CZ20031636A3 - Sloučenina schopná působení jako kationtový lipid - Google Patents

Sloučenina schopná působení jako kationtový lipid Download PDF

Info

Publication number
CZ20031636A3
CZ20031636A3 CZ20031636A CZ20031636A CZ20031636A3 CZ 20031636 A3 CZ20031636 A3 CZ 20031636A3 CZ 20031636 A CZ20031636 A CZ 20031636A CZ 20031636 A CZ20031636 A CZ 20031636A CZ 20031636 A3 CZ20031636 A3 CZ 20031636A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
compound
group
cationic liposome
polyamine
cholesterol
Prior art date
Application number
CZ20031636A
Other languages
English (en)
Inventor
Michael Jorgensen
Michael Keller
Andrew David Miller
Eric Perouzell
Original Assignee
Mitsubishi Chemical Corporation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from PCT/GB2000/004767 external-priority patent/WO2001048233A1/en
Priority claimed from GB0113781A external-priority patent/GB2372502B/en
Application filed by Mitsubishi Chemical Corporation filed Critical Mitsubishi Chemical Corporation
Publication of CZ20031636A3 publication Critical patent/CZ20031636A3/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/13—Amines
    • A61K31/15—Oximes (>C=N—O—); Hydrazines (>N—N<); Hydrazones (>N—N=) ; Imines (C—N=C)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/56—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids
    • A61K31/575—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids substituted in position 17 beta by a chain of three or more carbon atoms, e.g. cholane, cholestane, ergosterol, sitosterol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes or liposomes coated or grafted with polymers
    • A61K9/1272—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes or liposomes coated or grafted with polymers comprising non-phosphatidyl surfactants as bilayer-forming substances, e.g. cationic lipids or non-phosphatidyl liposomes coated or grafted with polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J41/00—Normal steroids containing one or more nitrogen atoms not belonging to a hetero ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J41/00—Normal steroids containing one or more nitrogen atoms not belonging to a hetero ring
    • C07J41/0033—Normal steroids containing one or more nitrogen atoms not belonging to a hetero ring not covered by C07J41/0005
    • C07J41/0055—Normal steroids containing one or more nitrogen atoms not belonging to a hetero ring not covered by C07J41/0005 the 17-beta position being substituted by an uninterrupted chain of at least three carbon atoms which may or may not be branched, e.g. cholane or cholestane derivatives, optionally cyclised, e.g. 17-beta-phenyl or 17-beta-furyl derivatives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/64—General methods for preparing the vector, for introducing it into the cell or for selecting the vector-containing host
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Description

Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká sloučeniny schopné působení jako kationtový lipid. Vynález se dále týká způsobu výroby této sloučeniny a použití sloučeniny v lékařství, zvláště při genové terapii a zejména při přenosu genů
Dosavadní stav techniky
Jeden aspekt genové terapie zahrnuje zavádění cizí nukleové kyseliny (jako je DNA) do buněk, takže odpovídající exprimovaný protein může provádět požadovanou terapeutickou funkci[1a].
Příklady tohoto typu terapie zahrnují vložení genů TK, TSG nebo ILG pro léčení rakoviny; vložení genu CFTR pro léčení cystické fibrózy; vložení genů NGF, TH nebo LDL pro léčení neurodegenerativních a kardiovaskulárních onemocnění; vložení genu antagonisty IL-1 pro léčení revmatoidní artritidy; vložení antigenů HIV a genu TK pro léčení infekcí AIDS a CMV; vložení antigenů a cytokinů pro vakcinaci; a vložení β-globinu pro léčení hemoglobinopatických stavů, jako jsou talasemie.
V mnoha současných studiích genové terapie se používá adenovirových genových vektorů, jako je Ad3 nebo Ad5, nebo jiných genových vektorů. S jejich použitím však je spojena řada problémů.[2a]
To zvýšilo požadavky na méně nebezpečné, nevirové přístupy přenosu
ZM Λ Λ |°| [3 a] genu
Potenciálně velmi výhodný nevirový přenosový systém zahrnuje použití kationtových liposomů[4aI. Kationtové liposomy, které se obvykle skládají z neutrálního fosfolipidu a kationtového lipidu, byly v tomto smyslu používány pro přenos DNA[4a], mRNA[5a], nekódujících ·· ···· ·· ·· ·· ···· ··· ···· ·· · ···· · · ·· · · ·
(antisense) oligonukleotidů[6a], proteinů[7a] a léčiv[8a] do buněk. Komerčně je dostupná celá řada kationtových lipidů143,9a] a v poslední době bylo syntetizováno mnoho nových kationtových lipidů[10a]. Účinnost těchto liposomů byla prokázána jak in vitro[4a], tak i in v/Vo[11a].
Neutrální fosfolipid použitelný při přípravě kationtového liposomů je /V-1-(2,3-dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylamoniumchlorid, jinak známý jako „DOTMA“.
Jeden z nejvíce používaných systémů kationtových liposomů je složený ze směsi neutrálního fosfolipidu dioleoylfosfatidylethanolaminu (běžně známý pod názvem „DOPE“) a kationtového lipidu, 3β-[(Ν,Ν-dimethylaminoethan)karbamoyl]cholesterol (běžně známý jako „DC-Chol“)[12a].
Přes účinnost známých kationtových liposomů je stále potřeba optimalizovat účinnost genového přenosu kationtových liposomů v humánní medicíně[10a]. Protože je projekt přečtení lidského genomu téměř u konce, použití genů pro léčebné účely, popisované jako genová terapie, bude podle očekávání převratem v medicíně. V této souvislosti je nevirové dodávání genů, ačkoli má stále menší účinnost než virové metody, stále více považováno vědeckou komunitou za nejbezpečnější možnost pro použití u člověka.
Tento obor se značně rozvíjel v posledních deseti letech, přičemž byly získány komplexní makromolekulární konstrukty obsahující mnoho prvků různých existujících technologií (virální proteiny nebo peptidy, liposomy, polymery, strategie směrováni na cíl a vlastnosti stealth).
Související přihláška autorů vynálezu PCT/GB00/04767 popisuje systém založený na triplexu složeném z peptidu virového jádra Mu, plasmidové DNA a kationtového liposomů (LMD). Tato základní technologie byla úspěšní in vitro a poskytla slibné výsledky in vivo. Ale stejně jako u všech existujících nevirových technologií je pro dosažení
• · terapeutické úrovně in vivo ještě další vývoj.
Z tohoto hlediska musí být dosažena stabilita částice v biologických kapalinách (sérum, sliznice plic) při zachování účinných transfekčních schopností.
Tento požadavek je jednou ze známých překážek všech existujících technologií. Současné stabilní formulace11,21 dosahují nízké účinnosti transfekce a nejnovější účinné transfekční prostředky mají značně omezenou použitelnost v důsledku nestability13'71.
Po podání (do krve při systémovém podání nebo na sliznici plic při místním podání) se nabité komplexy vystaví působení solí a biologických makromolekul, což vede k silné agregaci koloidů a adsorpci biologicky aktivních elementů (opsoninů) na jejich povrchu18' 11]. Dochází k drastickým změnám genových vehikul, které mohou zahrnovat srážení, navázání proteinů vedoucí k odstranění částic makrofágy a rozrušení povrchu vedoucí k jeho destrukci.
Nejvíce používaná stabilizovaná formulace obsahuje na povrchu roubované řetězce polyethylenglykolu (PEG)[12, 13]. PEG je netoxický, neutrální polyether, který má velký vylučovací objem pro většinu makromolekul. Formulace, u kterých je nezbytná míra stabilizace, však bohužel ztrácejí schopnost genového přenosu, pravděpodobně v důsledku jejich snížené nespecifické afinity k buňkám nebo ztráty vlastností z hlediska rozbíjení endosomů114,15].
Alternativní přístup k zabránění destruktivnímu účinku biologických tekutin na lipoplexy spočívá v pokusu napodobit povahu a povlak povrchu lipidových dvojvrstev pomocí polysacharidů[16,17].
Předkládaný vynález přispívá k řešení některých problémů ze stavu techniky.
9 · 9 9 ·
- 4 - ··
Podstata vynálezu
Podle jednoho provedení předkládaného vynálezu se poskytuje sloučenina schopná působení jako kationtový lipid, kde tato sloučenina obsahuje cholesterolovou skupinu a uhlohydrátovou skupinu.
Podle dalšího provedení předkládaného vynálezu se poskytuje způsob výroby sloučeniny podle předkládaného vynálezu, který zahrnuje reakci sloučeniny obsahující cholesterolovou skupinu a polyamin se sacharidem.
Podle dalšího provedení předkládaného vynálezu se poskytuje sloučenina podle předkládaného vynálezu nebo sloučenina připravená způsobem podle předkládaného vynálezu pro použití v lékařství
Podle dalšího provedení předkládaného vynálezu se poskytuje požití sloučeniny podle předkládaného vynálezu nebo sloučeniny připravené způsobem podle předkládaného vynálezu pro výrobu léčiva pro léčení genetické poruchy nebo stavu nebo onemocnění.
Podle dalšího provedení předkládaného vynálezu se poskytuje kationtový liposom vytvořený ze sloučeniny podle předkládaného vynálezu nebo sloučeniny připravené způsobem podle předkládaného vynálezu.
Podle dalšího provedení předkládaného vynálezu se poskytuje způsob výroby kationtového liposomu, který zahrnuje vytvoření kationtového liposomu ze sloučeniny podle předkládaného vynálezu nebo sloučeniny připravené způsobem podle předkládaného vynálezu.
Podle dalšího provedení předkládaného vynálezu se poskytuje kationtový liposom podle předkládaného vynálezu nebo kationtový liposom připravený způsobem podle předkládaného vynálezu pro použití v lékařství.
Podle dalšího provedení předkládaného vynálezu se poskytuje použití kationtového liposomu podle předkládaného vynálezu nebo ·· ··*· • ·· ·
kationtového liposomú připraveného způsobem podle předkládaného vynálezu pro výrobu léčiva pro léčení genetické poruchy nebo stavu nebo onemocnění.
Podle dalšího provedení předkládaného vynálezu se poskytuje kombinace nukleotidové sekvence a jedné nebo více látek ze skupiny: sloučenina podle předkládaného vynálezu, prostředek připravený způsobem podle předkládaného vynálezu, sloučenina připravená způsobem podle předkládaného vynálezu, liposom podle předkládaného vynálezu, nebo liposom připravený způsobem podle předkládaného vynálezu.
Podle dalšího provedení předkládaného vynálezu se poskytuje kombinace podle předkládaného vynálezu pro použití v lékařství.
Podle dalšího provedení předkládaného vynálezu se poskytuje použití kombinace podle předkládaného vynálezu při výrobě léčiva pro léčení genetické poruchy nebo stavu nebo onemocnění.
Podle dalšího provedení předkládaného vynálezu se poskytuje farmaceutický prostředek obsahující sloučeninu podle předkládaného vynálezu nebo sloučeninu připravenou způsobem podle předkládaného vynálezu ve směsi s léčivem a popřípadě ve směsi s farmaceuticky přijatelným ředivem, nosičem nebo pomocnou látkou.
Podle dalšího provedení předkládaného vynálezu se poskytuje farmaceutický prostředek obsahující kationtový liposom podle předkládaného vynálezu nebo kationtový liposom připravený způsobem podle předkládaného vynálezu ve směsi s léčivem a popřípadě ve směsi s farmaceuticky přijatelným ředivem, nosičem nebo pomocnou látkou.
Některé další aspekty vynálezu jsou definovány v přiložených nárocích.
Předpokládá se, že klíčovou výhodou sloučeniny podle předkládaného vynálezu je to, že může být použita jako kationtový «· ···· ·· ·«· · lipid (amfifilní sloučenina) při přípravě kationtového liposomu použitelného při genové terapii, zvláště při přenosu nukleových kyselin (včetně genů a nekódujících (antisense) DNA/RNA do buněk (in vitro, in vivo, a ex vivo), pro zvýšení terapeutického účinku.
Uhlohydráty mají četné biologické funkce. Autoři vynálezu zkoumali jejich kombinovaný směrovací potenciál a stabilizační vlastnosti118'201. Navrhli skupinu glykolipidů založenou na již dříve vyvinutém kationtovém lipidu na bázi cholesterolu pro vhodné vložení do dvojvrstvy. Pro vyhodnocení minimální velikosti uhlohydrátového motivu potřebného pro stabilizaci systému podle vynálezu byla zvolena chemoseliktivní metodologie121'231, která umožňuje snadnou modulaci počtu glykosidických jednotek[24'26]. Klíčový krok využíval tvorbu oximové vazby pro navázání lipidů na sloučeniny obsahující aldehydy jako jsou jednoduché uhlohydráty. V příkrém protikladu s jinými metodami používanými pro syntézu glykolipidů umožňuje tento postup uchování cyklické povahy sacharidové jednotky s vysoku účinností, je jednodušší než tradiční metody a nevyžaduje náročnou manipulaci při ochraně skupin pro každý nový navázaný cukr, pokud existuje aldehydová forma (mutarotační rovnováha).
Podle jednoho provedení předkládaného vynálezu se tedy poskytuje způsob výroby sloučeniny podle předkládaného vynálezu, který zahrnuje reakci sloučeniny obsahující cholesterolovou skupinu a polyaminovou skupinu s nechráněným polysacharidem.
Výhodná provedení vynálezu
Ve výhodném provedení má sloučenina podle předkládaného vynálezu vzorec Chol-L-Carb, kde Chol je cholesterolová skupina, L je případná propojovací skupina a Carb je uhlohydrátová skupina.
S výhodou je cholesterolová skupina cholesterol.
S výhodou je cholesterolová skupina navázána na případnou • · 4 94 4
4· «4·· « * • ···
9« • · · 9 9 9 9
9 99 9 9 9
9 9 9 9 9 9 · · • ·· · · · · · ·· 44 44 ·· propojovací skupinu karbamoylovou vazbou.
Ve zvláště výhodném provedení má sloučenina podle předkládaného vynálezu vzorec Chol-L-Carb, kde Chol je cholesterol, L je polyaminová skupina a Carb je glukóza, s výhodou D-glukóza.
Propojovací skupina
Ve výhodném provedení je propojovací skupina polyaminová skupina. Předpokládá se, že polyaminová skupina je výhodná, protože zvyšuje vazebnou schopnost DNA a účinnost přenosu genu výsledného liposomu.
V jednom provedení polyaminová skupina znamená s výhodou polyamin, který se vyskytuje v přírodě. Předpokládá se, že polyaminová hlavní skupina (head-group) je výhodná, protože zvýšená aminová funkčnost zvyšuje celkový kladný náboj liposomu. Navíc je známo, že polyaminy se silně vážou na DNA a stabilizují ji[14a]. Navíc se polyaminy přirozeně vyskytují v buňkách a tak se předpokládá minimalizace toxikologických problémůt15a].
V dalším provedení jsou s výhodou dvě nebo více aminových skupin polyaminové skupiny podle předkládaného vynálezu odděleny jednou nebo více skupinami, které se nenacházejí v přírodě a které oddělují aminové skupiny v přírodě se vyskytujících polyaminových sloučenin (tj. polyaminová skupina podle předkládaného vynálezu má s výhodou nepřirozené propojovací skupiny).
Polyaminová skupina s výhodou obsahuje alespoň dva aminy polyaminové skupiny, které jsou vzájemně oddělené (jsou od sebe v určité vzdálenosti) ethylenovou (-CH2CH2-) skupinou.
S výhodou je každý z aminů polyaminové skupiny oddělen (jsou od sebe v určité vzdálenosti) ethylenovou (-CH2CH2-) skupinou.
Typické příklady vhodných polyaminů zahrnují spermidin, spermin, kaldopentamin, norspermidin a norspermin. S výhodou je
4444 * 9 4
449 4 9
44 94 4*44
4 4 9 4 · 9
4 44 4 9 4
4 9 4 9 4 9 9
4 9 4 4 9 4 9
94 44 44 polyamin spermidin nebo spermin, protože je známo, že tyto polyaminy interagují s jednořetězcovou nebo dvouřetězcovou DNA. Alternativní výhodný polyamin je kaldopentamin.
Ve výhodném provedení je propojovací skupina skupinu polyethylenglykolu (PEG). Skupina PEG s výhodou obsahuje od 4 do 16 oxyethylenových jednotek, např. 4, 6, 8, 10, 12, 14 nebo 16 oxyethylenových jednotek.
Ve výhodném provedení obsahuje propojovací skupina skupinu polyethylenglykolu (PEG) a polyaminovou skupinu. Ve výhodném provedení je propojovací skupina konjugát oxyethylenových skupin a aminových skupin. V každém z těchto provedení se stejně uplatňují popisované výhodné vlastnosti skupin PEG a polyaminových skupin.
Uhlohydrát
Ve výhodném provedení je uhlohydrátová skupina monosacharid.
Ve výhodném provedení uhlohydrátová skupina znamená skupinu cukru.
S výhodou je uhlohydrátová skupina zvolena ze skupiny mannóza, glukóza (D-glukóza), galaktóza, glukuronová kyselina, laktóza, maltóza, maltotrióza, maltotetraóza, maltoheptaóza a jejich směsi. Výhodněji je uhlohydrátová skupina D-glukóza.
V jednom provedení obsahuje sloučenina podle předkládaného vynálezu 1 až 7 uhlohydrátových skupin. S výhodou obsahuje sloučenina jednu uhlohydrátovou skupinu.
Cholesterol
Cholesterolová skupina může být cholesterol nebo jeho derivát. Příklady derivátů cholesterolu zahrnují substituované deriváty, kde se • · · · • · ·· ·· · · · · ·· · · · · ·· · ···· · · ·· · · ·
vyskytuje vhodná substituce na jedné nebo více skupinách CH2 nebo CH cyklů a/nebo na jedné nebo více skupinách CH2 nebo CH přímých řetězců. Alternativně nebo navíc může být jedna nebo více cyklických skupina a/nebo jeden nebo více přímých řetězců nenasycených.
Ve výhodném provedení je cholesterolová skupina cholesterol. Předpokládá se, že cholesterol je výhodný, protože stabilizuje výslednou liposomovou dvojvrstvu.
S výhodou je cholesterolová skupina navázána případnou propojovací skupinu karbamoylovou vazbou. Předpokládá se, že teto vazba je výhodná, protože výsledný liposom má nízkou nebo minimální cytotoxicitu.
Další aspekty
S výhodou je sloučenina ve směsi nebo je asociována s nukleotidovou sekvencí.
Nukleotidová sekvence může být část nebo úplný expresní systém, který může být použitelný při terapii, jako je genová terapie.
