4,6-tetra-C/-acetyl)-p-D-glukopyranosidů,

Navázání antimykotického léčiva obsahujícího aminoskupinu se provede reakcí s 4-nitrofenylkarbonáty nebo sukcinimidyl karbonáty (2-polymeracylamino-4-hydroxymethylfenyl)-(2,3,4,625 tetra-0-acetyI)-[3-D-glukopyranosidů ne bo 4-nitrofenylkarbonáty nebo sukcinimidyl karbonáty (2-polymerimino-4-hydroxymethylfenyl)-(2,3,4,6-tetra-č)-acetyl)-p-D-glukopyranosidů v dimethylformamidu nebo dimethylsufoxidu za katalýzy d-AriV -dimethylaminopyridinem,

CZ 3W77G Β6

Krok odstranění acetylových skupin se provádí tehdy, je-li třeba vyrobit konjugát podle předloženého vynálezu, obsahující fragment vzorce I, kde R = H. Odstranění acetylových skupin se provádí v roztoku l,8-diazabicyklo[5.4.0]undec-7-enu (DBU) v methanolu. Reakce je modifikací reakce popsané v L. Η .B. Baptistella, J. F. dos Santos, K. C. Ballabio, A. J. Marsaioli:

Synthesis 1989,436. U deacetylovaných forem konjugátů podle předloženého vynálezu lze předpokládat rychlejší nástup účinku antimykotického léčiva, protože odpadá aktivace (deacetylace) krevními hydrolázami.

Předmětem předkládaného vynálezu je dále farmaceutická kompozice, obsahující alespoň jeden ío polymemí konjugát podle předloženého vynálezu a farmaceuticky přijatelný nosič. S výhodou je farmaceuticky přijatelným nosičem voda a kompozice je sestavena pro injekční aplikaci.

Vynález je dále osvětlen na následujících příkladech, aniž je jimi jakkoliv omezen.

Příklady provedeni vynálezu

Měření ’H a ^l3C NMR byla provedena na přístroji Broker Avance 500 (500,13 MHz pro ’H a 125,77 MHz pro ¹³C). Jako rozpouštědlo byl použít deuteriochloroform (CDC1₃). Kalibrace byla provedena na zbytkový signál rozpouštědla (7.25 ppm JH, 77.0 ppm ¹³C). Elementární analýza byla provedena na přístroji FISONS Instruments EA 1108 CHN. Měření UV/vis spekter byla provedena na přístroji HP UV/VIS 8453 Diodě Array. Gelová permeační chromatografie polymerů a konjugátů byla provedena na koloně HEMA-BIO (hydrofilně modifikovaný HEMA-Gel, velikost částic 10 pm, porosita 40/100/300/1000) při laboratorní teplotě použitím RI detektoru a

UV/vis detektoru. Jako eluent byla použita redestilovaná voda (pH = 7,1). Kolony byly kalibrovány na sérii standardů PEG s různými molekulovými hmotnostmi (PSS, Polymer Standard Service Gmbh, Mainz, Germany). Čistoty polymerů a konjugátů byly ověřeny na sestavě HPLC s použitím kolony LiChroCART® 125x4 mm s náplní LiChrospher® 100 RP-18e 5 pm (MERCK), mobilní fází: acetonitril, 20 mM chelaton II; při laboratorní teplotě použitím. UV/vis detektoru.

Příklad 1

Příprava (4-hydroxymethyi-2-nítrofenyl)-(2,3,4,6-tetra-<2-acetyt)-fí-I>-gIukopyranosidu (1)

K roztoku 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-a-D-glukopyranosyl bromidu (3,08 g; 7,5 mmol) a 4-hydroxymethyl-2-nitrofenolu (1,27 g; 7,5 mmol) v 65 ml suchého acetonitrilu byl přidán oxid stříbrný (7,3 g; 31,5 mmol). Reakční směs byla míchána ultrazvukem při laboratorní teplotě. Po pěti hodinách byla směs zfiltrována přes vrstvu křemeliny naplavenou na BOchnerově nálevce. Filtrát byl z vodní lázně odpařen k suchu a rozpuštěn ve 300 ml chloroformu. Vzniklý roztok byl extrahován nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného (2 x 100 ml) a nasyceným roztokem chloridu sodného (1 x 50 ml). Po vysušení (bezv. MgSO₄) a odpaření chloroformu byl odparek chromatograficky přečištěn na vrstvě silikagelu (10 cm, 0 5 cm; mobilní fáze: ethyl45 acetát). Odpařením spojených frakcí bylo získáno 2,7 g (77 %) produktu; b.t. 198 až 200 °C, TLC: (Silicagel plates Merck), ethylacetát, RF = 0.55; [α]₂ο° = + 19.4° (0.5g/100ml, CH₃OH); Ή NMR (500 MHz, CDC1₃, ppm): 82.06 (m; 12 H; (CH₃)₄), 3.84 (m; 1 H; CH), 4.23 (m; 2 H; CH₂), 4.69 (s; 2 H; CH₂), 5.07 (m; 1 H; CH), 5.14 (m; t H; CH), 5.25 (m; 1 H; CH), 5.27 (m; 1 H; CH), 7.31 (d, >8.6 Hz, 1 H-arom), 7.49 (dd, >8.6 Hz, \j= 1.9 Hz; 1 H-arom), 7.77 (d, >1.9 Hz; 1 H-arom); ¹³C NMR (500 MHz, CDC1₃, ppm): 8 20.5; 20.5; 20.5; 20.6; 20.7; 61.8;

