CZ300376B6 - Ligandy estrogenových receptoru alfa a beta, zpusob jejich prípravy a farmaceutické prostredky, které je obsahují - Google Patents

Abstract

Jsou popsány deriváty estradiolu obecného vzorce II, kde R.sup.5.n. znamená H, C.sub.1-8.n. alkyl, C.sub.6-14.n. aryl nebo skupinu -C(O)R, kde R je C.sub.1-8 .n.alkyl nebo C.sub.6-14 .n.aryl, R.sup.4.n. znamená H nebo C.sub.1-8.n. alkyl a X znamená napr. C, N, O. Tyto deriváty jsou ligandy estrogenových receptoru .alfa. a .beta. a jsou úcinné napr. pro hormonální substitucní terapii nebo pro lécení nádorových nebo zánetlivých onemocnení. Dále je popsán zpusob prípravy techto ligandu cyklotrimerizací ethynylestradiolu v organickém rozpouštedle s vhodným diynem a farmaceutická kompozice s jejich obsahem.

Description

Vynález se týká nových ligandů estrogenových receptorů a a β, nového způsobu jejich syntézy a jejich využití in vitro a in vivo. Ligandy estrogenových receptorů a a β podle vynálezu mohou být účinnou složkou farmaceutických prostředků, například prostředků užitečných pro hormonální substituční terapii nebo pro léčení nádorových nebo zánětlivých onemocnění.

Dosavadní stav techniky

Steroidní receptory a mechanismus jejich aktivace

Estrogenové receptory a (ERa) a estrogenové receptory β (ΕΚβ) spolu s ostatními členy rodiny steroidních receptorů jsou transkripční faktory vyskytující se uvnitř buňky a vázající příslušný steroidní hormon. Steroidní hormony jako estrogeny, androgeny, glukokortikoidy, mineralokortikoidy a progesteron jsou hydrofobní látky s malou molekulovou hmotností schopné volně difundovat přes buněčnou membránu dovnitř buňky. Receptor pro steroidní hormon, který v danou chvíli neváže patřičný ligand, se vyskytuje v cytoplazmě jako součást mu 1tiproteinového komplexu, který mu zabraňuje vstupovat do buněčného jádra. Po navázání ligandu do místa v ligandvazebné doméně steroidního receptorů dojde ke změně konformace receptorů a rozpadu multiproteínového komplexu. Komplex steroidního receptorů s navázaným ligandem je následně transportován do jádra, kde dimenzuje a váže se na specifickou sekvenci v promotorech genů (tzv. HRE, hormone response element), jejichž transkripci po vytvoření komplexu s příslušnými transkřípěními koaktivátory/korepresory moduluje.

Biologické vlastnosti estrogenových receptorů a a β

Estrogeny podobně jako ostatní steroidní hormony vyvolávají celou řadu biologických odpovědí. Od 60. let dvacátého století byla obecně přijímána představa, že aktivita estrogenů je zprostředkována receptorem pro estrogenový receptor, V roce 1986 byl vyklonován gen kódující tento receptor^1,2 a krátce nato byla připravena myš, u níž byl tento gen vyřazen z funkce³. Podle očekávání se projevila ztráta estrogenového receptorů řadou vážných poškození na úrovni funkce mnoha orgánů⁴. Tento fenotyp byl závažný, ale plně v souladu se známými funkcemi estrogenů v těle savců. V této situaci bylo objevení druhého genu pro estrogenový receptor - estrogenový receptor β v roce 1996 velmi překvapivé⁵ a toto zjištění znamenalo, že rozsáhlé spektrum působení estrogenů do té doby přičítané aktivitě jednoho estrogenového receptorů je ve skutečnosti zprostředkováno dvěma různými receptory sjen částečně se překrývajícími biologickými funkcemi.

Ligandy

V rané fázi zkoumání funkce ΕΚβ se výzkum zaměřil převážně na tkáňovou distribuci ΕΚβ a jeho schopnost vázat specificky ligand.

Bylo zjištěno, že Πβ-οβΙ^ίοΙ je nej účinnější endogenní ligand a váže se se stejnou afinitou k oběma receptorům⁶. Na aminokyselinové úrovni se ligand-vazebná doména obou receptorů shoduje pouze z 56 %⁷. Samotná vazebná kapsa má však homologii výrazně vyšší a liší se pouze záměnou aminokyselin na dvou pozicích. Tato záměna nicméně vytváří dostatečný prostor pro přípravu ligandů vážících se s různou afinitou na jednotlivé receptory. Několik látek s rozdílnou mírou selektivity pro ΕΚβ bylo v posledních letech skutečně připraveno, nej významnější z nich jsou například DPN⁸, ERB-041⁹, WAY-2O2196¹⁰, WAY200070⁹, 8β-νΕ₂. Tyto látky nemají příbuznou strukturu, a proto též vyvolávají různé konformační změny po navázání na receptor.

-1 CZ 300376 B6

Tyto změny se potom různým způsobem překládají do biologické aktivity receptoru v buňce. Dále platí, že z afinity ligandu k danému receptoru nelze vyvozovat to, do jaké míry bude ligand aktivovat receptor.

Využití selektivních ligandů ERp

Přestože je ΕΚβ exprimován v celé řadě tkání a buněčných typů, jeho expresní distribuce je značně odlišná od ERa. V dnešní době existuje velké množství experimentálních dat, která ukazují, že oba receptory mají často protichůdné účinky na konkrétní tkáň¹²¹⁴. Dobrým příkladem je například tkáň prsního epitelu, kde ERa je mediátor proliferativního účinku estradíolu, zatímco ίο ΕΚβ, rovněž exprimovaný v této tkáni, podporuje diferenciaci a negativně ovlivňuje prolíferaci této tkáně¹⁵. Exprese ERa při rakovině prsu je považována za důležitý diagnostický markér rozhodující o způsobu léčby¹⁶. Dále je exprese ΕΚβ spojována s lepší prognózou nemoci. Například jedna studie ukazuje, že je exprese ΕΚβ spojená s lepším přežíváním pacientů, kterým je v průběhu léčby podáván tamoxifen¹⁷. Kromě toho byla pozorována exprese tohoto receptoru v nádorech pacientů, u nichž nemoc ustoupila do bezpříznakové fáze¹⁸. Stručně řečeno, selektivní ligandy pro ΕΚβ se mohou projevovat jako látky se širokým spektrem estrogenních účinků, ale na rozdíl od estradiolu nepodporují růst prsní nádorové tkáně nebo dokonce mohou přispívat k potlačení jejího růstu,

Jinou výhodou selektivních ligandů pro ΕΚβ je to, že neovlivňují růst děl ožni tkáně, který je zprostředkován výhradně ERa^14,15.

Pouze částečně je zatím prozkoumána oblast využití selektivních ligandů ΕΚβ v léčbě nádorů prostaty. V této tkáni je hlavním exprimovaných estrogenním receptorem ΕΚβ. Analýza myši, u níž byl odstraněn ΕΚβ, ukázala, že tento receptor má v prostatě antiproliferativní funkci spojenou s kontrolou diferenciace několika buněčných typů¹⁹’²⁰. Současné podávání testosteronu a estradiolu působí na prostatickou tkáň antiproliferativně a vyšší dávky estradiolu v kombinaci s testosteronem dokonce proapoptoticky¹⁴. Také další práce naznačují, že ΕΚβ zprostředkuje antiproliferativní účinek na prostatickou tkáň a chrání ji před nadměrným růstem²¹. Proto jsou selek30 tivní ligandy pro ΕΚβ slibným terapeutickým prostředkem pro léčbu prostatických nádorů¹⁵’²².

V oblasti kardiovaskulárních onemocnění poukazují analýzy na transgenních myších, kterým byl odstraněn gen pro ERp, že selektivní ligandy pro tento receptor mohou být účinné v léčbě a prevenci infarktu myokardu^23,24 a hypertenze^25, .

ERp je silně exprimován v určitých částech mozku²⁷. Důležitým příspěvkem k poznání biologických projevů tohoto receptoru bylo zjištění, že estradiol zvyšuje expresi tryptofan hydroxy lázy I v serotoninergních neuronech v nucleus raphes dorsalis, a tím pozitivně reguluje syntézu šero tóninu, jehož nízká hladina v těchto částech mozku má za následek vznik depresí a stavů úzkosti. Studie chování myší, kterým byly podávány selektivní ligandy pro jeden z estrogenových receptorů ukazují, že selektivní ligandy pro ER|3 mají přímý blahodárný vliv na depresi a úzkost “ . Kromě toho je stále více zřejmé, že tyto ligandy mají potenciální využití v podpoře kognitivních funkcí mozku a zvláště paměti³⁶.

Neurony myší, kterým byl odstraněn gen pro ΕΚβ, vykazují kratší dobu života a ve stáří dvou let lze u těchto myší a zvláště v substantia nigra nalézt známky neurodegenerace^{37, 38}. Z toho vyplývá, že selektivní ligandy pro ΕΚβ mohou být použity pro léčbu Parkinsonovy choroby nebo jiných neurodegenerativních onemocnění¹⁵.

