CZ295412B6

CZ295412B6 - Monoklonální protilátka a koktejl protilátek, které se specificky vážou ke konzervovanému epitopu prionových proteinů, buněčné linie produkující tyto protilátky a způsob detekce PrP-Sc proteinu

Info

Publication number: CZ295412B6
Application number: CZ200225A
Authority: CZ
Inventors: Katherine I. O´Rourke
Original assignee: The United States Of America, As Represented By Th
Priority date: 1999-07-15
Filing date: 2000-07-14
Publication date: 2005-08-17
Also published as: EP1212082A1; EA200200164A1; CZ200225A3; US6261790B1; MXPA02000445A; PL199345B1; ZA200200969B; NO20020190L; UA72532C2; CN1450909A; CA2379349A1; PL354512A1; EE200200009A; JP2003504087A; WO2001005426A1; NZ517075A; NO20020190D0; EA005239B1; IL147517A0; EP1212082A4

Abstract

Monoklonální protilátka, která se specificky váže ke konzervovanému epitopu prionových proteinů označenému jako Gln-Tyr-Gln-Arg-Glu-Ser a která je schopná vázat PrP-Sc protein ve fixované nebo nefixované tkáni, jež byla upravena tak, aby se odmaskoval epitop PrP-Sc proteinu a eliminovala dostupnost odpovídajícího epitopu PrP-buněčného proteinu. Dále se řešení zabývá hybridomovou buněčnou linií uloženou pod přírůstkovým číslem ATCC HB-12696 produkující a sekretující tuto monoklonální protilátku a koktejlem monoklonálních protilátek obsahujícím výše uvedenou monoklonální protilátku v kombinaci s druhou monoklonální protilátkou, která se specificky váže k druhému konzervovanému epitopu prionových proteinů. Jedna nebo obě monoklonální protilátky koktejlu mohou rozpoznat epitopy přítomné u všech savčích druhů, navzdory mezidruhovým variacím i variacím uvnitř živočišných druhů, jako jsou například přežvýkavý dobytek, kočky, norek, člověk nebo nehumánní primáti. Předmětem řešení je také imunoanalytický způsob detekce PrP-Sc proteinu u zvířete nebo člověka. Řešení lze využít pro detekci prionu nebo proteinu PrP-Sc, jako markeru přenosných spongiformních encefalopatií (TSE).ŕ

Description

Monoklonální protilátka a koktejl protilátek, které se specificky vážou ke konzervovanému epitopu prionových proteinů, buněčné linie produkující tyto protilátky a způsob detekce PrP-Sc proteinu

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká detekce prionového proteinu (také označovaného jako PrP-Sc protein) jako markéru přenosných spongiformních encefalopatií (TSE). Obzvláště se vynález týká a) monoklonálních protilátek, které se specificky váží na konzervovaný epitop prionových proteinů a b) koktejlu monoklonálních protilátek obsahujícího monoklonální protilátku v kombinaci s druhou monoklonální protilátkou, která se specificky váže k druhému konzervovanému epitopu prionových proteinů. Nové protilátky a koktejl protilátek jsou užitečné v imunoanalýzách k detekci prionových proteinů u přežvýkavců a dalších druhů, u kterých se TSE vyskytuje přirozeně, nebo u příbuzných druhů potenciálně exponovaných TSE.

Dosavadní stav techniky

Přenosné spongiformní encefalopatie (TSE) jsou heterogenní skupinou fatálních neurodegenerativních onemocnění, které se vyskytují u člověka, přežvýkavých býložravců, norků a koček. Ovčí scrapie je prototypem této skupiny. TSE jsou charakterizovány depozicí prionových proteinů (také označovaných jako PrP-Scrapie, neboli PrP-Sc), infekční formy proteinů, v centrálním nervovém systému postižených jedinců. Priony byly definovány jako malé proteinové infekční partikule, které odolávají inaktivaci postupy, které modifikují nukleové kyseliny. Termín „prion“ vznikl stažením slov „protein“ a „infekce“ a priony jsou tvořeny většinou, pokud ne exkluzivně, molekulami PrP-Sc kódovaným genem PrP. Prionová onemocnění jsou často nazývána spongiformní encefalopatie kvůli post mortem mikroskopickému nebo histopatologickému vzhledu mozku infikovaných živočichů s velkými vakuolami v kůře a v mozečku. Prionové proteiny jsou nerozpustné, na proteázy rezistentní glykoproteiny vzniklé z posttranslační modifikace normálních savčích glykoproteinů (PrP-buněčný, neboli PrP-C) a depozice PrP-Sc proteinu, abnormální izoformy PrP-C sialoglykoproteinu v centrálním nervovém systému je spolehlivým markérem TSE infekce.

Nejstudovanějšími TSE u živočichů pěstovanými na potravu zahrnují scrapie u ovcí a koz, bovinní spongiformní encefalopatií (BSE) u dobytka (také známa jako nemoc šílených krav) a chronická chřadnoucí choroba (CWD) u severoamerických jelenů a losů. Další TSE u živočichů zahrnují přenosnou encefalopatií norků (TME) a felinní spongiformní encefalopatií (FSE) domácích i nedomestikovaných koček. Nedávno byla zaznamenána TSE non-humánních primátů chovaných v zoo ve Francii, toto onemocnění se pravděpodobně vyvinulo z BSE (Bons et al„ Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 96:4046-4051 (1999)). Prionová onemocnění člověka byla také identifikována. Tato onemocnění zahrnují: Creutzfeld-Jakobovo onemocnění (CJD), Gerstman-Straussler-Scheinkerův syndrom (GSS), fatální familální insomnie (FFI) a kuru.

Přenosná látka u těchto onemocnění zůstává kontroverzní. Jak je však uvedeno výše, je hlavní složkou v infekčním materiálu nerozpustná izoforma (prion neboli PrP-Sc) savčího sialoglykoproteinu (PrP-buněčný, neboli PrP-C). Zdá se, že izoforma prionového proteinu vyvolávající scrapie (PrP-Sc) je nezbytná pro přenos i patogenezi přenosných neurogenerativních onemocnění živočichů i člověka (viz SB Prusiner, Science 252:1515-1522 (1991) a SB Prusiner, Prceedings of the Acedemy of Sciences of the United States of America 95:13363-13383 (1998)). Hlavní hypotéza spočívá vtom, že prionová onemocnění jsou výsledkem konverze PrP-C na PrP-Sc nukleací nebo polymerací.

-1 CZ 295412 B6

Výskyt nových přenosných spongiformních encefalopatií u dobytka ve Spojeném království a v Evropě a u jelenů v částech Spojených států zvýraznil potřebu spolehlivých diagnostických testů. Dále epizoocismus TSE u dobytka a uvedený vztah k nové variantě lidské CreutzfeldJakobově chorobě (ME Bruče et al., Nátuře 389:498-501 (1997 a AF Hill et al., Nátuře 389:448-450 (1997) zvýšily veřejné i vědecké povědomí o těchto relativně vzácných onemocněních, a zvýšily potřebu preklinické detekce TSE. Ačkoli ve Spojených státech nebyly zaznamenány žádné případy BSE, jsou citlivé imunohistochemické techniky a preklinické detekční metody základem pro detekci, vyhledávání a kontrolu TSE.

Prionová onemocnění mohou mít dlouhou inkubační dobu. Například u ovcí může inkubační doba trvat 3 až 5 let od doby, kdy jsou zvířata infikována, až do prvních projevů onemocnění. U bovinní spongiformní encefalopatie (BSE) může trvat dva až osm let od doby, kdy jsou zvířata infikována, až do prvních projevů onemocnění. Infikovaná zvířata a lidé nemají ani imunitní odpověď specifickou vůči onemocnění, ani konzistentní biochemické, hematologické a výrazné patologické abnormality. Časná diagnóza přenosných spongiformních encefalopatií může být proto závislá na vzhledu klinických příznaků, elektroencefalografie nebo na invazivních metodách založených na biopsiích mozku. Potvrzení TSE je dosaženo postmortem mikroskopickým nebo histologickým vyšetřením mozkové tkáně suspektních případů. Postmortem histopatologická diagnóza TSE přežvýkavců je založena na vzhledu neuronální vakuolace, spongiformních změnách, glióze a astrocytóze. Tyto znaky se však mohou lišit v intenzitě a v anatomické lokalizaci v závislosti na hostiteli, na individuálních podmínkách, genetice hostitele, stadiu onemocnění a na infekčním zdroji. Diagnóza pomocí histopatologie samotné může být nepříznačná v časných stadiích a obvykle nemožná u autolyzované tkáně.