Ve výhodném provedení je sloučenina podle předkládaného vynálezu ve směsi s kondenzovaným komplexem polypeptid/nukleová kyselina pro poskytnutí nevirového dodávacího vektoru nukleové kyseliny. Kondenzovaný komplex polypeptid/nukleová kyselina s výhodou zahrnuje komplexy popisované v související přihlášce PCT/GB00/04767. S výhodou jsou polypeptidy nebo jejich deriváty schopny vázat se na komplex nukleové kyseliny. S výhodou jsou polypeptidy nebo jejich deriváty schopny kondenzovat komplex nukleové kyseliny. S výhodou je komplex nukleové kyseliny heterologní vzhledem k polypeptidům nebo jejich derivátům.
S výhodou zahrnuje proces použití molekulárního síta.
S výhodou je kationtový liposom vytvořen ze sloučeniny podle předkládaného vynálezu a neutrálního fosfolipidu jako je DOTMA nebo
- 10 • ·· · • · 0 0 • •0 0000 00 0 0000 0 000 · 0 0 0 000 00 000 0 0 0 0 0000 0000 0000 000 00 00 00 00
DOPE. S výhodou je neutrálním fosfolipidem DOPE.
V jednom provedení je sacharid navázán na polyaminovou skupinu přes koncový amin polyaminu. Jinými slovy, primární amin polyaminu je substituovaný.
Souhrnem lze říci, že předkládaný vynález poskytuje sloučeninu schopnou působit jako kationtový lipid, kde sloučenina obsahuje cholesterolovou skupinu, která má na sobě přes polyaminovou skupinu navázaný sacharid.
Ve výhodnějším provedené předkládaného vynálezu je sloučenina schopná působit jako kationtový lipid, sloučenina obsahuje cholesterol a glukózu (s výhodou D-glukózu) navázané přes polyaminovou skupinu.
V jednom provedené předkládaného vynálezu může být sacharid podle předkládaného vynálezu úplně nebo částečně substituovaný polyethylenglykolem (PEG). tak v dalších provedené poskytuje předkládaný vynález:
sloučeninu schopnou působit jako kationtový lipid, kde sloučenina obsahuje cholesterolovou skupinu a skupinu polyethylenglykolu;
sloučeninu schopnou působit jako kationtový lipid, kde sloučenina obsahuje cholesterolovou skupinu navázanou na sloučeninu přes polyaminovou skupinu, a polyethylenglykol;
sloučeninu schopnou působit jako kationtový lipid, kde sloučenina obsahuje cholesterolovou skupinu s polyethylenglykolem navázaným na sloučeninu přes polyaminovou skupinu; a sloučeninu schopnou působit jako kationtový lipid, kde sloučenina obsahuje cholesterol s polyethylenglykolem navázaným na sloučeninu přes polyaminovou skupinu.
• · · · • ·
- 11 • · • · ··
V jednom provedení je kationtový lipid podle předkládaného vynálezu modifikován cukernou skupinou nebo skupinou polyethylenglykolu (PEG). V dalším provedení obsahuje dále komplex podle předkládaného vynálezu sloučeninu schopnou působit jako kationtový lipid, kde sloučenina obsahuje cholesterolovou skupinu, na kterou je navázána aminová skupina, cukerná část nebo skupina polyethylenglykolu. V příkladech je ukázáno, že jako zvláště výhodné byly zjištěny kationtové lipidy modifikované cukrem/PEG. V dalším provedení tedy předkládaný vynález poskytuje sloučeninu schopnou působit jako kationtový lipid, kde sloučenina obsahuje cholesterolovou skupinu navázanou na sloučeninu přes aminovou skupinu, cukernou skupinu nebo skupinu polyethylenglykolu. Sloučenina s výhodou obsahuje od 1 do 7 cukerných skupin nebo skupin polyethylenglykolu. Sloučenina může obsahovat směs cukerných skupin a skupin polyethylenglykolu. Cukerná skupina je s výhodou odvozena od glukózy nebo D-glukózy.
Předkládaný vynález bude nyní podrobněji popsán na následujících příkladech s odkazem na následující obrázky, ve kterých:
Přehled obrázků na výkresech
Obr. 1 - Schéma 1 Syntéza hydroxylaminlipidu 11. Činidla: (a) CH2CI2, Et3N, Boc2O, laboratorní teplota, 5h, 98%; (b) EtOAc, N-hydroxysukcinimid (1 ekv.), DCC (1ekv.), 10 h, laboratorní teplota; (c) (8), EtOAC/THF [95/5], Et3N (pH = 8), 2 h, laboratorní teplota, 90%; (d) CH2CI2, TFA (15 ekv), 0 °C, N2, 5 h, 86%.
Obr. 2 - Princip chemoselektivní disociace O-substituovaného hydroxylaminu D-glukózou (ačkoli je ukázán β-anomer, probíhá mutarotace a vytváří se také a-anomer).
Obr. 3 - Možné struktury neoglykolipidu získaného z manózy.
- 12 ·· ···· ·· • · · ·
Obr. 4 - Výsledky analýzy velikosti různých lipoplexů fotonovou korelační spektroskopií (PCS). Velikost byla měřena po 30 min pro lipoplexy při [DNA] = 1 gg/ml v mediu Optimem +/-10% FCS, 37 °C. Porovnání standardní formulace LMD (LMD) a LMD s modifikací přídavkem 7,5 mol % produktu 12h a 12i bylo prováděno v mediu Optimem (bílé pruhy) a 10% séru (černé pruhy) a vyjádřeno jako procento zvýšení velikosti proti původně naměřené velikosti 180 nm.
Obr. 5 - Srovnání účinností transfekce základního LMD a LMD glykomodifikovaného 7,5 mol % produktu 12h a 12i na buňky HeLa v podmínkách 0% (bílé pruhy), 50% (šrafované pruhy) a 100 % séra (černé pruhy). Výsledky jsou vyjádřeny jako relativní světelné jednotky na miligram proteinu (n = 4).
Předkládaný vynález bude dále popsán na následujících příkladech.
Příklady provedení vynálezu
Experimentální část
Syntéza neoglykolipidů
Obecné údaje: 1H NMR spektra byla zaznamenávána při teplotě laboratoře buď na spektrometru Brucker DRX400, DRX300 nebo Jeol GX-270Q, se zbytkovým izotopově neznačeným rozpouštědlem (např. CHCI3, óh = 7,26) jako vnitřním standardem. 13C-NMR spektra byla zaznamenávána na stejných spektrometrech při 100, 75 a 68,5 MHz, rovněž se zbytkovým izotopově neznačeným rozpouštědlem (např. CHCI3, óc = 77,2) jako vnitřním standardem.
Infračervená spektra byla zaznamenávána na přístroji Jasco FT/IR 620 s použitím destiček NaCl a hmotnostní spektra (elektrorozprašování kladných iontů) byla zaznamenávána na přístroji VG-7070B nebo JEOL SX-102. Chromatografie označuje bleskovou • ·
- 13 9 9 9 9 · · 9 · 9 · «999 9 9 9 · · 9 9
999 99 999 9 9
9 9999 9999
9999999 99 99 99 99 chromatografií na koloně, která byla prováděna na silikagelu MerckKieselgel 60 (230-400 mesh) v běžném rozpouštědle.
Chromatografie na tenké vrstvě (Tle) byla prováděna na hotových deskách Merck-Kieselgel 60 F254 s hliníkovým podkladem a vyvolávána UV zářením, jódem, kyselým molybdenanem amonným), kyselým ethanolickým vanilinem, nebo jinými vhodnými činidly. Čistota neoglykolipidů byla zjišťována analytickou vysokotlakou kapalinovou chromatografií (HPLC) na systému Hitachi s použitím kolony Purospher® RP-18 endeapped column (5 pm). Eluce byla prováděna isokraticky s průtokem 1 ml/min CH3CN/H2O (60 : 40) a frakce byly detekovány při 205 nm před odběry na analýzy hmotnosti. Sušený CH2CI2 byl před použitím destilován s oxidem fosforečným. Všechna další suchá rozpouštědla a chemikálie byly získány u firmy SigmaAldrich Company LTD (Pool, Dorset, UK).
Zkratky: Boc: terc-butoxykarbonyl; br: široký; Chol: cholesteryl; DMF: Ν,Ν-dimethylformamid; DMSO: dimethylsulfoxid; TFA: kyselina trifluoroctová; THF: tetrahydrofuran.
2-(Cholestervloxvkarbonyl) aminoethanol (2):
Roztok cholesterylchlorformátu (99,89 g, 0,218 mol) v CH2CI2 (600 ml) byl přidáván k míchanému roztoku 2-aminoethanolu (29,5 ml, 0,489 mol, 2,2 ekv.) v CH2CI2 (450 ml) při 0 °C po dobu 2 hod. Reakční směs byla ponechána ohřát na laboratorní teplotu a míchání pokračovalo dalších 14 h. Reakční směs byla promyta nasyceným roztokem NaHCO3 (2 x 200 ml), vodou (2 x 200 ml), sušena (MgSCri) a rozpouštědla byla odstraněna za sníženého tlaku. Získaná pevná látka byla rekrystalizována (CH2Cl2/MeOH) za poskytnutí sloučeniny 2 jako bílé pevné látky. Výtěžek: 99,67 g (97 %); Teplota tání: 180 °C; Rf = 0,26 (aceton/ether 1 : 9); IR (CH2CI2): vmax = 3353, 2942, 2870, 1693, 1674, 1562, 1467, 1382, 1264 cm'1; 1H NMR (270 MHz, CDCI3): δ = 5,35 (d, J = 6,5 Hz, 1H, H6’), 5,25 - 5,29 (m, 1H, NH), 4,42 - 4,57 (1H, ·
· 9 9
9 9 9
- 14 m, H3’), 3,70 - 3,62 (m, 2H, H1), 3,25 - 3,35 (m, 2H, H2), 3,12 (s, 1H, OH), 2,28 - 2,38 (m, 2H, H4’), 1,77 - 2,03 (m, 5H, H2’, H7’, H8’), 1,59 0,96 (m, 21H, H1 ’, H9’, H11 ’, H12’, H14’-H17’, H22’-H25’), 1 (3H, s, H19’), 0,9 (d, J = 6,5 Hz, 3H, H21’), 0,87 (d, J = 6,5 Hz, 6H, H26’ & H27’) a 0,67 (s, 3H, H18 ); MS (FAB+): m/z = 496 [M+Na]+, 474 [M+H]+, 369 [Chol]+, 255, 175, 145, 105, 95, 81, 43.
2-f(Cholestervloxvkarbonvl)amino1ethylmethansulfonát (3):
K roztoku sloučeniny 2 (25 g, 52,3 mmol) a triethylaminu (22 ml, 0,16 mol, 3 ekv.) v CH2CI2 (500 ml) při 0 °C byl po kapkách přidán roztok methansulfonylchloridu (10,5 ml, 0,13 mol, 2,5 ekv.). Reakční směs byla ponechána ohřát na teplotu laboratoře a byla míchána 1 h 30 min. Po zjištění úplnosti reakce analýzou TLC byl přidán led pro zastavení reakce. Reakční směs byla přidána k nasycenému vodnému NH4CI (600 ml), a extrahována etherem (3 x 300 ml). Spojené organické vrstvy byly promyty vodou (2 x 300 ml), roztokem soli (250 ml) a sušeny (Na2SO4). Rozpouštědlo bylo odstraněno za sníženého tlaku za poskytnutí sloučeniny jako bílé pevné látky, která po chromatografickém čištění (ether) poskytla sloučeninu 3. Výtěžek: 28,3g (98 %); IR (CH2CI2): vmax = 3453, 3342, 1716, 1531, 1377, 1137 & 798 cm’1; 1H NMR (270 MHz, CDCI3): δ 5,34 (d, J = 6,5 Hz, 1H, H6’), 5 - 5,1 (m, 1H, NH), 4,41 - 4,53 (1H, m, H3’), 4,29 - 4,25 (t, J = 5 Hz, 2H, H1), 3,47 - 3,52 (m, 2H, H2), 3,01 (s, 3H, H3), 2,24 - 2,36 (m, 2H, H4’), 1,74 - 2 (m, 5H, H2’, H7’, H8’), 0,9 - 1,6 (m, 21H, HT, H9’, H11’, H12’, H14’-H17’, H22’-H25’), 0,98 (3H, s, H-19’), 0,84 (d, J = 6,5 Hz, 3H, H2T), 0,83 (d, J = 6,5 Hz, 6H, H26’ & H27’) a 0,65 (s, 3H, H18’); MS (FAB+): m/z = 1104 [2M+H]+, 574 [M+Na]+, 552 [M+H]+, 369 [Chol]+, 255, 175, 145, 95, 81.
• · · · • ·· ·
- 15 4-aza-N6(cholestervloxykarbonvlannino)hexanol (4):
K míchanému roztoku sloučeniny 3 (28,3 g, 51 mmol) rozpuštěné v minimálním množství THF byl po kapkách přidán aminopropanol (160 ml, 2 mol, 39 ekv.). Po zjištění ukončení reakce TLC (12 h) byly přidány CHCI3 (350 ml) a K2CO3 (20 g) a roztok byl důkladně míchán 30 min. Suspenze byla potom zfiltrována přes krátké lože Celite® a důkladně promyta CHCI3. Získaná látka byla promyta nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a sušena (Na2CO3). Rozpouštědlo bylo odstraněno za poskytnutí sloučeniny 4 jako bílé pevné látky. Výtěžek: 26,1 g (96 %); IR (CH2CI2): vmax = 3350 - 3210, 2937, 2850, 1531, 1460, 1380, 1220, 1120, 1040 cm'1; 1H NMR (270 MHz, CDCI3): δ = 5,33 - 5,35 (m, 1H, H6’), 4,92 - 4,96 (m, 1H, NH), 4,42 - 4,51 (1H, m, H3’), 3,7 - 3,83 (m, 2H, H5), 3,23 - 3,29 (m, 2H, H1), 2,73 - 2,57 (m, 6H, H2, H3, H4), 2,2 - 2,36 (m, 2H, H4’), 1,7 - 2 (m, 5H, H2’, H7’, H8’), 0,85 - 1,58 (m, 21H, H1’, H9’, H11’, H12’, H14’H17’, H22’-H25’), 0,98 (3H, s, H-19’), 0,84 (d, J = 6,5 Hz, 3H, H21 ’), 0,8 (d, J = 6,5 Hz, 6H, H26’ & H27’) a 0,61 (s, 3H, H18’); MS (FAB+): m/z = 543 [M+Na]’, 530 [M+H]+, 485 [M-CO2]+, 369 [Cholf, 144 [MOcholf, 69, 55.
4-aza-(Boc)-N6(cholestervloxykarbonvlamino)hexanol (5):
K roztoku sloučeniny 4 (26,1 g, 49 mmol), byl přidán Et3N (8,3 ml, 1,1 ekv.) a Boc2O (10,7 g, 1 ekv.) v CH2CI2 (200 ml) a reakce byla sledována TLC. Po ukončení byla reakční směs vlita do NH4CI (100 ml), a byla promyta vodou a sušena (Na2SO4). Rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu za poskytnutí sloučeniny 5 jako bílé pevné látky. Rozpouštědlo bylo odstraněno za sníženého tlaku za poskytnutí sloučeniny jako bílé pevné látky, která po chromatografickém čištění (CH2CI2/MeOH/NH3 92 : 7: 1) poskytla sloučeninu 3. Výtěžek (27,9 g, 90%); IR (CH2CI2): vmax = 3352, 3054, 2937, 1675, 1530, 1455, 1380, 1220, 1120; 1H NMR (270 MHz, CDCI3): δ = 5,33 - 5,35 (m, 1H, H6’),
9
- 16 •9 99··
9
9999 9 999 9 9 9
999 99 999 9 9
9 9999 9999
999 99* 99 99 99 99
4,86 (m, 1H, NH), 4,42 - 4,5 (1H, m, H3’), 3,62 - 3,7 (m, 2H, H5), 3,27 - 3,38 (m, 6H, H1, H2, H3), 2,18 - 2,33 (m, 2H, H4’), 1,73 - 2 (m, 5H, H2’, H7’, H8’), 1,45 (s, 9H, Boc), 1 - 1,65 (m, 23H, H4, H1’, H9’, H11’, H12’, H14’-H17’, H22’-H25’), 0,97 (3H, s, H-19’), 0,93 (d, J = 6,5 Hz, 3H, H21 ’), 0,8 (d, J = 6,5 Hz, 6H, H26’ & H27’) a 0,65 (s, 3H, H18’); MS (FAB+): m/z = 654 [M+Naf, 543 [M-Boc]+, 369 [Chol]+, 145, 121, 95, 69, 57.
4-aza-(Boc)-N6-(cholestervloxvkarbonvlamino)hexylmethansulfonát (6):
Tento experiment byl prováděn podobně jako příprava 2[(cholesteryloxykarbonyl)amino]ethylmethansulfonátu 3 v množství 44 mmol za poskytnutí sloučeniny 6. Výtěžek (28 g, 90%); IR (CH2CI2): vmax = 3305, 2980, 2900, 2865, 1675, 1530, 1455, 1350, 1150; 1H NMR (270 MHz, (CDCI3): δ 5,33 - 5,35 (m, 1H, H6 ), 4,86 (m, 1H, NH), 4,35 - 4,55 (m, 1H, H3’), 4,22 (t, 2H, J = 6,5 Hz, H5), 3,2 - 3,4 (m, 6H, H1, H2, H3), 3,01 (s, 3H, H6), 2,15 - 2,33 (m, 2H, H4’), 1,73 2 (m, 5H, H2’, H7’, H8’), 1,44 (s, 9H, Boc), 1 - 1,67 (m, 23H, H4, H1’, H9’, H11’, H12’, H14’-H17’, H22’-H25’), 0,97 (3H, s, H-19’), 0,94 (d, J = 6,5 Hz, 3H, H2T), 0,8 (d, J = 6,5 Hz, 6H, H26’ & H27’) a 0,65 (s, 3H, H18’); MS (FAB+): m/z = 722 [M+Na]+, 609 [M-Boc]+, 369 [Chol]+, 145, 121, 95, 69, 55.
4-aza-(Boc)-N6 (cholestervloxvkarbonylamino)hexanamin (7):
Ke sloučenině 6 (25 g, 35 mmol), azidu sodnému (11,49 g, 175,7 mmol, 5 ekv.), a jodidu sodnému (5 g, 35 mmol, 1 ekv.) v atmosféře dusíku byl přidán za míchání bezvodý DMF (200 ml). Zahřívání pod zpětným chladičem při 80 °C po dobu 2h vedlo k ukončení reakce. Reakční směs byla ponechána ochladit na teplotu laboratoře, DMF byl odstraněn za sníženého tlaku a zbytek rozpuštěn v EtOAc. Směs byla promyta vodou (2 x 100 ml), roztokem soli (100 • · · · • · · · 4 ·
- 17 • · · · · · «· · 4 · • ········· 4 • · · · · · · · · 4
444 444 ·· · 4» 44 ml) a sušena (Na2SO4) za poskytnutí sloučeniny 7 po chromatografickém čištění (hexan/ether 1:1) jako bílé pevné látky. Výtěžek (22 g, 95 %); 1H NMR (270 MHz, CDCI3): δ = 5,34 - 5,36 (m, 1 Η, H6’), 4,35 - 4,55 (m, 1H, H3’), 4,25 (t, 2H, J = 6,5 Hz, H5), 3,2 - 3,5 (m, 6H, H1, H2, H3), 2,25 - 2,33 (m, 2H, H4’), 1,7 - 2,05 (m, 5H, H2’, H7’, H8’), 1,45 (s, 9H, Boc), 1 - 1,72 (m, 23H, H4, H1’, H9’, H11’, H12’, H14’-H17’, H22’-H25’), 0,98 (3H, s, H 19’), 0,94 (d, J = 6,5 Hz, 3H, H21 ’), 0,83 (d, J = 6,5 Hz, 6H, H26’ & H27’) a 0,64 (s, 3H, H18’); MS (FAB+): m/z = 568 [M+Na-Boc]+, 556 [M-Boc]+, 369 [Cholf, 145, 121, 95, 69, 57.
4-aza-(Boc)-N6(cholestervloxvkarbonylamino)hexvlamin (8):