Jedno z nej slibnějších využití selektivních ligandů pro ΕΚβ představuje krysí model chronického zánětu střeva³⁹. Tyto transgenní krysy trpí chronickým zánětem střeva, který se projevuje silným a trvalým průjmem. Podávání selektivních ligandů pro ERp potlačilo zánět ve střevě a s ním spojený průjem^{10, 40}. Navíc selektivní ligand pro ΕΚβ, WAY-169916, inhibuje transkripční

-2CZ 300376 B6 aktivitu NF-κΒ⁴¹, klíčového transkripčního faktoru v procesu rané i pozdní fáze zánětlivého procesu a naznačuje širší využití selektivních ligandů pro ERB v nemocích, v nichž hraje zánět podstatnou úlohu, například trauma/sepse⁴², endometrióza , Alzheimerova choroba⁴⁴ nebo revmatoidní artritida⁴⁵. Pro toto širší použití selektivních ligandů obecně v léčbě zánětlivých onemocnění svědčí též zjištění, že selektivní ligandy pro ERp reprimují transkripci prozánětlivých genů jako je například TNF-α, IL-6 nebo CSF2 nejen cestou inhibiee NF-κΒ, ale též přímou represí transkripce navázáním specifického transkripčního korepresoru^41,44.

U myší, kteiým byl odstraněn gen pro ERp, se časem vyvine myeloproliferativní onemocnění, io které se podobá lidské chronické myeloidní leukémii s lymfoidní blastickou krizí⁴⁶, ERp tedy reguluje proliferaci pluripotentních hematopoetických progenitorů a selektivní ligandy pro ERP jsou potenciálně využitelné v léčbě myeloidní a lymfoidní leukemie⁴⁷.

ERp je v porovnání s ERa exprimován velmi silně v tlustém střevě. V průběhu maligní trans15 formace dochází v mnoha případech ke ztrátě exprese tohoto receptoru nebo ke změně jeho lokalizace z jádra do cytoplazmy^48,49. Ve studii organizované Women's Health Initiative (WHI) mající za úkol zhodnotit využití hormonální substituční léčby (podávání estrogenu a medroxyprogesteron acetátu) u žen ve věku 50-79 let v léčbě kardiovaskulárních onemocnění se sice podle očekávání zvýšil výskyt rakoviny prsu o 26 %⁵⁰, ale zároveň se snížil výskyt rakoviny tlustého střeva o 37 %⁵¹. Vzhledem ktomu, že je v této tkáni ERa exprimovaný pouze v minimálním množství, přisuzuje se ochranný účinek ERp⁵². Selektivní ligandy pro ERp jsou tedy potenciálně využitelné v léčbě rakoviny tlustého střeva.

Příprava 17-a-arylestradiolů

V literatuře byla dosud popsána příprava 17-a-arylestradiolů obecného vzorce I

kde R¹ je H, R² je H a R³ je Me;⁵³’⁵⁴, nebo kde R¹ je Η, I, NH₂₎ NMe₂, N=N-Net₂, N=N-N(CH₂)₄, Me, nebo OMe, R² je H a R³ je H;^55-57, nebo kde R¹ je H, R² je I a R³ je H,^55,58 přičemž Me je methyl a Et je ethyl.

Přitom tyto látky byly vždy připraveny reakcí příslušných aiyllithných sloučenin s estronem či jeho deriváty. Tyto látky byly připraveny buď prostou nukleofílní adicí arylkovových sloučenin na karbony lovou skupinu estronu nebo byly reakce prováděny v přítomnosti BF₃Et₂0.^53-58

Žádné z výše zmíněných látek neprokázaly významnou selektivitu pro jeden z estrogenových receptorů, ačkoli v některých případech projevovaly vysokou afinitu k oběma receptorům.

Britská patentová přihláška GB 2 361 642 A popisuje agonisty ERp pro použití pří léčení rakoviny. Příkladem vhodných agonistů jsou genistein nebo 3pAdiol.

Mezinárodní patentová přihláška WO 00/53620 popisuje deriváty estradiolu, které účinkují jako inhibitory sulfatázy steroidů a mohou být užitečné při léčení některých nemocí závislých na estrogenech.

-3CZ 300376 B6

WO 05/048956 se týká sloučenin příbuzných estradiolu (analoga 2,3,4-substituovaný-E/Z-feny 1vinyl-17β-estradiolu), které jsou užitečné jako protinádorová léčiva, přičemž v podstatě nereagují s estrogenními receptory.

WO 05/099704 se týká léčení hypertenze, srdeční dysfunkce nebo infarktu podáváním agonistů ERp.

WO 2006/013196 popisuje způsob přípravy 2-substituovaných derivátů estronu a estradiolu, konkrétně 2-alkoxyderívátů, zejména methoxyestronu a methoxyestradiolu. Některé sloučeniny mohou sloužit jako intermediáty estrogenů. Např. 2-methoxyestradiol má velmi nízkou estrogenní aktivitu, zato projevuje významné biologické účinky, jako např. protinádorové nebo protizánětlivé účinky.

Patentová přihláška US 2007/0135400 popisuje deriváty 2-methoxyestradiolu, zejména deriváty modifikované v poloze 2, 3 a 17. Sloučeniny mají antimitotické, antiangiogenní a protinádorové účinky.

Evropský patent EP 1131336 popisuje specifické deriváty estradiolu, 11—β substituované estradiolové deriváty, které projevují překvapivě vysokou aktivitu vůči estrogenovým receptorům a také selektivitu. Výhodné sloučeniny působí jako agonisté ERa a antagonisté ERp. Léky obsahující tyto deriváty jsou užitečné pro léčení nemocí souvisejících s deficitem estrogenů.

Žádný z výše uvedených dokumentů nepopisuje sloučeniny, které mají strukturu nových sloučenin podle předkládaného vynálezu a překvapivé selektivní účinky na estrogenové receptory.

Přestože existují četné hypotézy o funkci ER a byly již publikovány prakticky tisíce článků, přesné funkce ERa a ERp nejsou dosud jasné. Hodně je také známo o možnostech léčebného využití selektivních ligandů, kde se jeví jako zajímavé zejména ligandy selektivní pro ERp. Existuje proto stále potřeba nových ligandů, které by projevovaly selektivní účinky. Takové ligandy najdou uplatnění v biologickém a farmaceutickém výzkumu a také jako léčiva.

Nové deriváty estradiolu popsané dále v předkládané přihlášce vykazují aktivitu jako ligandy estrogenových reeeptoru ERa a ERp, některé s překvapivým selektivním účinkem, zejména β selektivním účinkem.

Podstata vynálezu

Nové sloučeniny

Nové možnosti ovlivnění ERa a ERp poskytují nové 17a-indanylestradioly, z nichž některé jsou selektivními ligandy ERp, a navíc postrádají nevýhody dosavadních selektivních ligandů. Nové sloučeniny podle vynálezu jsou sloučeniny obecného vzorce II kde

X je atom C nebo heteroatom vybraný ze skupiny sestávající z atomů N, O, kterýžto atom popřípadě nese jeden nebo dva substituenty nezávisle vybrané ze skupiny sestávající zCj-Cgalkylové skupiny, C₆-C_]4-arylové skupiny, karboxylové skupiny, esterifikované karboxylové

-4CZ 300376 B6 skupiny vzorce -C(O)OR, kde R je C|-C«-alkyl, C₆-Ci4-aiyl, hydrogenkarbonylové skupiny, alkyIkarbonylové skupiny obsahující 1 až 8 atomů uhlíku v alkylové části a nitrilové skupiny, přičemž případné neobsazené vazby atomu X nesou atom(y) H, nebo X je p-toluensulfoamidoskupina,

R⁴ je H nebo C^g-alkyl,

R⁵ je H, Q-Cg-alkyl, C₆-C_]4-aryl nebo acyl vzorce -C(O)R, kde R je H, C]-C«-alkyl nebo C₆—C^-aryl, ajejich izomerní formy, jejich soli ajejich solváty.

io Výhodněji se substituenty atomu X vyberou ze skupiny sestávající z H, COO-Et, COMe, CN. Obzvláště výhodně představuje X skupiny C(COOEt)₂, C(COMe)₂, C(COOEt)COMe, C(COOEt)CN, CH₂,0, NTs, nej výhodněji CH₂, NTs a C(COOEt)CN, přičemž Et znamená ethyl, Me znamená methyl a NTs znamená skupinu p-toluensulfoamido. R⁴ je nejvýhodněji H. R⁵ je výhodněji H, Q-Cy-alkyl nebo acyl vzorce -O(O)R, kde R je H, Cj-Cg-alkyl, C₆-C]₄-aiyl, nejvýhodněji H nebo methyl.

Pokud není uvedeno jinak, mají následující termíny v rámci předkládaného vynálezu následující významy.

Alkyl je uhlovodíkový zbytek, který vznikne po odtržení jednoho nebo více vodíkových atomů z molekuly uhlovodíku (uhlovodík je molekula, která má přímou nebo rozvětvenou uhlíkatou kostru obsahující pouze C-C a C-H vazby), a obsahuje 1 až 8 atomů uhlíku, výhodněji 1 až 4 atomy uhlíku. Typickými příklady alkylových skupin jsou např. methyl, ethyl, n-propyl, isopropyt, n-butyl, sek-butyl, terc-butyl atd., přičemž nej výhodnější je methyl a ethyl.

Aryl je skupina vzniklá odtržením jednoho nebo více vodíků z molekuly arénu (arény označují aromatické benzenoidní uhlovodíky, mezi něž vedle benzenu patří uhlovodíky odvozené od něho bud' záměnou jednoho nebo více vodíků uhlovodíkovými zbytky, nebo připojením dalších cyklů za vzniku vícejademých kondenzovaných uhlovodíků, přičemž sousední kruhy mají v nich spo30 léčné vždy dva uhlíkové atomy). V rámci předkládaného vynálezu obsahuje arylová skupina 6 až 14 atomů uhlíku. Typickými příklady arylových skupin jsou např. fenyl, naftyl, indenyl, anthracen, fenanthren atd., přičemž nejvýhodnější je fenyl nebo naftyl.

