CZ298560B6 - Zpusob výroby modifikovaného lipidu a smes - Google Patents

Abstract

Lipid obsahující aminoxyskupinu vzorce R.sub.2.n.NHOB, kde B je lipid; a kde R.sub.2 .n.je atom vodíku nebo hydrokarbylová skupina. Pri reakci se slouceninou obsahující aldehydovou nebo ketonovou skupinu tvorí skupina aminoxy modifikované lipidy s kovalentními vazbami -C=N- typu Schiffovy báze.

Description

takže odpovídající exprimovaný protein může provádět požadovanou terapeutickou funkci.

Příklady tohoto typu terapie zahrnují vložení genů TK, TSG nebo ILG pro léčení rakoviny;

vložení genu CFTR pro léčení cystické fibrosy; vložení genů NGF, TH nebo LDL pro léčení neurodegenerativních a kardiovaskulárních onemocnění; vložení genu antagonisty IL-1 pro léčení revmatoidní artritidy; vložení antigenů HIV a genu TK pro léčení infekcí AIDS a CMV; vložení antigenů a cytokinů pro vakcinaci; v ložení β-globinu pro léčení hemoglobinopatických stavů, jako jsou talasemie.

V mnoha současných studiích genové terapie se používá adenovirových genových vektorů jako je Ad3 nebo Ad5, nebo jiných genových vektorů. S jejich použitím však je spojena řada problémů. To zvýšilo požadavky na méně nebezpečné, nevirové přístupy přenosu genů.

Potenciálně velmi výhodný nevirový přenosový systém zahrnuje použití kationtových liposomů. kationtové liposomy, které se obvykle skládají z neutrálního fosfolipidu a kationtového lipidu, byly v tom smyslu používány pro přenos DNA, mRNA, nekódujících oligonukleotidů, proteinů a léčiv do buněk. Komerčně je dostupná celá řada kationtových lipidů a v poslední době bylo syntetizováno mnoho nových kationtových lipidů. Účinnost těchto liposomů byla prokázána jak in vitro, tak in vivo.

Cytofektin použitelný při přípravě kationtového liposomů je #-1-(2,3-dioleoyloxy)propyl]Ν,Ν,Ν-trimethylamoniumchlorid, jinak známý jako „DOTMA“.

Jeden z nejvíce používaných systémů kationtových liposomů je složený ze směsi neutrálního fosfolipidu dioleoylfosfatidylethanolaminu (běžně známý pod názvem „DOPE“) a kationtového lipidu, 3P-[(N,N-dimethylaminoethan)karbamoyl]cholesterol (běžně známý jako „DC-Chol“).

Přes účinnost známých kationtových liposomů je stále potřeba optimalizovat účinnost genového přenosu kationtových liposomů v humánní medicíně. Protože je projekt přečtení lidského genomu téměř u konce, použití genů pro léčebné účely, popisované jako genová terapie, bude podle očekávání převratem v medicíně. V této souvislosti je nevirové dodávání genů, ačkoli má stále menší účinnost než virové metody, stále více požadováno vědeckou komunitou za nejbezpečnější možnost pro použití u člověka.

Tento obor se značně rozvíjel v posledních deseti letech, přičemž byly získány komplexní makromolekulámí konstrukty obsahující mnoho prvků různých existujících technologií (virové proteiny nebo peptidy, liposomy, polymery, strategie směrování na cíl a vlastnosti stealth).

Podstata vynálezu

Souběžně projednávaná přihláška autorů vynálezu WO2001/048233 popisuje systém založený na triplexu složeném zpeptidu virového jádra Mu, plazmidové DNA a kationtového liposomů (LMD). Tato základní technologie byla úspěšná in vitro a poskytla slibné výsledky in vivo. Ale

-1 CZ 298560 B6 stejně jako u všech existujících nevirových technologií je pro dosažení terapeutické úrovně in vivo ještě další vývoj.

Z tohoto hlediska musí být dosažena stabilita částice v biologických kapalinách (sérum, sliznice plic) při zachování účinných transfekčních schopností.

Tento požadavek je jednou ze známých překážek všech existujících technologií. Současné stabilní formulace dosahují nízké účinnosti transfekce a nejnovější účinné transfekční prostředky mají značně omezenou použitelnost v důsledku nestability.

Po podání (do krve při systémovém podání nebo na sliznici plic při místním podání) se nabité komplexy vystaví působení solí a biologických makromolekul, což vede k silné agregaci koloidů a adsorpci biologicky aktivních elementů (opsoninů) na jejich povrchu. Dochází k drastickým změnám genových vehikul, které mohou zahrnovat srážení, navázání proteinů vedoucí k odstra15 nění částic makrofágy a rozrušení povrchu vedoucí k jeho destrukci.

S cílem vytvořit systémy pro podávání léčiv a genů pro specifické směrování do buněk in vitro a in vivo jsou nezbytné protokoly pro přípravu dodávacích systémů stabilních v biologických kapalinách s dostatečnou aktivitou pro terapeutické použití. Proto je nutno najít rovnováhu mezi stabilitou a aktivitou pro získání účinného dodávacího vehikula léčiv/genů.

Soutěžně projednávaná přihláška přihlašovatelů W02001/048233 popisuje systém založený na modifikovaném lipidu kde lipid nese sacharidovou skupinu. Bylo zjištěno, že tyto modifikované lipidy jsou stabilní a mají nízkou toxicitu. Takové systémy vyžadují nevázání další skupiny na lipid pro získání modifikovaného lipidu, který je stabilní a má nízkou toxicitu. V oboru tedy existuje potřeba poskytnout lipidy obsahující skupiny, na které se mohou snadno navázat další skupiny.

Modifikované lipidy obsahují lipid navázaný na aminovou hlavní skupinu pomocí propojovací skupiny byly popsány v časopise Human Gene Therapy 7: 1701-1717 (1996), US-A-5 510 510, GB-A-1178790 a US-A-3 766 235.

Použití oximových propojovacích skupin s lipidy bylo popsáno v článcích J. Medicinal Chemistry, 17: 396-403 (1974), J. Heterocycl. Chem. 16: 1459-1463 (1979) a GB-A-1288647.

Předkládaný vynález přispívá k řešení některých problémů ze stavu techniky.

Podle jednoho provedení předkládaného vynálezu se poskytuje způsob výroby modifikovaného lipidu vzorce I

při kterém se ponechá reagovat (i) sloučenina vzorce II

O

Ri

-2CZ 298560 B6 a (ii) sloučenina vzorce III

(III) ve směsi nebo v asociaci s nukleotidovou sekvencí nebo farmaceuticky účinnou látkou;

kde B je lipid a A znamená sledovanou skupinu (moiety of interest, MOI); kde X znamená případnou propojovací skupinu; kde Ri znamená atom vodíku nebo hydrokarbylovou skupinu; a kde R₂ znamená volný elektronový pár nebo R4, kde R4 znamená vhodný substituent.

Podle dalšího provedení předkládaného vynálezu se poskytuje směs obsahující o

(i) sloučeninu vzorce II

(ii) sloučeninu vzorce III r₂

a (iii) nukleotidovou sekvenci nebo farmaceuticky účinnou látku, kde B znamená lipid a A znamená sledovanou skupinu (MOI); kde X znamená případnou propojovací skupinu; kde Rj znamená atom vodíku nebo hydrokarbylovou skupinu; a kde R₂ znamená iontový pár nebo vhodný substituent.

Směs podle předkládaného vynálezu může najít použití v lékařství.

Směs podle předkládaného vynálezu se může použít pro výrobu léčiva pro léčení genetické poruchy nebo stavu nebo onemocnění.

Ze směsi podle předkládaného vynálezu se může vytvořit liposom.

Způsob výroby takového liposomu zahrnuje vytvoření liposomu ze směsi podle předkládaného vynálezu.

Takový liposom se může použít v lékařství.

Takový liposom se dále může použít pro výrobu léčiva pro léčení genetické poruchy nebo stavu nebo onemocnění.

-3CZ 298560 B6

Může být vytvořen farmaceutický prostředek obsahující směs podle předkládaného vynálezu ve směsi s léčivem a popřípadě ve směsi s farmaceuticky přijatelným ředivem, nosičem nebo pomocnou látkou.

Může být vytvořen farmaceutický prostředek obsahující liposom popsaný výše ve směsi s léčivem a popřípadě ve směsi s farmaceuticky přijatelným ředivem, nosičem nebo pomocnou látkou. Některé další aspekty vynálezu jsou definovány v přiložených nárocích.

Autoři vynálezu zjistili, že poskytnutí lipidu obsahujícího skupinu aminoxy umožní jednoduché navázání dalších skupin na lipid přes skupinu aminoxy. Při reakci se skupinou (MO1) obsahující aldehydovou nebo ketonovou skupinu se vytvoří sloučenina, ve které MO1 a lipid jsou navázány prostřednictvím amidové skupiny. Taková vazba může být jednoduše připravena v jednoduché reakci („one-pot“). Tak je možno vyhnout se náročným postupům čištění použitím jednoduché dialýzy nebo nadbytečných, reagujících činidel.

Metoda následného potahování v jednom kroku (post-coating one-pot methodology) podle předkládaného způsobu je založena na selektivní a vysoké reaktivitě propojovací skupiny aminoxy s aldehydy a ketony za vytvoření kovalentní vazby -C=N- (podobná Schiffově bázi). Je důležité, že reakce může být prováděna ve vodném prostředí při bazickém nebo kyselém pH. Dále nedochází k částečnému rozpadu při vystavení vodnému prostředí jako je tomu v případě NHSaktivovaných karboxylů a jiných esterů. Stabilita reaktivních skupin, např. aldehyd/keton skupiny aminoxy proto umožní úplné řízení povrchové reakce bez ztráty reaktivních skupin v důsledku hydrolýzy/degradace.

Výhodná provedení vynálezu

Sloučenina vzorce lil podle předkládaného vynálezu má vzorec r₂

(III), kde B znamená lipid; a kde R₂ znamená atom vodíku nebo a hydrokarbylovou skupinu.

Termín „hydrokarbylová skupina“, jak se zde používá, znamená skupinu obsahující alespoň C a H a může popřípadě obsahovat jeden nebo více vhodných substituentů. Příklady takových sub35 stituentů mohou zahrnovat halogen, alkoxy, nitro, skupinu alkyl, cyklickou skupinu atd. Kromě toho, že substituenty mohou být cyklické skupiny, může cyklickou skupinu tvořit kombinace substituentů. Jestliže hydrokarbylová skupina obsahuje více než jeden C, potom tyto atomy uhlíku nemusí být nezbytně vzájemně spojeny. Například alespoň dva atomy uhlíku mohou být spojeny vhodným prvkem nebo skupinou. Hydrokarbylová skupina může obsahovat heteroatomy. Vhod40 né heteroatomy budou zřejmé odborníkům v oboru a zahrnují například síru, dusík a kyslík. Neomezují příklad hydrokarbylové skupiny je acylová skupina.