63.4; 68.1; 70.5; 72.30; 100.3; 120.1; 123.1; 131.7; 137.36; 141.39; 148.3; 169.3; 169.4; 170.2; 172.5. Elementární analýza: pro C₂,H₂₅NO_I3 (499) (%) vypočteno:, C, 50.50; H, 5.05; N, 2.80; nalezeno: C, 50.50; H, 4.97; N, 2.98.

-7CZ 300776 B6

Příklad 2

Příprava (2-amino4-hydroxymethylfenyl)-(2,3,4,6-tetra-0-acety|)-p-D-glukopyranosidu (2)

K roztoku (4-hydroxymethyl-2-nitrofenyl)-(2,3,4,6-tetra-0-acetyl)-f)-D-g]ukopyranosidu (1) (1 g; 2 mmol) ve 150 ml ethylacetátu byl přidán oxid platičitý (0,1 g; 0,4 mmol). Míchaná suspenze byla hydrogenována za mírného přetlaku (cca 5 kPa) vodíku při 25 °C. Po třech hodinách byla reakční směs přefiltrována pod argonem a odpařena z vodní lázně k suchu. K. odparku byl přidán chloroform (10 ml), následně diethylether (20 ml), přičemž došlo k pozvolné krystalizaci ío produktu, který byl ochlazen odfiltrován a vysušen. Bylo získáno 0,9 g (96 %) produktu; b.t. 135 až 138 °C, TLC: (Silicagel plates Merck), ethylacetát, RF = 0.32; [α]₂ο° = - 30.4° (0.5g/100 ml, CH₃OH); ’H NMR (500 MHz, CDC1₃, ppm); δ 2.03 (m; 12 H; (CH₃)₄), 3.82 (m; 1 H; CH), 3.83 (m; 2 H; CH₂), 4.15 (m; 1 H; CH), 4.27 (m; 1 H; CH), 4.94 (d; 1 H; CH), 5.13 (m; 1 H; CH), 5.27 (m; 2 H; CH₂), 6.61 (dd, >8.6 Hz, >1.9 Hz; 1 H-arom),6.69 (d, >8.6 Hz, 1 H-arom),

7.77 (d, >1.9 Hz; 1 H-arom); ^,3C NMR(500 MHz, CDClj, ppm): 20.5; 61.7; 64.8; 68.2; 71,1;

71.9; 72.3; 100.4; 114.3; 116.0; 116.5; 137.0; 137.6; 143.7; 169.3; 169.7; 170.0; 170.5. Elementární analýza: pro C₂|H₂₇NOh (469) (%) vypočteno: C, 53.73; H, 5.80; N, 2.98; nalezeno: C, 53.70; H, 5.72; N,2.88.

Příklad 3

Příprava .Va^V<±>-di[2-(2,3,4,6-tetra-0-acetyl-{3-D-glukopyranosyloxy)-5-hydroxymethyl5 fenyljdiamidu poly(ethylenglykol)-a,ů>-dikarboxylové kyseliny (3)

K roztoku poly(ethylenglykol)-a,<»-dikarboxylové kyseliny (10 204 g/mol) (1,5 g; 0,15 mmol), (2-amino-4-hvdroxymethylfeny 1)-(2,3,4,6-tetra-0-acetyl)-p-D-glukopyranosidu (2) (0,7 g;

1,5 mmol) a trioktylaminu (0,53 g; 1,5 mmol) v dímethylformamidu (5 ml) byl při 0 °C přidán <%[(ethoxykarbonyl)kyanmethylenamino]--ALV, ACV-tetramethyluronium tetrafluorborát (TOTD) (0,48 g; 1,5 mmol). Během 5 hodin teplota reakční směsí postupně stoupla až na teplotu místnosti. Po pěti dnech byl z reakční směsi oddestilován dimethylformamid, zbytek byl rozpuštěn v dichlormethanu (60 ml) a extrahován nasyceným roztokem chloridu sodného (10 ml). Po vysušení, odpaření dichlormethanu a krystalizaci z propan-2-olu bylo získáno 1,1 g (74 %) prois duktu. *H NMR (500 MHz, CDC1₃, ppm):8 2.02 (m; 12 H; (CH₃)₄), 3,42-3,72 (m; 460 H, (CHr<H2-O)i₁₅), 3.69 (m; 1 H; CH), 3.74 (m; 1 H; CH), 3.85 (m; 2 H; CH₂), 4.18 (m; i H; CH), 4.23 (m; 1 H; CH), 4.37 (m; 1 H; CH), 5.05 (d; 1 H; CH), 5.15 (m; 2 H; CH₂), 6.88 (m, 1H; CH), 7.07 (m, 1 H; CH), 7.35 (d, I H; CH), 8.50 (d, IH, CONH). Elementární analýza: pro C_J06H₉₇₆N₂O₂₅₄ (11 153) (%) vypočteno: C, 54.49; H, 8.82; N, 0.25; nalezeno: C, 54.66; H, 9.02;

N, 0.33; 1.13.