Do kulové baňky se sloučeninou 7 (22,75 g, 34,6 mmol) v THF (230 ml) byl přidán trimethylfosfin v THF (1 M, 40 ml, 1,15 ekv.), a reakční směs byla monitorována TLC. Po ukončení reakce byla reakční směs míchána s vodou (3 ml) a vodným amoniakem (3 ml) po dobu 1h a rozpouštědlo bylo odstraněno za sníženého tlaku. Po čištění chromatografií (CH2Cl2/MeOH/NH3 92 : 7 : 1 až 75 : 22 : 3) byla získána sloučenina 8 jako bílé krystaly. Výtěžek (19,1 g, 88 %); IR (CH2CI2): vmax = 3689, 3456, 3155, 2948, 2907, 2869, 2253, 1793, 1709, 1512, 1468, 1381, 1168; 1H NMR (270 MHz, CDCI3): δ 5,32 5,35 (m, 1H, H6’>, 4,35 - 4,51 (m, 1H, H3 ), 3,45 - 3,05 (m, 8H, H1, H2, H3, H5), 2,18 - 2,4 (m, 2H, H4’), 1,8 - 2,1 (m, 5H, H2’, H7’, H8’), 1,46 (s, 9H, Boc), 1,01 - 1,72 (m, 23H, H4, H1’, H9’, H11’, H12’, H14-H17’, H22’ H25’), 0,97 (3H, s, H-19’), 0,85 (d, J = 6,5 Hz, 3H, H21 ’), 0,82 (d, J = 6,5 Hz, 6H, H26’ & H27’) a 0,64 (s, 3H, H18 ); MS (FAB+): m/z = 630 [M+H]+, 530 [M-Boc]+, 369 [Chol]+, 145, 121, 95, 69, 57.
(Boc)aminooxyoctová kyselina (9):
0-(Karboxymethyl)hydroxylaminhemihydrochlorid (1,16 g, 5,3 ·· ·«·· *· ·· ·· « · · · • · · · a · « · · a • ··· · ··· · · · • · » · · · ··« · · • · ···· «··· _ 18 _ ....... ·· ·· ·· ·· mmol) byl rozpuštěn v CH2CI2 (40 ml) a pH bylo nastaveno na 9 přídavkem triethylaminu (3 ml). Potom byl přidán di-terc-butyldikarbonát (2,36 g, 10,6 mmol, 2,0 ekv.) a směs byla míchána při teplotě laboratoře až do zjištění ukončení reakce TLC. pH bylo sníženo na 3 přidáním zředěné HCI. Reakční směs byla rozdělena mezi nasycený vodný NH4CI (20 ml) a CH2CI2 (30 ml). Vodná fáze byla extrahována CH2CI2 (3 x 100 ml). Spojené organické extrakty byly promyty H2O (2 x 100 ml) a sušeny (Na2SO4). Rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu za získání sloučeniny 9 jako bílé pevné látky. Výtěžek (1,86 g, 97%); IR (CH2CI2): vmax = 3373, 2983, 2574, 2461, 1724, 1413, 1369, 1235; 1H NMR (270 MHz, CDCI3): δ 4,48 (s, 2H, CH2), 1,48 (s, 9H, Boc); MS (FAB+): m/z = 214 [M+Naf, 192 [M+H]+, 135, 123, 109, 69.
(Boc)aminooxysloučenina (10):
N-hydroxysuccinimid (0,36 g, 3,13 mmol, 1 ekv.), sloučenina 9 (0,6 g, 3,13 mmol, 1 ekv.), a Ν,Ν’-dicyklohexylkarbodiimid (0,68 g, 3,13 mmol, 1 ekv.) byly rozpuštěny v EtOAc (90 ml), a heterogenní směs byla ponechána míchat při teplotě laboratoře přes noc. Směs byla potom zfiltrována přes lože materiálu Celíte® pro odstranění dicyklohexylmočoviny, která se vytvořila jako bílá sraženina (oplach 60 ml EtOAc), a přidána k roztoku sloučeniny 8 (1,97 g, 3,13 mmol, 1 ekv.) v THF (10 ml). Při této heterogenní reakci bylo udržováno pH 8 přidáváním triethylaminu (6 ml). Získaná směs byla ponechána míchat při teplotě laboratoře přes noc. Po ukončení reakce byla směs zfiltrována a rozpouštědlo bylo odstraněno za sníženého tlaku za poskytnutí sloučeniny 10 po čištění bleskovou chromatografií (CH2CI2/MeOH/NH3 92 : 7 : 1) jako bílé pevné látky. Výtěžek (2,3 g, 90 %); 1H NMR (270 MHz, CDCI3): δ = 5,33 - 5,35 (m, 1H, H6’), 4,4 4,52 (m, 1H, H3’), 4,3 (s, 2H, H90, 3,2 - 3,42 (m, 8H, H1, H2, H4, H6), 2,23 - 2,35 (m, 2H, H4 ), 1,7 - 2,1 (m, 7H, H2’, H7’, H8’, H5), 1,44 - 19 -
1,46 (m, 18H, 2 Boc), 1- 1,73 (m, 21H, HT, H9’, H11’, H12’, H14’H17’, H22’-H25’), 0,98 (3H, s, H-19 ), 0,85 (d, J = 6,5 Hz, 3H, H21 ’), 0,83 (d, J = 6,5 Hz, 6H, H26’ & H27’) a 0,65 (s, 3H, H18’); MS (FAB+): m/z = 803 [M+H]+, 703 [M-Boc]+, 647, 603 [M-2Boc]+, 369, 279, 255, 235, 204, 145, 95, 69.
Hydroxylamin (11):
K roztoku sloučeniny 10 (1,1 g, 1,36 mmol, 1 ekv.) v CH2CI2 (10 ml) byla přidána TFA (2 ml, 20,4 mmol, 15 ekv.) při 0 °C. Roztok byl ponechán míchat při teplotě laboratoře 5 hod. Po ukončení reakce byl přidán toluen pro azeotropní odstranění TFA z reakční směsi. Rozpouštědla byla odstraněna ve vakuu za získání, po chromatografickém čištění (CH2CI2/MeOH/NH3 92 : 7 : 1 až 75 : 22 : 3), sloučeniny 11 jako bílé pevné látky (709 mg, výtěžek: 86 %); IR (CHCb); vmax = 3306, 2948, 2850, 2246, 1698, 1647, 1541, 1467, 1253, 1133; 1H NMR (270 MHz, CDCI3): δ 5,26 - 5,4 (m, 1H, H6 ), 4,4 4,52 (m, 1H, H3 ), 4,12 (s, 2H, H9), 3,34 - 3,41 (m, 2H, H2), 3,15 - 3,3 (m, 2H, H4), 2,6 - 2,74 (m, 4H, H1 & H6), 2,14 - 2,39 (m, 2H, H4 ), 1,62 - 2,1 (m, 7H, H2’, H7’, H8’, H5), 1,02 - 1,6 (m, 21H, HT, H9’, H11 ’, H12’, H14 -H17’, H22’-H25’), 0,96 (3H, s, H-19’), 0,86 (d, J = 6,5 Hz, 3H, H2T), 0,83 (d, J = 6,5 Hz, 6H, H26’ & H27 ) a 0,66 (s, 3H, H18’); MS (FAB+): m/z = 603 [M+H]+, 369 [Cholf, 160, 137, 109, 95, 81, 69, 55.
Mannosylová sloučenina (12a):
Roztok D-manózy (266 mg, 4,8 mmol) v acetátovém vodném pufru (octan sodný/kyselina octová 0,1 M, pH 4, 7 ml) a roztok sloučeniny 11 (290 mg, 0,48 mmol, 10 ekv.) v DMF (7 ml) byl smísen a směs byla míchána 3 dny při teplotě laboratoře. Rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu lyofilizací a chromatografie (CH2CI2/MeOH/NH3
- 20 00 ··«· ·· ·· ·· ··«· • · 0 · * 0 · · · 0
0000 0 000 · · 0 : 22 : 3) poskytla produkt 21 jako bílou pevnou látku (233 mg, výtěžek: 65 %). Čistota byla dále potvrzena HPLC. Konečný produkt obsahoval β-pyranózovou (82 %) formu a a-pyranózovou (18 %) formu, které nebyly izolovány, ale charakterizovány ve směsi. MS (FAB+): m/z = 765 [M+Hf, 787 [M+Na]+, 397, 369 [Cholf, 322, 240, 121, 109, 95, 81, 69, 57. β-pyranózová forma: 1H NMR (400 MHz, CD3OD/CDCI3 [75/25]): δ = 7,64 - 7,62 (d, 3J1a.2a = 7 Hz, 1H, H1a), 5,35 - 5,36 (m, 1H, H6j, 4,45 - 4,5 (s, 2H, H9), 4,35 - 4,5 (m, 1H, H3’), 4,19 - 4,24 (dd, 1H, H2a, 3J1a.2a = 7,4 Hz, 3J2a.3a = 7,7 Hz), 3,81 - 3,9 (m, 1H, H3a), 3,73 - 3,8 (m, 2H, H4a, H6axa), 3,63 - 3,71 (m, 2H, H5a, Heq6a), 3,34 - 3,42 (m, 2H, H2), 3,27 - 3,30 (m, 2H, H4), 3 - 3,08 (m, 2H, H1), 2,9 - 2,98 (m, 2H, H6), 2,25 - 2,35 (m, 2H, H4’), 1,78 - 2,07 (m, 7H, H2’, H7’, H8’, H5), 1,03 - 1,65 (m, 21H, H1’, H9’, H11’, H12’, H14’-H17’, H22’-H25’), 1,01 (3H, s, H-19’), 0,91 (d, J = 6,5 Hz, 3H, H21’), 0,85 (d, J = 6,5 Hz, 6H, H26’ & H27’) a 0,69 (s, 3H, H18j; 13C NMR (400MHz, CDCI3/CD3OD [25/75]): 12,33 (C18’), 19,20 (C21’), 19,74 (C19’), 21,91 (C11j, 22,91 (C27’), 23,17 (C26’), 24,67 (C23’), 25,07 (C15’), 27,37 (C5), 28,85 (C25’)> 28,96 (C2’), 29,07 (C12’), 32,76 (C7’), 32,87 (C8’), 36,38 (C2), 36,78 (C20’), 37,09 (C1) 37,76 (C22’)> 37,95 (C1 j, 38,4 (C4), 39,36 (C4j, 40,41 (C24’)> 40,76 (C16’), 46,16 (C6), 51,19 (C9’)> 57,19 (C17j, 57,75 (C14’), 64,62 (C6a), 70,19 (C2a), 70,58 (C4a), 72,12 (C3a), 72,37 (C5a), 73,11 (C9), 75,91 (C3’), 123,39 (C6’), 140,72 (C5’), 155,02 (C1a), 158,69 (NHCOOChol), 173,1 (C8) ; α-pyranózová forma: identické údaje kromě: 1H NMR (400 MHz, CD3OD/CDCI3 [75/25]): δ = 6,90 - 6,88 (d, 3J1a.2a = 7 Hz, 1H, H1a), 5 5,05 (dd, 1H, H2a, 3Jia.2a = 7,3 Hz, 3J2a-3a = 7,6 Hz); 13C NMR (400 MHz, CDCI3/CD3OD [25/75]): 65,33 (C2a), 155,79 (C1a). 1H NMR (400, CD3OD/CDCI3 [75/25]): (m, 1H, H3’) chybí, pod vrcholem rozpouštědla; potvrzeno 1H NMR (300 MHz, DMSO): δ = 4,67 - 4,82 (m, 1 Η, H3’). 13C NMR (400 MHz, CDCI3/CD3OD [25/75]): C1 chybí, pod vrcholem MeOH potvrzeno korelací 1H/13C při 400 MHz, kolem 49.
•· ···· • φ • φ φφ • · φφφφ • φ · · · · · · · φ _ 21 - ......* ·· ·· ·* ·*
Přiřazené protonové rezonance bylo potvrzeno 1H gradientem typu DQF-COSY a TOCSY; Pro jednoznačné přiřazení rezonancí uhlíku byly použity korelace 1H/13C a DEPT 135. a-pyranózová forma poskytla 1J13C1a-H1a = 177 Hz a β-pyranózová forma poskytla 1J13C1a-H1a = 167 Hz. Konformace byla potvrzena 1H fázově senzitivní NOESY.
Glukosylová sloučenina (12b):
Tato sloučenina byla připravena s roztokem D-glukózy (150 mg, 0,82 mmol) a sloučeniny 11 (100 mg, 0,16 mmol) podobným způsobem jako při přípravě sloučeniny 12a, byla míchána 1 den a chromatograficky čištěna (ΟΗ2ΟΙ2/ΜβΟΗ/ΝΗ3 75 : 22 : 3) za získání produktu 12b jako bílé pevné látky (103 mg, výtěžek: 82 %). Čistota byla dále potvrzena HPLC. Konečný produkt obsahoval a-pyranózový anomer (11 %) a β-pyranózový anomer (89 %) které nebyly izolovány, ale charakterizovány ve směsi. (FAB+): m/z = 765 [M+H]+, 787 [M+Na]+, 391, 369 [Chol]+, 309, 290, 171, 152, 135, 123, 109, 95, 81, 69; β- pyranózová forma: (300 MHz, CDCI3/CD3OD [90/10]): δ = 7,53 7,56 (d, J = 5,6 Hz, 1H, H1a), 5,26 - 5,36 (m, 1H, H6’), 4,2 - 4,45 (m, 3H, H9, H3’), 4,05 - 4,15 (m, 1H, H2a), 3,45 - 3,85 (m, 5H, H6a, H3a, H5a, H4a), 2,9 - 3,4 (m, H2, H4, MeOH), 2,9 - 3,15 (m, 4H, H1, H6), 2,15 - 2,3 (m, 2H, H4’), 1,65 - 2 (m, 5H, H2’, H7’, H8’), 0,95 - 1,55 (m, 23H, H5, HT, H9’, H1T, H12’, H14’-H17’, H22’-H25’), 0,93 (3H, s, H19’), 0,84 (d, J = 6,5 Hz, 3H, H21 ’), 0,78 (d, J = 6,5 Hz, 6H, H26’ & H27’) a 0,62 (s, 3H, H18’); α-pyranózová forma: identická data, kromě: 1H NMR (300 MHz, CDCI3/CD3OD [90/10]): δ = 7,22 - 7,24 (d, J = 6,61 Hz, 1H, H1a), 4,95 - 5,07 (m, 1H, H2a); 1H NMR (300 MHz, CD3OD): (m, 1H, H3’) chybí, pravděpodobně pod vrcholem rozpouštědla; potvrzeno 1H NMR (300 MHz, DMSO): δ = 4,7 - 4,86 (m, 1H, H3’)
- 22 • · · · · · • · • · ·· • » · · · ♦ ·
9 49 · · · • · · * 9 4 9 9 4 4
444494 99 99 94 »·
Galaktosylová sloučenina (12c):
Tato sloučenina byla připravena s roztokem D-galaktózy (50 mg, 0,27 mmol) a sloučeniny 11 (40 mg, 0,066 mmol podobným způsobem jako při přípravě 12a, byla míchána 1 den a chromatograficky čištěna (CH2CI2/MeOH/NH3 75 : 22 : 3) za získání produktu 12c jako bílé pevné látky (35 mg, výtěžek: 70 %). Čistota byla dále potvrzena HPLC. Konečný produkt obsahoval a-pyranózovou (15 %) formu a βpyranózovou (85 %) formu, které nebyly izolovány, ale charakterizovány ve směsi. MS (FAB+): m/z = 765 [M+H]+, 588, 391, 369 [Chol]+, 322, 290, 165, 152, 135, 121, 109, 95, 81, 69; βpyranózová forma: 1H NMR (270 MHz, DMSO): δ = 7,78 - 7,82 (m, 1H,
NHCO uhlíku C8), 7,55 - 7,58 (d, J = 7,2 Hz, 1H, H1a), 6,95 - 7,1 (m, 1H, NHCOOChol), 5,25 - 5,37 (m, 1H, H6’>, 4,2 - 4,43 (m, 3H, H9,
H3’), 3,2 - 3,9 (m, H2a, H6a, H3a, H5a, H4a, OH), 2,9 - 3,18 (m, 4H,
H2, H4), 2,42,65 (m, 4H, H1, H6), 2,15 - 2,3 (m, 2H, H4’), 1,67 - 2 (m, 5H, H2’, H7’, H8’), 0,92 - 1,6 (m, 23H, H5, HT, H9’, H11’, H12’, H14’H17’, H22’-H25’), 0,96 (3H, s, H-19’), 0,89 (d, J = 6,5 Hz, 3H, H2T), 0,84 (d, J = 6,5 Hz, 6H, H26’ & H27’) a 0,65 (s, 3H, H18’). apyranózová forma: stejná data, kromě: 1H NMR (270 MHz, DMSO): 6,86 - 6,88 (d, J = 6 Hz, 1H, H1a)
Glukuronová sloučenina (12d):
Tato sloučenina byla připravena s roztokem D-glukuronové kyseliny ve formě monohydrátu sodné soli (30 mg, 0,128 mmol, 1,5 ekv.) a sloučeniny 11 (50 mg, 0,08 mmol) podobným způsobem jako bylo popsáno při přípravě sloučeniny 12a, byla míchána 1 den, chromatograficky čištěna (CH2CI2/MeOH/NH3 75 : 22 : 3) za získání sodné soli sloučeniny 12d jako bílé pevné látky (41 mg, výtěžek: 60 %). Čistota byla dále potvrzena HPLC. Konečný produkt obsahoval apyranózovou (85 %) formu a β-pyranózovou (15 %) formu které nebyly izolovány, ale charakterizovány ve směsi. MS (FAB+): m/z = 779
4 4444
4·44 · 4 4
4 4 4 4 4 4
444 94 444 4 4
4 4444 444» _ 23 - ......* ** ** ’* ** [M+H]+, 733, 588, 411, 369 [Cholj+, 336, 290, 240, 214, 159, 145, 135, 121, 109 ,95, 81, 69, 55, β-pyranózová forma: 1H NMR (300 MHz, CDCI3/CD3OD [75/25]): δ = 7,51 - 7,53 (d, J = 5,9 Hz, 1H, H1a), 5,25 5,33 (m, 1H, H6’), 4,2 - 4,45 (m, 3H, H9, H3’), 3,8 - 4,1 (m, 3H, H2a, H3a, H4a), 3,6 - 3,75 (m, 1H, H5a), 3,2 - 3,55 (m, H2, H4, MeOH), 2,7 - 3,15 (m, 4H, H1, H6), 2,18 - 2,32 (m, 2H, H4’), 1,62 - 2 (m, 5H, H2’, H7’, H8’), 0,9 - 1,6 (m, 23H, H5, H1 ’, H9’, H11 ’, H12’, H14’-H17’, H22’ H25’), 0,93 (3H, s, H-19’), 0,83 (d, J = 6,5 Hz, 3H, H21’), 0,77 (d, J = 6,5 Hz, 6H, H26’ & H27’) a 0,6 (s, 3H, H18’)); α-pyranózová forma: stejná data, kromě 1H NMR (300 MHz, CD3OD): δ 7,22 - 7,24 (d, J = 6,3 Hz, 1H, H1a), 5 - 5,1 (m, 1H, H2a).
β-D-Laktosylová sloučenina (12e):
Roztok β-D-laktózy, obsahující 25 - 30 % a (1,13 g, 3,3 mmol) a 11 (200 mg, 0,33 mmol) ve 14 ml vodného pufru DMF/acetát byla míchána 4 dny při teplotě laboratoře. Rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu lyofilizací a chromatografie (CH2CI2/MeOH/NH3 75 : 22 : 3) poskytla produkt 12e jako bílou pevnou látku (145 mg, výtěžek: 47 %). Čistota byla dále potvrzena HPLC. Konečný produkt obsahoval apyranózovou (15 %) formu a β-pyranózovou (85 %) formu (samy s obsahem 25 % α-laktózy), které nebyly izolovány, ale charakterizovány ve směsi. MS (FAB+): m/z = 927 [M+H]+, 588, 482, 369 [Chol]+, 290, 243, 216, 178, 152, 135, 121,109, 95, 81,69, 55; β-pyranózová forma: 1H NMR (400 MHz, CDCI3/CD3OD [20/80]): δ = 7,69 - 7,71 (d, 3Jia.2a = 5,8 Hz, 1 H, H1a β-laktózy), 7,66 - 7,68 (d, 3Jia.2a = 6,2 Hz, 1H, H1a a-laktózy), 5,35 - 5,37 (m, 1H, H6’), 4,37 - 4,6 (m, 4H, H9, H3’, H2a), 4,2 - 4,37 (m, 1H, H1b), 3,65 - 4,05 (m, 7 H, H3a, H4a, H5a, H4b, H5b, H6b), 3,25 - 3,6 (m, 8H, H2, H4, H6a, H2b, H3b, MeOH), 3 - 3,2 (m, 4H, H1, H6), 2,25 - 2,42 (m, 2H, H4’), 1,8 - 2,15 (m, 5H, H2’, H7’, H8’), 1 - 1,65 (m, 23H, H5, H1’, H9’, H11’, H12’, H14’-H17’, H22’H25’), 1,01 (3H, s, H-19’), 0,91 (d, J = 6,5 Hz, 3H, H21’), 0,85 (d, J =
- 24 44 4444
4444
4
4· 4 4
4 4
6,5 Hz, 6H, H26’ & H27’) a 0,69 (s, 3H, H18’); 13C NMR (400 MHz, CDCI3/CD3OD [20/80]): 13C NMR (400 MHz, CDCI3/CD3OD [20/80]): 12,32 (C18’), 19,2 (C21), 19,76 (C19 ), 21,94 (C11), 22,91 (C27’),
23.17 (C26’), 24,7 (C23’), 25,1 (C15’), 27,22 (C5), 28. 89 (C25’), 29 (C2’), 29,1 (C12’), 32,8 (C7’), 32,92 (C8’), 36,29 (C22’), 36,81 (C10’), 37,12 (ď), 37,99 (C6), 38,11 (C1), 39,48 (C2), 40,45 (C24’), 40,80 (C16’), 46,13 (C4’), 51,23 (C9’), 57,22 (C17’), 57,80 (C14’), 62,41 (C6a), 63,4 (C6a), 70,02 (C5b), 70,63 (C2a), 72,8 (C3a), 73 (C3’),
73.18 (C9), 74,75 (C2b), 76,8 (C3a), 81 (C4b), 92,39 (C1b), 105,2 (C3’>, 123,42 (C6’), 140,72 (C5’), 154,8 (C1a), 156,2 (NHCOOChol), 173,17 (C8). a-pyranózová forma·, stejná data, kromě 1H NMR (400 MHz, CD3OD/CDCI3 [80/20]): δΗ = 7,04 - 7,05 (d, 3J1a-2a = 5,6 Hz, 1H, H1a), 5,05 - 5,07 (m, 1H, H2a), 4,09 - 4,11 (m, 1H, H3a); 1H NMR (270 MHz, CD3OD): (m, 1H, H3’) chybí, pravděpodobně pod vrcholem rozpouštědla; potvrzeno 1H NMR (300 MHz, DMSO): δ = 4,7 - 4. 85 (m, 1H, H3’)· Přiřazení protonové rezonance byla potvrzena DQF-COSY a TOCSY 1H gradientového typu; Pro jednoznačné přiřazení rezonancí uhlíku byly použity 1H/13C korelace a DEPT 135. Konformace byla potvrzena 1H fázově senzitivní NOESY.
Maltosylová sloučenina (12f):