Typická hydrokarbylová skupina je uhlovodíková skupina. V tomto případě termín „uhlovodík“ znamená jakoukoli alkylovou skupinu alkenylovou skupinu, alkynylovou skupinu, přičemž tyto skupiny mohou být přímé, rozvětvené nebo cyklické, nebo arylovou skupinu. Termín uhlovodík také zahrnuje uvedené skupiny, které jsou substituované. Jestliže uhlovodík znamená rozvětvenou strukturu, která na sebe nese substituent (substituenty), potom substituent může být na uhlovodíkové kostře nebo na její větvi; alternativně mohou být substituenty jak na uhlovodíkové kostře, tak i na její větvi.

-4CZ 298560 B6

S výhodou se reakce podle předkládaného vynálezu provádějí ve vodném médiu.

Popřípadě přítomná propojovací skupina X

Ve výhodném provedení je případná propojovací skupina X přítomná.

Ve výhodném provedení znamená X hydrokarbylovou skupinu.

Ve výhodném provedení obsahuje propojovací skupina X lipid nebo je navázána na lipid přes polyaminovou skupinu. Předpokládá se, že polyaminová skupina je výhodná, protože zvyšuje vazebnou schopnost DNA a účinnost přenosu genu výsledného liposomu.

V jednom provedení polyaminová skupina znamená s výhodou polyamin, který se nevyskytuje v přírodě. Předpokládá se, že polyaminová hlavní skupina (head-group) je výhodná, protože zvýšená aminová funkčnost zvyšuje celkový hladný náboj liposomu. Navíc je známo, že polyaminy se silně vážou na DNA a stabilizují ji. Navíc se polyaminy přirozeně vyskytují v buňkách a tak se předpokládá minimalizace toxikologických problémů.

V dalším provedení jsou s výhodou dvě nebo více aminových skupin polyaminové skupiny podle předkládaného vynálezu odděleny jednou nebo více skupinami, které se nenacházejí v přírodě a které oddělují aminové skupiny v přírodě se vyskytujících polyaminových sloučenin (tj. polyaminová skupina podle předkládaného vynálezu má s výhodou nepřirozené propojovací skupiny).

Polyaminová skupina s výhodou obsahuje alespoň dva aminy polyaminové skupiny, které jsou vzájemně oddělené (jsou od sebe v určité vzdálenosti) ethylenovou (_CH₂CH₂-) skupinou. S výhodou je každý z aminů polyaminové skupiny oddělen (jsou od sebe v určité vzdálenosti) ethylenovou (-CH₂CH₂-) skupinou.

Typické příklady vhodných polyaminů zahrnují spermidin, spermin, kaldopentamin, norspermidin a norspermin. S výhodou je polyamin spermidin nebo spermin, protože je známo, že tyto polyaminy interagují s jednořetězcovou nebo dvouřetězcovou DNA. Alternativní výhodný polyamin je karldopentamin.

R]

Ve výhodném provedení Ri znamená atom vodíku.

C=N

Vazba C=N může být labilní nebo rezistentní vůči kyselému prostředí. V jednom provedení je vazba C=N labilní vůči kyselému prostředí. V jednom provedení je vazba C=N rezistentní vůči kyselému prostředí.

MOI

Sledovaná skupina (MOI) může být jakákoli skupina, která mu být navázána na lipid.

Skupina MOI může být sacharidová skupina.

Ve výhodném provedení sacharidová skupina znamená monosacharid.

Ve výhodném provedení sacharidová skupina znamená skupinu cukru.

-5CZ 298560 B6

S výhodou je sacharidová skupina zvolena ze skupiny mannosa, glukosa (D-glukosa), galaktosa, glukuronová kyselina, laktosa, maltosa, maltotriosa, maltotetrosa, maltoheptosa a jejich směsi. Výhodněji je sacharidová skupina D-glukosa.

V jednom provedení obsahuje sloučenina podle předkládaného vynálezu 1 až 7 sacharidových skupin. S výhodou obsahuje sloučenina jednu sacharidovou skupinu.

Lipid

Ve výhodném provedení lipid je nebo obsahuje cholesterolovou skupinu nebo glycerol/ceramidovou kostru. Je vhodná jakákoli struktura podobná lipidu nebo polyamin.

S výhodou je cholesterolová skupina cholesterol.

S výhodou je cholesterolová skupina navázána na skupinu X karbamoylovou vazbou.

Cholesterolová skupina může být cholesterol nebo jeho derivát. Příklady derivátů cholesterolu zahrnují substituované deriváty, kde se vyskytuje vhodná substituce na jedné nebo více skupinách CH₂ nebo CH cyklů a/nebo na jedné nebo více skupinách CH₂ nebo CH přímých řetězců.

Alternativně nebo navíc může být jedna nebo více cyklických skupin a/nebo jeden nebo více přímých řetězců nenasycených.

Ve výhodném provedení je cholesterolová skupina cholesterol. Předpokládá se, že cholesterol je výhodný, protože stabilizuje výslednou liposomovou dvojvrstvu.

S výhodou je cholesterolová skupina navázána případnou propojovací skupinu karbamoylovou vazbou. Předpokládá se, že tato vazba je výhodná, protože výsledný liposom má nízkou nebo minimální cytotoxicitu.

Další aspekty

S výhodu R₂ znamená atom vodíku nebo hydrokarbylovou skupinu.

Ve výhodném provedení obsahuje hydrokarbylová skupina R₂ případně heteroatomy zvolené z O,

Na atomů halogenu.

Ve výhodném provedení R₂ je H.

S výhodou se způsob podle předkládaného vynálezu provádí ve vodném mediu nebo ve zcela vodném médiu.

Předkládaný vynález dále poskytuje sloučeninu připravenou zde definovaným způsobem podle předkládaného vynálezu, sloučeninu získanou zde definovaným způsobem podle předkládaného vynálezu a/nebo sloučeninu získatelnou zde definovaným způsobem podle předkládaného vyná45 lezu.

Sloučenina ve směsi neboje asociována s nukleotidovou sekvencí.

Nukleotidová sekvence může být část nebo úplný expresní systém, který může být použitelný při terapii, jako je genová terapie.

Ve výhodném provedení je sloučenina podle předkládaného vynálezu ve směsi s kondenzovaným komplexem polypeptid/nukleová kyselina pro poskytnutí nevirového dodávacího vektoru nukleové kyseliny. Kondenzovaný komplex polypeptid/nukleová kyselina s výhodou zahrnuje komple55 xy popisované v související přihlášce WO 2001/048233. S výhodou jsou polypeptidy nebo jejich

-6CZ 298560 B6 deriváty schopny vázat se na komplex nukleové kyseliny. S výhodou jsou polypeptidy nebo jejich deriváty schopny kondenzovat komplex nukleové kyseliny. S výhodou je komplex nukleové kyseliny heterologní vzhledem k polypeptidům nebo jejich derivátům.

S výhodou zahrnuje proces použití molekulárního síta.

S výhodou je kationtový liposom vytvořen ze sloučeniny podle předkládaného vynálezu a neutrálního fosfolipidu jako je DOTMA nebo DOPE. S výhodou je neutrálním fosfolipidem DOPE.

Předkládaný vynález bude nyní podrobněji popsán na následujících příkladech s odkazem na následující obrázky, ve kterých:

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 - Schéma 1 Syntéza hydroxylaminlipidu 11. Činidla: (a) CH₂C1₂, Et₃N, Boc₂O, laboratorní teplota, 5h, 98%; (b) EtOAc, N-hydroxysukcinimid (1 ekv.) DCC (lekv.), 10 h, laboratorní teplota; (c) (8), EtOAC/THF [95/5], Et₃N (pH = 8), 2 h, laboratorní teplota, 90%; (d) CH₂C1₂, TFA (15 ekv), 0 °C, N₂, 5 h, 86%.

Obr. 2 - Princip chemoselektivní disociace O-substituovaného hydroxylaminu D-glukózou (ačkoli je ukázán β-anomer, probíhá mutarotace a vytváří se také a-anomer).

Obr. 3 - Možné struktury neoglykolipidu získaného z manosy.

Obr. 4 - Výsledky analýzy velikosti různých lipoplexů fotonovou korelační spektroskopií (PCS). Velkost byla měřena po 30 min pro lipoplexy při [DNA] = 1 pg/ml v médiu Optimem +/- 10 % FCS, 37 °C. Porovnání standardní formulace LMD (LMD) a LMD s modifikací přídavkem

7,5 mol % produktu 12h a 12i bylo prováděno v médiu Optimem (bílé pruhy) a 10% séru (černé pruhy) a vyjádřeno jako procento zvýšení velikosti proti původně naměřené velikosti 180 nm.

Obr. 5 - Srovnání účinnosti transfekce základního LMD a LMD glykomodifikovaného 7,5 mol % produktu 12h a 12i na buňky HeLa v podmínkách 0 % (bílé pruhy), 50 % (šrafované pruhy) a 100 % séra (černé pruhy). Výsledky jsou vyjádřeny jako relativní světelné jednotky na miligram proteinu (n = 4).

Obr. 6 - Struktura aminoxylipidu

Předkládaný vynález bude dále popsán na následujících příkladech.

Příklady provedení vynálezu 45 Experimentální část

Syntéza neoglykolipidů

Obecné údaje: 'H MR spektra byla zaznamenávána při teplotě laboratoře buď na spektrometru 50 Brucker DRX400, DRX300 nebo Jeol GX-270Q, se zbytkovým izotopově neznačeným rozpouštědlem (např. CHC1₃, δπ = 7,26) jako vnitřním standardem. ¹³C-NMR spektra byla zaznamenávána na stejných spektrometrech při 100, 75 a 68,5 MHz, rovněž se zbytkovým izotopově neznačeným rozpouštědlem (např. CHC1₃,5_C = 77,2) jako vnitřním standardem.

-7CZ 298560 B6

Infračervená spektra byla zaznamenávána na přístroji Jasco FT/IR 620 s použitím destiček NaCl a hmotnostní spektra (elektrorozprašování kladných iontů) byla zaznamenávána na přístroji VG-7070B nebo JEOL SX-102. Chromatografie označuje bleskovou chromatografií na koloně, která byla prováděna na silikagelu Merck-Kieselgel 60 (230-400 mesh) v běžném rozpouštědle.

Chromatografie na tenké vrstvě (Tle) byla prováděna na hotových deskách Merck-Kieselgel 60 F254 s hliníkovým podkladem a vyvolávána UV zářením, jódem, kyselým molybdenanem amonným), kyselým ethanolickým vanilinem, nebo jinými vhodnými činidly. Čistota neoglykolipidů byla zjišťována analytickou vysokotlakou kapalinovou chromatografií (HPLC) na systému Hitaio chi s použitím kolony Purospher® RP-18 endeapped column (5 pm). Eluce byla prováděna isokraticky s průtokem 1 ml/min CH3CN/H2O (60 : 40) a frakce byly detekovány při 205 nm před odběry na analýzy hmotnosti. Sušený CH2CI2 byl před použitím destilován s oxidem fosforečným. Všechna další suchá rozpouštědla a chemikálie byly získány u firmy Sigma-Aldrich Company LTD (Pool, Dorset, UK).