Příklad 4

Příprava N,N',N,N'' ’,N’''A ” '-hexa [2-(2,3,4, ó-tetra-O-acetyl-p-D-glu kopy ráno syl)-5hydroxymethylfenyl]hexamid poly(ethylenglykol)-á-poly(L-glutamové kyseliny) (4)

K. roztoku poly(ethylenglykol)-ó“poly(L-glutamové kyseliny) (13 570 g/mol, (COOH)i₀) (1,36 g; 0,1 mmol), (2-amino-4-hydroxymethylfenyl)-(2,3,4,6-tetra-D-acetyl)-p-I>-glukopyranosidu (2) (0,7 g; 1,5 mmol) a trioktylaminu (0,53 g; 1,5 mmol) v dimethylformamidu (10 ml) byl při 0 °C přidán 0-[(ethoxykarbonyl)kyanmethylenamino]-y/V,JV',JV-tetramethyluronium hexafluorfosfát (HOTU) (0,58 g; 1,5 mmol). Během 5 hodin teplota reakční směsi pos35 tupně stoupla až na teplotu místnosti. Po pěti dnech byl z reakční směsí oddestilován dimethylformamid, zbytek byl rozpuštěn v dichlormethanu (80 ml) a extrahován nasyceným roztokem chloridu sodného (15 ml). Po vysušení, odpaření dichlormethanu a krystalizaci z propan-2-olu bylo získáno 1,44 g (97 %) produktu. ’H NMR (500 MHz, CDC1₃, ppm): δ 1,83 (m, 20H; CH₂); 2.04 (m; 72 H; (CH₃)₄), 2,51 (m; 8 H, CH₂), 2.58 (m; 12 H CH₂); 3,42 - 3,72 (m; 472 H, (CHr40 CHrOjug), 3.69 (m; 6 H; CH), 3.74 (m; 6 H; CH), 3.85 (m; 12 H; CH₂), 4.18 (m; 6 H; CH), 4.23 (m; 6 H; CH), 4.37 (m; 6 H; CH), 5.05 (d; 6 H; CH), 5.15 (m; 12 H; CH₂), 6.88 (m, 6 H; CH),

-9CZ 300776 B6

7.07 (m, 6 H; CH), 7.35 (d, 6 H; CH), 9.24 (s, 6 H, CONH). Elementární analýza: pro C^Hl ]72N|_gC>326 (14 888) (%) vypočteno: C, 55.34; H, 7.93; N, 1.69; nalezeno: C, 55.56; H, 8.08; N, 1.8; MJM_n= 1.28.

o o (CH₂)jCOOH (CHj)₂COOH (PEG-d-PLG-CO₂H)

HOTU

Výchozí poly(ethylenglykol)-Z>“poly(L-glutamová kyselina) byla připravena dříve popsanou metodou (K. Kugo, A. Ohji, T. Uno, J. Nishino: Polym, J. 1987, 19, 375.). Pomocí 'HNMR a GPC bylo stanoveno; že střední molekula výchozí poly(ethylenglykol)-ó-poly(L-glutamové io kyseliny) statisticky obsahuje 10 karboxylových skupin (1 -70 g/mol; MJ\I_n = 1.18). Podle 'HNMR a GPC analýzy následně připraveného polymeru 4 bylo zjištěno, že bylo amidickou vazbou navázáno šest jednotek (2-amíno-4-hydroxymethylfenyl)-(2,3,4,6-tetra-ť?-acetyl)-|}D-glukopyranosidu (14 888 g/mol; Mv/M = 1.21).

Příklad 5

Příprava JVá,jVft>-di[2-(2,3,4,6-tetra-ť?-acetyl-fi-D-glukopyranosyloxy)-5-hydroxymethylfenyljdimínu a,íů-bis(4-formylfenyloxy)poly(ethylenglykolu) (5)