Tato sloučenina byla připravena s roztokem D-maltózy jako monohydrátu (30 mg, 1,8 mmol, 5 ekv.) a sloučeniny 11 (100 mg, 0,16 mmol) podobným způsobem jako bylo popsáno při přípravě sloučeniny 12e, byla míchána 1 den a chromatograficky čištěna (CH2CI2/MeOH/NH3 75 : 22 : 3) za získání sloučeniny 12f jako bílé pevné látky (100 mg, výtěžek: 65 %). Čistota byla dále potvrzena HPLC. Konečný produkt obsahoval a-pyranózovou (87 %) formu a βpyranózovou (13 %) formu které nebyly izolovány, ale charakterizovány ve směsi. MS (FAB+): m/z = 927 [M+H]+, 765, 588, 559, 484, 369 [Chol]+, 322, 290, 213, 167, 161, 143, 135, 121, 109,
- 25 44 4444
4« 4444
4 4 4 4 4 4 •444 44 4
44 444 4 4
44 · 4 4·· ·· 44 4· 4·
95, 81, 69, 55. β-pyranózová forma: 1H NMR (300 MHz, CDCI3/CD3OD [80/20]): δ = 7,55 - 7,57 (d, 3Jia-2a = 5,3 Hz, 1H, H1a), 5,3 (s, 1H, H6’), 4,85 - 5,02 (m, 1H, H3’), 4,09 - 4,22 (m, 1H, H1b), 3,57 - 4 (m, 7 H, H3a, H4a, H5a, H4b, H5b, H6b), 3,2 - 3,6 (m, 8H, H2, H4, H6a, H2b, H3b, MeOH), 2,8 - 3,1 (m, 4H, H1, H6), 2,1 - 2,36 (m, 2H, H4’), 1,6 2,05 (m, 5H, H2’, H7’, H8), 1 - 1,6 (m, 23H, H5, H1’, H9’, H11’, H12’, H14’-H17’, H22’ H25’), 0,93 (3H, s, H-19’), 0,83 (d, J = 6,5 Hz, 3H, H21 ’), 0,78 (d, J = 6,5 Hz, 6H, H26’ & H27’) a 0,6 (s, 3H, H18’); apyranózová forma: stejná data, kromě 1H NMR (300 MHz, CD3OD/CDCI3 [80/20]): δΗ= 6,92 - 6,94 (d, J = 4,62 Hz, 1H, H1a), 5,02 - 5,15 (m, 1H, H2a), 4,04 - 4,08 (m, 1 H, H3a)
Maltotriosylová sloučenina (12g):
Tato sloučenina byla připravena s roztokem maltotriózy (246,4 mg, 0,46 mmol, 7 ekv.) a sloučeniny 11 (40 mg, 0,066 mmol) podobným způsobem jako bylo popsáno při přípravě sloučeniny 12e, byla míchána 5 dnů a chromatograficky čištěna (CH2CI2/MeOH/NH3 75 : 22 : 3) za získání sloučeniny 12f jako bílé pevné látky (61 mg, výtěžek: 85 %). Čistota byla dále potvrzena HPLC. Konečný produkt obsahoval a-pyranózovou (15 %) formu a β-pyranózovou (85 %) formu, které nebyly izolovány, ale charakterizovány ve směsi. MS (FAB+): m/z = 1111 [M+Na]+, 1089 [M+H]+, 588, 423, 391, 369 [Chol]+, 240, 171, 159, 145, 121, 105, 95, 81, 69; β-pyranózová forma: 1H NMR (300 MHz, CDCI3/MeOH [20/80]): δ = 7,56 - 7,58 (d, J = 6 Hz, 1H, H1a), 5,2 - 5,27 (m, 1H, H6’), 4,9 - 4,95 (m, 1H, H3), 4,2 - 4,45 (m, 4H, H9, H3’, H2a), 4,05 - 4,2 (m, 2H, H1b, H1c), 2,95 - 4 (m, 21 H, H2, H4, H6a, H3a, H5a, H4a, H2b-6b, H2c-6c, MeOH), 2,85 - 2,95 (m, 4H, H1, H6), 2,2 - 2,3 (m, 2H, H4’), 1,8 - 2,1 (m, 5H, H2’, H7’, H8’), 0,98 - 1,6 (m, 23H, H5, HT, H9’, H1T, H12’, H14’-H17’, H22’-H25’), 0,94 (3H, s, H-19’), 0,84 (d, J = 6,5 Hz, 3H, H21 ’), 0,78 (d, J = 6,5 Hz, 6H, H26’ & H27’) a 0,61 (s, 3H, H18’); α-pyranózová forma: stejná
- 26 ·· ···· • · • · · · ·· · · · · ·· · · ·· ·· data, kromě 1H NMR (300 MHz, CDCI3/MeOH [20/80]): δ = 6,85 (d, J =
5,6 Hz, 1 H, H1a).
Maltotetraosylová sloučenina (12h):
Tato sloučenina byla připravena s roztokem D-maltotetraózy (200 mg, 0,3030 mmol) a sloučeniny 11 (80 mg, 0,133 mmol, byla míchána 5 dnů a chromatograficky čištěna (CH2CI2/MeOH/NH3 75 : 22 : 3) za získání sloučeniny 12h jako bílé pevné látky (67,5 mg, výtěžek: 41 %). Čistota byla dále potvrzena HPLC. Konečný produkt obsahoval a-pyranózovou (15 %) formu a β-pyranózovou (85 %) formu které nebyly izolovány, ale charakterizovány ve směsi. MS (FAB+): m/z = 1273 [M+Na]+, 1251 [M+H]+, 588,369 [Cholf, 159, 145, 121, 109, 95, 81, 69; HRMS (FAB+) C59Hio2N4024Na [M+Na]+ vypočteno
1273,6782, nalezeno 1273,6821. β-pyranózová forma'. 1H NMR (300 MHz, CDCI3/MeOH [20/80]): δ = 7,56 - 7,58 (d, 1H, H1a), 5,15 - 5,25 (m, 1H, H6’), 4,95 - 5,1 (m, 1H, H3’), 4,38 - 4,5 (m, 4H, H9, H3’, H2a), 4,04 - 4,22 (m, 3H, H1b, H1c, H1d), 3,1 - 3,95 (m, 27H, H2, H4, H6a, H3a, H5a, H4a, H2b-6b, H2c-6c, H2d-6d, MeOH), 2,85 - 3,1 (m, 4H, H1, H6), 2,2 - 2,33 (m, 2H, H4’), 1,75 - 2,1 (m, 5H, H2’, H7’, H8’), 1 1,6 (m, 23H, H5, H1’, H9’, H11’, H12’, H14’-H17’, H22’-H25’), 0,92 (3H, s, H-19’), 0,82 (d, J = 6,5 Hz, 3H, H21 ’), 0,78 (d, J = 6,5 Hz, 6H, H26’ & H27’) a 0,68 (s, 3H, H18’); α-pyranózová forma', stejná data, kromě, 1H NMR (300 MHz, CDCI3/MeOH [20/80]): δ = 7 (d, 1H, H1a).
Maltoheptaosylová sloučenina (12i):
Tato sloučenina byla připravena s roztokem D-maltoheptaózy (100 mg, 0,08673 mmol) a sloučeniny 11 (30 mg, 0,0497 mmol), byla míchána 7 dnů a chromatograficky čištěna (CH2Cl2/MeOH/NH3 75 : 22 : 3) za získání sloučeniny 12i jako bílé pevné látky (46mg, výtěžek: 53 %). Čistota byla dále potvrzena HPLC. Konečný produkt obsahoval a- 27 •9 ·<«· • · • · 9 9 9 9 9 9 9 9
999 999 99 99 99 99 pyranózovou (15 %) formu a β-pyranózovou (85 %) formu které nebyly izolovány, ale charakterizovány ve směsi. MS (FAB+): m/z = 1759 [M+Na]+, 1737 [M+H]+, 369 [Cholf, 145, 121, 109, 95, 81. βpyranózová forma: 1H NMR (300 MHz, CDCb/MeOH [20/80]): δ = 7,53 - 7,58 (d, 1H, H1a), 5,35 - 5,37 (m, 1H, H6’), 4,97 - 5,12 (m, 1H, H3’), 4,45 - 4,6 (m, 4H, H9, H3’, H2a), 4 - 4,5 (m, 6H, H1b, H1c-g), 3,1 - 3,9 (m, 45H, H2, H4, H6a, H3a, H5a, H4a, H2b-6b, H2c-6c, H2d-6d, H2e6e, H2f-6f, H2g-6 g, MeOH), 2,7 - 3 (m, 4H, H1, H6), 2,15 - 2,35 (m, 2H, H4’), 1,7 - 2,1 (m, 5H, H2’, H7’, H8’), 1 - 1,6 (m, 23H, H5, H1 ’, H9’, H11’, H12’, H14’-H17’, H22’-H25’), 0,94 (3H, s, H-19’) 0,84 (d, J = 6,5 Hz, 3H, H21’), 0,77 (d, J = 6,5 Hz, 6H, H26’ & H27’) a 0,63 (s, 3H, H18’); α-pyranózová forma: stejná data, kromě 1H NMR (300 MHz, CDCI3/MeOH [20/80]): δ = 6,9 (d, 1H, H1a).
Biologické a biofyzikální hodnocení:
Obecné:
Dioleoylfosfatidylethanolamin (DOPE) byl získán od firmy Avanti Lipid (Alabaster, AL, USA). Plasmid pCMVss byl získán u firmy Bayou Biolabs (Harahan, LA, USA). DC-Chol byl syntetizován v naší laboratoři[27]. Mu-peptid byl syntetizován M. Kellerem standardní Fmoc Merrifieldovou reakcí na pevné fázi s použitím Wangovy pryskyřice [43]. Všechny další chemikálie byly čistoty pro analýzu.
Příprava liposomů:
DC-Chol (7,5 mg, 15 mol) a DOPE (7,5 mg, 10 μίτιοί) byly spojeny v dichlormethanu. Roztok byl převeden do kulové baňky (typicky 50 ml) a organické rozpouštědlo bylo odstraněno za sníženého tlaku (rotační odparka) za poskytnutí tenké lipidické vrstvy, která byla sušena 2 - 3 h ve vakuu. Potom byl do kulové baňky přidán 4 mM pufr HEPES, pH 7,2 (3 ml) pro hydrataci tenké lipidické vrstvy. Po krátké sonikaci (2 - 3 min) pod argonem byla získaná suspenze
- 28 ·· 0*00 00 00 ·· ·«·· • « · 0 0 0 0 90 9 • 090 9 009 0 9 ·
009 90 909 0 9 • 9 »999 9999
0000 909 99 00 90 00 kationtových liposomů (koncentrace lipidu 5 mg/ml) extrudována na extrudéru (Northern lipid). Na začátku přes dva složené polykarbonátové filtry (0,2 pm) a potom desetkrát přes dva složené polykarbonátové filtry (0,1 pm) za vytvoření malých jednovrstevných kationtových liposomů (střední průměr 105 nm podle analýzy PCS). Koncentrace lipidů (přibližně 4 - 4,8 mg/ml) byly zjišťovány Stewartovým testem t44].
Příprava komplexů liposom:Mu:DNA (LMD) a liposom:DNA (LD):
Nejprve byly připraveny částice mu:DNA (MD) mícháním podle následujícího předpisu. Zásobní roztoky plasmidové DNA (typicky 1,2 mg/ml) byly přidávány k důkladně promíchávanému zředěnému roztoku peptidu mu (1 mg/ml) v 4mM HEPES pufru, pH 7,2. Konečný hmotnostní poměr mu:DNA byl 0,6: 1 pokud se neuvádí jinak, a konečná koncentrace plasmidové DNA byla 0,27 mg/ml. Potom byly pomalu přidávány roztoky obsahující MD za důkladného míchání k suspenzím extrudovaných kationtových liposomů (typicky přibližně 4,5 mg/ml), připravených jak bylo popsáno výše, za vytvoření malých částic LMD s úzkou distribucí velikosti (120 ± 30 nm) podle měření PCS. Konečný hmotnostní poměr lipid:mu:DNA byl 12:0,6:1. Potom byl přidán roztok sacharózy (100 %, hmotn./obj.) ve 4 mM pufru HEPES, pH 7,2, za získání suspenzí částic LMD ve 4mM pufru HEPES, pH 7,2 obsahujících 10% hmotn./obj. sacharózu při požadované koncentraci DNA (konečná koncentrace DNA typicky 0,14 mg/ml) a směs byla uchovávána při -80 °C. Komplexy liposom:DNA (LD) (lipoplexy) byly pro experimenty připraveny s poměrem lipid:DNA 12 : 1 (hmotnostní) podle stejného protokolu bez přidání peptidu Mu.
Měření velikosti částic:
Velikosti lipoplexů byly vyhodnocována po 30 min expozici při 37 °C v biologickém mediu metodou fotonové korelační spektroskopie (N4 plus, Coulter). Zvolená konkrétní koncentrace DNA byla kompatibilní se stavem in vitro (1 pg/ml DNA). Byly použity následující
- 29 9« *9··
9*99 φ 9 9 999 «β 99
9 9 9 *· 9 • 9 9 9 9 9 » • 999 99 999 9 9 • 9 9999 9999
999 999 99 9« *9 99 parametry: 20 °C, 0,089 cP, reflexní index 1,33, úhel 90 °C, 632,8 nm. Pro vyhodnocení střední velikosti částic v mediu Optimem byla použita jednomodální analýza. Pro oddělení subpopulace malých částic séra menších než 50 nm byl použit algoritmus CONTIN a také pro extrakci vypočtené velikosti lipoplexů v mediu Optimem + 10% FCS.
Transfekce buněk HeLa:
Buňky byly zaočkovány ve 24-jamkových kultivačních destičkách v mediu DMEM doplněném 10% FCS a pěstovány přibližně do 70% konfluence 24h při 37 °C v přítomnosti 5% CO2. Buňky byly promyty v PBS před přidáním transfekčního média do každé jamky (0,5 ml roztoku 0, 50 nebo 100 % fetálního telecího séra v médiu Dubelco OptiMem). 5 μΙ při 100 pg/ml DNA (nls Pgal) LMD bylo transfekováno na buňky Hela 30 min. Buňky byly potom třikrát opláchnuty PBS a inkubovány dalších 48h v DMEM doplněném 10% FCS před testováním na expresi β-Gal použitím standardního testovacího kitu chemiluminescenčního reporterového genu (Roche Diagnostics, GmbH Cat No. 1 758 241).
Výsledky a diskuse:
Syntéza neoglykolipidů:
Každý člen cílové skupiny neoglykolipidů se skládal z lipidu nesoucího cholesterol a oligosacharidové molekuly vzájemně svázaných prostřednictvím linkeru. Celkový syntetický přístup byl rozdělen do dvou částí; nejprve probíhala syntéza lipidu obsahujícího linker a potom chemioselektivní vazba tohoto lipidu s molekulami cukru. Klíčem k této strategii je tvorba hydroxylaminu (Obr. 1).
Tato syntéza lipidu chráněného Boc (8) byla původně navržena na základě konvergentní metodologie s použitím snadno dostupných aminoalkoholů jako výchozích materiálů se strategií komplementární blokovací skupiny aminové skupiny. Dříve publikovaná metodologie umožnila s malou modifikací přípravu tohoto lipidu na bázi polyamidu
- 30 •0 0000 ·· 0000 00 ··
0 0 ···· 0 · 0 • ··· 0 0 ·♦ · · « • 000*0*000 0 • · *000 ···· • 000 000 00 40 00 00
- Í271 pro přenos 1 J.
Jak bylo uvedeno výše, glykosylace hydroxylaminových derivátů poskytuje elegantní řešení požadavků na syntézu. Komerčně dostupný O-(karboxymethyl)hydroxylaminhydrochlorid byl nejprve chráněn Boc a potom ponechán reagovat s N-hydroxysukcinimidem a N,N’dicyklohexylkarbodiimidem (DCC) za získání odpovídajícího aktivovaného esteru. Tato sloučenina byla ihned zpracována in sítu lipidem (8) v THF při pH 8, za získání chráněného hydroxylaminu. Po velmi přímočarém odstranění ochranných skupin vodnou kyselinou trifluoroctovou byla syntéza hydroxylaminového lipidu (11) ukončena.
V této fázi autoři vynálezu testovali schopnost jejich chemoselektivní vazby reakcí lipidu (11) s řadou komerčně dostupných nechráněných oligosacharidů. Tato reakce byla prováděna za mírných podmínek s použitím systému rozpouštědel DMF a pufru na bázi vodné kyseliny octové pH 4 (1 : 1), který umožnil rozpuštění jak cukru, tak i lipidu. Jak je ukázáno na obr. 2, reaktanty jsou v dynamické rovnováze s open chair protonovaným meziproduktem. Pro posunutí rovnováhy směrem ke tvorbě produktu byl přidán nadbytek cukru. V důsledku amfifilní povahy neoglykolipidového produktu bylo zjištěno, že izolace v průběhu zpracování je obtížná, protože se tvoří micely a pěna. Problémy s rozpustností také ztěžovaly izolaci, čištění a analýzu. Doby reakce a výtěžky kolísaly v závislosti na použitém uhlohydrátu. (tabulka 1).
- 31 ·· ·· ·· ···· • · · · · · • · · · · ·
Tabulka 1 Výtěžky, reakční doby a diastereoselektivita glykosylace produktu 11.
Produkt Cukr Doby (dny) Výtěžek (%) β/α
12a Mannóza 3 65 82/18
12b Glukóza 1 80 89/11
12c Galaktóza 1 70 85/15
12d Glukuronová kyselina 1 60 85/15
12e Laktóza 4 50 85/15
12f Maltóza 1 65 87/13
12g Maltotrióza 5 85 85/15
12h Maltotetra- óza 5 40 85/15
12i Maltohepta- óza 7 55 85/15
Konformace neoglykolipidů:
Konformace uhlohydrátů mohou být zjišťovány metodou NMR v roztoku [28 ' 33]. Nejlepší data pro zjištění konformace na anomerním centru (C1a) je pravděpodobně 1J13C1a-H1a[34,35]. Absolutní hodnota této vazebné konstanty závisí na orientaci vazby uhlík-vodík vzhledem k iontovému páru kyslíku kruhu, elektronegativitě substituentu na C1 a povaze elektronegativních substituentů navázaných na zbytek molekuly. Rozdíl 1J13C1-H1 mezi a- a β-anomerem pyranóz se může použit pro zjištění anomerní konfigurace. Je bezpečně zjištěno, že 1J (C1-H1eq) > 1J(C1-H1ax) s přibližným rozdílem 10 Hz. 1J(C1-H1eq) je obvykle přibližně 170 Hz a 1J(C1-H1ax) s přibližným rozdílem 160 Hz. Vyšší hodnoty se pozorují, jestliže se 0-1 zamění za prvek s vyšší • ·
• · · · elektronegativitou jako chlor nebo fluor, ale obvykle se pozoruje rozdíl 10 Hz [36]. Byly zkoumány konstanty vazby uhlík-vodík furanosidů a 1J(C1-H1eq) > 1J(C1- H1ax), ale rozdíl je mnohem menší (1-3 Hz).
Charakterizace bude diskutována na příkladu mannózy, ale stejný analytický postup byl použit i při jiné sacharidy, jestliže byly podmínky analýzy NMR výhodné. Je možno zviditelnit tři rozdílné struktury kruhu (obr. 3). Ze sférických důvodů je možno očekávat, že pyranózové formy budou výhodnější proti furanózovým kruhům. Tak ze dvou sloučenin pozorovaných NMR je hlavní pravděpodobně pyranóza. Sekundárně pozorovaná sloučenina nemohla být připisována mutarotační rovnováze, protože fázově citlivá NOESY neukázala zkřížený vrchol mezi dvěma signály C1a (důkaz, že jde o odlišnou molekulu). Proto nebyla tato forma připisována furanózové formě, protože nebyl pozorován žádný posun 13C5a a 13C1a nebyl odstíněn, jak bylo ukázáno pro příbuzné substituované furanózové deriváty. [33]
Autoři vynálezu naměřili 1J13C1a-H1a = 167 Hz pro hlavní sloučeninu a 1J13C1a-H1a = 177 Hz pro sekundární sloučeninu. Absolutní hodnota těchto signálů 1J13C1-H1 je o 10 Hz vyšší, než by se dalo očekávat pro klasickou konformaci 4Ci, ale to se vysvětluje extrémní elektronegativitou O-substituované hydroxylaminové skupiny, která by mohla mírně deformovat židličkovou strukturu. Pro pyranózové kruhy bylo zjištěno, že [1J(C1-H1eq)-1J(C1-H1ax)] « 10 Hz, a proto je možno snadno dojít k závěru, že hlavní sloučenina je anomer (H1ax) a sekundární sloučenina je anomer (H1eq).