Zkratky: BOC: terc-butoxykarbonyl; br: široký; Chol: cholesteryl; DMF: N,N-dimethylformamid; DMSO: dimethylsulfoxid; TFA: kyselina trifluoroctová; THF: tetrahydrofuran.

2-(Cholesteryloxykarbonyl)aminoethanol (2):

Roztok cholesterylchlorformátu (99,89 g, 0,218 mol) v CH2CI2 (600 ml) byl přidáván k míchanému roztoku 2-aminoethanolu (29,5 ml, 0,489 mol, 2,2 ekv.) v CH₂C1₂ (450 ml) při 0 °C po dobu 2 h. Reakční směs byla ponechána ohřát na laboratorní teplotu a míchání pokračovalo dalších 14 h. Reakční směs byla promyta nasyceným roztokem NaHCO₃ (2x200 ml), vodou (2 x

200 ml), sušena (MgSO₄) a rozpouštědla byla odstraněna za sníženého tlaku. Získaná pevná látka byla rekrystalizována (CH₂Cl₂/MeOH) za poskytnutí sloučeniny 2 jako bílé pevné látky. Výtěžek: 99,67 g (97 %); Teplota tání: 180 °C; Rf = 0,26 (aceton/ether 1 : 9); IR (CH2CI2): v_max = 3353, 2942, 2870, 1693, 1674, 1562, 1467, 1382, 1264 cm'¹; 'HNMR (270 MHz, CDC1₃): δ =

5,35 (d, J= 6,5 Hz, 1H, H6'), 5,25-5,29 (m, 1H, NH), 4,42 - 4,57 (1H, m. H3'), 3,70-3,62 (m,

2H, Hl), 3,25 - 3,35 (m, 2H, H2), 3,12 (s, 1H, OH), 2,28 - 2,38 (m, 2H, H4'), 1,77-2,03 (m, 5H,

H2', H7', H8'), 1,59-0,96 (m, 21H, HT, H9', HIT, H12', H14'-H17', H22'-H25'), 1 (3H, s, H19'), 0,9 (d, J= 6,5 Hz, 3H, H2T), 0,87 (d, J= 6,5 Hz, 6H, H26' & H27') a 0,67 (s, 3H, H18'); MS (FAB⁺): m/z = 496 [M+Na]⁺, 475 [M+H]⁺, 369 [Chol]⁺, 255, 175, 145, 105, 95, 81, 43.

2-[(Cholesteryloxykarbonyl)amino]ethylmethansulfonát (3):

K roztoku sloučeniny 2 (25 g, 52,3 mmol) a triethylaminu (22 ml, 0,16 mol, 3 ekv.) vCH₂Cl₂ (500 ml) při 0 °C byl po kapkách přidán roztok methansulfonylchloridu (10,5 ml, 0,13 mol, 2,5 ekv.). Reakční směs byla ponechána ohřát na teplotu laboratoře a byla míchána 1 h 30 min.

Po zjištění úplnosti reakce analýzou TLC byl přidán led pro zastavení reakce. Reakční směs byla přidána k nasycenému vodnému NH₄C1 (600 ml), a extrahována etherem (3 x 300 ml). Spojené organické vrstvy byly promyty vodou (2 x 300 ml), roztokem soli (250 ml) a sušeny (Na₂SO₄). Rozpouštědlo bylo odstraněno za sníženého tlaku za poskytnutí sloučeniny jako bílé pevné látky, která po chromatografickém čištění (ether) poskytla sloučeninu 3. Výtěžek: 28,3 g (98%);

IR(CH₂C1₂): v_max = 3453, 3342, 1716, 1531, 1377, 1137 & 798 cm’¹; ‘Η NMR (270 MHz,

CDCf): δ 5,34 (d, J= 6,5 Hz, 1H, H6'), 5-5,1 (m, 1H, NH), 4,41 - 4,53 (1H, m, H3'), 4,294,25 (t, J= 5 Hz, 2H, Hl), 3,47 - 3,52 (m, 2H, H2), 3,01 (s, 3H, H3), 2,24-2,36 (m, 2H, H4'), 1,74-2 (M, 5H, H2', H7', H8'), 0,91,6 (m, 21H, HT, H9', Hl T, H12', H14'-H17', H22'-H25'), 0,98 (3H, s, H19'), 0,84 (d, J= 6,5 HZ, 3H, H2T), 0,83 (d, J= 6,5 Hz, 6H, H26' & H27') a 0,65 (s, 3H, H18'); MS (FAB⁺): m/z =1104 [2M+H]⁺, 574 [M+Na]⁺, 552 [M+H]⁺, 369 [Chol]⁺, 255,

175, 145, 95,81.

-8CZ 298560 B6

4-aza-N⁶(cholesteryloxykarbonylamino)hexanol (4):

K míchanému roztoku sloučeniny 3 (28,3 g, 51 mmol) rozpuštěné v minimálním množství THF byl po kapkách přidán aminopropanol (160 ml, 2 mol, 39 ekv.). Po zjištění ukončení rekce TLC (12 h) byly přidány CHC1₃ (350 ml) a K₂CO₃ (20 g) a roztok byl důkladně míchán 30 min.

Suspenze byla potom zfiltrována přes krátké lože Celíte® a důkladně promyty CHC1₃. Získaná látka byla promyta nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a sušena (Na₂CO₃). Rozpouštědlo bylo odstraněno za poskytnutí sloučeniny 4 jako bílé pevné látky. Výtěžek. 26,1 g (96 %); IR (CH₂C1₂): v_max= 3350-3210,2937,2850, 1531, 1460, 1380, 1220, 1120, 1040 cm’¹; ío ^]H NMR (270 MHz, CDC1₃) δ = 5,33 - 5,35 )m, 1H, H6'), 4,92-^1,96 (m, 1H, NM), 4,42 - 4,51 (1H, m, H3'), 3,7 - 3,83 (m, 2H, H5), 3,23-3,29 (m, 2H, Hl), 2,73 - 2,57 (m, 6H, H2, H3, H4), 2,2 - 2,36 (m, 2H, H4'), 1,7 - 2 (m, 5H, H2', H7', H8'), 0,85 - 1,58 (m, 21H, Hl', H9', Hl 1', H12', H14-H17', H22'-H25'), 0,98 (3H, s, H-19'), 0,84 (d, J= 6,5 Hz, 3H, H2T), 0,8 (d, J = 6,5 Hz, 6H, H26' & H27') a 0,61 (s, 3H, H18'); MS (FAB⁺): m/z = 543 [M+Na]', 530 [M+H]⁺, 485 [M-CO₂]⁺, 369 [Cholf, 144 [M-Ochol]⁺, 69, 55.

4-aza-(Boc)-N⁶(cholesteryloxykarbonylamino)hexanol (5):

K roztoku sloučeniny 4 (26,1 g, 49 mmol), byl přidán Et₃N (8,3 ml, 1,1 ekv.) a Boc₂O (10,7 g,

1 ekv.) v CH₂C1₂) 200 ml) a reakce byla sledována TLC. Po ukončení byla reakční směs vlita do

NH4CI (100 ml), a byla promyta vodou a sušena (Na₂SO₄). Rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu za poskytnutí sloučeniny 5 jako bílé pevné látky. Rozpouštědlo bylo odstraněno za sníženého tlaku za poskytnutí sloučeniny jako bílé pevné látky, která po chromatografickém čištění (CH₂Cl₂/MeOH/NH₃ 92:7:1) poskytla sloučeninu 3. Výtěžek (27,9 g, 90 %); IR (CH₂CL₂): v_max =

3352,3054,2937, 1675, 1530, 1455, 1380, 1220, 1120;’HNMR (270 MHz, CDC1₃): δ = 5,33 5.35 (m, 1H, H6'), 4,86 (m, 1H, NH), 4,42 - 4,5 (1H, m, H3'), 3,62-3,7 (m, 2H, H5), 3,27-3,38 (m, 6H, Hl, H2, H3), 2,18-2,33 (m, 2H, H4'), 1,73 - 2 (m, 5H, H2', H7', H8'), 1,45 (s, 9H, Boc), 1 - 1,65 (m, 23H, H4, HT, H9', HIT, H12', H14'-H17', H22'-H25'), 0,97 (3H, s, H-19'), 0,93 (d, J= 6,5 Hz, 3H, H2T), 0,8 (d, J= 6,5 Hz, 6H, H26' & H27') a 0,65 (s, 3H, Hl 8'); MS (FAB⁺):

m/z = 654 [M+Na]⁺, 543 [M-Boc]⁺, 369 [Cholf, 145, 121, 95, 69, 57.

4-aza-(Boc)-N⁶-(cholesteryloxykarbonylamino)hexylmethansulfonát (6):

Tento experiment byl prováděn podobně jako příprava 2[(cholesteryloxykarbonyl)amino]ethyl35 methansulfonátu 3 v množství 44 mmol za poskytnutí sloučeniny 6. Výtěžek (28 g, 90 %); IR (CH₂C1₂): v_max = 3305, 2980, 2900, 2865, 1675, 1530, 1455, 1350, 1150; ’H NMR (270 MHz, (CDC1₃): δ 5,33 - 5,35 (m, 1H, H6'), 4,86 (m, 1H, NH), 4,35 - 4,55 (m, 1H, H3'), 4,22 (t, 2H, J= 6,5 Hz, H5), 3,2 - 3,4 (m, 6H, Hl, H2, H3), 3,01 (s, 3H, H6), 2,15 - 2,33 (m, 2H, H4'), 1,73 - 2 (m, 5H, H2', H7', H8'), 1,44 (s, 9H, Boc), 1 - 1,67 (m, 23H, H4, HT, H9', HIT, H12',

H14-H17', H22-H25'), 0,97 (3H, s, H-19'), 0,94 (d, J= 6,5 Hz, 3H, H2T), 0,8 (d, J= 6,5 Hz,

6H, H26' & H27') a 0,65 (s, 3H, H18'); MS (FAB⁺): m/z = 722 [M+Na]⁺, 609 [M-Boc]⁺, 369 [Cholf, 145, 121,95,69,55.