Jako jiné možnosti navázání (2-amino-4-hydroxymethylfenyl)-(2,3,4,6-tetra-<9-acetyl)-p-D~ glukopyranosidu bylo využito dříve popsané reakce a,tt>-bis(4-formylfenyloxy)poly(ethylenglykolu) s aminoskupinou substrátu v triethylorthoformiátu v přítomnosti molekulového síta za vzniku imino vazby (M. Sedlák, L. Kubicová, K. Ventura, M. Pravda, F. Staud, V. Buchta: paten25 tová přihláška PV 2006-538; M. Sedlák, M. Pravda, L. Kubicová, K. Týčová, K. Ventura: Bioorg. Med. Chem, 2007, 15, 2 554; M. Sedlák, M. Pravda, L. Kubicová, P. Mikulčíková, K. Ventura: Bioorg. Med. Chem. Lett. 2007, 17, 4 069.) Směs a,co-bis(4-formylfenyloxy)poly(ethylenglykolu) (10 962 g/mol) (1,5 g; 0,15 mmol), [(2-amino-4~hydroxymethylfenyI)-(2,3,4,6-tetra-ť)-acetyl)-p-D-glukopyranosidu (2) (0,7 g; 1,5 mmol), trimethylorthoformiátu (3 ml) aktivovaného molekulového síta 4 Á(0.2 g) v dimethylformamidu (3 ml) byla míchána při laboratorní teplotě. Po pěti dnech bylo z reakční směsi odstraněno molekulové síto a oddestilován dimethylformamíd s trimethylorthoformiát. Po krystalizaci z propan-2-olu bylo získáno 1,2 g (80%) produktu. 'HNMR(500 MHz, CDC1₃, ppm)Ó2.02 (m; 12 H; (CH₃)₄), 3,42-3,72 (m; 488 H, (CH₂CH₂-O),₂₂), 3.70 (m; 1 H; CH), 3.75 (m; I H; CH), 3.87 (m; 2 H; CH₂), 4.19 (m;

1 H; CH), 4.24 (m; 1 H; CH), 4.38 (m; 1 H; CH), 5.05 (d; 1 H; CH), 5.16 (m; 2 H; CH₂), 6.88 (m, lH-arom), 7,07 (m, 1 H; C-arom), 7.18 (m, 2H; C-arom), 7.35 (d, 1 H-arom), 7.97 (m, 2 H; Carom), 9.28 (s, IH, CH=N); Elementární analýza: pro C₅₄₄H,o₄oN₂0₂69 (11 942) (%) vypočteno: C, 54.71; H, 8.78; N, 0.47; nalezeno: C, 54.92; H, 9.00; N, 0.54; K/3/„ =1.18.

Λ

Příklad 6

Příprava konjugátu 3 a

Roztok polymeru 3 (1,11 g; 0,10 mmol) v toluenu (60 ml) byl odvodněn oddestilováním toluenu (cca 20 ml). Po ochlazení na 50 °C byl k roztoku přidán 4-nítrofenylchIorfonniát (0,5 g; ío 2,5 mmol) a směs byla temperována na 50 °C. Po 48 hodinách byl z reakční směsi vakuově oddestilován další podíl toluenu (cca 30 ml) a destilaění zbytek byl rozmíchán v diethyletheru (250 ml). Vzniklá suspenze byla odfiltrována a promyta diethyletherem (10x50 ml). Po vysušení v exsikátoru byl 1 g aktivovaného polymeru 3 rozpuštěn v dimethylformamidu (8 ml) a ke vzniklému roztoku byl přidán amfotericin B (0,185 g, 0,20 mmol), 4-V’A-dimethylaminopyridin (0,005 g; 0,04 mmol) a trioktylamin (0,35 g; 1 mmol). Reakční směs byla míchána několik dnů při laboratorní teplotě v argonové atmosféře s vyloučením světelného záření. Ukončení reakce bylo monitorováno pomocí GPC. Závěrem byla reakční směs nalita do suchého diethyletheru (250 ml) a vyloučený produkt byl odfiltrován, rozpuštěn v dichlormethanu (10 ml) a opět přesrážen diethyletherem (250 ml). Po filtraci a vysušení bylo získáno 1,1 g (85 %) konjugátu; UV/vis:

Xmax (nm) 346, 367,386,409; Elementární analýza: pro ϋκχιΗι^Ν,Αβϊ (13 003) (%) vypočteno: C, 55.42; H, 8.71; N, 0.43; nalezeno: C, 55.23; H, 8.62; N, 0.29; = 1.32.

Příklad 7

Příprava konjugátu 4a

Roztok polymeru 4 (1,48 g; 0,10 mmol) v toluenu (60 ml) byl odvodněn oddestilováním toluenu (cca 20 ml). Po ochlazení na 50 °C byl k roztoku přidán 4-nÍtrofenylchlorformiát (0,5 g;

2,5 mmol) a směs byla temperována na 50 °C. Po 48 hodinách byl z reakční směsi vakuově oddestilován další podíl toluenu (cca 30 ml) a destilaění zbytek byl rozmíchán v diethyletheru (250 ml). Vzniklá suspenze byla odfiltrována a promyta diethyletherem (10 x 50 ml). Po vysušení byl aktivovaný polymer 4 (1,5 g) rozpuštěn v dimethylformamidu (8 ml) a ke vzniklému roztoku byl přidán amfotericin B (0,55 g, 0,60 mmol), 4-V,V-dimethylaminopyridín (0,01 g; 0,08 mmol) a trioktylamin (0.70 g; 20 mmol). Reakční směs byla míchána několik dnů při laboratorní teplotě v argonové atmosféře s vyloučením světelného záření. Ukončení reakce bylo monitorováno pomocí GPC. Závěrem byla reakční směs nalita do suchého diethyletheru (250 ml) a vyloučený produkt byl odfiltrován, rozpuštěn v dichlormethanu (10 ml) a opět pře srážen diethyletherem

- 11 CZ 300776 B6 (250 ml). Po filtraci a vysušení bylo získáno 1,8 g (88 %) konjugátu; UV/vis: λ™, (nm) 346,367, 386, 409; Elementární analýza: pro C968H1598N24O422 (20 324) (%) vypočteno: C, 57.20; H, 7.93; N, 1.65; nalezeno: C, 56.93; H, 8.21;N, 1.89; MJM_a = 1.29.