Tento závěr byl potvrzen 1H fázově senzitivní NOESY. Pro hlavní sloučeninu byl pozorován jaderný Overhauserův efekt mezi H1a a H2a & H3a. Vezmeme-li v úvahu výše uvedenou podrobnou strukturu, tato sloučenina nemohla být a pyranosylovým anomerem, protože ekvatoriální H1 nemůže v prostoru interagovat s H3, zatímco β anomer je zcela schopen poskytovat takové interakce. Pro H1a
- 33 sekundární sloučeniny nebyl pozorován žádný jaderný Overhauserův efekt, ale to by mohlo být způsobeno nedostatečnou citlivostí. Proto došli autoři v souladu s údaji analýz 1J13C1-H1 a NOESY k závěru, že byly vytvářeny dvě manózové pyranózové formy α/β (20/80).
Tento velmi podobná anomerní poměr (β/α) isomerů získaný pro neoglykolipidy není překvapivý (tabulka 1) u všech cukrů s ekvatoriálním hydroxylem v C2 kromě manózy. Poměr získaný pro tuto naposledy uvedenou sloučeninu je překvapivý, protože o β anomeru se obvykle uvádí, že je méně stericky výhodný než a anomer. Možné vysvětlení je, že tato reakce mohla být posouvána určitými sekundárními interakcemi (vodíkové vazby) mezi cukrem a hydroxylaminovým linkerem, stabilizujícími β anomer (to je v souladu s pozorováním, že signál NMR β anomeru je vždy více odstíněn než signál a anomeru). Neočekává se, že tato anomerní směs syntetizovaných glykolipidů bude ve velké míře ovlivňovat testované biologické vlastnosti liposomálních konstruktů, a proto se autoři nepokoušeli o namáhavou separaci těchto diastereomerů preparativní vysokotlakou kapalinovou chromatografií.
Biologické použití:
Glyko-modifikace LMD byla založena na přirozené schopnosti micelární suspenze inkorporovat se do lipidových membrán [37, 38]. Nejprve byly podle standardního protokolu vytvořeny LMD a potom byla k LMD přidána suspenze syntetizovaných neoglykolipidových micel v pufru Hepes 4mM pH 7 a směs byla inkubována 30 min při teplotě laboratoře pře obvyklým uchováním při -80 °C. Na stabilizační účinky byly byla testována různá procenta vytvořených neoglykolipidů, ale pouze delší řetězec (maltotetraóza 12h a maltoheptaóza 12i) měl signifikantní vlastnosti při koncentraci menší než 10 % (údaje nejsou ukázány).
• · · · • · • » • · · ···· ·· · • · · · · ··· · · · • ···*····· ·
- . · · ···· · · · ·
- 34 ........ ........
Stabilizační efekt neoglykolipidem modifikovaného LMD byl demonstrován inkorporací 7,5 mol % sloučeniny 12h nebo 12i. Je známo že po vystavení soli nebo séru dochází k agregaci formulací založených na lipidových vrstvách liposomů t11, 39, 40]. Tento jev je možno sledovat měřením průměrného zvýšení velikosti částic po pevně stanoveném čase; jakákoli stabilizace částice LMD by se měla projevit jako snížení tohoto parametru. Tento jev byl zvolen pro měření velikosti lipoplexů fotonovou korelační spektroskopií (PCS) po 30 min vystavení při 37 °C mediu OptiMem nebo OptiMem + 10% FCS pro napodobení standardních podmínek in vitro. Při vyšších množstvích séra nebylo možno jev pomocí PCS analyzovat, protože podmínky byla tak extrémní, že neumožnily smysluplné měření. Obr. 4 popisuje procento zvýšení velikosti těchto lipoplexů.
Tyto výsledky jasně ukazují stabilizaci částice mezi LMD a standardní formulací liposomů. Zavedení neoglykolipidů v koncentraci 7,5% se ukázalo jako signifikantně prospěšné v mediu OptiMem a 10% séru. Jako nejúčinnější se ukázalo zavedení 12i. Tento výsledek ukazuje potřebu dlouhých uhlohydrátových řetězců pro vytvoření účinných molekulárních kartáčových vrstev na povrchu těchto vrstev kationtových lipidů [41'Sheik0' 2001 #H9]
I v případech, kdy se ukáže určitý stupeň stabilizace, to obvykle vede ke snížení afinity kladně nabitého LMD k záporně nabité buněčné membráně, včetně poklesu transfekční schopnosti konstruktu. V tomto případě však výsledky transfekce in vitro ukázaly zvýšení účinnosti transfekce v důsledku modifikace noglykolipidu v podmínkách 0% i 50% séra (obr. 5). Tento výsledek byl připisován krátkému dosahu ochranného účinku bránící neoglykolipidy těchto interakcí krátkého dosahu van der Waalsova typu mezi lipidovými dvojvrstvami podobných polarit, ale neovlivňuje nábojové interakce delšího dosahu mezi opačně nabitými membránami. Agregace indukovaná sérem je primárně založena na interakci LMD se záporně nabitými proteiny t42] a prospěšný účinek neoglykolipidů podle vynálezu byl také snížen ·· ···· ·· ·· ·· ···· • · · · · · · · · ·
1111 1 111 1 1 1
- 35 zvýšenou koncentrací séra (žádný významný prospěšný účinek při 100% séru).
Všechny publikace uvedené v popisu jsou zařazeny odkazem. Odborníkům v oboru budou zřejmé různé modifikace a variace popisovaných způsobů a systému podle vynálezu, aniž by došlo k odchýlení od rozsahu a podstaty vynálezu. I když byl vynález popsán na určitých výhodných provedeních, není na tato provedení v rámci definice nároků omezen. Do rámce nároků jsou také zahrnuty různé modifikace popisovaných způsobů provádění vynálezu, které jsou zřejmé odborníkům v oboru biologie, chemie nebo příbuzných oborů.
Literatura
1a. W F Anderson, Science,1992, 256, 808.
2a. F D Ledley, Current Opinion in Biotechnology,1994, 5, 626; K F Kozarsky, et al, ibid,1993, 3, 499;
Gordon, et al, ibid,1994, 5, 611.
3a. C P Hodgon, BioTech,1995,13, 222.
4a. P L Felgner, et al, Proč Nat) Acad Sci USA,1987, 84, 7413; Felgner, et al, Nátuře,1989, 337, 387;
H-J Burger, et al, Proč Nati Acad Sci USA,1992, 89, 2145.
5a. Malone, et al, Proč Nati Acad Sci USA,1989, 86, 6077.
6a. M-Y Chiang, et al, J Biol Chem,1991, 226, 18162.
7a. R J Debs, et al, J Biol Chem,1990, 265,10189;
C Walker, et al, Proč Nati Acad Sci USA,1992, 89, 7915.
8a. A D Bangham, Hospital Practice,1992, 27, 51.
9a. J-P, Behr, et al, Proč Nati Acad Sci USA,1989, 86, 6982;
R Leventis, et al, Biochim Biophys Acta,1990, 1023, 124.
10a. X Gao, et al, Gene Therapy,1995, 2, 710.
• · · · · I ► · · • · · »
- 36 11 a.
12a.
13a.
14a.
15a.
16a.
17a.
18a.
a.
22a.
23a.
24a.
25a.
R Stribling, et al, Proč Nati Acad Sci USA,1992, 89,11277.
E W F W Afton, et al, Nátuře Genetics,1993, S,135.
X Gao, et al, Biochim Biophys Res Commun,1991, 179, 280.
J E Morgan, et al, Arch Biochem Biophys,1986, 246, 225.
A E Pegg, Biochem,1986, 234, 249.
H Staudinger, et al, Helv Chim Acta,1919, 2, 635;
S Knapp, et al, J Org Chem,1992, 57, 6239
K Omura, et al, Tetrahedron,1978, 34, 1651.
J K Guy-Caffey, et al, J Biol Chem, 1995, 270, 31391.
a) X Gao, L. Huang, Gene Ther. 1995, 2, 710-722, a tam uvedené odkazy;
b) A D. Miller, R. G. Cooper, C. J. Etheridge, L Stewart in Microspheres, Microcapsules and Liposomes (Ed. R. Arshady), John Wley & Sons,1997, v tisku, a tam uvedené odkazy;
c) P. L Felgner, Hum. Gene Ther. 1996, 7, 1791-1793.
a) H. Farhood, N. Serbina, L. Huang, Biochim. Biophys. Acta 1995, 1235, 289-295;
b) J. Zabner, A J. Fasbender, T. Moninger, K A Poellinger, M. J. Welsh, J. Biol. Chem. 1995, 270, 18987-19007.
H. Mitsui, L. G. Johnson, S. H. Randell, R. C. Boucher, J. Biol. Chem. 1997, 272, 1117-1126.
E. W. F. W. Alton, P. G. Middleton, N. J. Caplen, S. N. Smith, D. M. Steel, F. M. Munkonge, Ρ. K Jeffery, D. M. Geddes, S. L. Hart, R. Wlliamson, K. I. Fasold, A D. Miller, P. Dickinson, B. J. Stevenson, G. McLachfan, J. R. Dorin, D. J. Porteous, Nátuře Genetics 1993, 5,135-142.
a) N. J. Caplen, E. W. F. W. Alton, P. G. Middleton, J. R. Dorin, B. J. Stevenson, X. Gao, S. R. Durham, Ρ. K Jeffery, Μ. E.
• · ·» · · ·«·· • · · ···· · · · • · · · · · c · · · · • ···*···«· · __ · · « · « · · · · · _ $γ _···»··· ♦· ·« ·· ♦·
Hodson, C. Coutefle, L Huang, D. J. Porteous, R. Wlliamson, D. M. Geddes, Nátuře Medicine 1995,1, 39- 46;
b) G. J. Nabel, E. G. Nabel, Z-y. Yang, B. A Fox, G. E. Plautz, X. Gao, L Huang, S. Shu, D. Gordon, A E. Chang, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 1993, 90, 11307-11311.
26a. Liposomes: a practical approach (Ed.: R. R. C. New), IRL Press, Oxford, 1990.
27a. J. H. Felgner, R. Kumar, C. N. Sridhar, C. J. Wheeler, Y. J. Tsai, R. Border, P. Ramsey, M. Martin, P. L. Felgner, J. Biol. Chem. 1994, 269, 2550-2561.
28a. K Omura, D. Swem, Tetrahedron 1978, 34, 1651-1660.
29a. S. Knapp, J. J. Hale, M. Bastos, A Molina, K Y. Chen, J. Org. Chem. 1982, 57, 6239-6256
30a. (a) H. Staudinger, J. Meyer, Helv. Chim. Acta 1919, 2, 635-fi46;
(b) E. Fabiano, Β. T. Golding, Μ. M. Sadeghi, Synthesis 1987,190-192;
(c) Β. T. Golding, M. C. O'Sullivan, L. L. Smith, Tetrahedron Lett. 1988, 29, 6651-6654;
(d) Y. G. Gololobov, L. F. Kasukhín, Tetrahedron 1992, 48, 1353-1406;
(e) A W. Johnson, W. C. Kaska, K. A. O. Starzewski, D. A. Nixon, Ylides and Imines of Phosphorus (Ed.: A. W. Johnson), J. Wley and Sons, New York,1993, chap. 13, pp. 403-483.
31a. (a) J. E. Bafdwin, R. M. Adlington, A. S. Elend, M. L. Smith, Tetrahedron 1995, 51, 11581-11594;
(b) R. M. Moriarty, S. M. Tuladhar, L. Guo, S. Wehrli, Tetrahedron Lett 1994, 35, 8103-8106.
32a. E. R. Lee, J. Marshall, C. S. Siegel., C. Jiang, N. S. Yew, M. R. Nichols, J. B. Nietupski, R. J. Ziegler, Μ. B. Lané, Κ X. Wang, N.
« ·
- 38 -*
C. Wan, R. K. Scheule, D. J. Harris, A. E. Smith, S. H. Cheng, Hum. Gene Ther. 1996, 7,1701-1717.
33a. C. J. Wheeler, P. L. Felgner, Y. J. Tsai, J. Marshall, L Sukhu, S. G. Doh, J. Hartikka, J. Nietupski, M. Manthorpe, M. Nichols, M. Plewe, X. Liang, J. Norman, A. . Smith, S. H. Cheng, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 1996, 93,11454-11459.
34a. J. K. Guy-Caňey, V. Bodepudi, J. S. Bishop, K. Jayaraman, N. Chaudhary, J. Biol. Chem. 1995, 270, 31391-31396.
35a. a) J.-P. Vigneron, N. Oudrhiri, M. Fauquet, L. Vergely, J.-C. Bradley, M. Basseville, P. Lehn, J.-M. Lehn, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 1996, 93, 9682-9686;
b) J. G. Lewis, K.-Y. Lin, A. Kothavale, W. M. Flanagan, M. D. Matteucci, B. De Prince, R. A. Mook Jr., R W. Hendren, R. W. Wagner, ibid 1996, 93, 3176-3181;
c) D. Moradpour, J. I. Schauer, V. R. Zurawski Jr., J. R. Wands, R. H. Boutin, Biochem. Biophys. Res. Commun. 1996, 221, 8288.
36a. X. Gao, L. Huang, Biochem. Biophys. Res. Commun. 1991,179, 280-285.
[1 ] M. Ogris, S. Brunner, S. Schuller, R. Kircheis, E. Wagner, Gene Therapy 1999, 6, 595.
[2] A. L. Bailey, S. M. Sullivan, Biochimica Et Biophysica ActaBiomembranes 2000, 9468, 239.
[3] J. L. Coll, P. Chollet, E. Brambilla, D. Desplanques, J. P. Behr, M. Favrot, Hum Gene Ther 1999, 10, 1659.
[4] P. Erbacher, T. Bettinger, P. Belguise-Valladier, S. Zou, J. L. Coll, J. P. Behr, J. S. Remy, J Gene Med 1999, 1, 210.
[5] S. M. Zou, P. Erbacher, J. S. Remy, J. P. Behr, J Gene Med 2000, 2, 128.
• · φ φ · φ φ φ · · · · ♦ · · · · · · · · • ··· · φφφ φ φ φ φ φφφ φφ φφφ φ φ φ φ φφφ· φφφφ
- 39 -*··· ·♦· ·· ·· ·· ·· [6] A. Bragonzi, G. Dina, A. Villa, G. Calori, A. Biffi, C. Bordignon, Β. M. Assael, M. Conese, Gene Therapy 2000, 7, 1753.
[7] S. Li, M. A Rizzo, S. Bhattacharya, L. Huang, Gene Therapy 1998, 5, 930.
[8] Μ. I. Papisov, Advanced Drug Delivery Reviews 1998, 32, 119.
[9] D. V. Devine, A. J. Bradley, Advanced Drug Delivery Reviews 1998, 32, 19.
[10] C. Kitson, B. Angel, D. Judd, S. Rothery, N. J. Severs, A. Dewar, L. Huang, S. C. Wadsworth, S. H. Cheng, D. M. Geddes, E. Alton, Gene Therapy 1999, 6, 534.
[11] S. Li, W. C. Tseng, D. B. Stolz, S. P. Wu, S. C. Watkins, L Huang, Gene Therapy 1999, 6, 585.
[12] N. Duzgunes, S. Nir, Advanced Drug Delivery Reviews 1999, 40,
3.
[13] D. Needham, D. H. Kim, Colloids and Surfaces B-Biointerfaces 2000,18,183.
[14] . M. Hafez, P. R. Cullis, Adv Drug Deliv Rev 2001, 47, 139.
[15] D. Kirpotin, K. L. Hong, N. Mullah, D. Papahadjopoulos, S. Zalipsky, Febs Letters 1996, 388, 115.
[16] Μ. N. Jones, Advanced Drug Delivery Reviews 1994, 13, 215.
[17] S. Medda, S. Mukherjee, N. Das, K. Naskar, S. B. Mahato, Μ. K. Basu, Biotechnology and Applied Biochemistry 1993, 97, 37.
[18] S. Kawakami, J. Wong, A. Sáto, Y. Hattori, F. Yamashita, M. Hashida, Biochimica Et Biophysica Acta - General Subjects 2000,1524, 258.
[19] S. Kawakami, A. Sáto, M. Nishikawa, F. Yamashita, M. Hashida, Gene Therapy 2000, 7, 292.
• 4 4444 44 44 ·· • 4 4 4 4 4 4 · 4 4
4 4 4 4 4 « 4 4 4 4 • 444 44 444 4 4
4 4444 4444
- 40 -...............
[20] S. Kawakami, F. Yamashita, M. Nishikawa, Y. Takakura, M.
Hashida, Biochemical and Biophysical Research Communications 1998, 252, 78.
[21] C. F. Liu, C. Rao, J. P. Tam, Journal of the American Chemical Society 1996, 118, 307.
[22] L. E. Canne, A. R. Ferredamare, S. K. Burley, S. Β. H. Kent, Journal of the American Chemical Society 1995, 117, 2998.
[23] K. Rose, Journal of the American Chemical Society 1994, 116, 30.
[24] F. Peri, P. Dumy, M. Mutter, Tetrahedron 1998, 54, 12269.
[25] F. Peri, L. Cipolla, B. La Ferla, P. Dumy, F. Nicotra, Glycoconjugate Journal 1999, 96, 399.
[26] S. E. Cervigni, P. Dumy, M. Mutter, Angewandte Chemie International Edition in English 1996, 35, 1230.
[27] R. G. Cooper, C. J. Etheridge, L. Stewart, J. Marshali, S. Rudginsky, S. H. Cheng, A. D. Miller, Chemistry - a European Journal 1898, 4, 137.
[28] H. Vanhalbeek, Current Opinion in Structural Biology 1994, 4, 697.
[29] W. C. Kett, M. Batley, J. W. Redmond, Carbohydrate Research 1997, 299, 12g.
[30] C. A. Bush, Glycobiology 1999, 9,185.
[31] C. A. Bush, M. Martin-Pastor, A. Imberty, Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure 1999, 28, 269.
[32] K. Bock, H. Thogerson, Annu. Rep. NMR Spectroscopy 1982,13, 3.
[33] K. Bock, H. Thogerson, Journal of Carbohydrate Chem. 1992, 7, 813.
• · · · · 9 » · 9 · · · * ·· · ·9♦ · 9·· · « ·
999 99 9*9· ·
9 9999 9999 <999 999 99 ·9 99 99 [34] Κ. Bock, C. Pedersen, J. Chem. Soc. Perkin Trans I1 1974, 293.
[35] K. Bock, I. Lundt, C. Pedersen, Tetrahedron Letters 1974, 1037.
[36] P. Hansen, Prog. Nud. Magn. Reson. Spectroscop. 1980, 94, 249.
[37] T. Ishida, D. L. Iden, T. M. Allen, Febs Letters 1999, 460, 12g.
[38] S. Kanda, K. Inoue, S. Nojima, H. Utsumi, H. Wiegandt, Journal of Biochemistry 1982, 91, 2095.
[39] P. R. Dash, M. L. Read, L. B. Barrett, M. Wolfert, L. W. Seymour, Gene Therapy 1999, 6, 643.
[40] M. Malmsten, Colloids and Surfaces a-Physicochemical and Engineering Aspects 1998,159, 77.
[41] J. Klein, E. Kumacheva, D. Mahalu, D. Perahia, L. J. Fetters, Nátuře 1994, 370, 634.
[42] J. P. Yang, L. Huang, Gene Ther 1997, 4, 950.
[43] B. Merrifield, Science 1986, 232, 341.
[44] J. C. Stewart, Analytical Biochemistry 1980, 104, 10.
Zastupuje:
- 42 • 9 9999 • 9 • 999
99
9· 9 • 9 9 9
9 9 9
9 9 9 • 99 9
9 9 9 9 9 9* 9 < 9
-ÍW® a