Depozice prionového proteinu (PrP-Sc) v centrálním nervovém systému je spolehlivý markér TSE. Imunohistochemická detekce PrP-Sc je proto důležitým doplňkem histopatologického vyšetření v diagnostice, vyhledávání a v kontrole TSE. Monoklonální protilátka 263K3F4 US patent 4 806 627) detekuje PrP-Sc u křečků a u člověka a má široké použití v diagnostických stanovení i v patologických studiích TSE u člověka. Eílavní nevýhodou této protilátky je, že nereaguje s PrP ovcí a dobytka (RJ Kascak et al., Immunological Investigations 26:259-268 (1997)). Králičí antiséra reagující s PrP-Sc přežvýkavců mají nevýhody v tom, že nemohou být standardizována pro široké použití pro omezení týkající se množství a specifity. Monoklonální protilátky jsou preferovány v králičích antisérech, protože jejich množství není omezeno a specifita může být přesně definována na úrovni jednoho epitopu. Specifita však může být překážkou u druhů s polymorfními PrP geny. Záměna jedné báze vedoucí k aminokyselinové náhradě v epitopu může eliminovat vazbu protilátkou. Lidský PrP gen má alespoň 18 patogenních mutací vedoucích k vrozeným prionovým onemocněním (J Collinge et al., Philos Trans Royal Soc London (Biol) 343:371-378 (1994)) a celou řadu nepatogenních mutací, z nichž jedna z nich je (kodón 129) sdružena s predispozicí k iatrogenní, sporadické a variantní Creutzfeld Jakobově nemoci (J Collinge et al., Lancet 337:1441-1442 (1991), MS Palmer et al., Nátuře 352: 340-342 (1991), M Zeidler et al., Lancet 350:668 (1997). M Horiuchi et al., (Joumal of Generál Virology 76:2583-2587 (1995)) popisují panel syntetických peptidů, které generují monoklonální a polyklonální protilátky, které reagují s PrP-buněčným, (protein nemající vztah k onemocnění) v imunoblotech vybraných ovčích a dobytčích tkání. Autoři nezaznamenali účinnost detekce izoformy PrP-Sc mající vztah k onemocnění. Navíc nezaznamenali účinnost detekce izoformy PrP-Sc buďto PrP-C, nebo PrP-Sc v tkáních fixovaných formalinem.

Post mortem diagnóza prionových onemocnění je prováděna za použití histologických a imunochemických stanovení v mozkové tkáni. Ante-mortem testování u člověka se suspektní CJD je prováděna imunohistochemickým a histologickým vyšetřováním biopsií mozku. Navíc jedinci s novou variantou CJD mající vztah k expozici vůči BSE mají PrP-Sc akumulaci v lymfoidních tkáních (AF Hill et al., Lancet 349:99(1997)). Přítomnost PrP-Sc vlymfoidní tkáni odlišuje variantu CJD od sporadického nebo familiárního onemocnění. Protože biopsie mozku u přežvýkavců není možná, je alternativním přístupem založeným na pozorování J Hadlowa et al (The Joumal of Infectious Diseases 146:657-664 (1982)) biopsie vybraných lymfatických uzlin.

-2CZ 295412 B6

Hadlow et al demonstroval, že infekčnost byla detekovatelná v určitých lymfatických uzlinách (retrofaryngeálních, tonsilámích, mezenterických, prekapsulárních, bronchiálně-mediastinálních a splenických) a v lymfoidní tkáni ve střevě ovcí infikovaných scrapie. Studie Hadlowa, provedené před objevem prionového proteinu, detekovaly infektivitu inokulací myší. Race et al. (Američan Joumal of Veterinary Research 53:883-889 (1992)), Ikegami et al. (Veterinary Record 128:271-275 (1991)), a van Keulen et al. (Joumal of Clinical Microbiology 34:1228-1231 (1996)) provedli podobná stanovení pomocí Western imunoblotů nebo imunohistochemických stanovení vybraných lymfatických uzlin za použití polyklonálních antisér. Biopsie tonsilámí tkáně lidí s klinickými příznaky variantní CJD je méně invazivním postupem než biopsie mozku a imunostanovení lymfoidní tkáně může být použito k diagnóze variantní CJD a diferenciaci od familiární, iatrogenní a sporadické CJD. U přežvýkavého dobytka však zahrnují hlavní nevýhody odběrů tonsilámí nebo lymfoidní tkáně následující: Odběr těchto vnitřních tkání vyžaduje druhé invazivní metody zahrnující celkovou anestézii s příslušnými riziky a zotavovacím obdobím; lymfoidní tkáně ovcí jsou často infikovány bakterií Corynebacterium pseudotuberculosis, která ničí architekturu uzliny a omezuje její použití v těchto stanoveních; a tonsilámí tkáň zachycuje antigeny okolního prostředí včetně fungálních antigenů, z nichž některé zkříženě reagují s PrPSc, což dává nepříznačné nebo falešně pozitivní imunohistochemické reakce, které musí být řešeny technicky zatěžující analýzou Western blotem. V nedávné době popsali O'Rourke et al., (The Veterinary Record, květen 2, 1998, strany 489-491) neinvazivní diagnostické stanovení pro preklinickou detekci PrP-Sc u ovcí při použití lymfoidní tkáně mrkací membrány (třetí oční víčko).

Současná US Federal omezení vyžadují zničení ovce infikované scrapie a některé státy vyžadují zničení všech ovcí ve stádě narozených během 60-denního období po narození jehněte ovce, u které bylo následně diagnostikováno scrapie. Takové eradikační postupy jsou pro průmysl velmi nákladné. Americké ovce jsou navíc velké, s velkým množstvím masa a jsou rychle rostoucí. V mnoha cizích zemích jsou tendence nakupovat americké ovce pro genetické účely, ale neděje se tak kvůli přítomnosti scrapie.

Epidemie BSE ve Spojeném království a v Evropském společenství stálo výrobce a konzumenty přímé ztráty na dobytku a nepřímé ztráty trhů s hovězím masem a produktů z hovězího masa zahrnující ekonomicky důležité farmaceutické produkty. Země celého světa produkující ovce a hovězí dobytek provádějí nákladnou depistáž a karanténní programy k udržení svého stavu jako „bez BSE“. Co je důležitější, údaje z několika výzkumných dotazníků poskytly silný důkaz, že infekce BSE infikovala lidi ve Velké Británii. Rozsah této nové choroby musí být ještě určen.

Co je potřeba, je praktický imunoanalytický reagenční systém vhodný pro detekci PrP-Sc v tkáních člověka, živočichů chovaných kvůli potravě, domácích zvířat a nedomestikovaných zvířat v zoo. Činidla v analýze musí být vhodná pro detekci PrP-Sc u jedinců s různými PrP genotypy u každého druhu, a citlivá a specifická, jsou-li použita v celé řadě standardních laboratorních protokolů.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález je obecně zaměřen na detekci prionových nebo PrP-Sc proteinů jako markérů přenosných spongiformních encefalopatií.

Prvním aspektem předmětu vynálezu je monoklonální protilátka, která se specificky váže ke konzervovanému epitopu prionových proteinů označenému jako Gln-Tyr-Gln-Arg-Glu-Ser, a která je schopná vázat PrP-Sc protein ve fixované nebo nefixované tkáni, jež byla upravena tak, aby se odmaskoval uvedený epitop PrP-Sc proteinu a eliminovala dostupnost odpovídajícího epitopu PrP-buněčného proteinu.

-3 CZ 295412 B6

Druhým aspektem předmětu vynálezu je hybridomová buněčná linie uložená pod přírůstkovým číslem ATCC HB-12696 produkující a sekretující monoklonální protilátku, která se specificky váže ke konzervovanému epitopu prionových proteinů, označenému jako Gln-Tyr-Gln-ArgGlu-Ser, a která váže PrP-Sc protein ve fixované nebo nefixované tkáni, jež byla upravena tak, aby se odmaskoval uvedený epitop PrP-Sc proteinu a eliminovala dostupnost odpovídajícího epitopu PrP-buněčného proteinu.

Třetím aspektem předmětu vynálezu je koktejl monoklonálních protilátek obsahující první monoklonální protilátku, jež obsahuje monoklonální protilátku podle prvního aspektu předmětu vynálezu, v kombinaci s druhou monoklonální protilátkou, jež obsahuje monoklonální protilátku, která se specificky váže k druhému konzervovanému epitopu prionových proteinů označenému jako Ile-His-Phe-Gly, a která je schopná vázat PrP-Sc protein ve fixované nebo nefixované tkáni, jež byla upravena tak, aby se odmaskoval uvedený epitop PrP-Sc proteinu a eliminovala dostupnost odpovídajícího epitopu PrP-buněčného proteinu.