Acyl je organický zbytek vzniklý odtržením hydroxylové skupiny z karboxylu karboxylových kyselin, s výhodou alkylkarboxylových nebo arylkarboxylových kyselin, tj. skupina vzorce -C(O)R, kde R je H, alkyl nebo aryl, kde alkyl a aryl je definován stejně jako výše. Typickými příklady acylových skupin jsou benzoyl, formyl nebo acetyl.

Karbonylová skupina se skládá z uhlíkového atomu navázaného dvojnou vazbou ke kyslíkovému atomu, tj. má vzorec -C(O)-. Ve sloučenině podle vynálezu je jedna z jejích volných vazeb navázána na atom X a druhá z nich nese atom vodíku (hydrogenkarbonylové skupina) nebo alkylovou skupinu (alky Ikarbony lová skupina), jak je definována výše,

Karboxylová skupina se skládá z karbonylové skupiny, ve které je na atom uhlíku navázána hydroxylová skupina, tj. je to skupina vzorce -C(O)OH. Esterifikovaná karboxylová skupina je skupina vzorce -C(O)OR, kde R je alkyl nebo aryl, jak jsou definovány výše.

Nitrilová skupina se skládá z atomu uhlíku, na který je navázán atom dusíku trojnou vazbou.

Výhodné sloučeniny podle vynálezu jsou sloučeniny označené PN202, PN207, PN214, PN228, PN229, PN232 a PN233, jejichž strukturní vzorce jsou uvedeny dále.

-5CZ 300376 B6

COOEt

COMe

-6CZ 300376 B6

Na základě testování aktivity výše uvedených sloučenin v reportérových studiích na tkáňových kulturách s buňkami COS-7 (viz příklad 13) lze shrnout, že nové látky jsou vysoce účinné ligandy obou estrogenových reeeptorů a jejich účinnost je srovnatelná s estradiolem. To je důležitá vlastnost z hlediska léčebného využití těchto látek, protože takové látky jsou účinné v nízkých koncentracích ajejich aplikace není spojená s vedlejšími účinky jako je např. nespecifická vazba a stimulace ostatních členů rodiny jaderných reeeptorů, interference s metabolismem steroidních látek nebo obecná toxicita látek v těle. Jako výhodné ligandy se jeví látky PN202, PN207, PN214, PN229, PN232 a PN233 ajako nejvýhodnější ligandy se pak jeví látky io PN214aPN233.

Kromě toho vykazují nové látky různou selektivitu vůči jednomu z estrogenových reeeptorů. Zde se jako výhodné selektivní ligandy jeví látky PN229 a PN233 pro ERa a látka PN214 pro ERp.

Jako nejvýhodnější selektivní ligand se jeví látka PN214 pro ERp, přičemž selektivita tohoto ligandu je srovnatelná s nejlepšími známými selektivními ligandy pro tento reeeptor.

Proliferační studie provedené se stejnými sloučeninami (viz příklad 14) podporují předchozí zjištění, že látka PN2Í4 je vysoce selektivním ligandem ERp.

Výše definované sloučeniny obecného vzorce II nebyly v literatuře dosud popsány. Žádné z těchto látek tedy nebyly testovány na afinitu k ERa nebo ERp.

Předkládaný vynález zahrnuje také sloučeniny obecného vzorce II uvedené výše ve všech jejich isomemích formách, a rovněž jejich soli a jejich solváty. Odborník zná způsoby, jak připravit směsi či izolované enantiomery sloučenin podle vynálezu^{53 58}, a je tedy schopen je rutinním způsobem realizovat. Vynález zahrnuje rovněž profarmaka sloučenin podle vynálezu, tj. látky, které jsou po podání metabolizovány in vivo na vlastní účinnou sloučeninu. Pro všechny tyto sloučeniny ve všech těchto formách se v rámci předloženého popisu užívá termín „sloučenina(y) podle vynálezu“.

Předkládaný vynález zahrnuje také každou ze sloučenin výše uvedeného obecného vzorce II jednotlivě,

-7CZ 300376 B6

Nový způsob přípravy sloučenin podle vynálezu

Výše definované sloučeniny podle vynálezu byly připraveny novým způsobem, který spočívá v cyklotrimerizaci derivátů ethynylestradiolu s příslušnými diyny za katalýzy komplexy přechodných kovů v organických rozpouštědlech.

V souladu s tím je předmětem vynálezu rovněž způsob přípravy sloučeniny obecného vzorce II definované výše, zahrnující cyklotrimerizaci ethynylestradiolu v organickém rozpouštědle, s diynem obecného vzorce III

X (IH).

\ — ⁷ ve kterém má X významy uvedené výše pro obecný vzorec II, za přidání katalyzátoru v podobě komplexu přechodného kovu. Poté se případně obvyklým způsobem, např. odpařením, odstraní rozpouštědla a zbytek se případně známými způsoby přečistí, např. chromatografií na silikagelu.

Jako ethynylestradiol se výhodně použije 17a-ethynylestradiol.

Výhodnými diyny použitými v rámci způsobu podle vynálezu jsou diyny obecného vzorce III, ve kterých má X výhodné významy uvedené výše pro obecný vzorec II. Nejvýhodněji se jako diyny obecného vzorce III použijí následující sloučeniny:

COOEt

COOEt

COOEt = COMe

1,6-heptadiyn y diethy! 2,2-(diprop-2-ynyt)-l,3-pr°pandioát _t ethyl 2-acetyf-2-(prop-2-yny0pent4-ynoát

3,3-(diprop-2-ynyl)-2,4-pentadion ,

AlTs — --⁷ N,N-di(prop“2-ynyl)-4-methy1benzensulfony!amÍcl_/

dipropargylether, λ COOEt

J CN 2-kyano-2-(prop-2-ynyl)pent-4-ynoát .

-8CZ 300376 B6

Organickým rozpouštědlem použitým při způsobu podle vynálezu může být jakékoliv vhodné, odborníkovi známé organické rozpouštědlo, např. vybrané z toluenu, benzenu, THF, diehlormethanu, acetonitrilu atd. nebo jejich směsí, výhodněji toluen nebo acetonitril, nejvýhodněji je použitým rozpouštědlem směs suchého toluenu a acetonitrilu.

Katalyzátor použitý při způsobu podle vynálezu se vybere z komplexů přechodných kovů, např. Ru, Rh, Co, Ni, atd., nebo jejich kombinací, výhodněji Ni(cod)₂/PPh₃ nebo RhCl(PPh₃)₃, nejvýhodněji RhCl(PPh₃)₃ (Ni(cod>2/PPh₃ je bis(hapto4-cyklookta-l,5-dien)nikl/trifenylfosfan, RhCl(PPh₃)₃ označuje chlorido-tris(trifenylfosfan)rhodný komplex).

Reakce se výhodně provádí za míchání, výhodně při teplotě 15 až 100 °C, výhodněji při teplotě io 15 až 60 °C, nejvýhodněji při 20 °C, výhodně po dobu 8 až 72 hodin, výhodněji po dobu 24 až hodin, nej výhodněji do úplného zreagování výchozích látek, což lze snadno zkontrolovat, např. chromatografií na tenké vrstvě (TLC).

Vzájemný výhodný molární poměr ethynylestradiolu a diynů obecného vzorce III je přibližně 2:1 až 1:5, výhodně přibližně 1:1 až 1:2, nejvýhodněji přibližně 1:1,2.

Ve výhodném provedení způsobu podle vynálezu se k roztoku 17<x-ethynylestradiolu (0,5 mmol, 150 mg) ve směsi suchého toluenu (6 ml) acetonitrilu (1 ml) přidá RhCl(PPh₃)₃ (0,05 mmol, 46 mg) a diyn obecného vzorce III (0,6 mmol). Reakční směs se míchá při 20 °C po dobu 48 hodin do úplného zreagování výchozích látek (kontrolováno TLC). Poté se odpaří rozpouštědlo a zbytek se podrobí ehromatografii na silikagelu.

Odborník si je vědom toho, že uvedený způsob může být modifikován (změna některého parametru, např, teploty či rozpouštědla či směsi rozpouštědel) a doplňován dalšími v podstatě rutinními kroky (např. čištění), které nemění podstatu způsobu. Takové případně změny a doplnění jsou rutinního charakteru a spadají též do rozsahu předkládaného vynálezu.

Farmaceutické prostředky obsahuj ící sloučeniny podle vynálezu

V současnosti nejvíce používané nové syntetické ligandy pro estrogenové receptory nemají steroidní charakter ajejich používání jako léčiv v medicíně s sebou přináší celou řadu problémů, jako je například genotoxicita, nízká stabilita ligandů v tělech pacientů, neznámý a potenciálně problematický metabolismus těchto látek a v neposlední řadě též problémy s transportem těchto látek v těle na místo určení. Vzhledem k tomu, že nové ligandy pro estrogenové receptory podle předkládaného vynálezu jsou deriváty estradiolu, lze očekávat podobný farmakologický a toxikologický profil jako u ostatních steroidních hormonů.

Jak bylo již uvedeno výše (viz Dosavadní stav techniky) ligandy ER mají významné farmakologické účinky. Ligandy podle předloženého vynálezu mohou být proto použity jako léčiva nebo účinné složky léků. Ligandy podle vynálezu mohou být účinnou látkou farmaceutických prostředků vhodných pro hormonální substituční terapii nebo k léčení nemocí, které mohou být léčeny ovlivněním ER, zejména pak ERS, např. nádorových či zánětlivých onemocnění, jak bylo již uvedeno.