Claims (30)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY X
    1. Sloučenina schopná působit jako kationtový lipid, kde sloučenina obsahuje cholesterolovou skupinu a uhlohydrátovou skupinu.
  2. 2. Sloučenina podle nároku 1 , kde tato sloučenina má vzorec
    Chol-L-Carb kde Chol je cholesterolová skupina, L je případná propojovací skupina a Carb je uhlohydrátová skupina.
  3. 3. Sloučenina podle nároku 1 nebo 2, kde cholesterolová skupina je cholesterol.
  4. 4. Sloučenina podle nároku 2, kde cholesterolová skupina je navázána na případnou propojovací skupinu karbamoylovou vazbou.
  5. 5. Sloučenina podle některého z nároků 1 až 4, kde propojovací skupina je polyaminová skupina.
  6. 6. Sloučenina podle nároku 4, kde polyaminová skupina je v přírodě se vyskytující polyamin.
    9 9 9999 ·· ··♦»
    9 9 9 9 9 9 9 9 9 9
    9 9 99 9 999 9 9 9
    9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9
    9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 . 43 -......* ........
  7. 7. Sloučenina podle nároku 4 nebo 5, kde polyaminová skupina obsahuje alespoň dva aminy polyaminové skupiny vzájemně oddělené ethylenovou skupinou -CH2-CH2-.
  8. 8. Sloučenina podle nároku 5, kde polyamin je kterákoli ze sloučenin spermidin, spermin nebo kaldopentamin.
  9. 9. Sloučenina podle některého z nároků 1 až 8, kde uhlohydrátová skupina je monosacharid.
  10. 10. Sloučenina podle některého z nároků 1 až 8, kde uhlohydrátová skupina je skupina cukru.
  11. 11. Sloučenina podle některého z nároků 1 až 8, kde uhlohydrátová skupina je zvolená ze skupiny mannóza, glukóza (D-glukóza), galaktóza, glukuronová kyselina, laktóza, maltóza, maltotrióza, maltotetraóza, maltoheptaóza a jejich směsi.
  12. 12. Sloučenina podle některého z nároků 1 až 8, kde uhlohydrátová skupina je D-glukóza.
  13. 13. Sloučenina podle některého z nároků 1 až 12, kde sloučenina obsahuje 1 až 7 uhlohydrátových skupin.
  14. 14. Sloučenina podle nároku 13, kde sloučenina obsahuje jednu uhlohydrátovou skupinu.
    • · ···· • · • ··· ·· ··· · ·« ·♦ « · · · · · · • · ·♦ * « ·
  15. 15. Sloučenina podle nároku 1 , kde tato sloučenina má vzorec Chol-L-Carb kde Chol je cholesterol,
    L je případná polyaminová skupina a Carb je glukóza, s výhodou D-glukóza.
  16. 16. Sloučenina podle některého z nároků 1 až 15 ve směsi nebo asociovaná s nukleotidovou sekvencí.
  17. 17. Způsob výroby sloučeniny podle některého z nároků 1 až 15, vyznačující se tím, že se ponechá reagovat sloučenina obsahující cholesterolovou skupinu a polyamin se sacharidem.
  18. 18. Sloučenina podle některého z nároků 1 až 15 nebo sloučenina připravená způsobem podle nároku 17 pro použití v lékařství.
  19. 19. Použití sloučeniny podle některého z nároků 1 až 15 nebo sloučeniny připravené způsobem podle nároku 17 pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení genetické poruchy nebo stavu nebo onemocnění.
  20. 20. Kationtový liposom vyrobený ze sloučeniny podle některého z nároků 1 až 15 nebo sloučeniny připravené způsobem podle nároku 17.
  21. 21. Způsob výroby kationtového liposomu, vyznačující se tím, že se kationtový liposom vytvoří ze sloučeniny
    - 45 φφ φφφφ • · • φφφ
    ΦΦ φφ φ φ φ φ φ φφ φφφφ φ φ φφ φφ φ φ · φ φφ φφ podle některého z nároků 1 až 15 nebo sloučeniny připravené způsobem podle nároku 17.
  22. 22. Kationtový liposom podle nároku 20 nebo kationtový liposom vyrobený způsobem podle nároku 21 pro použití v lékařství.
  23. 23. Použití kationtového liposomú podle nároku 20 nebo kationtového liposomú připraveného způsobem podle nároku 21 pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení genetické poruchy nebo stavu nebo onemocnění.
  24. 24. Kombinace nukleotidové sekvence a jedné nebo více složek zvolených ze skupiny: sloučenina podle některého z nároků 1 až 15, sloučenina připravená způsobem podle nároku 17, kationtový liposom podle nároku 20, nebo kationtový liposom připravený způsobem podle nároku 21.
  25. 25. Kombinace podle nároku 24 pro použití v lékařství.
  26. 26. Použití kombinace podle nároku 24 pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení genetické poruchy nebo stavu nebo onemocnění.
  27. 27. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, ž e obsahuje sloučeninu podle některého z nároků 1 až 15 nebo sloučeninu připravenou způsobem podle nároku 17 spolu s farmaceuticky účinnou látkou, a popřípadě spolu s farmaceuticky přijatelným ředivem, nosičem nebo pomocnou látkou.
    ·· ··«·
  28. 28. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, ž e obsahuje kationtový liposom podle nároku 20, nebo kationtový liposom připravený způsobem podle nároku 21 spolu s farmaceuticky účinnou látkou, a popřípadě spolu s farmaceuticky přijatelným ředivem, nosičem nebo pomocnou látkou.
  29. 29. Sloučenina nebo kationtový liposom v podstatě tak, jak jsou zde popsány, a podle kteréhokoli z obrázků.
  30. 30. Způsob v podstatě tak, jak je zde popsán, a podle kteréhokoli z obrázků.
    Zastupuje:
CZ20031636A 2000-12-12 2001-12-05 Sloučenina schopná působení jako kationtový lipid CZ20031636A3 (cs)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/GB2000/004767 WO2001048233A1 (en) 1999-12-23 2000-12-12 Viral core protein-cationic lipid-nucleic acid-delivery complexes
GB0113781A GB2372502B (en) 2000-12-12 2001-06-06 Carbohydrate compounds containing cholesterol and their use