4-aza-(Boc)-N⁶ (cholesteryloxykarbonylamino)hexanamin (7):

Ke sloučenina 6 (25 g, 35 mmol), azidu sodnému (11,49 g, 175,7 mmol, 5 ekv.), a jodidu sodnému (5 g, 35 mmol, 1 ekv.) v atmosféře dusíku byl přidán za míchání vodný DMF (200 ml). Zahřívání pod zpětným chladičem při 80 °C po dobu 2 h vedlo ke ukončení reakce. Reakční směs byla ponechána ochladit na teplotu laboratoře, DMF byl odstraněn za sníženého tlaku a zbytek roz50 pouštěn v EtOAc. Směs byla promyta vodou (2 x 100 ml), roztokem soli (100 ml) a sušena (Na₂SO₄) za poskytnutí sloučeniny 7 po chromatografickém čištění (hexan/ether 1 : 1) jako bílé pevné látky. Výtěžek (22 g, 95 %); *H NMR (270 MHz, CDC1₃): δ = 5,34 - 5,35 (m, 1H, H6'),

4.35 - 4,55 (m, 1H, H3'), 4,25 (t, 2H, J= 6,5 Hz, H5), 3,2-3,5 (m, 6H, Hl, H2, H3), 2,25-2,33

-9CZ 298560 B6 (m, 2H, H4'), 1,7-2,05 (m, 5H, H2', H7', H8'), 1,45 (s, 9H, Boc), 1-1,72 (m, 23H, H4, HT, H9', Hll', H12', H14-H17', H22'-H25'), 0,98 (3H, s, H19'), 0,94 (d, J= 6,5 Hz, 3H, H2T), 0,83 (d, J= 6,5 Hz, 6H, H26' & H27') a 0,64 (s, 3H, H18'); MS (FAB⁺): m/z = 568 [M+Na-Boc]⁺, 556 [M-Boc]⁺, 369 [Chol]⁺, 145, 121, 95, 69, 57.

4-aza-(Boc)-N⁶(cholesteryloxykarbonylamino)hexylamin (8):

Do kulové baňky se sloučeninou 7 (22,75 g, 34,6 mmol) v THF (230 ml) byl přidán trimethylfosfin v THF (1 M, 40 ml, 1,15 ekv.) a reakční směs byla monitorována TLC. Po ukončení reakce byla reakční směs míchána s vodou (3 ml) a vodným amoniakem (3 ml) po dobu lh a rozpouštědlo bylo odstraněno za sníženého tlaku. Po čištění chromatografií (CH₂Cl₂/MeOH/NH₃ 92 : 7 : 1 až 75 : 22 : 3) byla získána sloučenina 8 jako bílé krystaly. Výtěžek (19,1 g, 88%); IR (CH₂C1₂): v_max = 3689, 3456,3155,2948, 2907, 2869, 2253, 1793, 1709, 1512, 1468, 1381, 1168; *H NMR (270 MHz, CDC1₃): δ 5,32 - 5,35 (m, 1H, H6'), 4,35-4,51 (m, 1H, H3'), 3,45 - 3,05 (m,

8H, Hl, H2, H3, H5), 2,18 - 2,4 (m, 2H, H4'), 1,8 - 2,1 (m, 5H, H2', H7, H8', 1,46 (s, 9H, Boc),

1,01-1,72 (m, 23H, H4, Hl', H9', HIT, H12', H14'-H17', H22', H25'), 0,97 (3H, s, H-19'), 0,85 (d, J= 6,5 Hz, 3H, H2T), 0,82 (d, J = 6,5 Hz, 6H, H26' & H27') a 0,64 (s, 3H, H18'); MS (FAB⁺): m/z = 630 [M+H]⁺, 530 [M-Boc]⁺, 369 [Chol]⁺, 145, 121, 95, 69, 57.

(Boc)aminooxyoctová kyselina (9):

O-(Karboxymethyl)hydroxylaminhemihydrochlorid (1,16 g, 5,3 mmol) byl rozpuštěn v CH₂C1₂ (40 ml) a pH bylo nastaveno na 9 přídavkem triethylaminu (3 ml). Potom byl přidán di-ter-butyldikarbonát (2,36 g, 10,6 m mol, 2,0 ekv.) a směs byla míchána při teplotě laboratoře až do zjištění ukončení reakce TLC. pH bylo sníženo na 3 přidáním zředěné HC1. Reakční směs byla rozdělena mezi nasycený vodný NH₄C1 (20 ml) a CH₂C1₂ (30 ml). Vodná fáze byla extrahována CH₂C1₂ (3 x 100 ml). Spojené organické extrakty byly promyty H₂O (2 x 100 ml) a sušeny (Na₂SO4). Rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu za získání sloučeniny 9 jako bílé pevné látky. Výtěžek (1,86 g, 97%); IR (CH₂C1₂): v_max = 373, 2983, 2574, 2461, 1724, 1413, 1369, 1235;

’HNMR (270 MHz, CDC1₃): δ 4,48 (s, 2H, CH2), 1,48 (s, 9H, Boc); MS (FAB)⁺: m/z = 214 [M+Na]⁺, 192, [M+H]⁺, 135, 123, 109, 69.

(Boc)aminooxysloučenina (10):

N-hydroxysukcinimid (0,36 g, 3,13 mmol, 1 ekv.), sloučenina 9 (0,6 g, 3,13 mmol, 1 ekv.), a N,N'-dicyklohexylkarbodiimid (0,68 g 3,13 mmol., 1 ekv.) byly rozpuštěny v ETOAc (90 ml), a heterogenní směs byla ponechána míchat při teplotě laboratoře přes noc. Směs byla potom zfíltrována přes lože materiálu Celite® pro odstranění dicyklohexylmočoviny, která se vytvořila jako bílá sraženina (oplach 60 ml EtOAc), a přidá k roztoku sloučeniny 8 (1,97 g, 3,13 mmol,

1 ekv.) v THF (10 ml). Při této heterogenní reakci bylo udržováno pH 8 přidáváním triethylaminu (6 ml). Získaná směs byla ponechána míchat při teplotě laboratoře přes noc. Po ukončení reakce byla směs zfíltrována a rozpouštědlo bylo odstraněno za sníženého tlaku za poskytnutí sloučeniny 10 po čištění bleskovou chromatografií (CH₂Cl₂/MeOH/NH₃ 92: 7:1) jako bílé pevné látky. Výtěžek (2,3 g 90 %); ’H NMR (270 MHz, CDC1₃): δ 5,33 - 5,35 (m, 1H, H6'), 4,4M,52 (m, 1H,

H3'), 4,3 (s, 2H, H90, 3,2 - 3,42 (m, 8H, Hl, H2, H4, H6), 2,23 - 2,35 (m, 2H, H4'), 1,7 - 2,1 (m, 7H, H2', H7', H8', H5), 1,44-1,46 (m, 18H, 2 Boc), 1-1,73 (m, 21H, HT, H9', HIT, H12', H14-H17', H22-H25'), 0,98 (3H, s, H-19'), 0,85 (d, /= 6,5 Hz, 3H, H2T), 0,83 (d, J= 6,5 Hz, 6H, H26' & H27') a 0,65 (s, 3H, H18'); MS (FAB)⁺: m/z = 803 [M+H]⁺, 703 [M-Boc]⁺, 647, 603 [M-2Boc]⁺, 369, 279, 255, 235, 204, 145, 95, 69.

-10CZ 298560 B6

Hydroxylamin (11):

K roztoku sloučeniny 10 (1,1 g, 1,36 mmol, 1 ekv.) v CH₂C1₂ (10 ml) byla přidána TFA (2 ml, 204 mmol, 15 ekv.) při 0 °C. Roztok byl ponechán míchat při teplotě laboratoře 5 h. Po ukončení reakce byl přidán toluen pro azeotropní odstranění TFA z reakční směsi. Rozpouštědla byla odstraněna ve vakuu za získání, po chromatografickém čištění (CH₂Cl₂/MeOH/NH₃ 92:7:1 až 75:22:3), sloučeniny 11 jako bílé pevné látky (709 mg, výtěžek: 86 %); IR (CHC1₃): v_max = 3306, 2948, 2850, 2246, 1698, 1647, 1541, 1467, 1253, 1133; ’H NMR (270 MHz, CDC1₃): δ 5,26 5,4 (m, 1H, H6'), 4,4 - 4,52 (m, 1H, H3'), 4,12 (s, 2H, H9), 3,34-3,41 (m, 2, H2), 3,15 - 3,3 (m, io 2H, H4), 2,6 - 2,74 (m, 4H, H1 & H6), 2,14 - 2,39 (m, 2H, H4'), 1,62 - 2,1 (m, 7H, H2', H7', H8', H5), 1,02 - 1,6 (m, 21H, HT, H9', HIT, H12', H14'-H17', H22'-H25'), 0,96 (3H, s, H19'), 0,86 (d, /= 6,5 Hz, 3H, H2T), 0,83 (d, J= 6,5 Hz, 6H, H26' & H27') a 0,66 (s, 3H, H18');

MS (FAB⁺): m/z = 603 [M+H]⁺, 369 [Chol]⁺, 160, 137, 109, 95, 81, 69, 55.

Mannosylová sloučenina (12a):

Roztok D-manosy (266 mg, 4,8 mmol) v acetátovém vodném pufru (octan sodný/kyselina octová (0,1 m, pH 4, 7 ml) a roztok sloučeniny 11 (290 mg, 0,48 mmol, 10 ekv.), v DMF (7 ml) byl smísen a směs byla míchána 3 dny při teplotě laboratoře. Rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu lyofilizací a chromatografie (CH₂Cl₂/MeOH/NH₃ 75 : 22 : 3) poskytla produkt 21 jako bílou pevnou látku (233 mg, výtěžek: 65 %). Čistota byla dále potvrzena HLC. Konečný produkt obsahoval β-pyranosovou (82 %) formu a a-pyranosovou (18 %), formu, které nebyly izolovány, ale charakterizovány ve směsi. MS (FAB⁺): m/z = 765 [M+H]⁺, 787 [M+Na]⁺, 397, 369 [Chol]⁺, 322, 240, 121, 109, 95, 81, 69, 57. β-pyranosová forma. ^!H NMR (400 MHz,

CD₃OD/CDC1₃ [75/25]): δ = 7,64 - 7,62 (d, Vi_a__2a= 7 Hz, 1H, Hla), 5,35 - 5,36 (m, 1H, H6'), 4,45 - 4,5 (s, 2H, 9H), 4,35 - 4,5 (1H, H3'), 4,19 - 4,24 (dd, 1H, H2a, ³Jla_2a = 7,4 Hz, ³J2a-3a = l,l Hz), 3,81 - 3,9 (m, 1H, H3a), 3,73 - 3,8 (m, 2H, H4a, Hó^), 3,63-3,71 (m, 2H, H5a, Heq6a), 3,34-3,42 (m, 2H, H2), 3,27-3,30 (m, 2H, H4), 3-3,08 (m, 2H, Hl), 2,9-2,98 (m, 2H, H6), 2,25-2,35 (m, 2H, H 4'), 1,78-2,07 (m, 7H, 2H', H7', H8', H5), 1,03 -1,65 (m, 21H,