Léčením je přitom míněno podávání léčiva jak pro kurativní tak i proťylaktické účely. Ovlivně40 ním ER či působením na ERje míněno to, že sloučenina podle vynálezu může působit jako agonista/antagonista, parciální agonista/antagonista nebo selektivní agonista/antagonista estradiolu.

Předmětem vynálezu je proto též farmaceutická kompozice obsahující jako účinnou látku sloučeninu podle vynálezu.

Farmaceutické prostředky (kompozice, léčiva, přípravky) podle vynálezu jsou určeny k léčbě rakoviny, např. rakoviny prostaty, rakoviny tlustého střeva, myeloidní a lymfoidní leukemie, klečení zánětlivých onemocnění, jako např. střevních zánětlivých onemocnění a dalších zánětlivých onemocnění, nebo onemocnění, v nichž zánětlivá reakce hraje důležitou roli, jako je např. trauma/sepse, endometrióza, Alzheimerova choroba nebo revmatoidní artritida, dále k léčení psychiatrických a neurologických onemocnění, jako např. k léčbě deprese, úzkosti, poruch

-9CZ 300376 B6 paměti a procesu učení, léčbě neurodegenerativních onemocnění jako je např. Parkinsonova choroba, dále k léčení nemocí srdce a oběhového systému, jako např. k léčbě infarktu myokardu, hypertenze. Dále lze sloučeniny podle vynálezu využít jako specifické léčivo, které poskytuje řadu estrogenních účinků a zároveň není uterotrofní a nepodporuje růst prsní epiteliální tkáně ani prsních nádorů.

Farmaceutické prostředky podle vynálezu obsahují jako účinnou látku sloučeninu podle vynálezu ve farmaceuticky účinném množství. Způsob stanovení farmaceuticky účinného množství je běžným postupem, který je odborníkovi znám.

Ve farmaceutickém přípravku mohou být sloučeniny podle vynálezu přítomny také ve formě farmaceuticky přijatelných solí (netoxických, fyziologicky přijatelných), anorganické či organické povahy. Příkladem vhodných solí je hydrochlorid nebo methansulfonát, přičemž odborník zná a je schopen připravit vhodné soli.

Sloučeniny mohou být ve farmaceutických prostředcích podle vynálezu přítomny rovněž v podobě profarmak.

Farmaceutické prostředky podle vynálezu jsou určeny zejména k léčení lidí, ale mohou najít uplatnění i při léčení jiných savců, jako např. hospodářských nebo domácích zvířat.

Farmaceutické přípravky obsahující sloučeniny podle vynálezu, jejich izomery, soli mohou být formulovány pro systémové podávání, např. enterální podávání, jako např. perorální podávání, např. ve formě tablet nebo tobolek, pro rektální podávání, např. ve formě čípků, pro nasál ní podá25 vání či inhalaci, např. ve formě spreje nebo kapek. Dále mohou být formulovány pro topické nebo lokální podávání, např. ve formě bukálních tablet nebo masti nebo náplasti nebo složitějších transdermálních systémů. Přípravky podle vynálezu mohou být formulovány také pro parenterální podávání, jako např. injekcí (i.v., i.m., s.c.), infúzí nebo pomocí implantovatelného zásobníkového systému. Odborníkovi je zřejmé, že tento výčet není vyčerpávající, a odborník zná další vhodné způsoby.

Účinná látka je ve farmaceutickém přípravku zpravidla společně s pomocnými látkami jako jsou např. plnidla, rozvolňovadla, ředidla, pojidla, emulgátory, pufry, stabilizující činidla, konzervanty a barviva. Odborníkovi jsou známy pomocné farmaceutické látky a jejich použití při formulaci přípravku.

Sloučenina podle vynálezu může být ve farmaceutickém přípravku také v kombinaci s jinou účinnou látkou, např. s účinnou látkou projevující synergický účinek.

Stanovení dávky účinné látky obsažené v jednotkové lékové formě např. v případě tobolek nebo např. vhodné koncentrace v případě injekčního nebo infúzního roztoku je také běžným postupem odborníkovi známým.

Výše zmíněné znalosti odborníka týkající se farmaceutických přípravků, lékových forem, pomocných látek a pod. jsou shrnuty v odborných příručkách^{59 60}, které jsou odborníkovi snadno dostupné, případně také v Českém lékopisu (ČL 2005, 2007), v Evropském lékopisu (Ph.Eur.) a/nebo lékopisu Spojených států (USP).

Popis obrázků

Na obrázcích jsou použity následující označení/zkratky: ICI 182780 je 13-methyl-7-[9-(4,4,50 5,5,5-pentafluoropentylsulfinyl)nonyl]-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-dekahydro—67/-cyklopenta[a]-fenanthren-3,17-diol a E2 je estradiol.

- 10CZ 300376 B6

Obrázek 1: Závislost transkripční aktivity estrogenového receptoru a a β na koncentraci ligandů PN202.

Obrázek 2: Závislost transkripční aktivity estrogenového receptoru a a β na koncentraci ligandů PN207.

Obrázek 3: Závislost transkripční aktivity estrogenového receptoru a a β na koncentraci ligandů PN214.

Obrázek 4: Závislost transkripční aktivity estrogenového receptoru a a β na koncentraci ligandů PN228.

Obrázek 5: Závislost transkripční aktivity estrogenového receptoru a a β na koncentraci ligandů ίο PN229.

Obrázek 6: Závislost transkripční aktivity estrogenového receptoru a a β na koncentraci ligandů PN232.

Obrázek 7: Závislost transkripční aktivity estrogenového receptoru a a β na koncentraci ligandů PN233.

Obrázek 8: Růst buněk MCF-7 v závislosti na koncentraci testovaných látek Obrázek 9: Růst buněk MCF-7 v přítomnosti 1 nM testované látky

Provedení vynálezu je dále demonstrováno na následujících příkladech, které slouží jen pro ilustraci provedení vynálezu a rozsah vynálezu žádným způsobem neomezují.

Příklady provedení vynálezu

Obecný způsob přípravy sloučenin podle vynálezu

Nové sloučeniny podle vynálezu byly připraveny způsobem podle vynálezu, tj. cyklotrimerizací, jak byla výše popsána. Konkrétně byl použit výhodný způsob, kdy k roztoku 17 a—ethynylestradiolu (0,5 mmol, 150 mg) ve směsi suchého toluenu (6 ml) acetonitrilu (1 ml) byl přidán RhCl(PPh₃)₃ (0,05 mmol, 46 mg) a příslušný diyn obecného vzorce III (0,6 mmol). Reakční směs byla míchána při 20 °C po dobu 48 hodin nebo do úplného zreagování výchozích látek (kontrolováno TLC). Poté byla odpařena rozpouštědla a zbytek byl chromatografován na silikagelu. Tímto způsobem se získala zpravidla bezbarvá látka, která byla dále charakterizována ’H a ⁿC NMR spektroskopií, infračervenou spektroskopií a hmotovou spektroskopií.

Tímto obecným postupem, za použití výchozích látek uvedených níže, byly připraveny následující výhodné sloučeniny:

Příklad 1

PN202: 17a-[2,2-Bis(ethoxykarbonyl)-l ,3-dihydro—2H-inden-5-y!]-estradiol

17a-EthynylestradÍol (0,25 mmol, 74 mg), diethyl 2,2-(diprop-2-ynyl)-l,3-propandioát (0,3 mmol, 70,8 mg), RhCl(PPh₃)₃ (0,025 mmol, 23 mg). Po sloupcové chromatografii na silikagelu (2/1 hexan/EtOAc) bylo získáno 75 mg (56%) bezbarvé látky.

T.t. 164 °C; [a]_D = +35° (c 0,022 g/ml, aceton); ^]HNMR (400 MHz, C₆D₆) δ 0,71-0,79 (m, IH),

0,87 (t, 7 = 6,8 Hz, 3H), 0,88 (t, 7= 6,8 Hz, 3H), l,06(s,3H), 1,03-1,12 (m, IH), 1,29-1,42 (m,

4H), 1,61-1,75 (m, 4H), 1,88-2,00 (m, 2H), 2,18-2,23 (m, IH), 2,58-2,70 (m, 2H), 3,73-3,85 (m, 4H), 3,91 (q, J = 6,8 Hz, 2H), 3,92 (q, 7= 6,8 Hz, 2H), 5,14 (5, IH), 6,47 (d, 7 = 2,8 Hz, IH), 6,57 (dd, 7= 8, 2,8 Hz, IH), 6,94 (d, 7 = 8 Hz, IH), 7,04 (d, 7= 8 Hz, IH), 7,164 (s, IH)

- 11 CZ 300376 B6 signál překryt, 7,37 (s, IH); ^BC NMR (100 MHz, C6D6) δ 14,60 (2x), 15,74, 25,05, 27,33, 28,46, 30,62, 34,67, 39,63, 40,46, 41,37, 41,76, 44,20, 47,83, 49,15, 61,66, 62,35(2x), 86,64, 113,73, 116,23, 123,90, 124,49, 127,40, 129,23, 133,05, 138,56, 139,50, 140,19, 146,60, 155,06, 172,47 (2x); IR (ATR ZnSe) v 3398, 2958, 2927, 2870, 1727, 1711, 1610, 1502, 1442, 1283, 1249, 1185, 1068, 1049, 1008 cm’¹ MS (El) 532 (8), 514 (72), 499 (17), 425 (17), 314 (12), 213 (56), 149 (77); HRMS (El) vypočteno pro C33H₄₀O₆ 532,282 489, nalezeno 532,283 226.

Příklad 2

PN207: 17a-[2-Acetyl-2-(ethoxykarbonyl)-l ,3-dihydro-2H-inden-5-yl]-estradiol.