Druhá protilátka je popsána v US patentu 6 165 784. Překvapivě bylo zjištěno, že kombinace (zde označovaná jako koktejl monoklonálních protilátek) protilátek k nepřekrývajícím se, odděleným epitopům poskytuje optimální kombinaci vysoké citlivosti definované specifity a široké reaktivity k PrP proteinům navzdory mezidruhovým variacím i variacím uvnitř druhu. Jednanebo obě monoklonální protilátky v tomto koktejlu mohou rozpoznávat epitopy nacházející se ve všech savčích druzích, u kterých byla zaznamenána přirozená TSE a u celé řady blízce příbuzných druhů.

Čtvrtým aspektem předmětu vynálezu je imunoanalytický způsob detekce PrP-Sc proteinu u zvířete nebo člověka, jehož podstata spočívá v tom, že se (1) získá tkáň od zvířete nebo člověka, kteří mají být testováni;

(2) tkáň se fixuje nebo zmrazí;

(3) fixovaná nebo zmrazená tkáň se upraví tak, aby se odmaskovaly epitopy PrP-Sc proteinu a eliminovala dostupnost odpovídajícího epitopu PrP-buněčného proteinu;

(4) upravená tkáň se uvede do styku s monoklonálními protilátkami, které zahrnují a) monoklonální protilátky podle nároku 1 nebo b) koktejl monoklonálních protilátek podle nároku 5 v takovém množství a za takových podmínek, že protilátky váží PrP-Sc protein, pokud je přítomen v tkáni, a (5) detekuje se přítomnost řečených navázaných protilátek.

Imunoanalytické způsoby podle vynálezu zahrnují imunohistochemická stanovení a Western blot. Protilátky jsou užitečné k detekci PrP-Sc ve fixované nebo nefixované tkáni jako markér přítomnosti infekce TSE. Při těchto způsobech se používá protilátky podle prvního aspektu předmětu vynálezu nebo/a koktejlu protilátek podle třetího aspektu předmětu vynálezu. Protilátka podle prvního aspektu předmětu vynálezu a koktejl protilátek podle třetího aspektu předmětu vynálezu mohou být použity k neinvazivnímu diagnostickému stanovení za použití lymfoidní tkáně oční mžurky k detekci PrP-Sc, jak je popsáno v US patentu 6 165 784. Mrkací membrána mžurky (palpebra tertia) přežvýkavých živočichů se skládá z chrupavčité pochvy s povrchovými lymfoidními folikuly a seromucinózní sekreční žlázy pod spojivkou bulbámího povrchu. Přežvýkaví živočichové zahrnují ovci, kozu, jelence ušatého a losa, a hovězí dobytek, které mají mžurku. Vzorek lymfoidní tkáně sdružené s mrkací membránou může být snadno odebrán otočením mžurky. Typicky jsou viditelné dvě skupiny lymfoidní tkáně nad bledší glandulámí tkání. Biopsie lymfatické uzliny může být provedena za použití pouze lokálního anestetika. Odebraný vzorek tkáně je poté podroben imunohistochemickým nebo dalším bílkovinu detekujícím stanovením, které jsou schopné detekovat prion nebo PrP-Sc, pokud jsou přítomny v tkáni. Proto

-4CZ 295412 B6 představuje mžurka snadno získatelný vzorek pro testování tkáně živých zvířat, který je odebrán při porážce. Tento detekční způsob poskytuje mnohem potřebnější praktický způsob pro častou detekci PrP-Sc a poskytuje prostředek pro preklinickou diagnózu TSE.

Ve shodě s tímto zjištěním je cílem vynálezu poskytnout monoklonální protilátky, které rozpoznávají konzervovaný epitop prionového proteinu a panspecifícký koktejl protilátek, který obsahuje monoklonální protilátky proti nepřekiývajícím se, odděleným epitopům na prionových proteinech živočišných druhů, u kterých se TSE vyskytuje přirozeně (člověk, dobytek, ovce, kozy, jeleni, norci, domácí a nedomestikované kočky, několik druhů nedomestikovaných přežvýkavých zvířat a mnoho druhů nehumánních primátů umístěných v zoo) a dalších blízce příbuzných druhů potenciálně exponovaných infekci TSE. Protilátky detekují PrP-Sc ve fixované, upravené tkáni jako markér přítomnosti infekce TSE a poskytují citlivou reagenční směs pro diagnózu TSE. Tyto monoklonální protilátky proti konzervovaným epitopům na PrP-Sc poskytují specifický, spolehlivý a flexibilní prostředek pro přesnou diagnózu TSE. Použití protilátek zahrnuje jejich použití jako činidla pro standardizovaná diagnostická testování a komparativní patologické studie.

Dalším cílem vynálezu je poskytnout způsoby detekce prionu nebo PrP-Sc jako markéru TSE zahrnující preklinickou detekci infikovaných živých zvířat a postmortem detekční způsoby.

Dalším cílem vynálezu je poskytnutí neinvazivních diagnostických stanovení založených na biopsii lymfoidní tkáně mžurky („třetího očního víčka“) a detekci PrP-Sc in šitu jako praktického způsobu časné detekce PrP-Sc.

Ještě další cíl vynálezu zahrnuje imunoanalytické způsoby užitečné v diagnostických a patogenetických studiích TSE u přežvýkavců a u člověka, a užitečné pro detekci, vyhledávání a kontrolu TSE.

Další cíle a výhody vynálezu se stanou snadno zřejmými z následujícího popisu.

Detailní popis vynálezu

V první formě vynálezu zahrnuje vynález monoklonální protilátky, které se specificky váží na konzervovaný karboxylový epitop prionových proteinů identifikovaných jako Gln-Tyr-GlnArg-Glu-Ser. Monoklonální protilátky se váží na epitop PrP proteinů ve fixované nebo zmražené tkáni, která byla upravena, aby se odmaskoval epitop na PrP-Sc a eliminovala dostupnost korespondujícího epitopu PrP-Sc. Pro účely tohoto vynálezu je termín prion nebo PrP-Sc definován jako protein mající vztah k onemocnění, který je markérem TSE. Protože protilátky detekují PrPSc ve fixované, upravené tkáni, nebo ve zmražené tkáni předem upravené proteinázou K, aby se degradoval PrP-C, jako markér přítomnosti infekce TSE, poskytují tyto protilátky citlivý způsob pro diagnózu TSE.

Protilátky, které jsou předmětem vynálezu, byly získány, jak je popsáno v příkladu 2 níže. Stručně řečeno byl syntetizován protein reprezentující ovčí rezidua 217-233 (bovinní rezidua 225241) Cys-Ile-Thr-Gln-Arg-Glu-Ser-Gln-Ala-Tyr-Tyr-Gln-Arg-Gly-Ala, a tento protein byl navázán k maleimidem aktivovanému KLH pro použití jako imunogen. Antiséra a monoklonální protilátky z inokulovaných myší byly analyzovány na reaktivitu k rekombinantnímu ovčímu PrP, aby byly vybrány zkříženě reagující protilátky. Později bylo prokázáno, že tyto protilátky reagují s PrP-Sc ve formalinem fixované, hydratované, autoklávované tkáni ovcí, severoamerických jelenů a dobytka.

Pro účely tohoto vynálezu jsou monoklonální protilátky, které se specificky váží ke konzervovanému epitopu PrP-Sc zahrnuté tímto vynálezem takové protilátky, které jsou specifické pro epitop produktu genu pro PrP-Sc, zahrnující peptid Gln-Tyr-Gln-Arg-Glu-Ser a detekují PrP

-5CZ 295412 B6

C v zmražené, neupravované tkáni a PrP-Sc ve fixované nebo zmražené, upravené tkáni. Příkladem monoklonálních protilátek, které se váží k tomuto konzervovanému epitopu ve fixované nebo nefixované, upravované tkáni je monoklonální protilátka F99/97.6.1 Izotyp protilátky je IgGl.

Vynález také zahrnuje imunoanalytické způsoby za použití protilátek, zahrnující imunohistochemické stanovení a Western bloting. Protilátky jsou užitečné k detekci PrP-Sc ve fixované nebo nefixované tkáni jako markér přítomnosti infekce TSE.