HT, H9', HIT, H12', H14'-H17', H22'-H25'), 1,01 (3H, s, H-19'), 0,91 (d, J = 6,5 Hz, 3H, H2T), 0,85 (d, J = 6,5 Hz, 6H, H26' & H27') a 0,69 (s, 3H, H18'), ¹³C NMR (400 MHz, CDC1₃/CD₃OD [25/75]): 12,33 (Cl8'), 19,20 (C2T), 19,74 (Cl9'), 21,91 (CIT), 22,91 (C27'), 23,17 (C26'), 24,67 (C23'), 25,07 (C15'), 27,37 (C5), 28,85 (C25'), 28,96 (C2'), 29,07 (C12'), 32,76 (C7'), 32,87 (C8'), 36,38 (C2), 36,78 (C20', 37,09 (Cl), 37,76 (C22'),37,95 (CT), 38,4 (C4), 39,36 (C4'), 40,41 (C24'), 40,76 (C16'), 40,16 (C6), 51,19 (C9'), 57,19 (C17'), 57,57 (C14'), 64,62 (C6a), 70,19 (C2a), 70,58 (C2a), 72,12 (C3a), 72,37 (C5a), 73,11 (C9), 75,91 (C3'), 123,39 (C6'), 140,72 (C5'), 155,02 (Cla), 158,69 (NHCOOChol), 173,1 (C8); a-pyranosová forma: identické údaje kromě: *H NMR (400 MHz, CD₃OD/CDC1₃ [75/25]): δ = 6,90 - 6,88 (d, ³Jla_2a = 7 Hz, 1H, Hla), 5-5,05 (dd, 1H, H2a, ³JU 2a = 7,3 Hz, ³J_2a__3a = 7,6 Hz); ¹³C NMR (400 MHz, CDC1₃/CD₃OD [25/75]): 65,33 (C2a), 155,79 (Cla). ^!H NMR (400, CD₃OD/CDC1₃ [75/25]): (m, 1H H3') chybí, pod vrcholem rozpouštědla; potvrzeno 'HNMR (300 MHz, DMSO): δ 4,67 - 4,82 (m, 1H, H3'). ¹³C NMR (400 MHz, CDC1₃/CD₃OD [25/75]): Cl chybí, pod vrcholem MeOH potvrzeno korelací 'H/¹³C při 400 MHz, kolem 49. Přiřazené protonové rezonance bylo potvrzeno ’H gradientem typu DQF-COSY a TOCSY; Pro jednoznačné přiřazení rezonancí uhlíku byly použity korelace 'H/¹³C a DEPT 135. α-pyranosová forma poskytla ’j¹³Cla-Hla = 177 Hz a β-pyranosová forma poskytla './^l3Cla-Hla = 167 Hz. Koncentrace byla potvrzena 'H fázově senzitivní NOESY.

Glukosylová sloučenina (12b):

Tato sloučenina byla připravena s roztokem D-glukosy (150 mg, 0,82 mmol) a sloučeniny 11 (100 mg, 0,16 mmol) podobným způsobem jako při přípravě sloučeniny 12a, byla míchána 1 den a chromatograficky čištěna (CH₂Cl₂/MeOH/NH₃ 75 : 22 : 3) za získání produktu 12b jako bílé

- 11 CZ 298560 B6 pevné látky (103 mg, výtěžek: 82 %). Čistota byla dále potvrzena HPLC. Konečný produkt obsahoval α-pyranosový anomer (11 %) a β-pyranosový anomer (89 %) které nebyly izolovány, ale charakterizovány ve směsi. (FAB⁺): m/z = 765 [M+H]⁺, 787 [M+Na]⁺, 391, 369 [Chol]⁺, 309, 290, 171, 152, 135, 123, 109, 95, 81, 69; β-pyranosová forma·. (300 MHz, CDC1₃/CD₃OD [90/10]): δ 7,53 - 7,56 (d, J= 5,6 Hz, 1H, Hla), 5,26 - 5,36 (m, 1H, H6'), 4,2 - 4,45 (m, 3H, H9,

H3'), 4,05 - 4,15 (m, 1H, H2a), 3,45 - 3,85 (m, 5H), H6a, H3a, H5a, H4a), 2,9 - 3,4 (m, 2H, H4, MeOH), 2,9 - 3,15 (m, 4H, Hl, H6), 2,15 - 2,3 (m, 2H, H4'), 1,65 - 2 (m, 5H, H2', H7', H8'), 0,95 - 1,55 (m, 23H, H5, Hl', H9', Hll', H12', H14'-H17', H22'-H25'), 0,93 (3H, s, H-19'), 0,84 (d, J= 6,5 Hz, 3H, H2T), 0,78 (d, J= 6,5 Hz, 6H, H26' & H27') a 0,62 (s, 3H, H18'); ío a-pyranosová forma, identická data, kromě: ^!H NMR (300 MHz, CDC1₃/CD₃OD [90/10]): δ 7,22 - 7,24 (d, J= 6,61 Hz, 1Z, Hla), 4,95 - 5,07 (m, 1H, H2a); Ή NMR (300 MHz, CD₃OD): (m, 1H, H3') chybí, pravděpodobně pod vrcholem rozpouštědla; potvrzeno *H NMR (300 MHz,

DMSO): δ = 4,7 - 4,86 (m, 1H, H3').

Galaktosylová sloučenina (12c):

Tato sloučenina byla připravena s roztokem D-galaktosy (50 mg, 0,27 mmol) a sloučeniny 11 (40 mg, 0,066 mmol) podobným způsobem jako při přípravě 12a, byla míchána 1 den a chromatograficky čištěna (CH₂Cl₂/MeOH/NH₃ 75 : 22 : 3) za získání produktu 12c jako bílé pevné látky (35 mg, výtěžek: 70 %). Čistota byla dále potvrzena HPLC. Konečný produkt obsahoval a-pyranosovou (15 %) formu a β-pyranosovou (85 %) formu, které nebyly izolovány, ale charakterizovány ve směsi. MS (FAB⁺): m/z = 765 [M+H]⁺, 588, 391, 369 [Chol]⁺, 322, 290, 165, 152, 135, 121, 109, 95, 81, 69; β-pyranosová forma: 'H NMR (270 MHZ, DMSO): δ = 7,78 - 7,82 (m, 1H, NHCO uhlíku C8), 7,55-7,58 (d, J= 7,2 Hz, 1H, Hla), 6,95 - 7,1 (m, 1H, NHCOOChol),

5,25 - 5,37 (m, 1H, H6'), 4,2 - 4,43 (m, m, 3H, H9, H3'), 3,2 - 3,9 (m, H2a, H6a, H3a, H5a,

H4a, OH), 2,9 - 3,18 (m, 4H, H2, H4), 2,42,65 (m, 4H, Hl, H6), 2,15 - 2,3 (m, 2H, H4'), 1,67 2 (m, 5H, H2', H7', H8'), 0,92 - 1,6 (m, 23H, H5, Hl', H9', Hll', H12', H14'-H17', H22'-H25'), 0,96 (3H, S, H-19'), 0,89 (d, J= 6,5 Hz, 3H, H21'), 0,84 (d, J = 6,5 Hz, 6H, H26' & H27') a 0,65 (s, 3H, H18'). a-pyranosová forma: stejná data, kromě: ’H NMR (270 MHz, DMSO): 6,86 30 6,88 (d, J= 6 Hz, 1H, Hla).

Glukuronová sloučenina (12d):

Tato sloučenina byla připravena s roztokem D-glukuronové kyseliny ve formě monohydrátu sod35 né soli (30 mg, 0,128 mmol, 1,5 ekv.) a sloučeniny 11 (50 mg, 0,08 mmol) podobným způsobem jako bylo popsáno při přípravě sloučeniny 12a, byla míchána 1 den, chromatograficky čištěna (CH₂Cl₂/MeOH/NH₃ 75 : 22 : 3) za získání sodné soli sloučeniny 12d jako bílé pevné látky (41 mg, výtěžek: 60 %). Čistota byla dále potvrzena HPLC. Konečný produkt obsahoval a-pyranosovou (85 %) formu a β-pyranosovou (15 %) formu které nebyly izolovány, ale charakterizo40 vány ve směsi. MS (FAB⁺): m/z = ΊΊ9 [M+H]⁺, 733, 588, 411, 369 [Chol]⁺, 336, 290, 240, 214, 159, 145, 135, 121, 109, 95, 81, 69, 55, β-pyranosová forma:^}W NMR (300 MHz, CDC1₃/CD₃OD [75/25]): δ = 7,51 - 7,53 (d, J= 5,9 Hz, 1H, Hla), 5,25 - 5,33 (m, 1H, H6'), 4,2 4,45 (m, 3H, H9, H3'), 3,8 - 4,1 (m, 3H, H2a, H3a, H4a), 3,6 - 3,75 (m, 1H, H5a), 3,2 - 3,55 (m, H2, H4, MeOH), 2,7-3,15 (m, 4H, Hl, H6), 2,18-2,32 (m, 2H, H4'), 1,62 - 2 (m, 5H, H2',

H7', H8'), 0,9-1,6 (m, 23H, H5, Hl', H9', Hll', H12', H14'-H17', H22', H25'), 0,93 (3H, s, H19'), 0,83 (d, J= 6,5 Hz, 3H, H21'), 0,77 (d, J= 6,5 Hz, 6H, H26' & H27') a 0,6 (s, 3H, Hl 8')); or-pyranosová forma: stejná data, kromě ^!H NMR (300 MHz, CD₃OD): δ 7,22- 7,24 (d, </ = 6,3 Hz, 1H, Hla), 5 - 5,1 (m, 1H, H2a).

- 12CZ 298560 B6 β-D-Laktosylová sloučenina (12e):

Roztok β-D-laktosy, obsahující 25 až 30 % a (1,13 g, 3,3 mmol) a 11 (200 mg, 0,33 mmol) ve 14 ml vodného pufru DMF/acetát byla míchána 4 dny při teplotě laboratoře. Rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu lyofilizací a chromatografie (CFFCF/MeOH/NFF 75 : 22 : 3) poskytla produkt 12e jako bílou pevnou látku (145 mg, výtěžek: 47 %).Cistota byla dále potvrzena HPLC. Konečný produkt obsahoval a-pyranosovou (15 %) formu a β-pyranosovou (85 %) formu (samy s obsahem 25 % α-laktosy), které nebyly izolovány, ale charakterizovány ve směsi. MS (FAB⁺): m/z = 927 [M+H]⁺, 588, 482, 369 [Chol]⁺, 290, 243, 216, 178, 152, 135, 121, 109, 95, 81, 69, 55;

β-pyranosová forma: ’H NMR (400 MHz, CDC1₃/CD₃OD [20/80]): δ = 7,69 - 7,71 (d, ³J_{la 2a} =

5.8 Hz, 1 H, Hla β-laktosy), 7,66 - 7,68 (d, ³J_]a__2a = 6,2 Hz, 1H, Hla a-laktosy), 5,35 - 5,37 (m, 1H, H6'), 4,37 - 4,6 (m, 4H, H9, H3', H2a), 4,2 - 4,37 (m, 1H, Hlb), 3,65 - 4,05 (m, 7 H, H3a, H4a, H5a, H4b, H5b, H6b), 3,25 - 3,6 (m, 8H, H2, H4, H6a, H2b, H3b, MeOH), 3 - 3,2 (m, 4H, Hl, H6), 2,25 - 2,42 (m, 2H, H4'), 1,8 - 2,15 (m, 5H, H2', H7', H8'), 1-1,65 (m, 23H, H5, Hl',