17a-Ethynylestradiol (0,5 mmol, 150 mg), ethyl 2-acetyl-2-(prop~2-ynyl)pent^4-ynoát (0,6 mmol, 106 mg), RhCl(PPh₃)₃ (0,05 mmol, 46 mg). Po sloupcové chromatografii na silikagelu (2/1 hexan/EtOAc) bylo získáno 103 mg (41%) směsi diastereoizomerů jako bezbarvé látky.

T.t, 113 °C; [α]ο = +28,7° (c 0,023 g/ml, aceton); *H NMR (400 MHz, C₆D₆) δ 0,58-0,64 (m, 2xlH), 0,96 (s, 3H), 1,05 (s, 3H), 1,22 (t, J = 7,2 Hz, 3H), 1,23 (t,J=7,2 Hz, 3H), 1,28-1,39 (m, 2x5H), 1,52-1,74 (m, 2x2H), 1,84-1,93 (m, 2x2H), 1,99-2,07 (m, 2x2H), 2,20 (s, 3H), 2,21 (s, 3H), 2,31-2,39 (m, 2xlH), 2,70-2,80 (m, 2x2H), 3,41-3,51 (m, 2x4H), 4,18 (q, J= 7,2 Hz, 2H), 4,19 (q, J =7,2 Hz, 2H), 4,85 (bs, 2xlH), 6,43 (d, J= 2,4 Hz, 2xlH), 6,47 (dd, J = 8,4, 2,4 Hz, 2xlH), 6,92 (d, J= 8 Hz, 2xlH), 7,12 (d, J= 8 Hz, 2x1 H), 7,16-7,17 (m, 2x1 H), 7,25 (s,2x1H); ⁿC NMR (100 MHz, CD3OD) δ 14,31, 14,50, 15,57, 15,72, 25,07, 25,08, 26,31, 26,38, 27,36, 27,54, 28,47, 28,72, 30,62, 30,70, 34,71, 34,90, 38,91, 39,65, 39,69, 40,05, 40,12, 40,49 (2x), 41,15,44,23,44,81, 47,85, 47,99, 49,18, signál je překiyt, 62,27, 62,90, 68,04, 68,34, 86,55, 86,84, 113,62, 113,69, 115,97, 116,19, 123,76, 123,94, 124,53, 127,11, 127,39, 127,59, 128,24, 129,24, 132,54, 133,06, 138,54, 138,72, 139,37, 139,46, 140,09, 140,10, 146,64, 146,75, 155,00, 155,82, 173,15, 173,87, 202,26, 204,79; IR (ATR ZnSe) v 3398, 2955,2923, 2870, 1711, 1692, 1610, 1502, 1442, 1353, 1283, 1242, 1182, 1154, 1078, 1011 cm“¹; MS (El) 502 (<1), 314 (10), 213 (16), 149 (40), 43 (100); HRMS (El) vypočteno pro C32H₃₈O₅ 502,271 125, nalezeno 502,269 356.

Příklad 3

PN214: 17α-( 1,3-Dihydro-2H-inden-5-yl)^estradiol

17a-EthynylestradÍol (0,25 mmol, 74 mg), 1,6-heptadiyn (0,3 mmol, 35 μΐ), RhCl(PPh₃)₃ (0,025 mmol, 23 mg). Po kolonové chromatografii na silikagelu (2/1 hexan/EtOAc) bylo získáno 56 mg (58%) bezbarvé látky.

T.t. 226 °C; [<x]_d = +57,2° (c 0,009 g/ml, aceton); ‘H NMR (400 MHz, DMSO) δ 0,50-0,53 (m, IH), 0,96 (s, 3H), 1,13-1,33 (m, 4H), 1,43-1,49 (m, 2H), 1,64-1,67 (m, IH), 1,75-1,85 (m,2H), 1,96-2,06 (m, 4H), 2,16-2,22 (m, IH), 2,60-2,72 (m, 2H), 2,80-2,87 (m, 4H), 4,93 (5, IH), 6,396 (d, J = 2,8 Hz, IH), 6,45 (dd, J = 8,4, 2,8 Hz, IH), 6,91 (d, J = 8,4 Hz, IH), 7,06 (d, .7 = 7,6 Hz, IH), 7,13 (d, .7=7,6 Hz, IH), 7,24 (s, IH), 8,93 (s, IH); ^l3C NMR (100 MHz, DMSO) δ 14,96, 23,82, 25,14, 26,01,27,19,29,18,31,88, 32,44, 33,31,37,84,43,10,46,39 (2x), 47,61, 84,40, 112,59, 114,81, 122,41, 123,45, 125,33, 125,90, 130,40, 137,05, 141,16, 141,96, 145,27, 154,83; IR (CCI4) v 3609, 3259,2913,2869, 2855, 1722, 1612, 1499, 1287, 1249, 1068, 1053, 1029, 1011, 820 cm’¹; MS (El) 388 (5), 370 (4), 228 (6), 173 (7), 149 (10), 111 (8), 84 (98), 66 (100); HRMS (El) vypočteno pro C27H₃₂O₂ 388,240 231, nalezeno 388,239 602.

Příklad 4

PN228: 17a-(2,2-Diacetyl-l,3-dihydro-2H-inden-5-yl)-estradiol

-12CZ 300376 B6

17a-Ethynyle$tradiol (0,5 mmol, 150 mg), 3,3^(diprop-2-ynyl)-2,4-pentadion (0,6 mmol,

105,6 mg), RhCl(PPh₃)₃ (0,05 mmol, 46 mg). Po kolonové chromatografií na silikagelu (2/1 hexan/EtOAc) bylo získáno 119 mg (50%) bezbarvé látky.

Bezbarvá tuhá látka. T.t. 158 °C; [a]_D =+40,90 (c 0,0055 g/ml, aceton); 'HNMR(400 MHz, C₆D₆) δ 0,71-0,78 (m, IH), 1,04 (s, 3H), 1,05-1,19 (m, IH), 1,30-1,40 (m, 4H), 1,62-1,65 (m,2H), 1,69 (s, 3H), 1,70 (s, 3H), 1,72-1,77 (m, 2H), 1,90-1,96 (m, 2H), 2,21-2,27 (m, IH), 2,60-2,70 (m, 2H), 3,22-3,34 (m, 4H), 4,46 (s, 1H), 6,39 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,47 (dd, J = 8 Hz, 2,4, IH), 6,92 (d,7 = 8Hz, IH), 6,99 (d, J = 8 Hz, IH), 7,18(s, IH) signál překryt, 7,32 (s, IH); io ^BC NMR (100 MHz, C6D6)Ó15,71, 25,08, 26,60, 26,66, 27,38, 28,50, 30,61, 34,74, 38,01, 38,39, 39,75, 40,52, 44,31, 47,87, 49,20, 75,75, 86,55, 113,69, 116,18, 124,00, 124,59, 127,37, 128,25, 129,24, 133,01, 138,53, 139,30, 140,03, 146,59, 154,96, 204,48 (2x); IR(ATR ZnSe) v 3427, 2927, 2870, 1692, 1610, 1498, 1359, 1249, 1150 cm’¹; MS (El) 472 (9), 454 (12), 411 (100), 228 (14), 213 (13), 159 (17); HRMS (El) vypočteno pro C31H₃₆O₄ 472,261 360, nalezeno

472,261 119.

Příklad 5

PN229: 17α-( 1,3-Dihydro-2-tosyl-2H-indol-5-yl)-estradiol

17a-Ethynylestradiol (0,5 mmol, 150 mg), ;V,A^r-di(prop-2-ynyl)-4-methylbenzensul fonyl amid (0,6 mmol, 148 mg), RhCl(PPh₃)₃ (0,05 mmol, 46 mg). Po sloupcové chromatografii na silikagelu (2/1 hexan/EtOAc) bylo získáno (27%) bezbarvé látky.

T.t. 178 °C; [a]_D = +18,20 (c 0,00825 g/ml, aceton); 'H NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 0,42-0,47 (m, IH), 1,02 (s, 3H), 1,14-1,37 (m, 5H), 1,45-1,67 (m, 3H), 1,83-1,95 (m, 3H), 2,27-2,40, (m, IH), 2,31 (s, 3H), 2,62-2,73 (m, 2H), 4,56-4,60 (m, 4H), 6,41 (d, 7 = 2,4 Hz, IH), 6,46 (dd, J= 8,4, 2,4 Hz, IH), 6,87 (d, J= 8,4 Hz, IH), 7,14 (d, J = 8 Hz, IH), 7,23-7,32 (m, 2H), 7,72-7,75 (m, 4H); ⁿCNMR (100 MHz, CD₃OD)δ 15,51, 21,46, 24,99, 27,41, 28,67, 30,64,

34,87, 38,86, 41,08, 44,76, 48,02, 54,67, 54,97, 55,68, 86,72, 113,60, 115,98, 122,16, 122,82,

127,10, 128,47, 128,74 (2x), 130,93 (2x), 132,40, 134,74, 135,59, 136,31, 138,71, 145,35, 147,93, 155,86; IR(ATR ZnSe) v 3452, 3281, 2927, 2870, 1613, 1502, 1347, 1166, 1099, 818, 666 cm“¹; MS (FAB) C₃₃H₃₇NO₄S molekulový peak je příliš slabý pro HRMS, FAB+ 544 (25), 526(23),456(23),443 (27),401 (31), 339(44),211 (57), 165 (71),91 (100).

Příklad 6

PN232: 17α-( 1,3-Di hydro i sobe nzofuran-5-yl)-e strad iol

17a-Ethynylestradiol (0,5 mmol, 150 mg), dipropargylether (0,6 mmol, 62 μΐ), RhCl(PPh₃)₃ (0,05 mmol, 46 mg). Po kolonové chromatografií na silikagelu (2/1 hexan/EtOAc) bylo získáno 28 mg (14%) bezbarvé látky.