Příklad 8

Příprava konjugátu 5a

Roztok polymeru 5 (1,2 g; 0,10 mmol) v toluenu (40 ml) byl odvodněn oddestilováním toluenu (cca 30 ml). Po ochlazení na 0 °C byl k roztoku přidán roztok /V,JV'-disukcinimidyl karbonátu (0,05 g; 0,20 mmol) v suchém dichormethanu (10 ml) a pyridin (8 μΐ; 0,1 mmol) a směs byla temperována na 4 °C. Po 24 hodinách byl z reakční směsi vakuově oddestilován dichlormethan a destilační zbytek byl rozmíchán v diethyletheru (250 ml). Vzniklá suspenze byla odfiltrována a promyta diethyletherem (10 x 50 ml). Po vysušení byl aktivovaný polymer 5 (1,2 g) rozpuštěn v dimethylformamidu (8 ml) a ke vzniklému roztoku byl přidán amfotericin B (0,185 g, 0,20 mmol), 4-W/V-dimethylamínopyridin (0,005 g; 0,04 mmol) a tríoktylamin (0,35 g; 1 mmol). Reakční směs byla míchána několik dnů při laboratorní teplotě v argonové atmosféře s vyloučením světelného záření. Ukončení reakce bylo monitorováno pomocí GPC. Závěrem byla reakční směs nalita do suchého diethyletheru (250 ml) a vyloučený produkt byl odfiltrován, rozpuštěn v dichlormethanu (10 ml) a opět vysrážen diethyletherem (250 ml). Po filtraci a vysušení bylo získáno 1,25 g (91 %) konjugátu; UV/vis: (nm) 346, 367, 386, 409; Elementární analýza: pro C638HH82N4O301 (13 726) (%) vypočteno: C, 55.82; H, 8.68; N, 0,41; nalezeno: C, 55.99; H, 8.92; N, 0.66; MM = 1.29,

Příklad 9

Příprava konjugátu 3n

Roztok polymeru 3 (1,11 g; 0,10 mmol) v toluenu (60 ml) byl odvodněn oddestilováním toluenu (cca 20 ml). Po ochlazení na 50 °C byl k roztoku přidán 4-nitrofenylchlorformiát (0,5 g;

2,5 mmol) a směs byla temperována na 50 °C. Po 48 hodinách byl z reakční směsi vakuově oddestilován další podíl toluenu (cca 30 ml) a destilační zbytek byl rozmíchán v diethyletheru (250 ml). Vzniklá suspenze byla odfiltrována a promyta diethyletherem (10 x 50 ml). Po vysušení byl aktivovaný polymer 3 (1,1 g) rozpuštěn v dimethylformamidu (8 ml) a ke vzniklému roztoku byl přidán nystatin (0,185 g; 0,20 mmol), 4-/V,jV-dimethylaminopyridin (0,005 g; 0,04 mmol) a trioktylamin (0,35 g; 1 mmol). Reakční směs byla míchána několik dnů při laboratorní teplotě v argonové atmosféře s vyloučením světelného záření. Ukončení reakce bylo monitorováno pomocí GPC. Závěrem byla reakční směs nalita do suchého diethyletheru (250 ml) a vyloučený produkt byl odfiltrován, rozpuštěn v dichlormethanu (10 ml) a opět vysrážen diethyletherem (250 ml). Po filtraci a vysušení bylo získáno 1,2 g (92 %) konjugátu; UV/vis: (nm) 346,367,

386; Elementární analýza: pro Č^cH, 120N4O288 (12 999) (%) vypočteno: C, 55.44; H, 8.69; N, 0.42; nalezeno: C, 55.78; H, 8.92; N, 0.51; MJM_n = 1.36.

Příklad 10

Příprava konjugátu 4n

Roztok polymeru 4 (1,48 g; 0,10 mmol) v toluenu (60 ml) byl odvodněn oddestilováním toluenu (cca 20 ml). Po ochlazení na 50 °C byl k roztoku přidán 4-nitrofenylchlorformiát (0,5 g;

2,5 mmol) a směs byla temperována na 50 °C. Po 48 hodinách byl z reakční směsi vakuově oddestilován další podíl toluenu (cca 30 ml) a destilační zbytek byl rozmíchán v diethyletheru (250 ml). Vzniklá suspenze byla odfiltrována a promyta diethyletherem (10 x 50 ml). Po vysušení . 12.