H9', Hll', H12', H14'-H17', H22'-H25'), 1,01 (3H, s, H-19'), 0,91 (d, J= 6,5 Hz, 3H, H21'),

0,85 (d, J= 6,5 Hz, 6H, H26' & H27') a 0,69 (s, 3H, Hl 8'); ¹³C NMR (400 MHz, CDC13/CD3OD [20/80]): ¹³C NMR (400 MHz, CDC13/CD₃OD [20/80]): 12,32 (Cl8'), 19,2 (C21'), 19,76 (C19'), 21,94 (Cil'), 22,91 (C27'), 23,17 (C26'), 24,7 (C23'), 25,1 (C15'), 27,22 (C5), 28.89 (C25'), 29 (C2'), 29,1 (C12'), 32,8 (C7'), 32,92 (C8'), 36,29 (C22'), 36,81 (CIO'), 37,12 (Cl'), 37,99 (C6),

38,11 (Cl), 39,48 (C2), 40,45 (C24'), 40,80 (C16'), 46,13 (C4'), 51,23 (C9'), 57,22 (C17'), 57,80 (C14'), 62,41 (C6a), 63,4 (C6a), 70,02 (C5b), 70,63 (C2a), 72,8 (C3a), 73 (C3'), 73,18 (C9), 74,75 (C2b), 76,8 (C3a), 81 (C4b), 92,39 (Clb), 105,2 (C3'), 123,42 (C6'), 140,72 (C5'), 154,8 (Cla), 156,2 (NHCOOChol), 173,17 (C8). a-pyranosová forma: stejná data, kromě ’H NMR (400 MHz, CD₃OD/CDC1₃ [80/20]): δ_Η = 7,04 - 7,05 (d, ³J,_{a 2a} = 5,6 Hz, 1H, Hla), 5,05 - 5,07 (m, 1H, H2a), 4,09 - 4,11 (m, 1H, H3a); 'H NMR (270 MHz, CD₃OD): (m, 1H, H3') chybí, pravděpodobně pod vrcholem rozpouštědla; potvrzeno *HNMR (300 MHz, DMSO): δ = 4,7 4,85 (m, 1H, H3'). Přiřazení protonové rezonance byla potvrzena DQF-COSY a TOCSY *H gradientového typu; Pro jednoznačné přiřazení rezonancí uhlíku byly použity 'H/^C korelace a DEPT 135. Konformace byla potvrzena 'H fázově senzitivní NOESY.

Maltosylová sloučenina (12f):

Tato sloučenina byla připravena s roztokem D-maltosy jako monohydrátu (30 mg, 1,8 mmol, 5 ekv.) a sloučeniny 11 (100 mg, 0,16 mmol) podobným způsobem jako bylo popsáno při přípra35 vě sloučeniny 12e, byla míchána 1 den a chromatograficky čištěna (CH₂Cl₂/MeOH/NH₃ 75 : 22 : 3) za získání sloučeniny 12f jako bílé pevné látky (100 mg, výtěžek: 65 %). Čistota byla dále potvrzena HPLC. Konečný produkt obsahoval a-pyranosovou (87 %) formu a β- pyranosovou (13 %) formu které nebyly izolovány, ale charakterizovány ve směsi. MS (FAB⁺): m/z = 927 [M+H]⁺, 765, 588, 559, 484, 369 [Chol]⁺, 322, 290, 213, 167, 161, 143, 135, 121, 109, 95, 81, 69,

55. β-pyranosová forma: ^]H NMR (300 MHz, CDC13/CD3OD [80/20]): δ 7,55 - 7,57 (d, ³./|a -_2a =

5,3 Hz, 1H, Hla), 5,3 (s, 1H, H6'), 4,85 - 5,02 (m, 1H, H3'), 4,09 - 4,22 (m, 1H, Hlb), 3,57 - 4 (m, 7 H, H3a, H4a, H5a, H4b, H5b, H6b), 3,2 - 3,6 (m, 8H, H2, H4, H6a, H2b, H3b, MeOH),

2.8 - 3,1 (m, 4H, Hl, H6), 2,1 - 2,36 (m, 2H, H4'), 1,6 - 2,05 (m, 5H, H2', H7', H8'), 1 - 1,6 (m, 23H, H5, Hl', H9', Hll', H12', H14'-H17', H22', H25'), 0,93 (3H, s, H-19'), 0,83 (d, J= 6,5 Hz,

3H, H21'), 0,78 (d, J= 6,5 Hz, 6H, H26' & H27') a 0,6 (s, 3H, Hl 8'); a-pyranosová forma·.

stejná data, kromě ^]H NMR (300 MHz, CD₃OD/CDC1₃ [80/20]): δ_Η = 6,92 - 6,94 (d, J= 4,62 Hz, 1H, Hla), 5,02 - 5,15 (m, 1H, H2a), 4,04 - 4,08 (m, 1H, H3a).

Maltotriosylová sloučenina (12g):

Tato sloučenina byla připravena s roztokem maltotriosy (246,4 mg, 0,46 mmol, 7 ekv.) a sloučeniny 11 (40 mg, 0,066 mmol) podobným způsobem jako bylo popsáno při přípravě sloučeniny 12e, byla míchána 5 dnů a chromatograficky čištěna (CH₂Cl₂/MeOH/NH₃ 75 : 22 : 3) za získání

- 13 CZ 298560 B6 sloučeniny 12f jako bílé pevné látky (61 mg, výtěžek: 85 %). Čistota byla dále potvrzena HPLC. Konečný produkt obsahoval ot-pyranosovou (15 %) formu a β-pyranosovou (85 %) formu, které nebyly izolovány, ale charakterizovány ve směsi. MS (FAB⁺): m/z = 1111 [M+Na] ⁺, 1089 [M+H]⁺, 588, 423, 391, 369 [Chol]⁺, 240, 171, 159, 145, 121, 105, 95, 81, 69; β-pyranosová forma·. ’H NMR (300 MHz, CD₃Cl₃/MeOH [20/80]): δ = 7,56 - 7,58 (d, J= 6 Hz, 1H, Hla), 5,2 - 5,27 (m, 1H, H6'), 4,9 - 4,95 (m, 1H, H3'), 4,2 - 4,45 (m, 4H, H9, H3', H2a), 4,05 - 4,2 (m, 2H, Hlb, Hic), 2,95 - 4 (m, 21 H, H2, H4, H6a, H3a, H5a, H4a, H2b-6b, H2c-6c, MeOH),

2,85 - 2,95 (m, 4H, Hl, H6), 2,2 - 2,3 (m, 2H, H4'), 1,8-2,1 (m, 5H, H2', H7', H8'), 0,98 - 1,6 (m, 23H, H5, Hl', H9', Hl 1', H12', H14'-H17', H22'-H25'), 0,94 (3H, s, H-19'), 0,84 (d, J= 6,5 io Hz, 3H, Η2Γ), 0,78 (d, J= 6,5 Hz, 6H, H26' & H27') a 0,61 (s, 3H, Hl 8'); a-pyranosováforma·. stejná data, kromě ’H NMR (300 MHz, CD₃Cl₃/MeOH [20/80]): δ = 6,85 (d, J = 5,6 Hz, 1 H,

Hla).

Maltotetraosylová sloučenina (12h):

Tato sloučenina byla připravena s roztokem D-maltotetraosy (200 mg, 0,3030 mmol) a sloučeniny 11 (80 mg, 0,133 mmol, byla míchána 5 dnů a chromatografícky čištěna (CH₂Cl₂/MeOH/NH₃ 75 : 22 : 3) za získání sloučeniny 12h jako bílé pevné látky (67,5 mg, výtěžek: 41 %). Čistota byla dále potvrzena HPLC. Konečný produkt obsahoval a-pyranosovou (15 %) formu a β-pyra20 nosovou (85 %) formu které nebyly izolovány, ale charakterizovány ve směsi. MS (FAB⁺): m/z = 1273 [M+Na]⁺, 1251 [M+H]⁺, 588,369 [Chol]⁺, 159, 145, 121, 109, 95, 81, 69; HRMS (FAB⁺) C59H102N4O24Na: [M+Na]⁺ vypočteno 1273,6782, nalezeno 1273,6821. β-pyranosová forma·. ’H NMR (300 MHz, CD3Cl₃/MeOH [20/80]): δ= 7,56 - 7,58 (d, 1H, Hla), 5,15-5,25 (m, 1H, H6'), 4,95 - 5,1 (m, 1H, H3'), 4,38 - 4,5 (m, 4H, H9, H3', H2a), 4,04 - 4,22 (m, 3H, Hlb, Hic,

Hld), 3,1 - 3,95 (m, 27H, H2, H4, H6a, H3a, H5a, H4a, H2b-6b, H2c-6c, H2d-6d, MeOH),

2,85 - 3,1 (m, 4H, Hl, H6), 2,2 - 2,33 (m, 2H, H4'), 1,75 - 2,1 (m, 5H, H2', H7', H8'), 1-1,6 (m, 23H, H5, Hl', H9', Hl 1', H12', H14'-H17', H22'-H25'), 0,92 (3H, s, H-19'), 0,82 (d, J= 6,5 Hz, 3H, H21'), 0,78 (d, J= 6,5 Hz, 6H, H26' & H27') a 0,68 (s, 3H, Hl 8'); a-pyranosová forma·. stejná data, kromě ’H NMR (300 MHz, CD₃Cl₃/MeOH [20/80]): δ = 7 (d, 1H, Hla).

Maltoheptaosylová sloučenina (12i):

Tato sloučenina byla připravena s roztokem D-maltoheptaosy (100 mg, 0,08673 mmol) a sloučeniny 11 (30 mg, 0,0497 mmol), byla míchána 7 dnů a chromatografícky čištěna (CH₂Cl₂/MeOH/NH₃ 75 : 22 : 3) za získání sloučeniny 12i jako bílé pevné látky (46 mg, výtěžek: 53 %). Čistota byla dále potvrzena HPLC. Konečný produkt obsahoval a-pyranosovou (15 %) formu a β-pyranosovou (85 %) formu, které nebyly izolovány, ale charakterizovány ve směsi. MS (FAB⁺): m/z = 1759 [M+Na]⁺. 1737 [M+H]⁺, 369 [Chol]⁺. 145, 121, 109, 95, 81. βpyranosová forma·. ’H NMR (300 MHz, CD₃Cl₃/MeOH [20/80]): δ = 7,53 - 7,58 (d, 1H, Hla),

5,35 - 5,37 (m, 1H, H6'), 4,97 - 5,12 (m, 1H, H3'), 4,45 - 4,6 (m, 4H, H9, H3', H2a), 4 - 4,5 (m,6H, Hlb, Hlc-g), 3,1 - 3,9 (m, 45H, H2, H4, H6a, H3a, H5a, H4a, H2b-6b, H2c-6c, H2d-6d, H2e-6e, H2f-6f, H2g-6 g, MeOH), 2,7 - 3 (m, 4H, Hl, H6), 2,15 - 2,35 (m, 2H, H4'), 1,7- 2,1 (m, 5H, H2', H7', H8'), 1 - 1,6 (m, 23H, H5, Hl', H9', Hll', H12', H14'-H17', H22-H25'), 0,94 (3H, s, H-19'), 0,84 (d, J= 6,5 Hz, 3H, H21'), 0,77 (d, J= 6,5 Hz, 6H, H26' &

H27') a 0,63 (s, 3H, H18'); ar-pyranosová forma·, stejná data, kromě *H NMR (300 MHz,

CD₃Cl₃/MeOH [20/80]): δ = 6,9 (d, 1H, Hla).