T.t. 195 °C; [a]_D = +44,8° (c 0,0125 g/ml, aceton); 'HNMR (400 MHz, CD₃OD) δ 0,54-0,64 (m, IH), 1,07 (s, 3H), 1,21-1,54 (m, 4H), 1,55-1,80 (m, 3H), 1,89-2,07 (m, 3H), 2,15-2,22 (m, IH), 2,34-2,39 (m, IH), 2,71-2,77 (m, 2H), 5,07 (m, 4H), 6,43 (d, J = 2,8 Hz, IH), 6,47 (dd, 7 = 8,4 Hz, IH), 6,93 (d, 7 = 8,4 Hz, IH), 7,20 (d, J= 8,4 Hz, IH), 7,30 (s, IH), 7,32 (s, IH); ^l3C NMR (100 MHz, CD₃OD) δ 15,56, 25,05, 27,53, 28,74, 30,69, 34,94, 38,98, 41,16, 44,86,48,06, 55,68, 74,20, 74,45, 86,87, 113,63, 115,98,120,47, 121,18, 127,09, 128,11, 132,50,

138,38, 138,73, 139,10, 147,42, 155,86; IR(ATR ZnSe) v3417, 2930, 2866, 1723, 1613, 1502,

1287, 1252, 1027 cm¹; MS (El) 390 (2), 372 (3), 357 (2), 314 (7), 213 (20), 149 (50), 57 (63), 43 (100); HRMS (El) vypočteno pro C₂₆H₃o0₃ 390,219 495, nalezeno 390,217 671.

- 13CZ 300376 B6

Příklad 7

PN233: 17ct-[2-Kyano-2-( ethoxykarbonyl)-1,3-dihydro-2H-inden-5-yl]-estradiol

17a-Ethynylestradíol (0,5 mmol, 150 mg), ethyl 2-kyano—2—(prop-2-ynyl)pent-4—ynoát (0,6 mmol, 114 mg), RhCl(PPh₃)₃ (0,05 mmol, 46 mg). Po kolonové chromatografii na silikagelu (2/1 hexan/EtOAc) bylo získáno 110 mg (45%) směsi diastereoizomerů jako bezbarvé látky.

T.t. 138 °C; [a]_D = +21,4° (c 0,0055 g/ml, aceton); *H NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 0,58-0,67 io (m,2x1 H), 0,97(s,3H), l,08(s,3H), 1,31 (t, J= 7,2 Hz,3H), 1,32 (t, J= 7,2 Hz, 3H), 1,34-1,48 (m, 2x4H), 1,55-1,78 (m, 2x3H), 1,81-1,99 (m, 2x2H), 2,12-2,28 (m, 2x2H), 2,07 (s, IH), 2,24 (s, IH), 2,32-2,41 (m, 2xlH), 2,74-2,79 (m, 2x2H), 3,52-3,74 (m, 2x4H), 4,28 (q, J= 7,2 Hz,

2H), 4,30 (q, J = 7,2 Hz, 2H), 4,85 (bs, 2xlH), 6,44 (d, J= 2,8 Hz, IH), 6,47 (d, J = 2 Hz, IH),

6,48 (dd, J= 8,4, 2,8 Hz, IH), 6,51 (dd, J= 8,4, 2,8 Hz, IH), 6,95 (d, J= 8,4 Hz, IH), 7,03 is (d, 7=8,4 Hz, IH), 7,06-7,12 (m, 2H), 7,21-7,35 (m, 4H); ^,3C NMR (100 MHz, CD₃OD)6

14,24, 14,54, 14,71, 15,54, 24,57 (2x), 27,60, 28,59, 28,74, 28,79 (2x), 30,73 (2x), 34,94 (2x),

35,68 (2x), 38,96 (2x), 40,86, 41,21, 43,89, 44,24 (2x), 44,88, 44,92 (2x), 46,45 (2x), 48,06,

64,15 (2x), 86,79,86,84,92,02 (2x), 113,66, 113,72, 115,98, 116,05, 121,90 (2x), 123,96, 124,72,

124,82, 127,11 (2x), 128,27, 128,40, 132,30, 132,52, 138,00 (2x), 138,68, 138,74, 138,79, 147,77 20 (2x), 155,88, 155,98, 169,92 (2x); IR (ATR ZnSe) v 3376, 2927, 2866, 2249, 1736, 1727, 1499,

1442, 1283, 1226, 1059, 1011, 818 cm¹; HRMS (FAB) vypočteno pro C₃₁H₃₅NO₄ 485,256 609, nalezeno 485,258 821.

Příklady 8 až 12

Další sloučeniny podle vynálezu

Způsobem podle vynálezu se připraví rovněž sloučeniny uvedené v následujícím přehledu:

Příklad č.	X	R4	R5	m.h.
8	ch2	H	Me	402,57
9	qcooEth	H	Me	546,69
10	o	H	Me	404,54
11	CfMeh	H	H	416,59
12	C(Me):	H	Me	430,62

Příklad 13

Testování selektivity a účinnosti vybraných nových ligandů v in vitro reportérových studiích

Aktivita některých vybraných nových ligandů pro estrogenové reeeptory byla testována v reportérových studiích na tkáňových kulturách s COS-7 buňkami. Reportérové studie jsou vhodnějším typem experimentu než běžné vazebné studie, protože v případě estrogenových receptorů se vysoká afinita ligandu k receptorů vždy nutně neprojevuje vysokou aktivitou receptorů jako transkřípěního faktoru po navázání ligandu, COS-7 buněčná linie poskytuje významnou výhodu pro tento typ experimentu, jelikož neexprimuje endogenní ERa ani ERp a je proto vhodná pro testování selektivity ligandů. Kromě toho byly tyto látky testovány také v reportérových studiích na tkáňových kulturách s HEK293 buňkami.

- 14CZ 300376 B6

Buňky COS-7 byly transfekovány expresním vektorem kódujícím ERa nebo ΕΚβ a reportérovým vektorem obsahujícím jeden estrogenový responsivní element následovaný minimálním promotorem tymidin kinázy z herpes simplex viru. Jako reportéra vý gen byla použita luciferáza. Buňky byly po transfekci vysety na bílé 96jamkové kultivační destičky a byly dále kultivovány v médiu DMEM bez fenolové červeně obsahujícím 2mM glutamin, 20mM Hepes, pH 7,5, 5 pg/ml inzulín, 5 pg/ml lidský transferin, 100 pg/ml hovězí sérový albumin (BSA). 24 h po transfekci byly k buňkám přidány testované látky připravené v různých koncentracích sériovým ředěním v DMSO a po dalších 24 h byla pomocí komerčního kitu Steady-Glo® Luciferase Assay Kit (Promega) stanovena aktivita luciferázy podle přiloženého návodu, io Luminiscence byla změřena pomocí kombinovaného spektrofotometru EnVision™ (PerkinElmer) s ls integrací signálu. Data byla vyhodnocena v programu GraphPad Prism a pomocí regresní funkce (dose response, variable slape) byly stanoveny hodnoty EC50, které ukazuje tabulka 1. Selektivita ligandu pro daný reeeptor byla vypočítána jako podíl relativních aktivit ERa a ERp pro daný ligand. Hodnoty selektivity jsou uvedeny v tabulce 2 a závislosti transkr i pěních aktivit na koncentracích ligandů jsou znázorněny na obrázcích 1-7.

Tabulka 1: EC50 [nM] testovaných ligandů v reportérových studiích

Ligand	ERa	ER β
E2	0,66	1,80
PN202	3,85	19,30
PN207	2,49	14,50
PN214	21,10	1,08
PN228	18,97	60,39
PN229	5,37	62,71
PN232	5,14	12,09
PN233	0,80	12,79

Tabulka 2: Selektivita ligandů pro ERa a ERp v reportérových studiích

Ligand	ERa	ERP
E2	1,00	1,00
PN202	1,83	0,55
PN207	2,13	0,47
PN214	0,02	53,44
PN228	1,16	0,86
PN229	4,27	0,23
PN232	0,86	1,16
PN233	5,87	0,17

- 15CZ 300376 B6

Z naměřených hodnot EC50 je patrné, že nové látky jsou vysoce účinné ligandy obou estrogenových receptorů ajejich účinnost je srovnatelná nebo velice podobná estradiolu. To je důležitá vlastnost, protože takové látky jsou účinné v nízkých koncentracích ajejich aplikace není spojená s vedlejšími účinky jako je např. nespecifická vazba a stimulace ostatních členů rodiny jaderných receptorů, interference s metabolismem steroidních látek nebo obecná toxicita látek v těle. Jako výhodné ligandy se jeví látky PN202, PN207, PN214, PN229, PN232 a PN233 a jako nejvýhodnější ligandy se pak jeví látky PN214 a PN233.

Kromě toho vykazují nové látky různou selektivitu vůči jednomu z estrogenových receptorů. Zde io se jako výhodné selektivní ligandy jeví látky PN229 a PN233 pro ERa a látka PN214 pro ERp.

Jako nejvýhodnější selektivní ligand se jeví látka PN214 pro ERp a selektivita tohoto ligandu je srovnatelná s nej lepšími známými selektivními ligandy pro tento receptor.

Příklad 14

Testování aktivity vybraných nových ligandů v proliferaěních studiích.