Dále vynález poskytuje koktejl monoklonálních protilátek obsahující výše uvedenou monoklonální protilátku v kombinaci s druhou monoklonální protilátkou, která se specificky váže k druhému konzervovanému epitopu produktu genu pro PrP u ovcí, severoamerických jelenů a dobytka, která je označována jako Ile-His-Phe-Gly. Tyto monoklonální protilátky jsou detailně popsány v patentu US 6 165 784, který je tímto začleněn do předkládaného vynálezu jako reference. Tento epitop byl dále identifikován jako zahrnující aminokyseliny 142-145 ovčího produktu genu pro PrP, kterážto sekvence je identická s aminokyselinami 142-145 produktu genu pro PrP severoamerických jelenů mule deer a Rocky Mountain elk a s aminokyselinami 150-153 bovinního produktu genu pro PrP. Protilátky mají další vlastnost, a to že mohou detekovat nemaskovaný epitop proteinu PrP-Sc ve fixované nebo zmražené tkáni a tedy jsou užitečné jako činidla pro diagnózu TSE u ovcí, koz, dobytka, severoamerických jelenů s přirozeně se vyskytující TSE. Přítomnost PrP-Sc indikuje infekci scrapie, bovinní encefalopatie nebo chronického chřadnoucího onemocnění u těchto zvířat.

Přítomnost monoklonálních protilátek, které se váží na konzervovaný epitop Ile-His-Phe-Gly nebo PrP-Sc ve fixované nebo zmražené upravené tkáni přežvýkavců je monoklonální protilátka F89/160.1.5. Izotyp této protilátky je IgGl. Imunohistochemické barvení monoklonální protilátkou F89/160.1.5 bylo podobné barvení popsanému v mozku ovcí postižených scrapie při použití polyklonálního králičího antiséra k ovčímu nebo křeččímu PrP. Dalším příkladem monoklonální protilátky, která se specificky váže k epitopu, vůči kterému je namířena monoklonální protilátka F89/160.1.5, je monoklonální protilátka F89/193.1.5.

Byla zaznamenána genetická variace u koz v aminokyselinovém reziduu v epitopu monoklonálních protilátek F89/160.1.5 a F89/192.1.5 (Ile až Met v kodónu 142) (W Goldman et al., Joumal of Generál Virology 77:2885-2891 (1996)) a mutace v ovčím genu v kodónu 141 (Phe až Leu), které hraničí s epitopem (ABossers et al., Joumal of Generál Virology 77:2669-2673 (1996). Ačkoli se tyto variace vyskytují pouze v malých subpopulacích těchto druhů, existuje možnost, že variace, nebo další dosud neidentifikované variace mohou zabránit vazbě těchto monoklonálních protilátek k prionovému proteinu. Je proto důležité mít k dispozici citlivé imunohistochemické techniky a preklinické detekční metody pro detekci, vyhledávání a kontrolu TSE včetně genetických variant.

Překvapivě bylo zjištěno, že kombinace (zde označovaná jako koktejl monoklonálních protilátek) protilátek k těmto dvěma nepřekrývajícím se, odděleným epitopům poskytuje optimální kombinaci o vysoké citlivosti, definované specifitě a široké reaktivitě kPrP proteinům navzdory mezidruhovým variacím a variacím uvnitř druhu. Koktejl monoklonálních protilátek, který je předmětem vynálezu se zdá, že detekuje všechny druhy a všechny známé variace, u kterých se TSE přirozeně vyskytuje. Protilátky detekují PrP-Sc v nefixované nebo fixované, upravené tkáni jako markér přítomnosti infekce TSE, a poskytují citlivou reagenční směs pro diagnózu TSE. Vyšetření sekvencí PrP deponovaných v GenBank (Tabulka 1) demonstruje, že koktejl protilátek bude detekovat epitopy na produktu genu pro PrP ovcí, dobytka, lidí, jelenů, norků, domácích koček a 56 druhů nedomestikovaných přežvýkavců a nehumánních primátů. Protilátky váží nepřekrývající se epitopy ve formalinem fixovaných tkáních, protože zdvojnásobení koncentrace každé z protilátek je méně citlivé než kombinace protilátek ve stejných koncentracích. Protilátky ke každému epitopu a koktejl protilátek detekují PrP-Sc ve fixované nebo zmražené, upravené tkáni jako markér přítomnosti infekce TSE, a poskytují citlivou reagenční směs pro diagnózu

-6CZ 295412 B6

TSE. Vzorky tkáně užitečné pro testování PrP-Sc zahrnují lymfoidní tkáň sdruženou s třetím očním víčkem, nekroptickou mozkovou tkáň, biopsii nebo nekropsii tkáně lymfatické uzliny, nebo biopsii či nekropsii sleziny. Monoklonální protilátka tvoří komplex antigen-protilátka a navázaná protilátka je detekovaná imunologickými způsoby, jako je například ELISA, Western 5 blot, dot blot, imunodekorace a imunocytochemie.

Údaj o deponování. Kontinuální buněčná linie (hybridom), která produkuje a sekretuje monoklonální protilátku F99/97.6.1 byla deponována 6. dubna 1999 v Americké sbírce typových kultur (Američan Type Culture Collection - ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, VA20110ío 2209 USA za podmínek Budapešťské dohody a bylo jí přiřazeno přírůstkové číslo ATCC HB129696. Kontinuální buněčná linie (hybridom), která produkuje a sekretuje monoklonální protilátku F89/160.1.5 byla deponována v ATCC za podmínek Budapešťské dohody a bylo jí přiřazeno přírůstkové číslo ATCC HB-12403. Kontinuální buněčná linie (hybridom) 11, která produkuje a sekretuje monoklonální protilátku F89/193.1.5 byla deponována v ATCC za podmínek Buda15 pešťské dohody a bylo jí přiřazeno přírůstkové číslo PTA-114.

Tabulka 1: Živočišné druhy, jejichž produkt PrP genu obsahuje epitop(y) Ile-His-Phe-Gly a/nebo Gln-Tyr-Gln-Arg-Glu-Ser

Addax nasomaculatus	Gorilla gorilla
Africké trpasličí kozy
Antilocarpa americana	Hippotragus niger
Aotus trivirgatus	Homo sapiens (human) všechny zaznamenané varianty
Ateles geoffroyi	Hylobates lar
Ateles paniscus x ateles fusciceps	Hylobates syndactylus
Bison bonascus	Macaca arctoides
Bos javanicus	Macaca fascicularis
Bos primigenius	Macaca fuscata
Bos taurus (dobytek)	Macaca mullata
Budoecas taxicolor	Macaca nemestrina
Callicebus moloch	Macaca sylvanus
Callithrix jacchus	Mandrillus sphinx
Camellus dromedarius	Meriones unguiculatus
Canis familiaris	Mus musculus
Capra hircus (koza), obě varianty	Mustela spp (norek)
Capra ibex nubiana	Mustela putorius
Cebus apella	Odocoileus hemionus hemionus (jelen)
Cercocebus aterrimus	Odocoileus viřginianus (jelen)
Cercocebus torquatus atys	Qryctolagus cuniculus
Cercopithecus diana	Ovibos moschatus
Cercopithecus mona	Ovis aries (domácí ovce, všechny zaznamenané varianty
Cercopithecus patas	Pan troglogytes
Cervus elaphus spp (jelen)	Papio Hamadryas
Cervus nippon dybowskii	Pongo pygmaeus
Chlorocebus aethiops	Presbytis francoisi
Colobus guereza	Saimiri sciureus
Equus caballus	Sigmodon fulviventer
Equus przewalskii	Sigmodon hispiedis
Felis catus	Sus scrofa
Gazella subgutturosa	Theropithecus gelada
Giraffa camelopardalis	Tragelaphus strepsiceros
	Trichosusrus vulpecula