- 14CZ 298560 B6

Biologické a biofyzikální hodnocení:

Obecné:

Dioleoylfosfatidylethanolamin (DOPE) byl získán od firmy Avanti Lipid (Alabaster, AL, USA). Plazmid pCMVss byl získán u firmy Bayou Biolabs (Harahan, LA, USA). DC-Chol byl syntetizován v naší laboratoři ^[27]. Mu-peptid byl syntetizován M. Kellerem standardní Fmoc Merrifieldovou reakcí na pevné fázi s použitím Wangovy pryskyřice ^[431. Všechny další chemikálie byly čistoty pro analýzu.

Příprava liposomů:

DC-Chol (7,5 mg, 15 mol) a DOPE (7,5 mg, 10 mmol) byly spojeny v dichlormethanu. Roztok byl převeden do kulové baňky (typicky 50 ml) a organické rozpouštědlo bylo odstraněno za sníženého tlaku (rotační odparka) za poskytnutí tenké lipidické vrstvy, která byla sušena 2 až 3 h ve vakuu. Potom byl do kulové baňky přidán 4 mM pufr HEPES, pH 7,2 (3 ml) pro hydrataci tenké lipidické vrstvy. Po krátké sonikaci (2 až 3 min) pod argonem byla získaná suspenze kationtových liposomů (koncentrace lipidu 5 mg/ml) extrudována na extrudéru (Northern lipid). Na začátku přes dva složené polykarbonátové filtry (0,2 pm) a potom desetkrát přes dva složené polykarbonátové filtry (0,1 pm) za vytvoření malých jednovrstevných kationtových liposomů (střední průměr 105 nm podle analýzy PCS). Koncentrace lipidů (přibližně 4 až 4,8 mg/ml) byly zjišťovány Stewartovým testem ^[44].

Příprava komplexů liposom:Mu:DNA (LMD) a liposom:DNA (LD):

Nejprve byly připraveny částice mu:DNA (MD) mícháním podle následujícího předpisu. Zásobní roztoky plazmidové DNA (typicky 1,2 mg/ml) byly přidávány k důkladně promíchávanému zředěnému roztoku peptidu mu (1 mg/ml) v 4mM HEPES pufru, pH 7,2. Konečný hmotnostní poměr mu:DNA byl 0,6 : 1 pokud se neuvádí jinak, a konečná koncentrace plazmidové DNA byla 0,27 mg/ml. Potom byly pomalu přidávány roztoky obsahující MD za důkladného míchání k suspenzím extrudovaných kationtových liposomů (typicky přibližně 4,5 mg/ml), připravených jak bylo popsáno výše, za vytvoření malých částic LMD s úzkou distribucí velikosti (120 ± 30 nm) podle měření PCS. Konečný hmotnostní poměr lipid:muDNA byl 12:0,6:1. Potom byl přidán roztok sacharosy (100%, hmotn./obj.) ve 4mM pufru HEPES, pH 7,2, za získání suspenzí částic LMD ve 4mM pufru HEPES, pH 7,2 obsahujících 10% hmotn./obj. sacharózu při požadované koncentraci DNA (konečná koncentrace DNA typicky 0,14 mg/ml) a směs byla uchovávána při -80 °C. Komplexy liposom:DNA (LD) (lipoplexy) byly pro experimenty připraveny s poměrem lipid:DNA 12:1 (hmotnostní) podle stejného protokolu bez přidání peptidu Mu.

Měření velikosti částic:

Velikosti lipoplexů byly vyhodnocována po 30 min expozici při 37 °C v biologickém médiu metodou fotonové korelační spektroskopie (N4 plus, Coulter). Zvolená konkrétní koncentrace DNA byla kompatibilní se stavem in vitro (1 pg/ml DNA). Byly použity následující parametry:

20 °C, 0,089 cP, reflexní index 1,33, úhel 90 °C, 632,8 nm. Pro vyhodnocení střední velikosti částic v médiu Optimem byla použita jednomodální analýza. Pro oddělení subpopulace malých částic séra menších než 50 nm byl použit algoritmus CONTIN a také pro extrakci vypočtené velikosti lipoplexů v mediu Optimem + 10% FCS.

Transfekce buněk HeLa:

Buňky byly zaočkovány ve 24jamkových kultivačních destičkách v médiu DMEM doplněném 10% FCS a pěstovány přibližně do 70% konfluence 24 h při 37 °C v přítomnosti 5% CO₂. Buňky byly promyty v PBS před přidáním transfekčního média do každé jamky (0,5 ml roztoku

0,50 nebo 100 % fetálního telecího séra v médiu Dubelco OptiMem). 5 μΐ při 100 pg/ml DNA

- 15 CZ 298560 B6 (nls Pgal) LMD bylo transfekováno na buňky Hela 30 min. Buňky byly potom třikrát opláchnuty PBS a inkubovány dalších 48 h v DMEM doplněném 10% FCS před testováním na expresi βGal použitím standardního testovacího kitu chemiluminescenčního reporterového genu (Roche Diagnostics, GmbH CatNo. 1 758 241).

Výsledky a diskuse:

Syntéza neoglykolipidů:

Každý člen cílové skupiny neoglykolipidů se skládal z lipidu nesoucího cholesterol a oligosacharidové molekuly vzájemně svázaných prostřednictvím linkeru. Celkový syntetický přístup byl rozdělen do dvou částí; nejprve probíhala syntéza lipidu obsahujícího linker a potom chemioselektivní vazba tohoto lipidu s molekulami cukru. Klíčem k této strategii je tvorba hydroxylaminu (Obr. 1).

Tato syntéza lipidu chráněného Boc (8) byla původně navržena na základě konvergentní metodologie s použitím snadno dostupných aminoalkoholů jako výchozích materiálů se strategií komplementární blokovací skupiny aminové skupiny. Dříve publikovaná metodologie umožnila s malou modifikací přípravu tohoto lipidu na bázi polyamidu pro přenos ^[2?I.

Jak bylo uvedeno výše, glykosylace hydroxylaminových derivátů poskytuje elegantní řešení požadavků na syntézu. Komerčně dostupný O-(karboxymethyl)hydroxylaminhydrochlorid byl nejprve chráněn Boc a potom ponechán reagovat s N-hydroxysukcinimidem a N,N'-dicyklohexylkarbodiimidem (DCC) za získání odpovídajícího aktivovaného esteru. Tato sloučenina byla ihned zpracována in šitu lipidem (8) v THF při pH 8, za získání chráněného hydroxylaminu. Po velmi přímočarém odstranění ochranných skupin vodnou kyselinou trifluoroctovou byla syntéza hydroxylaminového lipidu (11) ukončena.

V této fázi autoři vynálezu testovali schopnost jejich chemoselektivní vazby reakcí lipidu (11) s řadou komerčně dostupných nechráněných oligosacharidů. Tato reakce byla prováděna za mírných podmínek s použitím systému rozpouštědel DMF a pufru na bázi vodné kyseliny octové pH 4 (1 : 1), který umožnil rozpuštění jak cukru, tak i lipidu. Jak je ukázáno na obr. 2, reaktanty jsou v dynamické rovnováze s open chair protonovaným meziproduktem. Pro posunutí rovnováhy směrem ke tvorbě produktu byl přidán nadbytek cukru. V důsledku amfífílní povahy neoglykoli35 pidového produktu bylo zjištěno, že izolace v průběhu zpracování je obtížná, protože se tvoří micely a pěna. Problémy s rozpustností také ztěžovaly izolaci, čištění a analýzu. Doby reakce a výtěžky kolísaly v závislosti na použitém sacharidu (tabulka 1).

Tabulka 1. Výtěžky, reakční doby a diastereoselektivita glykosylace produktu 11.

Produkt	Cukr	Doby (dny)	Výtěžek (%)	β/α
12a	Mannosa	3	65	82/18
12b	Glukosa	1	80	89/11
12c	Galaktosa	1	70	85/15
12d	Glukuronová kyselina	1	60	85/15
12e	Laktosa	4	50	85/15
12f	Maltosa	1	65	87/13
12g	Maltotriosa	5	85	85/15
12h	Maltotetraosa	5	40	85/15
12i	Maltoheptaosa	7	55	85/15

- 16CZ 298560 B6

Konformace neoglykolipidu:

Konformace sacharidů mohou být zjišťovány metodou NMR v roztoku ^{[28 33)}. Nej lepší data pro zjištění konformace na anomemím centru (Cla) je pravděpodobně ¹J^,3Cla-Hla^[34’³⁵. Absolutní hodnota této vazebné konstanty závisí na orientaci vazby uhlík-vodík vzhledem k iontovému páru kyslíku kruhu, elektronegativně substituentu na Cl a povaze elektronegativních substituentů navázaných na zbytek molekuly. Rozdíl ¹J^I3C1H1 mezi a- a β-anomerem pyranos se může použít pro zjištění anomemí konfigurace. Je bezpečně zjištěno, že ’j (Cl-Hleq) > ’j(Cl-Hlax) s přibližným rozdílem 10 Hz. 'j(Cl-Hleq) je obvykle přibližně 170 Hz a ’j(Cl-Hlax) s přibližným rozdílem 160 Hz. Vyšší hodnoty se pozorují, jestliže se O-l zamění za prvek s vyšší elektronegativitou jako chlor nebo fluor, ale obvykle se pozoruje rozdíl 10 Hz [36]. Byly zkoumány konstanty vazby uhlík-vodík furanosidů a 'j(Cl-Hleq) > 'j(Cl-Hlax), ale rozdíl je mnohem menší (1-3 Hz).

Charakterizace bude diskutována na příkladu mannosy, ale stejný analytický postup byl použit i při jiné sacharidy, jestliže byly podmínky analýzy NMR výhodné. Je možno zviditelnit tři rozdílné struktury kruhu (obr. 3). Ze sférických důvodů je možno očekávat, že pyranosové formy budou výhodnější proti furanosovým kruhům. Tak ze dvou sloučenin pozorovaných NMR je hlavní pravděpodobně pyranosa. Sekundárně pozorovaná sloučenina nemohla být připisována mutarotační rovnováze, protože fázově citlivá NOESY neukázala zkřížený vrchol mezi dvěma signály Cla (důkaz, že jde o odlišnou molekulu). Proto nebyla tato forma připisována furanosové formě, protože nebyl pozorován žádný posun ¹³C5a a ¹³Cla nebyl odstíněn, jak bylo ukázáno, pro příbuzné substituované furanosové deriváty ^[331.