Buněčná linie MCF-7 byla odvozena z adenokarcinomu prsu a vzhledem ke své proliferační závislosti na estrogenu je vhodná pro testování estrogenních vlastností chemických látek. Buňky

MCF-7 exprimují pouze ERa a proto je proliferativní účinek testovaných látek zprostředkován hlavně tímto receptorem.

Buňky MCF-7 byly kultivovány 6 dní v médiu DMEM bez fenolové červeně obsahujícím 8% fetální telecí sérum zbavené steroidních látek na aktivním uhlí a 2mM glutamin. Po této době buňky přestaly proliferovat a do média byly přidány různé koncentrace testovaných látek v DMSO. Buňky byly dále kultivovány ve výše popsaném médiu v přítomnosti testovaných látek a po 3 dnech jim bylo vyměněno médium a znovu byly do média přidány testované látky v DMSO. Po dalších 3 dnech bylo v kultuře stanoveno množství živých buněk za pomocí kitu CellTiter-Blue® Cell Viabilíty Assay (promega) podle přiloženého návodu. Fluorescenční měření bylo provedeno pomocí kombinovaného spektrofotometru EnVision™ (PerkinElmer) a data z měření jsou uvedena na obrázku 8 a 9.

Z naměřených dat je patrný toxický efekt vysokých koncentrací (l-ΙΟμΜ) přirozeného ligandu estradiolu jakož i nově připravených látek. Naopak v oblasti koncentrací od 0,5nM do 1OOnM, tedy v oblasti nízkých koncentrací, v nichž se estradiol vyskytuje v živém těle, podporují nově připravené látky prolíferaci MCF-7 buněk, v koncentračním rozsahu 10 až lOOnM je proliferativní účinek všech testovaných látek srovnatelný s estradiolem. V koncentraci lnM je proliferativní účinek látky PN202 srovnatelný s estradiolem zatímco látka PN214 je v této koncentraci neaktivní. Toto zjištění je v souladu s daty z reportérových studií, kde je lnM PN214 selektivní pro ERp a v této koncentraci ERa nestimuluje. Jak bylo výše uvedeno, proliferativní účinek vyvolaný estrogeny na buňkách MCF-7 je zprostředkován hlavně ERa a nízká proliferace buněk MCF-7 v přítomnosti 1 nm PN214 podporuje pozorování, že je tato látka vysoce selektivním ligandem.

Obsah všech citovaných publikací, jejichž seznam je uveden dále, je v celém rozsahu zahrnut v předložené přihlášce formou odkazu.

Citovaná patentová literatura

- GB 2 361 642 A

- WO 00/53620

- WO 05/048956

- WO 05/099704

- 16CZ 300376 B6

- WO 2006/013196

- US 2007/0135400 Al

- EP 1131336

Citovaná nepatentová literatura

1. Greene, G.L. etal. Sequence and expression of human estrogen receptor complementary

DNA.Sfc/ewe231, 1 150-4(1986).

2. Green, S. etal. Human oestrogen receptor cDNA: sequence, expression and homology to verb-A. Nátuře 320,134-9 (1986).

ío 3. Lubahn, D.B. etal. Alteration of reproductive function but not prenatal sexual development after insertional disruption of the mouše estrogen receptor gene. Proč Nati. Acad Sci USA 90, 11 162-6(1993).

4. Hewitt, S.C. & Korach, K.S. Oestrogen receptor knockout míče: roles for oestrogen receptors alpha and beta in reproductive tissues. Reproduction 125, 143-9 (2003).

5. Kuiper, G.G., Enmark, E., Pelto-Huikko, M., Nilsson, S. & Gustafsson, J.A, Cloning of a novel receptor expressed in rat prostatě and ovary. Proč Nati Acad Sci USA 93, 5 925-30 (1996).

6. Gustafsson, J.A. Estrogen receptor beta-a new dimension in estrogen mechanism of action. J Endocrinol 163, 379-83 (1999).

7. Ogawa, S. et al. The complete primary structure of human estrogen receptor beta (hER beta) and its heterodimerizatíon with ER alpha in vivo and in vitro. Biochem Biophys Res Commun 243, 122-6 (1998).

8. Meyers, M.J. et al, Estrogen receptor-beta potency-selective ligands: structure-activity relationship studies of diarylpropionitriles and their acetylene and polar analogues. J Med

CAew 44, 4 230-51 (2001).

9. Malamas, M.S. et al. Design and synthesis of aryl diphenolic azoles as potent and selective estrogen receptor-beta ligands, JMed Chem 41, 5 021-40 (2004).

10. Mewshaw, R,E. etal. ERbeta ligands. 3. Exploiting two binding orientations of the 2-phenyInaphthalene scaffold to achieve ERbeta selectivity. J Med Chem 48, 3 953-79 (2005).

11. Hillisch, A. et al. Dissecting physiological roles of estrogen receptor alpha and beta with potent selectiveligands from structure-based design. Mol Endocrinol 18, 1 599-609 (2004).

12. Couse, J.F. & Korach, K.S. Estrogen receptor null mice: what háve we leamed and where will they lead us? Endocr Rev 20, 358-417 (1999).

13. Gustafsson, J.A. What pharmacologists can leam from recent advances in estrogen signalling. Trends Pharmacol Sci 24, 479-85 (2003).

14. Harris, H.A. Estrogen receptor-beta: recent lessons from in vivo studies. Mol Endocrinol 21,

1-13 (2007).

15. Koehler, K.F., Helguero, L.A., Haldosen, L.A., Warner, M. & Gustafsson, J.A. Reflections on the discovery and significance of estrogen receptor beta. Endocr Rev 26, 465-78 (2005).

16. Palmieri, C. etal. Estrogen receptor beta in breast cancer. Endocr Relot Concer 9, 1-13 (2002).

-17CZ 300376 B6

17. Mann, S. et al. Estrogen receptor beta expression in invasive breast cancer. Hum Pathol 32, 113-8(2001).

18. Omoto, Y. et al. Clinieal value of the wild-type estrogen receptor beta expression in breast cancer. Cancer Lett 163, 207-12 (2001).

19. Weihua, Z. et al. A role for estrogen receptor beta in the regulation of growth of the ventral prostatě. Proč Nati Acad Sci USA 98, 6 330-5 (2001).

20. Imamov, O. etal. Estrogen receptor beta regulates epithelial cellular differentiation in the mouše ventral prostatě. Proč Nati Acad Sci USA 101,9 375-80 (2004).

21. Neubauer, B.L, etal. The selective estrogen receptor modulátor trioxifene (LY133314) io inhibits metastasis and extends survival in the PAIII rat prostatic carcinoma model. Cancer

Res 63, 6 056-62 (2003).

22. Pearce, S.T & Jordán, V.C. The biological role of estrogen receptors alpha and beta in cancer. Crit Rev Oncol Hematol 50, 3-22 (2004).

23. Kořte, T. etal. Female mice lacking estrogen receptor beta display prolonged ventricular repolarízation and reduced ventricular automaticity after myocardial infaretion. Circulation

111,2 282-90 (2005).

24. Pelzer, T. etal. Increased mortality and aggravation of heart failure in estrogen receptor-beta knockout mice after myocardial infaretion. Circulation 111,1 492-8 (2005).

25. Zhu, Y. etal. Abnormal vascular function and hypertension in mice deficient in estrogen receptor beta. Science 295, 505-8 (2002).

26. Skavdahl, M. et al. Estrogen receptor-beta mediates male-female differences in the development of pressure overload hypertrophy, Am J Physiol Heart Circ Physiol 288, H469-76 (2005).

27. Shughrue, P.J., Lané, M.V. & Merchenthaler, 1. Comparative distribution of estrogen receptor-alpha and -beta mRNA in the rat centrál nervous systém. J Comp Neurol 388,

507-25(1997).

28. Gundlah, C. et al. Estrogen receptor-beta regulates tiyptophan hydroxylase-1 expression in the murine midbrain raphe. Biol Psychiatry 57, 938^12 (2005).

29. Walf, A.A., Rhodes, M.E. & Frye, C.A. Antidepressant effects of ERbeta-selective estrogen receptor modulators in the forced swim test. Pharmacol Biochem Behav 1%, 523-9 (2004).

30. Shively, CA., Mirkes, S.J., Lu, N.Z., Henderson, J.A. & Bethea, C.L. Soy and sociál stress affect serotonin neurotransmission in primates. Pharmacogenomics J3, 114-21 (2003).

31. Rocha, BA, Fleischer, R., Schaeffer, J.M., Rohrer, S.P, & Hickey, G.J. 17

Beta-estradiolinduced antidepressant-like effect in the forced swim test is absent in estrogen receptor-beta knockout (BERKO) mice. Psychopharmacology (Berl) 179, 637—43 (2005).

32. Krezel, W., Dupont, S., Krust, A., Chambon, P. & Chapman, P.F. Increased anxiety and synaptic plasticity in estrogen receptor beta -deficient mice. Proč Nati Acad Sci USA 98, 12 278-82 (2001).

33. Imwalle, D.B., Gustafsson, J.A. & Rissman, E.F. Lack of functional estrogen receptor beta influences anxiety behavior and serotonin content in female mice. Physiol Behav 84, 157-63 (2005).

- 18CZ 300376 B6

34. Walf, A.A. & Frye, CA. ERbeta-selective estrogen reeeptor modulators produce antianxiety behavior when administered systemically to ovariectomized rats. Neuropsychopharmacology30, 1 598-609(2005).

35. Lund, T.D., Rovis, T., Chung, W.C. & Handa, R.J. Novel actions of estrogen receptor-beta on anxiety-related behaviors. Endocrinology 146, 797-807 (2005).