Imunoanalytícké metody používající protilátky jsou také zahrnuty vynálezem. Stručně řečeno je k detekci PrP-Sc získán vzorek tkáně od testovaného jedince, tkáň je fixována, například konzervací ve formalinu nebo v paraformaldehydu, jak je známo v oboru. Dále je řez fixované tkáně upraven, aby se odmaskoval epitop k PrP-Sc a eliminovala dostupnost odpovídajícího epitopu PrP-buněčný, který je exprimován v tkáních od normálních zvířat. To může být pohodlně provedeno a) hydratovaným autoklávováním, například autoklávováním hydratovaných řezů ve vodě nebo pufru při teplotě 121 °C po dobu 20 až 30 minut s následným ochlazením; b) reakcí s 9599% kyselinou mravenčí po dobu 5 až 30 minut s nebo bez následného kroku hydratovaného autoklávování, nebo c) natrávením trypsinem (například 0,1% trypsinem po dobu 20 minut při teplotě 37 °C v Tris HC1 pufru, pH 7,6). Fixovaná, upravená tkáň je v kontaktu s monoklonální protilátkou nebo koktejlem monoklonálních protilátek, které jsou předmětem vynálezu v množství a za podmínek účinných k vazbě PrP-Sc proteinu, pokud je přítomen v tkáni. Jak je zmíněno v příkladech provedení vynálezu, způsobuje inkubace vzorku tkáně se zhruba 3-5 pg/ml buďto monoklonálních protilátek, nebo s koktejlem zhruba 3-5 pg/ml každé z protilátek ve vhodném pufru po dobu 30 minut navázání protilátky ke konzervovanému PrP-Sc epitopu. Navázaná protilátka je detekována postupy známu v oboru. V jednom aspektu je monoklonální protilátka navázaná k tkáňovým řezům detekována jejím kontaktem s detekovatelně označeným (enzymatickými, radioaktivními nebo fluorescenčními detekčními molekulami nebo biotinovýmí molekulami) antimyším imunoglobulinem (například IgGl) za podmínek takových, že označený imunoglobulinový antimyší globulin se váže k monoklonální protilátce a může být následně detekován aktivitou enzymové, radioaktivní nebo fluorescenční značky nebo vazbou biotinové značky k molekule avidin/streptavidinu označené enzymovými, radioaktivními nebo fluorescenčními molekulami. V přednostní formě vynálezu je detekce provedena sekvenční inkubací antimyšího imunoglobulinu, například biotinylovaného antimyšího IgG a křenovou peroxidázou označeného streptavidinu se zasahujícími promytími v pufru, například Tris-HCl-Tween 20. K detekci navázané protilátky je přidán indikátorový chromogen, jako je například AEC.

Alternativně je zmražená tkáň zhomogenizovaná v detergentu a upravená pomocí proteinázy K, aby se eliminoval 35K PrP-C proužek a objevily se charakteristické mnohočetné 28-32 proužky PrP-Sc fragmentů rezistentních na proteinázou K. Upravené proteiny jsou separovány na polyakrylamidových gelech a jsou přeneseny na filtry. Filtr je v kontaktu s monoklonální protilátkou, která je předmětem vynálezu, nebo s koktejlem monoklonálních protilátek, který je předmětem vynálezu v množství a za podmínek účinných k vazbě PrP-Sc proteinu, pokud je přítomen vtkáni. Protilátka nebo protilátkový koktejl je detekován, jak je popsáno výše, s výjimkou toho, že přednostním finálním detekčním krokem je krok schemiluminiscenčním substrátem.

Jak je diskutováno výše, jsou protilátky, které jsou předmětem vynálezu, užitečné v diagnostických a patogenetických studiích TSE.

Příklady provedení vynálezu

Následující příklady jsou zamýšleny pouze k další ilustraci vynálezu a nejsou zamýšleny, aby omezily rozsah vynálezu, který je definován patentovými nároky.

Příklad 1

Následující příklad popisuje detekční stanovení PrP-Sc za použití koktejlu podle vynálezu na ovčí lymfoidní tkáni.

Testovaná zvířata. Dvacet sedm ovcí chovu Suffolk nebo příbuzné chovy s černým obličejem ze stád bez známé expozice bahnicím infikovaným scrapie byly použity k odběru vzorků z mrkací membrány lymfoidní tkáně. Čtyřicet sedm ovcí ze stád exponovaných scrapie bylopoužito k nekroptickému odběru vzorků, minimálně byly odebrány mozek, retrofaryngeální lymfatická uzlina a

-8CZ 295412 B6 tonsila. Všechny tkáně byly negativní na PrP-Sc imunohistochemicky a u žádné nebyly prokázány léze charakteristické pro scrapie. Čtyřicet pět ovcí bylo odebráno zaživa a opět při nekropsii, nebo byly odebrány při eutanazii po zpozorování klinických příznaků scrapie. Minimálně byly odebrány lymfatická tkáň mozku a mrkací membrány. Vzorky mozku ze všech 45 ovcí byly pozitivní na akumulaci PrP-Sc a byla stanovena diagnóza scrapie podle National Veterinary Services Laboratories, Ames IA.

Stručně řečeno byly lymfoidní tkáň z mrkací membrány a/nebo retrofaryngeální uzliny připraveny za použití rutinních histopatologických zpracovávacích technik s výjimkou toho, že většina tkání byla dekontaminována kyselinou mravenčí (99%, jedna hodina) před zalitím. Tři mikronové řezy byly umístěny na skleněná sklíčka. Řezy byly zakódovány a zaslány do třech laboratoří na imunostaining. Všem laboratořím byla poskytnuta směs monoklonálních protilátek F89/160.1.5 a F99/97.6.1 ve finální koncentraci 0,5 mg/ml každé protilátky. Vzorky byly také retestovány v zařízení US Department of Agriculture, Agricultural Research Service, Animal Disease Research Unit (USDA, ARS, ADRU). Vzorky v ADRU a laboratoři 1 byly analyzovány za použití Ventana Medical systems, lne., automatizovaného imunobarvení a činidel doporučovaných výrobcem pro detekci křenovou peroxidázou/AEC (ADRU) detekci alkalickou fosfatázou/Fast Red (laboratoř 1). V laboratoři 2 byly řezy barveny za použití DAKO automatizovaného barvení Dako reagencí, a v laboratoři 3 bylo použito automatizované kapilární imunobarvení s činidly popsanými dříve (JM Miller et al, Joumal of Veterinary Diagnosis Investigation 6:366368 (1994)). Výsledky byly tabulovány v ADRU.

Z 27 ovcí, u kterých nebyla známa expozice vůči scrapie, bylo 26 skórováno jako negativní ve všech laboratořích; jeden vzorek byl skórován jako pozitivní jednou laboratoří (laboratoř 3). Ze 47 ovcí exponovaných infekci scrapie, ale bez důkazu PrP-Sc v mozku nebo lymfatických uzlinách za použití imunobarvení v ADRU, bylo 42 skórováno jako negativní všemi třemi laboratořemi. Pět vzorků bylo skórováno jako pozitivní laboratoří 3. Z 45 ovcí s onemocněním scrapie diagnostikovaným pozitivním PrP-Sc imunobarvením v mozku, bylo 44 pozitivních při retestování v ADRU, 43 bylo pozitivních v laboratořích 2 a 3.

Celkově tento přehled demonstroval, že koktejl monoklonálních protilátek F89/160.1.5 a F99/97.6.1 detekuje PrP-Sc v lymfoidních tkáních ovcí za celé řady konvenčních laboratorních podmínek. Imunohistochemické stanovení lymfoidní tkáně třetíhoočního víčka je citlivým (93%) a specifickým (100%) diagnostickým testem pro ovčí scrapie. Infikované ovce mohou být identifikovány v přibližně jedné třetině inkubační doby. Stanovení je také užitečné ve studiích genetické vnímavosti, způsobu přenosu a patogeneze. Široká druhová reaktivita monoklonálních protilátek F89/160.1.5 a F99/97.6.1 činí tento koktejl reagencií vhodným pro imunohistochemická a imunoblotová stanovení neurálních a extraneurálních tkání od všech druhů s přirozeně se vyskytující TSE a pro vyhledávání příbuzných živočišných druhů exponovaných TSE v polních podmínkách a v zoologických zahradách.

Příklad 2

Následující příklad popisuje přípravu a charakterizaci monoklonálních protilátek, které specificky váží konzervovaný epitop PrP-Sc u přežvýkavců a dalších živočichů a lidí.

Stručně řečeno bylo pět myší imunizováno KLH syntetizovaným peptidem reprezentujícím aminokyseliny 217-233 produktu ovčího PrP genu (aminokyseliny 225-241 produktu bovinního PrP genu). Antiséra a hybridomové supematanty byly analyzovány ELISA stanovením za použití rekombinantního ovčího fúzního PrP proteinu jako antigenu, jak je popsáno v patentu US 6 165 784. Buněčná linie 99/97 produkovala protilátky reagující v ELISA stanovení a byla vybrána pro dva cykly klonování omezeným ředěním. Hybridomové buňky z dvojitě klonované linie (F99/97.6.1) byly přeneseny do in vitro produkčního systému arteficiální kapilární buněčné

-9CZ 295412 B6 kultury. Supernatant buněčné kultury s monoklonální protilátkou F99/97.6.1 (IgGl) s koncentrací 2 až 4 mg/ml byl dále charakterizován mapováním epitopu, imunoblotem a imunohistochemicky.