Autoři vynálezu naměřili 'j¹³Cla-Hla = 167 Hz pro hlavní sloučeninu a 'j¹³Cla-Hla = 177 Hz pro sekundární sloučeninu. Absolutní hodnota těchto signálů 'j¹³Cla-Hl je o 10 Hz vyšší, než by se dalo očekávat pro klasickou konformaci ⁴C_b ale to se vysvětluje extrémní elektronegativitou O-substituované hydroxylaminové skupiny, která by mohla mírně deformovat židličkovou strukturu. Pro pyranosové kruhy bylo zjištěno, že [¹J(Cla-Hleq)-¹J(Cl-Hlax)] « 10 Hz, a proto je možno snadno dojít k závěru, že hlavní sloučenina je anomer (Hlax) a sekundární sloučenina je anomer (Η 1 eq).

Tento závěr byl potvrzen 1H fázově senzitivní NOESY. Pro hlavní sloučeninu byl pozorován 35 jaderný Overhauserův efekt mezi Hla a H2a & H3a. Vezmeme-li v úvahu výše uvedenou podrobnou strukturu, tato sloučenina nemohla být a pyranosylovým anomerem, protože ekvatoriální

H1 nemůže v prostoru interagovat s H3, zatímco β anomer je zcela schopen poskytovat takové interakce. Pro Hla sekundární sloučeniny nebyl pozorován žádný jaderný Overhauserův efekt, ale to by mohlo být způsobeno nedostatečnou citlivostí. Proto došli autoři v souladu s údaji ana40 lýz ’j¹³Cl-Hl a NOESY k závěru, že byly vytvářeny dvě manosové pyranosové formy α/β (20/80).

Tento velmi podobný anomemí poměr (β/α) isomerů získaný pro neoglykolipidy není překvapivý (tabulka 1) u všech cukrů s ekvatoriálním hydroxylem v C2 kromě manosy. Poměr získaný pro tuto naposledy uvedenou sloučeninu je překvapivý, protože o β anomeru se obvykle uvádí, že je méně stericky výhodný než a anomer. Možné vysvětlení je, že tato reakce mohla být posouvána určitými sekundárními interakcemi (vodíkové vazby) mezi cukrem a hydroxylaminovým linkerem, stabilizujícími β anomer (to je v souladu s pozorováním, že signál NMR β anomeru je vždy více odstíněn než signál a anomeru). Neočekává se, že tato anomemí směs syntetizovaných glykolipidů bude ve velké míře ovlivňovat testované biologické vlastnosti liposomálních konstruktů, a proto se autoři nepokoušeli o namáhavou separaci těchto diastereomů preparativní vysokotlakou kapalinovou chromatografií.

- 17CZ 298560 B6

Biologické použití:

Glyko-modifikace LMD byla založena na přirozené schopnosti micelámí suspenze inkorporovat se do lipidových membrán ^[37’^38]. Nejprve byly podle standardního protokolu vytvořeny LMD a potom byla k LMD přidána suspenze syntetizovaných neoglykolipidových micel v pufru Hepes 4 mM pH 7 a směs byla inkubována 30 min při teplotě laboratoře před obvyklým uchováním při -80 °C. Na stabilizační účinky byla testována různá procenta vytvořených neoglykolipidů, ale pouze delší řetězec (maltotetraosy 12h a maltoheptaosa 12i) měl signifikantní vlastnosti při koncentraci menší než 10 % (údaje nejsou ukázány).

Stabilizační efekt neoglykolipidem modifikovaného LMD byl demonstrován inkorporací 7,5 mol % sloučeniny 12h nebo 12i. Je známo, že po vystavení soli nebo séru dochází k agregaci formulací založených na lipidových vrstvách liposomů ^[11,39’⁴⁰¹. Tento jev je možno sledovat měřením průměrného zvýšení velikosti částic po pevně stanoveném čase; jakákoli stabilizace částice LMD by se měla projevit jako snížení tohoto parametru. Tento jev byl zvolen pro měření velikosti lipoplexů fotonovou korelační spektroskopií (PCS) po 30 min vystavení při 37 °C médiu OptiMem nebo OptiMem + 10% FCS pro napodobení standardních podmínek in vitro. Při vyšších množstvích séra nebylo možno jev pomocí PCS analyzovat, protože podmínky byla tak extrémní, že neumožnily smysluplné měření. Obr. 4 popisuje procento zvýšení velikosti těchto lipoplexů.

Tyto výsledky jasně ukazují stabilizaci částice mezi LMD a standardní formulaci liposomů. Zavedení neoglykolipidů v koncentraci 7,5 % se ukázalo jako signifikantně prospěšné v médiu OptiMem a 10% séru. Jako nejúčinnější se ukázalo zavedení 12i. Tento výsledek ukazuje potřebu dlouhých sacharidových řetězců pro vytvoření účinných molekulárních kartáčových vrstev na povrchu těchto vrstev kationtových lipidů ^{[41, Sheik0,2001 # 119]}.

I v případech, kdy se ukáže určitý stupeň stabilizace, to obvykle vede ke snížení afinity kladně nabitého LMD k záporně nabité buněčné membráně, včetně poklesu transfekční schopnosti konstruktu. V tomto případě však výsledky transfekce in vitro ukázaly zvýšení účinnosti transfekce v důsledku modifikace neoglykolipidů v podmínkách 0% i 50% séra (obr. 5). Tento výsledek byl připisován krátkému dosahu ochranného účinku bránící neoglykolipidy těchto interakcí krátkého dosahu van der Waalsova typu mezi lipidovými dvojvrstvami podobných polarit, ale neovlivňuje nábojové interakce delšího dosahu mezi opačně nabitými membránami. Agregace indukovaná sérem je primárně založena na interakci LMD se záporně nabitými proteiny ^[42] a prospěšný účinek neoglykolipidů podle vynálezu byl také snížen zvýšenou koncentrací séra (žádný významný prospěšný účinek při 100% séru).

Všechny publikace uvedené v popisu jsou zařazeny odkazem. Odborníkům v oboru budou zřejmé různé modifikace a variace popisovaných způsobů a systému podle vynálezu, aniž by došlo k odchýlení od rozsahu a podstaty vynálezu. I když byl vynález popsán na určitých výhodných provedeních, není na tato provedení v rámci definice nároků omezen. Do rámce nároků jsou také zahrnuty různé modifikace popisovaných způsobů provádění vynálezu, které jsou zřejmé odborníkům v oboru biologie, chemie nebo příbuzných oborů.

- 18CZ 298560 B6 (I),

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (12)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Způsob výroby modifikovaného lipidu vzorce I

   Ri vyznačující se tím, že se ponechá reagovat (i) sloučenina vzorce II (H);a

   10 (ii) sloučenina vzorce III r₂ (III) ve směsi nebo v asociaci s nukleotidovou sekvencí nebo farmaceuticky aktivní látkou;

   kde B je lipid a A znamená sledovanou skupinu, MOI;

   kde X znamená případnou propojovací skupinu;

   kde R_t znamená atom vodíku nebo hydrokarbylovou skupinu; a

   20 kde R₂ znamená volný elektronový pár nebo R4, kde R4 znamená vhodný substituent.
2. 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že reakce se provádí ve vodném prostředí.

   25
3. 3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, v y z n a č u j í c í se t í m , že skupina X je přítomna.
4. 4. Způsob podle některého z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že skupina X je hydrokarbylová skupina.

   30 5. Způsob podle některého z nároků laž4, vyznačující se tím, že skupina R₂ je hydrokarbylová skupina.

   6. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že skupina R₂ je hydrokarbylová skupina obsahující případné heteroatomy zvolené ze skupiny O, N a atomy halogenu.

   -19CZ 298560 B6

   7. Způsob podle některého z nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že skupina R? je atom vodíku.

   8. Způsob podle některého z nároků laž7, vyznačující se tím, že skupina Ri je
5. 5 atom vodíku.
6. 9. Způsob podle některého z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že lipid je nebo obsahuje cholesterolovou skupinu.

   ío
7. 10. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že cholesterolová skupina je cholesterol.
8. 11. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že cholesterolová skupina je navázána na skupinu X karbamoylovou vazbou nebo etherovou vazbou.
9. 12. Způsob podle některého z nároků 1 až 11, vyznačující se tím, že lipid je navázán na skupinu X přes polyaminovou skupinu.
10. 13. Způsob podle nároku 12, vyznačující se tím, že polyaminová skupina není v pří20 rodě se vyskytující polyamin.
11. 14. Způsob podle nároku 12 nebo 13, vyznačující se tím, že alespoň dva aminy polyaminové skupiny jsou vzájemně oddělené ethylenovou skupinou -CH2-CH2-.

    25 15. Způsob podle nároku 12, vyznačující se tím, že polyamin je kterákoli z látek spermidin, spermin nebo kaldopentamin.

    16. Směs, vyznačující se tím, že obsahuje

    30 (i) sloučeninu vzorce II (Π), (III) a (iii) a nukleotidovou sekvenci nebo farmaceuticky aktivní látku; 35 kde B je lipid a A znamená sledovanou skupinu, MOI; kde X znamená případnou propojovací skupinu;

    40 kde R] znamená atom vodíku nebo hydrokarbylovou skupinu; a kde R₂ znamená volný elektronový pár nebo vhodný substituent.

    -20CZ 298560 B6

    17. Směs podle nároku 16, vyznačující se tím, že skupina X je přítomna.

    18. Směs podle některého z nároků 16 až 17, vyznačující se tím, že skupina X je hydrokarbylová skupina.

    19. Směs podle některého z nároků 16 až 18, vyznačující se tím, že skupina R₂ je hydrokarbylová skupina.

    20. Směs podle nároku 19, vyznačující se tím, že skupina R₂ je hydrokarbylová 10 skupina obsahující případné heteroatomy zvolené ze skupiny O, N a atomy halogenu.

    21. Směs podle některého z nároků 16 až 19, vyznačující se tím, že skupina R₂ je atom vodíku.
12. 15 22. Směs podle některého z nároků 16 až 21, vyznačující se tím, že skupina R] je atom vodíku.

    23. Směs podle některého z nároků 16 až 22, v yznačující se tím, že lipid je nebo obsahuje cholesterolovou skupinu.

    24. Směs podle nároku 23, vyznačující se tím, že cholesterolová skupina je cholesterol.

    25. Směs podle nároku 23, vyznačující se tím, že cholesterolová skupina je navázá25 na na skupinu X karbamoylovou vazbou nebo etherovou vazbou.

    26. Směs podle některého z nároků 16 až 25, vyznačující se tím, že lipid je navázán na skupinu X přes polyaminovou skupinu.

    30 27. Směs podle nároku 26, vyznačující se tím, že polyaminová skupina není v přírodě se vyskytující polyamin.

    28. Směs podle nároku 26 nebo 27, vyznačující se tím, že alespoň dva aminy polyaminové skupiny jsou vzájemně oddělené ethylenovou skupinou -CH₂-CH₂35

    29. Směs podle nároku 26, vyznačující se tím, že polyamin je kterákoli z látek spermidin, spermin nebo kaldopentamin.