cz. juv/70 ao byl aktivovaný polymer 4 (1,5 g) rozpuštěn v dimethylformamidu (8 ml) a ke vzniklému roztoku byl přidán nystatin (0,55 g, 0,60 mmol), 4-JV,W-dimethylaminopyridín (0,01 g; 0,08 mmol) a trioktylamin (0,70 g; 20 mmol). Reakění směs byla míchána několik dnů při laboratorní teplotě v argonové atmosféře s vyloučením světelného záření. Ukončení reakce bylo monitorováno pomocí GPC. Závěrem byla reakční směs nalita do suchého diethyletheru (250 ml) a vyloučený produkt byl odfiltrován, rozpuštěn v dichlormethanu (10 ml) a opět pře srážen diethyletherem (250 ml). Po filtraci a vysušení bylo získáno 1,91 g (95 %) konjugátu; UV/vís: (^nm) 290,

307, 322; Elementární analýza: pro CoísHuioNyC^ (20 337) (%) vypočteno: C, 57.17; H, 7.98; N, 1.65; nalezeno: C, 57.45; H, 8.26; N, 1.83; MJM* = 1.29.

ío

Příklad 11

Příprava konjugátu 5n

Roztok polymeru 5 (1,2 g; 0,10 mmol) v toluenu (40 ml) byl odvodněn oddestilováním toluenu (cca 30 ml). Po ochlazení na 0°C byl k roztoku přidán roztok jV.Tf-disukcinimidvl karbonát (0,05 g; 0,20 mmol) v suchém dichormethanu (10 ml) a pyridin (8 μί; 0,1 mmol), směs byla temperována na 4 °C. Po 24 hodinách byl z reakění směsi vakuově oddestilován dichlormethan a dešti lační zbytek byl rozmíchán v diethyletheru (250 ml). Vzniklá suspenze byla odfiltrována a promyta diethyletherem (10 x 50 ml). Po vysušení byl aktivovaný polymer s (1,2 g) rozpuštěn v dimethylformamidu (8 ml) a ke vzniklému roztoku byl přidán nystatin (0,185 g, 0,20 mmol), 4MJV-dimethylamínopyridin (0,005 g; 0,04 mmol) a trioktylamin (0,35 g; 1 mmol). Reakění směs byla míchána několik dnů při laboratorní teplotě v argonové atmosféře s vyloučením světelného záření. Ukončení reakce bylo monitorováno pomocí GPC. Závěrem byla reakční směs nalita do suchého diethyletheru (250 ml) a vyloučený produkt byl odfiltrován, rozpuštěn v dichlormethanu (10 ml) a opět vysrážen diethyletherem (250 ml). Po filtraci a vysušení bylo získáno 1,21 g (87 %) konjugátu; UV/vis: (nm) 346, 367, 386; Elementární analýza: pro ^βΗ^ΝΧ^οι (13 730) (%) vypočteno: C, 55.81; H, 8.71; N, 0.41; nalezeno; C, 55.71; H, 9.00; N, 0.64;

Μ7Μ=1.22.

3,4,5

1) 4-nitrofenylkarbonát 2) ANTIMYKOTIKUM-NHj nebo DMAP/DMF

N, W'-disukcinimidylkarbonát

konjugáty amfotericinu: 3a-5a, konjugáty nystatinu: 3n-5n

Pro navázání amfotericinu B nebo nystatinu byly benzy lalkoholové skupiny (2-amino-4-hydro35 xymethylfenyl)-(2,3,4,6-tetra-0-acetyl)-p-D-glukopyranosidových jednotek polymerů 3 až 5 dále aktivovány pomocí 4-nÍtrofenylchlorfbrmiátu nebo N, V-disukcinimidyl karbonátu. Následnou reakcí příslušných karbonátů s amfoterícinem B nebo nystatinem v dimethylformamidu za katalýzy 4-V,JV-dimethylaminopyridinem byly připraveny odpovídající karbamáty amfotericinu

B (konjugáty I: 3a až 5a) a nystatinu (konjugáty I: 3n až 5n). Výtěžky konjugátů I se pohybovaly 4o v rozmezí 85 až 95 %. Pomocí HPLC a GPC byla stanovena čistota konjugátů, obsah volného

-13CZ 300776 B6

Λ amfotericinu B a nystatinu byl < 1 mol %. Pomocí UV/VIS spektroskopie bylo dále ověřeno, že poměry aktivních složek v konjugátech 3a, 5a, 3n a 5n odpovídají molámímu poměru 2:1 (AMB (NY)/polymer) a v konjugátech 4a a 4n, odpovídají molámímu poměru 6:1 (AMB (NY)/polymer). UV/vis spektra všech konjugátů změřená ve vodě mají shodná typická maxima odpovídající polyenovému systému amfotericinu B (346, 367, 386, 409 nm) a nystatinu (290, 307, 322 nm).