Materiál a metodika

Příprava antigenu a tvorba monoklonální protilátky. Peptid NH₂-Cys-Ile-Thr-Gln-Tyr-ArgGlu-Ser-Gln-Ala-Tyr-Tyr-Gln-Arg-Gly-Ala-COOH představující rezidua 225-241 bovinního prionového genu (Horiuchi et al., výše) byl syntetizován a navázán k maleimidem aktivovanému klíštěcímu hemocyaninu (KLH) (Pierce Chemical Company). Pět 6-týdenních BALB/c myší bylo inokulováno subkutánně na dvou místech celkem 10 pg konjugovaného peptidu emulzifikovaného ve 200 pl Freudnova kompletního adjuvans. Ve 14 denních intervalech byly podány dvě posilovači inokulace 10 pg konjugovaného peptidu ve 200 pl Freundova nekompletního adjuvans. Séra sbíraná venepunkcí ocasní žíly byla analyzována ELISA stanovením za použití rekombinantního ovčího PrP-C jako antigenu (viz níže). Tři dny před buněčnou fúzí byly myši imunizovány intravenózně 10 pg konjugovaného peptidu ve fosfátovém pufru (PBS) bez adjuvans. Buněčná fúze a klonování omezeným ředěním byly provedeny podle standardních protokolů (WM Yokoyama, v: JE Coligan (ed). Current Protocols in Immunology, Wiley Intersciences, New York, str. 2.2.1-2.5.17 (1994)). Supematanty z primárních a klonovaných hybridomů byly analyzovány pomocí ELISA stanovení s rekombinantním ovčím PrP-C. Klon 6.1 z buněčné linie F99/97 byl vybrán a přenesen do arteficiálního kapilárního systému buněčných kultur (CellMax, CellCo lne.) pro in vitro tvorbu supematantu s monoklonální protilátkou. Supematanty byly sbírány denně a shromažďovány. Izotyp s těžkým řetězcem byl identifikován ELISA stanovením a koncentrace monoklonální protilátky imunodifuzí.

Tvorba rekombinantního ovčího PrP-C vEscherichia coli. Genomická DNA byla izolována z mononukleámích buněk periferní krve ovce Suffolk. PrP otevřený čtecí rámec byl amplífikován pomocí hraničících primerů (D Westaway et al., Genes Devel. 8:959-969 (1994)) modifikovaných, aby inkorporovaly EcoRI restrikční místa:

dopředný primer: 5-ATCGAATTCAAGAAGCGACCAAAAC-3 reverzní primer: 5-ATCGAATTCAGACACCACCACT-3'.

700 bp PCR produkt byl natráven pomocí EcoRI, purifikován na agarózovém gelu a ligován do vektoru pMal-cRI. Transformace kmene E.coli DH5 byla provedena následujícími konvenčními technikami. Transformanty byly analyzovány pomocí PCR miniprepů kolonií za použití klonovacích primerů. Jeden pozitivní klon (shPrP-Pmal-1) byl zvolen pro expresi fúzního proteinu ve velkém měřítku. Fúzní produkt ShPrP-MBP byl izolován z bakteriálních lyzátů afinitní chromatografií na koloně s amylózovou pryskyřicí a eluován 10 mM maltózou. Frakce byly analyzovány Western imunoblotem za použití králičího antiséra k PrP peptidu NH₂-Gly-Gln-Gly-Gly-GlyThr-His-Asn-Gln-Trp-Asn-Lys-Pro-Ser-Lys-COOH (R2843) (KI O'Rourke et al., J Gen Virol 75:1511-1514(1994)).

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). 2 destičky Immulon byly potaženy 6,25 pg na jamku rekombinantním ShPrP-MBP fúzním proteinem v 50 μΐ 0,05 M karbonátového pufru, pH 9,6, před noc při teplotě 4 °C. Destičky byly blokovány komerčně dostupným blokovacím mlékem ředěným v poměru 1:15 (KPL, Gaithersburg, MD) po dobu jedné hodiny. 50 μΐ antiséra nebo hybridomového supematantu bylo inkubováno v každé jamce 30 minut při pokojové teplotě. Destičky byly vyvíjeny s kozí antimyší křenovou peroxidázou a 2,2'-azido-di[3-ethyl-benzthiazolin sulfonátem] (R Fatzer et al., Zentralbl. Veterinarmed. A. 43:23-29 (1996)) (ABTS) (KPL, Gaithersburg, MD). Optická denzita byla odečítána při 405 nm. Negativní kontroly zahrnovaly séra od inokulovaných myší, supematanty izotypově souhlasným monoklonálních protilátek irelevantní specifity, nebo médium pro tkáňové kultury upravené na 15% fetální telecí sérum. Jamky s pozitivními kontrolami byly inkubovány s králičím anti PrP peptidovým anti

-10CZ 295412 B6 sérem (R2843) a vyvinuty s kozí antikráličí HRPO a ABTS. Pozitivní jamky měly OD_40S vyšší než dvě směrodatné odchylky nad průměr 4 negativních kontrolních jamek.

Definice epitopu vázaného monoklonální protilátkou F99/97.6.1. Překrývající se souboru peptidů, každý se 6 aminokyselinami, v rozsahu Val-Glu-Gln-Met-Cys-Ile-Thr-Gln-Tyr-Gln-ArgGlu-Ser-Gln-Ata-Tyr-Tyr-Gln-Arg-Gly-Ala-Ser-Val-Ile-Leu-Phe byl syntetizován na membránové podpoře za použití konvenčních technik známých osobám znalým oboru (Sigma-Genosys). Schopnost monoklonální protilátky F99/97,6,l vázat jednotlivé peptidy byla určena vizuálně po inkubaci s antimyší IgG křenové peroxidázy a chemiluminiscenčním substrátem a po expozici filtrů filmu Kodak X-Omat.

Zdroj a sekvence PrP genu přežvýkavých býložravců spřirozeně se vyskytující se TSE. Mozkové tkáně od 34 ovcí s histopatologickými lézemi scrapie byly testovány na reaktivitu s monoklonální protilátkou F99/97-6.1 imunochemicky. PrP-Sc byl detekován imunohistochemicky za použití králičího antikřeččího PrP polyklonálního antiséra ve 20 z těchto vzorků a Western imunoblotem u 6 z 20 (JM Miller, Diagn Invent 5:309-316 (1993)). Tři ovce bez histologických lézí scrapie a bez detekovatelného PrP-Sc v analýze Western blotem byly použity jako negativní kontroly. Tyto tkáně byly poskytnuty patology ve veterinárních zařízeních a ve státních diagnostických laboratořích personálem z USDA Animal and Plant Health Inspecton Service. Vzorky mozku z 10 severoamerických jelenů (Odocoileus hemionus hemionus) a 4 losů (Cervus elaphus nelsoni) s přirozeně se vyskytující CWD byly poskytnuty laboratoří Colorado Statě Diagnostic Laboratory a organizací Colorado Division of Wildlife. Neobarvené řezy od 10 kusů dobytka s BSE a 5 BSE negativních kusů dobytka bylo poskytnuto laboratoří Pathobiology Laboratory, National Veterinary Services Laboratories, USDA-APHIS, Ames, IA. Parafínové bločky těchto řezů dodal dr. Gerald Wells, Ministry of Agriculture, Fisheries and Food, Centrál Veterinary Laboratory, New Haw, Surrey, Spojené Království.

Zmražená mozková tkáň na analýzu PrP genotypu byla dostupná od 12 z 34 scrapie pozitivních ovcí, všech 10 jelenů s CWD a 42 losů postižených CWD. Vzorky krve byly také dostupné od 150 zdravých severoamerických jelenů a 244 zdravých losů. Otevřený čtecí rámec PrP genu ovce byl amplifikován polymerázovou řetězovou reakcí, jak je popsáno výše a polymorfní oblasti z kodonů 112-240 byly sekvenovány na obou vláknech automatizovanou fluorescenčním barvivém označenou dideoxy vláknovou terminací (KIO'Rourke et al. Anim. Biotech 7:155-162 (1996)). 100 až 800 ng genomické DNA od severoamerických jelenů nebo losů bylo amplifikováno za použití primerů specifických pro jednotlivé živočišné druhy:

dopředný 5'CTGCAAGAAGCGACCAAAACC reverzní 5'CACAGGAGGGGAGGAGAGAAGAGGAT za standardních podmínek s výjimkou toho, že koncentrace Mg²⁺ byla zvýšena na 2,5 mM. PCR produkty byly sekvenovány na obou vláknech za použití dopředný primer 5'GGCTATCCACCTCAGGGAG reverzní primer 5'TCACACTTGCCCCCTCTTTTGGT s typicky dosaženou sekvenční informací na kodonech 106 až 224.