36. Day, M., Sung, A., Logue, S., Bowlby, M. & Arias, R. Beta estrogen reeeptor knockout (BERKO) mice present attenuated hippocampal CA1 long-term potentiation and related memory deficits in contextual fear conditioning. Behov Brain Res 164, 128-31 (2005).

37. Wang, L., Andersson, S., Warner, M. & Gustafsson, J.A. Morphological abnormalities in the brains of estrogen reeeptor beta knockout mice. Proč Nati Aead Sci USA 98, 2 792-6 (2001).

38. Wang, L., Andersson, S., Warner, M. & Gustafsson, J.A. Estrogen reeeptor (ER)beta knockout mice reveal a role for ERbeta in migration of cortical neurons in the developing brain. Proč Nati Aead Sci USA 100, 703-8 (2003).

39. Taurog, J.D. etal. Inflammatory dtsease in HLA-B27 transgenic rats. Immunol Rev 169, 209-23 (1999).

40. Harris, HA et al. Evaluation of an estrogen receptor-beta agonist in animal models of human disease. Endocrinology 144,4 241-9 (2003).

41. Chadwick, C.C. etal. Identification of pathway-selective estrogen reeeptor ligands that inhibitNF-kappaB transeriptional activity. Proč Nati Aead Sci USA 102, 2 543-8 (2005).

42. Cristofaro, P.A. etal. WAY-202196, a selective estrogen receptor-beta agonist, protects against death in experimental septic shock. Crit Care Med 34, 2 188-93 (2006).

43. Harris, HA, Bruner-Tran, K.L., Zhang, X., Osteen, K,G. & Lyttle, C.R. A selective estrogen receptor-beta agonist causes lesion regression in an experimental ly induced model of endometriosis. Hum Reprod 20,936-41 (2005).

44. Cvoro, A. et al. Selective estrogen receptor-beta agonísts repress transeription of proinflammatory genes. JImmunol 180, 630-6 (2008).

45. Follettie, M.T. et al. Organ messenger ribonucleic acid and plasma proteome changes in the adjuvant-induced arthritis model: responses to disease induction and therapy with the estrogen receptor-beta selective agonist ERB-041. Endocrinology 147, 714-23 (2006).

46. Shim, G.J. etal. Disruption of the estrogen reeeptor beta gene in mice causes myeloproliferative disease resembling chronic myeloid leukemia with lymphoid blast erisis. Proč Nati Aead Sci USA 100, 6 694-9 (2003).

47. Imamov, O., Shim, G.J., Warner, M. & Gustafsson, J.A. Estrogen reeeptor beta in health and disease. Biol Reprod 73, 866-71 (2005).

48. Witte, D., Chirala, M., Younes, A., Li, Y. & Younes, M. Estrogen reeeptor beta is expressed in human colorectal adenocarcinoma, Hum Pathol 32, 940—4 (2001).

49. Foley, E,F., Jazaeri, A.A., Shupnik, MA, Jazaeri, O. & Rice, L.W. Selective loss of estrogen reeeptor beta in malignant human colon. Cancer Res 60, 245-8 (2000).

50. Hulley, S. et al. Noncardiovascular disease outcomes during 6.8 years of hormone therapy: Heart and Estrogen/progestin Replacement Study follow-up (HERS II). JAMA 288, 58-66 (2002).

51. Grodstein, F., Newcomb, P.A. & Stampfer, M.J. Postmenopausal hormone therapy and the risk of colorectal cancer: a review and meta-analysis. Am J Med 106, 574-82 (1999).

-19CZ 300376 B6

52. Campbell-Thompson, M., Lynch, U. & Bhardwaj, B. Expression of estrogen receptor (ER) subtypes and ERbeta isoforms in colon cancer. Cancer Res 61, 632^10 (2001).

53. Peters, R.H., Crowe, O.F., Avery, MA, Chong, W,K. & Tanabe, Μ. 11 beta-nitrate estrane analogues: potent estrogens. J Med Chem 32,2 306-10 (1989).

54. Jaouen, G. & Vessiers, A. in Eur. Pat. Appl. (1989).

55. Foy, N., Stephan, E. & Jaouen, G. Soft cleavage of THP protected estradiols mediated by TMSI. Journal of Chemical Research (Synopses) 2001, 518-519 (2001).

56. Stephan, E., Affergan, T., Weber, P, & Jaouen, G. Tetrahedron Lett. 39, 9 427-9 430 (1998).

io 57. Foy, N., Stéphan, E. & Jaouen, G. Tetrahedron Lett. 41,8 089-8 092 (2000).

58. Foy, N. et al. Synthesis, receptor binding, molecular model ing, and proliferative assays of a series of 17alpha-arylestradiols. Chembiochem 4, 494-503 (2003).

59. Gennaro, A.R. etal. Remington: The Science and Practice in Pharmacy. 20. vydání. Lippincot Williams & Wilkins, Baltimore, MO, 2000.

60. Chalabala, M. etal. Technologie Léků. Galén, Praha, 2001.

61. Kibbe, A.H, Handbook of Pharmaceutical Excipients. Pharmaceutical Press, London, 2000.

Claims (10)

1. Steroidní sloučenina obecného vzorce II

25 kde

X je atom C nebo heteroatom vybraný ze skupiny sestávající z atomů N, O, kteiýžto atom popřípadě nese jeden nebo dva substituenty nezávisle vybrané ze skupiny sestávající z Ci-Cg-alkýlové skupiny, C₆-Ci₄-arylové skupiny, karboxylové skupiny, esterifi kované karboxylové skupiny vzorce -C(O)OR, kde R je Ci-Cg-alkyl nebo C₆-C₁₄-aryl, hydrogen30 karbonylové skupiny, alkylkarbonylové skupiny obsahující 1 až 8 atomů uhlíku v alkylové části a nitrilové skupiny, přičemž případné neobsazené vazby atomu X nesou atom(y) H, nebo X je p-toluensulfoamidoskupina,

R⁴ je H nebo Ci-Cs-alkyl,

R^s je H, Ci-Cr-alkyl, C₆-Ci₄-aryl nebo skupina -C(O)R, kde R je Q-Cg-alkyl nebo

35 C₆-C₎₄-aryl, a její izomemí formy, jejich soli a jejich solváty.

2. Steroidní sloučenina podle nároku 1 obecného vzorce II, kde

X je atom C nebo heteroatom vybraný ze skupiny sestávající z atomů N, O, kterýžto atom

40 popřípadě nese jeden nebo dva substituenty nezávisle vybrané ze skupiny sestávající z H, COO—ethyl, CO-methyl, CN, přičemž případné neobsazené vazby atomu X nesou atom(y) H,

-20CZ 300376 B6 nebo X je p-toluensulfoamidoskupina,

R⁴ je H nebo Cj-Cg-alkyl,

R⁵ je H, Ci-C₄-alkyl, C₆-Ci4-aryl nebo acyl vzorce -C(O)R, kde Rje H, Ci-Cg-alkyl nebo Ce-Cu-aryl,

5 a její izomemí formy, jejich soli ajejich solváty.

3. Steroidní sloučenina podle nároku 1 vybraná z následujících sloučenin

-21 CZ 300376 B6 kde Et znamená ethyl, Me znamená methyl a NTs znamená p-toluensulfoamidoskupinu.

4. Steroidní sloučenina podle nároku 3 vybraná ze sloučenin vzorců PN214, PN229 a PN233

5 uvedených v nároku 3.

5. Způsob přípravy steroidní sloučeniny podle libovolného z nároků laž4, vyznačující se tím, že zahrnuje krok, při němž se cyklotrimer izuje ethynylestradiol v organickém rozpouštědle s diynem obecného vzorce III χ^ζ 2Z ^(,ii)z ve kterém má X významy uvedené v příslušném z nároků 1 až 4, za přidání katalyzátoru v podobě komplexu přechodného kovu, a případně další kroky, při nichž se odstraní rozpouštědlo a produkt se přečistí.

15

6. Způsob podle nároku 5, v y z n a č u j í c í se tím, že jako ethynylestradiol se použije 17a-ethynylestradiol, a/nebo jako organické rozpouštědlo se použije rozpouštědlo vybrané z toluenu, benzenu, THF, dichlormethanu, acetonitrilu nebo jejich směsí, výhodněji toluen nebo acetonitril, nejvýhodněji směs suchého toluenu a acetonitrilu, a/nebo

20 jako katalyzátor se použije katalyzátor vybraný z komplexů přechodných kovů, výhodně Ru, Rh, Co, Ni, nebo jejich kombinací, výhodněji Ni(cod)₂/PPh₃ nebo RhCl(PPh₃)₃, nej výhodněj i RhCl(PPh₃)₃.

7. Způsob podle nároku 5 nebo 6, vy zn ač u j í c í se t í m , že

25 vzájemný výhodný molární poměr ethynylestradiolu a diynů vzorce III je 2:1 až 1:5, výhodněji 1:1 až 1:2, nejvýhodněji 1:1,2, a/nebo reakce se provádí za míchání, výhodně při teplotě 15 až 100°C, výhodněji při teplotě 15 až 60 °C, nejvýhodněji při 20 °C, a/nebo

-22CZ 300376 B6 reakce se provádí po dobu 8 až 72 hodin, výhodněji po dobu 24 až 48 hodin, nej výhodněji do úplného zreagování výchozích látek.

8. Steroidní sloučenina podle libovolného z nároků 1 až 4 pro použití jako léčivo.

9. Farmaceutická kompozice vyznačující se tím, že obsahuje steroidní sloučeninu podle libovolného z nároků 1 až 4 a případně farmaceuticky přijatelné pomocné látky.

10. Použití steroidní sloučeniny podle libovolného z nároků 1 až 4 pro výrobu léku.