Příklad 12 io

Deacetylace konjugátu 3a

Směs konjugátu 3a (0,65 g; 0,05 mmol) a I,8-diazabicyklo[5.4.0]undec-7-enu (0,53 g;

3,5 mmol) v methanolu (50 ml) byla míchána při laboratorní teplotě v argonové atmosféře s vyloučením světelného záření. Ukončení reakce bylo monitorováno pomocí HPLC. Závěrem byla za vakua a do teploty 30 °C odpařena část methanolu (cca 35 ml) a zbytek byl nalit do suchého diethyletheru (100 ml).Vyloučený produkt byl odfiltrován a promyt diethyletherem (5 x 20 ml). Po filtraci a vysušení bylo získáno 0,44 g (68 %) deacetylovaného konjugátu 3a; UV/vis: λπ,ω (nm) 346, 367, 386,409. Elementární analýza: pro CjEHmeN^w (12 835) (%) vypočteno: C, 55.39; H, 8.76; N, 0.44; nalezeno: C, 55.12; H, 8.51;N, 0.31; = 1.36.

Příklad 13

Deacetylace konjugátu 3n

Směs konjugátu 3n (0,65 g; 0,05 mmol) a l,8-diazabicyklo[5.4.0]undec-7-enu (0,53 g;

3,5 mmol) v methanolu (50 ml) byla míchána pri laboratorní teplotě v argonové atmosféře s vyloučením světelného záření. Ukončení reakce bylo monitorováno pomocí HPLC. Závěrem byla za vakua a do teploty 30 °C odpařena část methanolu (cca 35 ml) a zbytek byl nalit do suchého diethyletheru (100 ml).Vyloučený produkt byl odfiltrován a promyt diethyletherem (5 x 20 ml). Po filtraci a vysušení bylo získáno 0,42g (65 %) deacetylovaného konjugátu 3n; UV/vis: λ,ηηχ (nm) 346, 367, 386. Elementární analýza: pro C592H11 ιχΝ₄Ο₂84 (12 837) (%) vypočteno: C, 55.39; H, 8.78; N, 0.44; nalezeno: C, 55.62; H, 8.58; N, 0.36; MJM_n = 1.32.

NK-ANT1MYKOTIKUM

Λ

CZ JUU77O ΒΟ

Průmyslová využitelnost

Konjugáty podle předloženého vynálezu, připravené uvedeným způsobem lze použít pro přípravu 5 intravenózních lékových forem v humánní i veterinární medicíně a to u systemických fungálních onemocnění, která jsou způsobena selháním imunity pacientů, a to příčinou těžkých chorob jako je AIDS, nebo jako následek chemoterapie nádorových onemocnění, dále při podávání imunosupresivních léčiv po transplantaci orgánů a také jako důsledek invazivní medicíny.

Claims (15)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Polymemí konjugát antimykotického léčiva obsahujícího aminoskupinu, obsahující vodorozpustný polymer a antimykotické léčivo obsahující aminoskupinu, vyznačený tím, že obsahuje fragment obecného vzorce I,

   K

   N-ANTíMYKOTIKUM kde R znamená acetyl skupinu nebo atom vodíku; Z znamená amidickou vazbu (CONH) nebo imino vazbu (CH=N).

   25
2. 2. Polymemí konjugát podle nároku 1, vyznačený tím, že vodorozpustnými polymery jsou poly(ethylenglykoly) nebo blokové kopolymery poly(ethylenglykolu) a poly(aminokyselin) s molekulovými hmotnostmi 10 000 až 30 000.
3. 3. Polymemí konjugát podle nároku 1 nebo 2, vyznačený tím, že antimykotickými

   30 léčivy obsahujícími aminoskupinu jsou amfotericin B nebo nystatin.
4. 4. Způsob přípravy polymemího konjugátu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, vyznačený tím, že se připraví (2-amino-^4-hydroxymethylfenyl)-(2,3,4,6-tetra-<?-acetyl)-p-Dglukopyranosid vzorce II,

   -15CZ 300776 B6 jeho aminová skupina se naváže na vodorozpustný polymer za tvorby amidové nebo minové vazby, jeho hydroxyskupina se následně naváže na antimykotické léčivo obsahující aminoskupinu za tvorby karbamátové vazby a případně se poté odstraní acetylové skupiny na glukopyra5 nosidovém zbytku za vzniku hydroxy skupin.
5. 5. Způsob podle nároku 4, vyznačený tím, že vodorozpustným polymerem je poly(ethylenglykol) nebo blokový kopolymer poly(ethylenglykolu) a poly(aminokyselin) s molekulovou hmotností 10 000 až 30 000, nesoucí alespoň jednu aldehydickou nebo karboxylovou ío skupinu.
6. 6. Způsob podle nároku 4 nebo 5, vyznačený tím, že antimykotické léčivo obsahující aminoskupinu je amfotericin B nebo nystatin.

   15
7. 7. Způsob podle nároku 4, vyznačený tím, že příprava (2-amino-4-hydroxymethylfenyl)-(2,3,4,6-tetra-0-acetyl)-fi-D-glukopyranosidu se provádí tak, že se z 2,3,4,6-tetra-Oacetyl-a-D-glukopyranosyl bromidu s 4-hydroxymethyl-2-nitrofenolem za katalýzy oxidem stříbrným a za působení ultrazvuku v rozpouštědle vybraném ze skupiny zahrnující suchý acetonitril, propionitril nebo etherová rozpouštědla připraví (4-hydroxymethyl-2-nitrofenyl)20 (2,3,4,6-tetra-<9-acetyl)-p-D-glukopyranosid a nitroskupina (4-hydroxymethyl-2-nitrofenyl)(2,3,4,6-tetra-ť>~acetyl)-JÍ-D-gIukopyranosidu se následně redukuje vodíkem za přítomnosti Adamsova katalyzátoru (PtO₂) za vzniku (2-amino-4-hydroxymethylfenyl)-(2,3,4,6-tetra-0acetyl)-P-D-glukopyranosidu.