Imunoblotová analýza. PrP-Sc byl izolován z mozku ovcí s klinickými znaky scrapie pomocí diferenciální centrifugace ze Sarkosylového pufru, jak popsali Race et al., viz výše. Typicky 0,3 g mozku homogenizovaného v 50 mM Tris-HCl, 5 mM MgCl₂, pH 7,4 za použití sonikace. Homogenát byl upraven na 80 pg/ml RNAzy a 20 pg/ml DNAzy a inkubován po dobu 1,5 hodiny při pokojové teplotě. Po centrifugací při 2000 g po dobu 30 minut a při teplotě 20 °C byl

-11 CZ 295412 B6 supernatant odstraněn a centrifugován při 200000 g po dobu 2,5 hodin při teplotě 20 °C. Peletovaný materiál byl resuspendován v 300 μΐ 50 mM Tris-HCl, pH 7,4 sonikací. Suspenze byla upravena 10 pg/ml proteinázy K podané na 1 hodinu při teplotě 37 °C, aby se hydrolyzoval PrPC. Po přidání Pefablocu (Boehringer Manheim), aby se zastavila enzymová aktivita, byla suspenze centrifugována při 20000 g po dobu 1 hodiny při teplotě 20 °C. Peleta byla vařena v 300 μΐ SDS vzorkového pufru pro imunoblot. Různá množství byla rozpuštěna na 15% polyakrylamidových gelech a přenesena na PVDF membrány (Millipore).

Membrány byly vyvinuty s 3 pg/ml F99/97.6.1 s izotypovou kontrolní monoklonální protilátkou, nebo s 3 pg/ml F99/97.6.1 Gln-Ala-Tyr-Tyr-Gln-Arg-Gly-Ala, aby se specificky eliminovala reaktivita monoklonální protilátky. Navázaná protilátka byla detekována s křenovou peroxidázou konjugovaným kozím antimyším IgGl. Filtry byly exponovány filmu (Amersham Hyperfilm) na 20 až 120 minut.

Imunohistochemie. Mozky byly fixovány v 10% pufrovaném formalinu imerzí a zapuštěny do parafínu. Jeden řez z každého bločku byl obarven hematoxylinem a eozinem pro rutinní histopatologii. Na sílaném upravená skleněná sklíčka byly umístěny další tkáňové řezy. Řezy byly deparafinizovány a hydratovány. Sekce byly inkubovány v 99% kyselině mravenčí po dobu 5 minut, poté promyty a neutralizovány 0,1 M Tris-HCl, pH 7,6. Řezy byly zahřívány v autoklávu nebo v tlakovém hrnci při teplotě 121 °C po dobu 20 minut v modifikovaném citrátovém pufru, pH 6,1 (DAKO TR pufr). Sklíčka byla inkubována sekvenčně v pufru s peroxidem vodíku, aby se blokovala endogenní křenová peroxidáza, v koktejlu monoklonálních protilátek F89/160.1.5 a F9/97.6.1, kde každé protilátky bylo přidáno 3 pg/ml v Tris casein ředícím činidle (32 minut při teplotě 37 °C), biotinylovaném kozím antimyším IgG (8 minut při teplotě 37 °C), streptavidin-křenové peroxidáze (8 minut při teplotě 37 °C), AEC/peroxid vodíku (8 minut, 37 °C) a poté přebarvena hematoxylinem. Tkáně byly připevněny ve vodném médiu pro použití krycích sklíček. Negativní kontroly obsahovaly 1) náhradu koktejlu monoklonálních protilátek s podobnou koncentrací irelevantní monoklonální protilátky stejného izotypu (IgGl) a 2) inkubaci koktejlu monoklonálních protilátek s mozkovou a lymfoidní tkání ovcí bez scrapie, jak bylo prokázáno histopatologicky a analýzou Western blotem.

Sekvence PrP genu severoamerického jelena a losa. Byly identifikovány tři alely PrP genu severoamerického jelena. Alely 138S2 (GenBank přístup AF009180) a 138N1 (přístup U97331) kódují Ser a Asn v kodonu 138. Alela SI (přístup AF009181) se liší od S2 tichou mutací. Byly nalezeny dvě alely PrP genu losa (GenBank AF016227, AF016228) kódující substituci M na L v kodonu 132.

Výsledky

Epitopové mapování a určení sekvence. Epitop rozpoznávaný monoklonální protilátkou F99/97.6.1 byl mapován panelem překrývajících se peptidů. Rezidua 220-225 (Gln-Tyr-GlnArg-Glu-Ser) byla zjištěna jako dostatečná pro vazbu protilátky. Tato sekvence je konzervovaná v odvozených aminokyselinových sekvencích alel severoamerického jelena, losa, koz, lidí a ovcí, stejně tak jako u 32 živočišných druhů s rizikem TSE. Epitop je zjištěn na variantě alely C. hircus (koza) (GenBank X91999) s polymorfismem ve vazebném místě pro F89/160.1.5 a variantě alely O. aries (ovce) s polymorfismem těsně předcházejícím epitopu pro F89/160.1.5 (citováno v A. Bossers et al., Archives of Virology 144:829-834 (1999)).

Reaktivita v imunoblotu s PrP-Sc od ovcí postižených TSE. Specifita monoklonální protilátky F99/97.6.1 byla hodnocena analýzou Western blotem preparátů PrP-Sc od ovcí s přirozenou scrapie a od normálních ovcí. V extraktech z mozku od ovcí postižených scrapie byly detekovány peptidové proužky se zjevnými molekulovými hmotnostmi mezi 28000-35000. V extraktech mozků normálních ovcí při použití izotypově příbuzné kontrolní monoklonální protilátky, nebo

-12CZ 295412 B6 když byla protilátka F99/97.6.1 absorbována peptidem obsahujícím epitop, ke kterému se váže, nebyly detekovány žádné proužky.

Imunohistochemie tkání od normálních a TSE postižených přežvýkavců.Monoklonální protilátka F99/97.6.1 byla dále hodnocena imunohistochemicky na reaktivitu na formalinem fixované, v parafínu zalité mozkové tkáni, rutinním způsobem zpracované na histopatologické vyšetření. Všechna zvířata postižená TSE měla neuropilovou spongiózu, intraneuronální vakuoly a gliózu ve vybraných jádrech mozkového kmene a středního mozku, což jsou léze diagnostické pro TSE. Pro imunohistochemické vyšetření byly zvoleny minimálně mesencefalon (na úrovni rostrálního kolikulu) a myencefalon (na úrovni obexu). Zpracování teplem bylo nezbytné k odmaskování vazby monoklonální protilátky F99/97.6.1. k PrP-Sc epitopu.

Pozitivní barvení bylo detekováno v mozku ovcí s přirozenou scrapie, severoamerických jelenů a losů s CWD a dobytka s BSE. Reaktivita byla omezena na šedou hmotu ve středním mozku a v mozkovém kmeni, byla koncentrována v postižených jádrech a byla přítomna v neuropilu a v neuronech a gliálních buňkách. Většina imunobarvení se týkala denzních granul nebo plaků náhodně v šedé hmotě neuropilu. PrP-Sc často agregovalo přilehle k jádrům gliových buněk a akumulovalo se větvícím způsobem okolo gliových buněk identifikovaných histologicky jako makroglie (malá, oválná až angulámí hyperchromatická jádra bez rozpoznatelné cytoplazmy). Občas bylo zjištěno perivaskulární a subependymální obroubení PrP-Sc svědčící pro astrogliální výběžky. Neuronální reaktivita byla tvořena imunobarvením punktátu v neuronálním těle nebo odlišným obroubením neuronálního těla v PrP-Sc, buďto v neuronálních membránách nebo v perineuronálních gliových výběžcích. Neurony s i bez intraneuronálních vakuol měly PrP-Sc reaktivitu. Žádná reaktivita nebyla detekována v mozku nepostižených ovcí, jelenů, losů nebo dobytka imunobarvených monoklonální protilátkou F99/97.6.1 nebo v mozku ovcí postižených scrapie nebo dobytka pozitivního na BSE imunobarvených izotypovou kontrolní monoklonální protilátkou.

Je rozuměno, že následující detailní popis je uveden čistě ilustračně, a že mohou být provedeny modifikace a variace bez odchýlení od ducha a rozsahu vynálezu.

Seznam sekvencí <110> O'Rourke, Katherine I.