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ20031636A3 true CZ20031636A3 (cs) 2003-11-12

Family

ID=9916033

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20031637A CZ298560B6 (cs) 2000-12-12 2001-12-05 Zpusob výroby modifikovaného lipidu a smes
CZ20031636A CZ20031636A3 (cs) 2000-12-12 2001-12-05 Sloučenina schopná působení jako kationtový lipid

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20031637A CZ298560B6 (cs) 2000-12-12 2001-12-05 Zpusob výroby modifikovaného lipidu a smes

Country Status (4)

Country Link
US (2) US20020188023A1 (cs)
EP (1) EP1377673A2 (cs)
CZ (2) CZ298560B6 (cs)
DK (1) DK1351972T3 (cs)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NO328803B1 (no) * 2000-03-03 2010-05-18 Thia Medica Nye fettsyreanaloger
WO2004000854A1 (en) * 2002-06-20 2003-12-31 Ic Vec Limited Sulfur-containing phospholipid derivatives
DE10236146A1 (de) * 2002-07-31 2004-02-19 Basf Coatings Ag Beschichtungsstoff, Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung
US7906122B2 (en) * 2003-06-18 2011-03-15 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jersusalem Sphingoid polyalkylamine conjugates for Hepatitis B virus vaccination
WO2004110499A1 (en) * 2003-06-18 2004-12-23 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Sphingolipids polyalkylamine conjugates for use in transfection
GB0418172D0 (en) * 2004-08-13 2004-09-15 Ic Vec Ltd Vector

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL31160A0 (en) * 1967-12-04 1969-01-29 Bayer Ag Basically substituted oximes of 5h-dibenzo-(a,d)-10,11-dihydro-cyclohepten-5-one and their production
NL6818074A (cs) * 1968-12-17 1970-06-19
CH574396A5 (cs) * 1969-12-29 1976-04-15 Richter Gedeon Vegyeszet
US4189431A (en) * 1975-08-04 1980-02-19 The Board of Trustees of Leland Stanford Junior University Alkinyl terminating groups in biogenetic-like cyclizations to steroids
JPH0198494A (ja) * 1987-10-09 1989-04-17 Agency Of Ind Science & Technol バイオリアクター
US5283185A (en) * 1991-08-28 1994-02-01 University Of Tennessee Research Corporation Method for delivering nucleic acids into cells
US5510510A (en) * 1994-05-10 1996-04-23 Bristol-Meyers Squibb Company Inhibitors of farnesyl protein transferase
US5837533A (en) * 1994-09-28 1998-11-17 American Home Products Corporation Complexes comprising a nucleic acid bound to a cationic polyamine having an endosome disruption agent
US5668272A (en) * 1995-06-30 1997-09-16 National Research Council Of Canada Method for producing synthetic N-linked glycoconjugates

Also Published As

Publication number Publication date
CZ20031637A3 (cs) 2003-11-12
CZ298560B6 (cs) 2007-11-07
EP1377673A2 (en) 2004-01-07
US20020188023A1 (en) 2002-12-12
DK1351972T3 (da) 2006-05-08
US20040081687A1 (en) 2004-04-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69324367T2 (de) Kationische lipide
Volmer et al. Synthesis and biological evaluation of amphotericin B derivatives
US5965434A (en) Amphipathic PH sensitive compounds and delivery systems for delivering biologically active compounds
US5451661A (en) Process for making lipid conjugates
CN103189057B (zh) 大环脂类化合物及其应用
JP2000502061A (ja) カチオン脂質複合体
Perouzel et al. Synthesis and formulation of neoglycolipids for the functionalization of liposomes and lipoplexes
CZ20031636A3 (cs) Sloučenina schopná působení jako kationtový lipid
AU687557B2 (en) Compositions and methods for cell transformation
RU2290409C2 (ru) Способ получения соединений, композиция для приготовления лекарственного средства
US5780444A (en) Compositions and methods for cell transformation
AU2002222128A1 (en) Lipids comprising an aminoxy group
US20050064023A1 (en) Compound
GB2372502A (en) Cholesterol-carbohydrate compound for treating genetic disorders
EP1669366A1 (en) Lipids comprising an aminoxy group
US20050287202A1 (en) Compound
HK1057048B (en) Lipids comprising an aminoxy group
ES2288472T3 (es) Lipidos bipolares y su uso para la liberacion de sustancias bioactivas.
CA2364730A1 (en) Lipids comprising an aminoxy group
WO2025051994A1 (en) Ionizable lipid nanoparticles