   25
8. 8. Způsob podle nároku 7, vyznačený tím, že redukce nitro skupiny (4—hydroxymethyl-2-nitrofenyl)-{2,3,4,6-tetra-O-acetylHi-D-glukopyranosidu se provádí za míchání v heterogenní fázi při laboratorní teplotě a za mírného přetlaku vodíku v rozpouštědlech vybraných ze skupiny zahrnující alkoholy, tetrahydrofuran, cyklohexan a estery kyseliny octové.

   30
9. 9. Způsob podle nároku 4, vyznačený tím, že navázání aminové skupiny (2-amino-4hydroxymethylfenyl}-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl)-p-D-glukopyranosidu amidovou nebo iminovou vazbou na vodorozpustný polymer se provádí tak, že se (2-amino-4-hydroxymethylfenyl)(2,3,4,6-tetra-<9-acetyl)-P-D-glukopyranosid uvede do kontaktu s vodorozpustnými polymery s aktivovanými karboxylovými nebo aldehydickými skupinami za vzniku odpovídajících (235 polymeracylamíno-4-hydroxymethylfenyl)-(2.3,4,6-tetra-(9-acetyi)-|3-D-glukopyranosídů nebo (2-polymerimino-4-hydroxymethylfenyl)-(2₎3,4,6-tetra-0-acetyl)-p-D-glukopyranostdů.
10. 10. Způsob podle nároku 9, vyznačený tím, že aktivátorem karboxylových skupin pro

    40 přípravu (2-polymeracylamino-4-hydroxymethylfenyl)-(2,3,4,6-tetra-ť>-acetyl)-p“D-glukopyranosidů je f9-[(ethoxykarbonyl)kyaninethylenaniino]-;V,_iV,A,jV'-tetramethyluronium tetrafluorborát nebo O-[(ethoxykarbonyl)-kyanmethylenamino}-/V,,iV₎N',N -tetramethyluronium hexafluorofosfát.

    45
11. 11. Způsob podle nároku 9, vyznačený tím, že aktivátorem aldehydických skupin pro přípravu (2-polymerimino-4-hydroxymethylfenyl)-(2,3,4,6-tetra-0-acetyl)-P-Ď-glukopyranosidů je aktivované molekulové síto atrimethylorthoformiát nebo triethylorthoformiát.
12. 12. Způsob podle nároku 4, vyznačený tím, že navázání hydroxyskupiny na antimyko50 tické léčivo obsahující aminoskupinu se provádí tak, že se volná hydroxyskupina (2-polymeracylamino-4-hydroxymethylfenyl)-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl)-P-D-'glukopyranosidů nebo (2polymerimíno-4-hydroxymethylfeny!)-(2,3,4,6-tetra-(J-acetylj-p-O-glukopyranosidů aktivuje pomocí 4-nitrofenylchlorformiátu nebo Λ',Λ'-disukcinimidyl karbonátu za vzniku 4-nitrofenylkarbonátů nebo sukcinimidyl karbonátů (2-polymeracyIamino-4-hydroxymethylfenyl)-(2,3,4,655 tetra-O-acetyl)-fi-D-glukopyranosidů nebo 4-nitrofenylkarbonátů nebo sukcinimidyl karbonátů

    1 £.

    (2-polymerimino-4-hydroxymethylfenyl)-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl)-p-D-glukopyranosidů a tyto 4-nitrofenylkarbonáty nebo sukcinimidyl karbonáty (2-polymeracylamino-4-hydroxynethylfenylH2,3₎4,6-tetra-ť9-acetyl>-p-D-glukopyranosidů nebo 4-nitrofenylkarbonáty nebo sukcinimidyl karbonáty (2-polymerimino-4-hydroxymethylfenyl)-(2,3,4,6-tetra-č>-acetyl)-p5 D-glukopyranosidů se následně podrobí reakci s antimykotickým léčivem obsahujícím aminoskupinu v dimethylformamidu nebo dimethylsufoxidu za katalýzy 4-N,JV-dimethylaminopyridinem,
13. 13. Způsob podle nároku 4, vyznačený tím, že odstranění acetylových skupin glukoío pyranosidového zbytku se provádí v roztoku l,8-diazabicyklo[5.4.0]undec-7-enu (DBU) v methanolu.
14. 14. Farmaceutická kompozice, vyznačená tím, že obsahuje alespoň jeden polymerní konjugát podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 a farmaceuticky přijatelný nosič.
15. 15. Farmaceutická kompozice podle nároku 14, vyznačená tím, že farmaceuticky přijatelným nosičem je voda a kompozice je sestavena pro injekční aplikaci.