<120> Monoklonální protilátky a koktejl protilátek pro detekci prionového proteinu jako markéru přenosných spongiformních encefalopatií <130> O'Rourke <140> 09/353,348 <141> 1999-07-15 <160> 11 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211>6 <212>PRT <213> Ovis aries <400> 1

Gin Tyr Gin Arg Glu Ser

-13CZ 295412 B6 <210> 2 <211>4 <212> PRT <213> Bos taurus <400>2

Ile His Phe Gly <210> 3 <211> 17 <212>PRT <213> Ovis Aries <400>3

Cys Ile Thr Gin Tyr Gin Arg Glu Ser Gin Ala Tyr Tyr Gin Arg

Gly Ala <210>4 <211> 25 <212>DNA <213> Ovis Aries <400>4 atcgaattca agaagcgacc aaaac 25 <210>5 <211> 22 <212>DNA <211> Ovis Aries <400> 5 atcgaattca gacaccaca ct 22 <210> 6 <211> 15 <212> PRT <213> Mesocricetus auratus <400>6

Gly Gin Gly Gly Gly Thr His Asn Gin Trp Asn Lys Pro ser Lys <210 7 <211> 26

-14CZ 295412 B6 <212> PRT <213> Ovis Aries <400>7

Val Glu Gin Met Cys Ile Thr Gin Tyr Gin Arg Glu Ser Gin Ala

Tyr Tyr Gin Arg Gly Ala Ser Val Ile Leu Phe <210>8 <211> 21 <212>DNA <213> Odocoileus hemionus hemionus <400>8 ctgcaagaag cgaccaaaac c 21 <210>9 <211> 24 <212>DNA <213> Odocoileus hemionus hemionus <400>9 cacaggaggg gaggagaaga ggat 24 <210> 10 <211> 19 <212>DNA <213> Odocoileus hemionus hemionus <400> 10 ggctatccac ctcagggag 19 <210> 11 <211> 22 <212>DNA <213> Odocoileus hemionus hemionus <400> 11 tcacacttgc cccctctttg gt 22

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

(1) získá tkáň od zvířete nebo člověka, kteří mají být testováni;

1. Monoklonální protilátka, která se specificky váže ke konzervovanému epitopu prionových proteinů označenému jako Gln-Tyr-Gln-Arg-Glu-Ser, a která je schopná vázat PrP-Sc protein ve fixované nebo nefixované tkáni, jež byla upravena tak, aby se odmaskoval uvedený epitop PrP-Sc proteinu a eliminovala dostupnost odpovídajícího epitopu PrP-buněčného proteinu.
(2) tkáň se fixuje nebo zmrazí;

2. Monoklonální protilátka podle nároku 1, která se váže k epitopu, proti kterému je namířena monoklonální protilátka produkovaná hybridomovou buněčnou linií uloženou pod přírůstkovým číslem ATCC HB-12696.
(3) fixovaná nebo zmrazená tkáň se upraví tak, aby se odmaskovaly epitopy PrP-Sc proteinu a eliminovala dostupnost odpovídajícího epitopu PrP-buněčného proteinu;

-16CZ 295412 B6 (4) upravená tkáň se uvede do styku s monoklonálními protilátkami, které zahrnují a) monoklonální protilátky podle nároku 1 nebo b) koktejl monoklonálních protilátek podle nároku 5 v takovém množství a za takových podmínek, že protilátky váží PrP-Sc protein, pokud je přítomen v tkáni, a (5) detekuje se přítomnost řečených navázaných protilátek.

10. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že tkání je fixovaná tkáň a úprava tkáně se provádí způsobem zvoleným ze souboru sestávajícího z a) hydratačního zpracování v autoklávu, b) reakce s kyselinou mravenčí s nebo bez následného hydratačního zpracování v autoklávu a c) štěpení trypsinem.

11. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že tkání je zmrazená tkáň a úprava tkáně se provádí reakcí s proteinázou K k eliminaci pásu PrP-C proteinu o relativní molekulové hmotnosti 35 000 a k odhalení charakteristických mnohočetných proteináz K-rezistentních PrPSc proteinů o relativní molekulové hmotnosti 28 000 až 32 000.

12. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že monoklonální protilátky se váží k epitopu, ke kterému je namířena monoklonální protilátka produkovaná hybridomovou buněčnou linií uloženou pod přírůstkovým číslem ATCC HB-12696.

13. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že monoklonální protilátka je produkována hybridomovou buněčnou linií uloženou pod přírůstkovým číslem ATCC HB-12696.

14. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že koktejl obsahuje první monoklonální protilátku, která se váže na epitop, ke kterému je namířena monoklonální protilátka produkovaná hybridomovou buněčnou linií uloženou pod přírůstkovým číslem ATCC HB-12696 a druhou monoklonální protilátku, která se váže na epitop, ke kterému je namířena monoklonální protilátka produkovaná hybridomovou buněčnou linií uloženou pod přírůstkovým číslem ATCC HB-12403.

15. Způsob podle nároku 9, v y z n a č u j í c í se t í m , že první monoklonální protilátkou je protilátka produkovaná hybridomovou buněčnou linií uloženou pod přírůstkovým číslem ATCC HB-12696 a druhou monoklonální protilátkou je protilátka produkovaná hybridomovou buněčnou linií uloženou pod přírůstkovým číslem ATCC HB-12403 nebo PTA-114.

16. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že detekce se provádí tak, že se protilátky uvedou do styku s detekovatelně označeným antimyším imunoglobulinovým činidlem za takových podmínek, že se činidlo váže kprotilátkám, a detekuje se navázané činidlo.

17. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že detekce se provádí tak, že se

a) protilátky uvedou do styku se značeným antimyším imunoglobulinovým činidlem za takových podmínek, že se činidlo váže kprotilátkám,

b) činidlo se uvede do styku s komplexem enzym-ligand tak, že se komplex váže ke značce na činidlu, a

c) detekuje se komplex enzym-ligand s chromogenním substrátem.

18. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že zvíře je vybráno ze souboru sestávajícího z přežvýkavých hospodářských zvířat, kočky, norka a nehumánních primátů.

- 17CZ 295412 B6

19. Způsob podle nároku 18, vyznačující se tím, že přežvýkavá hospodářská zvířata jsou vybrána ze souboru sestávajícího z ovce, kozy, hovězího dobytka, jelence ušatého a losa.

20. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že tkáň je lymfoidní tkáň sdružená

3. Monoklonální protilátka podle nároku 2 produkovaná hybridomovou buněčnou linií uloženou pod přírůstkovým číslem ATCC HB-12696.
4. Hybridomová buněčná linie uložená pod přírůstkovým číslem ATCC HB-12696 produkující a sekretující monoklonální protilátku, která se specificky váže ke konzervovanému epitopu prionových proteinů, označenému jako Gln-Tyr-Gln-Arg-Glu-Ser a která váže PrP-Sc protein ve fixované nebo nefixované tkáni, jež byla upravena tak, aby se odmaskoval uvedený epitop PrP-Sc proteinu a eliminovala dostupnost odpovídajícího epitopu PrP-buněčného proteinu.

5. Koktejl monoklonálních protilátek obsahující první monoklonální protilátku, jež obsahuje monoklonální protilátku podle nároku 1, v kombinaci s druhou monoklonální protilátkou, jež obsahuje monoklonální protilátku, která se specificky váže k druhému konzervovanému epitopu prionových proteinů označenému jako Ile-His-Phe-Gly a která je schopná vázat PrP-Sc protein ve fixované nebo nefixované tkáni, jež byla upravena tak, aby se odmaskoval uvedený epitop PrP-Sc proteinu a eliminovala dostupnost odpovídajícího epitopu PrP-buněčného proteinu.

6. Koktejl monoklonálních protilátek podle nároku 5, kde se první monoklonální protilátka váže na epitop, ke kterému je namířena monoklonální protilátka produkovaná hybridomovou buněčnou linií uloženou pod přírůstkovým číslem ATCC HB-12696.

7. Koktejl monoklonálních protilátek podle nároku 5, kde se druhá monoklonální protilátka váže na epitop, ke kterému je namířena monoklonální protilátka produkovaná hybridomovou buněčnou linií uloženou pod přírůstkovým číslem ATCC HB-12403.

8. Koktejl monoklonálních protilátek podle nároku 5, kde první monoklonální protilátkou je protilátka produkovaná hybridomovou buněčnou linií uloženou pod přírůstkovým číslem ATCC HB-12696 a druhou monoklonální protilátkou je protilátka produkovaná hybridomovou buněčnou linií uloženou pod přírůstkovým číslem ATCC HB-12403 nebo PTA-114.

9. Imunoanalytický způsob detekce PrP-Sc proteinu u zvířete nebo člověka, vyznačující se t í m, že se:
5 s oční mžurkou, mozková nekroptická tkáň, bioptická nebo nekroptická tkáň lymfatických uzlin, nebo bioptická nebo nekroptická tkáň mízních uzlin nebo bioptická nebo nekroptická tkáň sleziny.